DE19753681A1 - Erythropoietin composition has a highly specific activity - Google Patents

Erythropoietin composition has a highly specific activity

Info

Publication number
DE19753681A1
DE19753681A1 DE1997153681 DE19753681A DE19753681A1 DE 19753681 A1 DE19753681 A1 DE 19753681A1 DE 1997153681 DE1997153681 DE 1997153681 DE 19753681 A DE19753681 A DE 19753681A DE 19753681 A1 DE19753681 A1 DE 19753681A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
epo
acetyl
tetra
lactosamine
molecules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE1997153681
Other languages
German (de)
Inventor
Josef Dipl Chem Dr Burg
Karl-Heinz Sellinger
Anton Dr Haselbeck
Hans Dipl Biol Dr Koll
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Priority to DE1997153681 priority Critical patent/DE19753681A1/en
Priority to US09/113,692 priority patent/US6548296B1/en
Priority to AU89786/98A priority patent/AU754619B2/en
Priority to JP2000504243A priority patent/JP4541539B2/en
Priority to AT98941401T priority patent/ATE341625T1/en
Priority to BRPI9811031-4 priority patent/BRPI9811031B8/en
Priority to US09/463,380 priority patent/US6391633B1/en
Priority to PT98941401T priority patent/PT986644E/en
Priority to KR1020007000677A priority patent/KR100641969B1/en
Priority to CA2298015A priority patent/CA2298015C/en
Priority to DE59813758T priority patent/DE59813758D1/en
Priority to EP98941401A priority patent/EP0986644B1/en
Priority to TR2000/00175T priority patent/TR200000175T2/en
Priority to PCT/EP1998/004590 priority patent/WO1999005268A1/en
Priority to DK98941401T priority patent/DK0986644T3/en
Priority to CNB988074826A priority patent/CN1151258C/en
Priority to ES98941401T priority patent/ES2273434T3/en
Priority to CO98042019A priority patent/CO4790181A1/en
Priority to ARP980103619A priority patent/AR016537A1/en
Priority to TW87116028A priority patent/TW574372B/en
Priority to DK98965223.5T priority patent/DK1036179T4/en
Priority to AT98965223T priority patent/ATE309350T1/en
Priority to ZA9811003A priority patent/ZA9811003B/en
Priority to US09/555,533 priority patent/US6673575B1/en
Priority to EP98965223.5A priority patent/EP1036179B2/en
Priority to ZA9811004A priority patent/ZA9811004B/en
Priority to PCT/EP1998/007819 priority patent/WO1999028455A1/en
Priority to AU20518/99A priority patent/AU2051899A/en
Priority to DE59813187T priority patent/DE59813187D1/en
Priority to ES98965223.5T priority patent/ES2252876T5/en
Priority to JP2000523332A priority patent/JP3394240B2/en
Priority to ARP980106125A priority patent/AR022358A1/en
Priority to KR10-2000-7006085A priority patent/KR100390325B1/en
Priority to ES98965756.4T priority patent/ES2523599T3/en
Priority to TR2000/01580T priority patent/TR200001580T2/en
Priority to CA2309810A priority patent/CA2309810C/en
Priority to PCT/EP1998/007876 priority patent/WO1999028346A1/en
Priority to EP98965756.4A priority patent/EP1037921B1/en
Priority to AU21581/99A priority patent/AU744086B2/en
Priority to JP2000523237A priority patent/JP4220125B2/en
Priority to CNB988117924A priority patent/CN1280309C/en
Priority to BRPI9813391A priority patent/BR9813391C1/en
Priority to ARP980106124A priority patent/AR018023A1/en
Publication of DE19753681A1 publication Critical patent/DE19753681A1/en
Priority to ARP990105069A priority patent/AR020735A1/en
Priority to US09/607,277 priority patent/US6555373B1/en
Priority to US09/985,357 priority patent/US6544748B2/en
Priority to JP2002321415A priority patent/JP4384400B2/en
Priority to US10/351,397 priority patent/US7214532B2/en
Priority to US10/353,767 priority patent/US7186529B2/en
Priority to JP2003055499A priority patent/JP3673261B2/en
Priority to JP2004219290A priority patent/JP4234647B2/en
Priority to US11/201,006 priority patent/US7659373B2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

An erythropoietin (EPO) composition (I) consists mainly or completely of glycosylised EPO molecules and comprises at least 75% tetra-antenna structures with respect to the total N-bound carbohydrate chains present. Independent claims are also included for the following: (1) (I) comprising on average 3.7 units N-acetyl-lactosamine with respect to an N-bound carbohydrate chain to an EPO molecule, and 11.1 units of N-acetyl-lactosamine with respect to the total N-glycosylation of an EPO molecules; (2) (I) where the average product of the multiplication of N-acetyl-lactosamine/carbohydrate chain/EPO molecule times sialinic acid content is 43.3 or 130, when multiplying with N-acetyl-lactosamine/total N-glycosylation with sialinic acid; (3) a pharmaceutical composition comprising (I) and diluents, carriers and other additives; (4) a preparation of (I) comprising: (a) selecting a production cell which can produce carbohydrate chains with a high content of tetra-antenna structures and/or N-acetyl-lactosamine content; (b) selecting of culture conditions which promotes the cells of (a); and (c) separating the undesired products from the EPO molecules chains with a high content of tetra-antenna structures and/or N-acetyl-lactosamine content; and (5) a method for increasing the specific activity of (I), comprising concentrating (I) so that (I) has: (a) a high content of tetra-antenna carbohydrate structures; (b) a large number of N-acetyl-lactosamine units; (c) a high product of N-acetyl-lactosamine units and sialinic acid; (d) a high content of N-acetyl-lactosamine repeats; and/or (e) a high product of N-acetyl-lactosamine repeats and tetra-antenna carbohydrate structures.

Description

Die Erfindung betrifft neue EPO-Zusammensetzungen mit hoher spezifischer Aktivität, die durch einen hohen Gehalt an N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten oder/und tetraantennären Verzweigungen in der Kohlenhydratstruktur gekennzeichnet sind. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Gewinnen solcher EPO-Produkte.The invention relates to new EPO compositions with high specificity Activity due to a high content of N-acetyl-lactosamine units or / and tetra-antenna branches in the carbohydrate structure Marked are. The invention also relates to a method for Obtaining such EPO products.

Erythropoietin (EPO) ist ein humanes Glycoprotein, welches die Produktion von roten Blutzellen stimuliert. EPO kommt im Blutplasma von gesunden Personen nur in sehr geringen Konzentration vor, so daß eine Bereitstellung in größeren Mengen auf diese Weise nicht möglich ist. EP-B-0 148 605 und EP-B-0 205 564 beschreiben die Herstellung von rekombinantem humanen EPO in CHO-Zellen. Das in EP-B-0 148 605 beschriebene EPO weist ein höheres Molekulargewicht als urinäres EPO und keine O-Glykosilierung auf. Das in EP-B-0 205 564 beschriebene EPO aus CHO-Zellen ist mittlerweile in großen Mengen und in reiner Form verfügbar.Erythropoietin (EPO) is a human glycoprotein which is the production stimulated by red blood cells. EPO comes from healthy blood plasma People only in very low concentration, so that a provision in larger quantities in this way is not possible. EP-B-0 148 605 and EP-B-0 205 564 describe the production of recombinant human EPO in CHO cells. The EPO described in EP-B-0 148 605 has a higher molecular weight than urinary EPO and no O-glycosylation. The EPO from CHO cells described in EP-B-0 205 564 is meanwhile available in large quantities and in pure form.

Weiterhin ist die Gewinnung von humanem EPO aus dem Urin von Patienten mit aplastischer Anämie bekannt (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1 977), 5558-5564).Furthermore, the extraction of human EPO from the urine of patients known with aplastic anemia (Miyake et al., J. Biol. Chem. 252 (1 977), 5558-5564).

Rekombinantes und urinäres EPO wird als Gemisch verschiedener Isoformen gewonnen, von denen bekannt ist, daß sie sich in ihrem Sialylierungsgrad unterscheiden. Diese EPO-Isoformen weisen unterschiedliche isoelektrische Punkte auf und können durch isoelektrische Fokussierung bzw. Kapillarelek­ trophorese aufgetrennt werden (siehe Tsao et al., Biotech. Bioeng. 40 (1992), 1190-1196; Nieto et al., Anal. Commun. 33 (1996), 425-427; Tran et al., J. Chromatogr. 542 (1991), 459-471; Bietot et al., J. Chromatogr. 759 (1997), 177-184; Watson et al. Anal. Biochem. 210 (1993), 389-393). Die Isoformen mit der höchsten Anzahl von SiaIinsäuren weisen die höchste spezifische Aktivität auf, während die mit der niedrigsten Anzahl die geringste Aktivität besitzen (siehe z. B. Imai et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990), 457-462; EP-A-0 428 267).Recombinant and urinary EPO is produced as a mixture of different isoforms obtained which are known to vary in their degree of sialylation distinguish. These EPO isoforms have different isoelectric Points on and can by isoelectric focusing or Kapillarelek trophoresis (see Tsao et al., Biotech. Bioeng. 40 (1992): 1190-1196; Nieto et al., Anal. Commun. 33: 425-427 (1996); Tran et al., J. Chromatogr. 1991: 542: 459-471; Bietot et al., J. Chromatogr. 1997: 759: 177-184; Watson et al. Anal. Biochem. 210: 389-393 (1993)). The isoforms with the highest number of sialic acids have the highest specific activity, while those with the lowest number the have the lowest activity (see, for example, Imai et al., Eur. J. Biochem. 194 (1990): 457-462; EP-A-0 428 267).

Takeuchi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 7819-7822) beschreiben einen Zusammenhang der biologischen Aktivität mit dem Sialinsäuregehalt und dem Verhältnis von bi- und tetraantennären Kohlenhy­ dratstrukturen. Takeuchi et al. kommen weiterhin zur Schlußfolgerung, daß die in den EPO-Kohlenhydratstrukturen vorhandenen N-Acetyl-Lactosamin- Disaccharideinheiten nicht mit der biologischen Aktivität korrelieren.Takeuchi et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 7819-7822 (1989)) describe a relationship between the biological activity and the Sialic acid content and the ratio of bi- and tetra-antennary carbohydrates wire structures. Takeuchi et al. continue to conclude that the N-acetyl-lactosamine present in the EPO carbohydrate structures Disaccharide units do not correlate with biological activity.

Fukuda et al. (Blood 73 (1989), 84-89) befassen sich mit der Geschwindig­ keit der Elimination von EPO aus dem Blutkreislauf, die wesentlich zur biologischen Aktivität beiträgt, und kommen zu dem Schluß, daß EPO mit einer größeren Anzahl an N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten schneller aus dem Kreislauf entfernt wird als EPO ohne Lactosamin-Einheiten. Morimoto et al. (Glycoconjugate J. 13 (1996), 1093-1120) beschreiben die Auftrennung von EPO-Isoformen mittels Mono-Q-Chromatographie, so daß die einzelnen Fraktionen jeweils aus nur noch wenigen Isoformen bestehen. Die mit diesen Fraktionen durchgeführten Untersuchungen zeigen eine Gleichver­ teilung aller Strukturen in allen Fraktionen. Es wird keine Korrelation des Gehalts an bi- oder triantennären Strukturen oder des Gehalts an N-Acetyl- Lactosamin-Einheiten mit der spezifischen Aktivität gefunden.Fukuda et al. (Blood 73 (1989), 84-89) deal with the velocity the elimination of EPO from the bloodstream, which is essential for biological activity contributes, and come to the conclusion that EPO with a larger number of N-acetyl-lactosamine units more quickly from the Circulation is removed as EPO with no lactosamine units. Morimoto et al. (Glycoconjugate J. 13 (1996), 1093-1120) describe the separation of EPO isoforms using Mono-Q chromatography, so that the individual Fractions each consist of only a few isoforms. With Investigations carried out in these fractions show an equivalence division of all structures in all political groups. There will be no correlation of the Content of bi- or triantennary structures or the content of N-acetyl- Lactosamine units with the specific activity found.

Somit geht aus dem genannten Stand der Technik hervor, daß eine generelle Korrelation der biologischen Aktivität mit der Zuckerstruktur besteht, insbesondere im Hinblick auf den Gehalt an Sialinsäuren. Es findet sich jedoch keinerlei Hinweis, daß der Anteil an tetraantennären Strukturen oder/und der Anteil an N-Acetyl-Lactosamin-Disaccharideinheiten eine direkte Korrelation mit der biologischen Aktivität besitzt. Thus, it emerges from the cited prior art that a general There is a correlation between the biological activity and the sugar structure, especially with regard to the content of sialic acids. It is found however, no indication that the proportion of tetra-antenna structures or / and the proportion of N-acetyl-lactosamine disaccharide units has a direct correlation with biological activity.

Überraschenderweise wurde bei der Aufreinigung von EPO-Präparationen festgestellt, daß eine Erhöhung des Anteils an tetraantennären Kohlenhy­ dratstrukturen oder/und N-Acetyl-Lactosamin-Disaccharid-Einheiten in der Kohlenhydratstruktur zu einer signifikanten Verbesserung der spezifischen biologischen Aktivität führt. Dies trifft insbesondere zu bei der Herstellung von EPO in einer humanen Zellinie gemäß den europäischen Anmeldungen 97 112 649.5 und 97 112 640.4.Surprisingly, in the purification of EPO preparations found that an increase in the proportion of tetra-antennary carbohydrates drate structures and / or N-acetyl-lactosamine disaccharide units in the Carbohydrate structure to a significant improvement in the specific biological activity. This is particularly true during manufacture of EPO in a human cell line according to the European applications 97 112 649.5 and 97 112 640.4.

Vergleichende Aktivitätsuntersuchungen einzelner EPO-Präparationen oder EPO-Isoformen, deren Kohlenhydratstruktur sich im wesentlichen nur im Gehalt der N-Acetyl-Lactosamin-Disaccharideinheiten unterscheidet, zeigen eine signifikant höhere Aktivität für die Präparationen oder Isoformen mit dem höheren Anteil an N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bei gleichen Sialinsäuregehalt und bei etwa gleicher Antennärität. Außerdem wurde gefunden, daß gerade in Präparationen oder Isoformen mit einem erhöhten Anteil an triantennären Strukturen der Gehalt an Lactosamin-Einheiten für die in vivo Aktivität von erheblicher Bedeutung ist. Weiterhin wurde festgestellt, daß durch Erhöhung des Anteils antetratantennären Strukturen eine Verbesserung der biologischen Aktivität erreicht werden kann.Comparative activity studies of individual EPO preparations or EPO isoforms whose carbohydrate structure is essentially only in the Content of the N-acetyl-lactosamine disaccharide units differs a significantly higher activity for the preparations or isoforms with the higher proportion of N-acetyl-lactosamine units at the same Sialic acid content and with about the same antennarity. In addition, was found that just in preparations or isoforms with an increased Proportion of triantennary structures the content of lactosamine units for the in vivo activity is of considerable importance. Furthermore was found that by increasing the proportion of antetratal structures an improvement in biological activity can be achieved.

Ist man folglich bestrebt, ein EPO-Präparat mit möglichst hoher spezifischer Aktivität und in hoher Ausbeute zu erzeugen, so ist bei der Auswahl der Aufreinigungsschritte, der Produktionszellen oder/und bei deren Kultivierung auf einen möglichst hohen Anteil von tetraantennären Kohlenhydrat­ strukturen oder/und Lactosamin-Disaccharideinheiten zu optimieren.The aim is therefore to produce an EPO preparation with the highest possible specificity To produce activity and in high yield, so is the choice of Purification steps, the production cells and / or during their cultivation on the highest possible proportion of tetra-antennary carbohydrate to optimize structures and / or lactosamine disaccharide units.

Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine EPO-Zusammen­ setzung, die im wesentlichen aus glykosilierten EPO-Molekülen besteht, die einen Anteil von mindestens 75% vorzugsweise mindestens 80% und am meisten bevorzugt mindestens 85% tetraantennären Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydratketten, d. h. die Summe von bi-, tri- und tetraantennären Strukturen, enthalten. A first aspect of the present invention relates to an EPO composite settlement, which consists essentially of glycosylated EPO molecules, the a proportion of at least 75%, preferably at least 80% and am most preferably at least 85% based on tetra-antenna structures the total number of carbohydrate chains, d. H. the sum of bi-, tri- and tetra-antenna structures.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine EPO-Zusammensetzung, die im wesentlichen aus glykosilierten EPO-Molekülen besteht, die eine Anzahl von mindestens 3,7, vorzugsweise von mindestens 4,0 und am meisten bevorzugt mindestens 4,5 N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf eine Glykosilierungsstelle des EPO-Moleküls bzw. eine Anzahl von mindestens 11,1, vorzugsweise von mindestens 12,0 und am meisten bevorzugt von mindestens 13,5 N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf die 3 Glykosilierungsstellen des EPO-Moleküls enthalten.Another aspect of the invention relates to an EPO composition which consists essentially of glycosylated EPO molecules that have a number of at least 3.7, preferably at least 4.0, and most preferably at least 4.5 N-acetyl-lactosamine units based on one Glycosylation site of the EPO molecule or a number of at least 11.1, preferably of at least 12.0, and most preferably of at least 13.5 N-acetyl-lactosamine units based on the 3rd Contain glycosylation sites of the EPO molecule.

Die Angabe "im wesentlichen" bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die gewünschten EPO-Moleküle in einem Anteil von vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt von mindestens 90% und am meisten bevorzugt von mindestens 95% bezogen auf die Gesamtzahl der EPO-Moleküle in der Zusammensetzung vorhanden sind.The term "essentially" means in this context that the desired EPO molecules in a proportion of preferably at least 80%, more preferably at least 90% and most preferably of at least 95% based on the total number of EPO molecules in the Composition are in place.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine EPO-Zusammensetzung, die aus glykosilierten EPO-Molekülen besteht, die einen mittleren Anteil von mindestens 75%, vorzugsweise von mindestens 80% und besonders bevorzugt von mindestens 85% tetraantennären Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydratketten enthalten.Yet another aspect of the invention relates to an EPO composition, which consists of glycosylated EPO molecules with an average proportion of at least 75%, preferably at least 80% and especially preferably of at least 85% tetra-antenna structures based on the Total number of carbohydrate chains included.

Außerdem betrifft die Erfindung eine EPO-Zusammensetzung, die aus glykosilierten EPO-Molekülen besteht, die eine mittlere Anzahl von mindestens 3,7, vorzugsweise von mindestens 4,0 und besonders bevorzugt von mindestens 4,5 N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf eine Glykosylierungsstelle des EPO-Moleküls bzw. eine Anzahl von mindestens 11,1, vorzugsweise von mindestens 12,0 und am meisten bevorzugt von mindestens 13,5 N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf die 3 Glykosilierungsstellen des EPO-Moleküls enthalten.The invention also relates to an EPO composition consisting of is made up of glycated EPO molecules that have an average number of at least 3.7, preferably at least 4.0 and especially preferably based on at least 4.5 N-acetyl-lactosamine units a glycosylation site of the EPO molecule or a number of at least 11.1, preferably at least 12.0, and most preferably based on at least 13.5 N-acetyl-lactosamine units which contain 3 glycosylation sites of the EPO molecule.

Die Höchstgrenze des Anteils an tetraantennären Strukturen kann bis zu 100% der gesamten Kohlenhydratketten reichen. Die Anzahl an N-Acetyl- Lactosamin-Einheiten pro Glykosilierungsstelle kann bis zu 6 (tetraantennäre Strukturen und 2 zusätzliche N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten) betragen oder - bei Strukturen mit mehr als 2 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten - sogar noch höher sein.The maximum limit on the proportion of tetra-antenna structures can be up to 100% of the total carbohydrate chains are enough. The number of N-acetyl Lactosamine units per glycosylation site can contain up to 6 (tetraantennary Structures and 2 additional N-acetyl-lactosamine units) or - for structures with more than 2 additional N-acetyl-lactosamine units - be even higher.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine EPO-Zusammensetzung, welche die Merkmale von mindestens zwei oder mehreren der zuvor genannten Aspekte aufweist.Another object of the invention is an EPO composition, which have the characteristics of at least two or more of the previously has mentioned aspects.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann aus einer oder mehreren Isoformen, d. h. EPO-Molekülen mit unterschiedlichen isoelektrischen Punkten bei der isoelektrischen Fokussierung, bestehen. Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein Gemisch aus mindestens 2, z. B. aus 2 bis 5 Isoformen, insbesondere ein Gemisch aus 3 oder 4 Isoformen.The composition according to the invention can consist of one or more Isoforms, d. H. EPO molecules with different isoelectric Points in isoelectric focusing. Preferably the composition of the invention comprises a mixture of at least 2, e.g. B. from 2 to 5 isoforms, in particular a mixture of 3 or 4 isoforms.

Die spezifische Aktivität der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist vorzugsweise mindestens 200 000 lU/mg in vivo (normozythämische Maus). Besonders bevorzugt ist die spezifische Aktivität im Bereich von etwa 200 000 bis 400 000 lU/mg Protein, am meisten bevorzugt im Bereich von 250 000 bis 400 000 lU/mg Protein.The specific activity of the composition according to the invention is preferably at least 200,000 IU / mg in vivo (normocytemic Mouse). Particularly preferred is the specific activity in the range of about 200,000 to 400,000 IU / mg protein, most preferably in the range from 250,000 to 400,000 IU / mg protein.

Der mittlere Sialinsäuregehalt pro Molekül EPO beträgt in der erfindungs­ gemäßen Zusammensetzung vorzugsweise 11 bis 14, besonders bevorzugt mindestens 11,5 und am meisten bevorzugt mindestens 12,5.The mean sialic acid content per molecule of EPO is in the fiction according to the composition preferably 11 to 14, particularly preferred at least 11.5 and most preferably at least 12.5.

Das Produkt aus der Anzahl der N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten pro Glykosilierungsstelle multipliziert mit dem mittleren Sialinsäuregehalt hat vorzugsweise einen Wert von mindestens 45, besonders bevorzugt von mindestens 50 und am meisten bevorzugt von mindestens 55. The product of the number of N-acetyl-lactosamine units per Glycosylation site multiplied by the mean sialic acid content preferably a value of at least 45, particularly preferably of at least 50, and most preferably at least 55.

Die erfindungsgemäße EPO-Zusammensetzung ist einerseits erhältlich aus EPO-Molekülen, die das Produkt einer Expression exogener DNA in Säugerzellen, z. B. in Nagetierzellen, wie etwa CHO- oder BHK-Zellen sind, wie sie in EP-B-0 205 564 beschrieben ist. Alternativ kann die Zusammen­ setzung auch aus EPO-Molekülen bestehen, welche das Produkt einer Expression endogener DNA nach Genaktivierung in humanen Zellen, z. B. in immortalisierten Zellinien wie etwa Namalwa (Nadkarni et al, Cancer 23 (1969), 64-79), HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033) oder HeLa S3 (Puck et al., J. Exp. Meth. 103 (1956), 273-284) sind. Derartige Verfahren sind in den europäischen Patentanmeldungen 97 112 640.4 und 97 112 649.5 beschrieben, deren Offenbarung zum Bestandteil der vorliegenden Anmeldung gemacht wird.The EPO composition according to the invention is obtainable on the one hand from EPO molecules that are the product of exogenous DNA expression in Mammalian cells, e.g. B. in rodent cells, such as CHO or BHK cells, as described in EP-B-0 205 564. Alternatively, the Together They also consist of EPO molecules, which are the product of a Expression of endogenous DNA after gene activation in human cells, e.g. B. in immortalized cell lines such as Namalwa (Nadkarni et al, Cancer 23 (1969), 64-79), HT1080 (Rasheed et al., Cancer 33 (1973), 1027-1033) or HeLa S3 (Puck et al., J. Exp. Meth. 103: 273-284 (1956)). Such procedures are in the European patent applications 97 112 640.4 and 97 112 649.5, the disclosure of which for Part of the present application is made.

Besonders bevorzugt wird eine EPO-Zusammensetzung verwendet, die durch Kultivierung von EPO-Produktionszellen in einem Kulturmedium mit geringem Serumgehalt, z. B. maximal 1% (v/v) oder insbesondere in einem serumfreien Kulturmedium hergestellt wurde (vgl. hierzu WO 96/35718). Beispiele für geeignete Kulturmedien sind RPMI 1640 oder DMEM.It is particularly preferred to use an EPO composition which by culturing EPO production cells in a culture medium with low serum content, e.g. B. a maximum of 1% (v / v) or in particular in one serum-free culture medium was produced (cf. in this regard WO 96/35718). Examples of suitable culture media are RPMI 1640 or DMEM.

Die erfindungsgemäße EPO-Zusammensetzung kann als pharmazeutisches Präparat gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Verdünnungs-, Hilfs- und Trägermitteln formuliert werden. Die erfindungs­ gemäße EPO-Zusammensetzung, die zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparats eingesetzt werden kann, hat eine Reinheit von vorzugsweise mindestens 99% und besonders bevorzugt von mindestens 99,9% bei Bestimmung durch Reverse Phase-HPLC (z. B. auf einer Vydac C4-Säule) und/oder Größenausschlußchromatographie (z. B. auf einen TSK 2000SW Ultrapac-Säule).The EPO composition according to the invention can be used as a pharmaceutical Preparation if necessary together with usual pharmaceutical Diluents, auxiliaries and carriers are formulated. The invention according to EPO composition used for the manufacture of a pharmaceutical Preparation can be used has a purity of preferably at least 99% and particularly preferably at least 99.9% Determination by reverse phase HPLC (e.g. on a Vydac C4 column) and / or size exclusion chromatography (e.g. on a TSK 2000SW Ultrapac column).

Außerdem weist die erfindungsgemäße Zusammensetzung einen DNA-Gehalt von vorzugsweise < 10 pg, besonders bevorzugt < 5 pg und am meisten bevorzugt < 1 pg DNA pro 10 000 lU Protein auf. Außerdem ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung vorzugsweise weitgehend frei von bakteriellen Verunreinigungen (< 1 CFU/ml) und Endotoxinen (< 1 EU/10 000 lU Protein).In addition, the composition according to the invention has a DNA content of preferably <10 pg, particularly preferably <5 pg and am most preferably <1 pg DNA per 10,000 IU protein. Also is the composition according to the invention preferably largely free of bacterial contamination (<1 CFU / ml) and endotoxins (<1 EU / 10,000 IU protein).

Die Bestimmung des DNA-Gehalts kann durch einen Hybridisierungstest mit radioaktiver oder fluoreszenzmarkierter DNA erfolgen. Als Sonden-DNA wird z. B. kommerziell erhältliche aufgereinigte Human-DNA verwendet. Die Human-DNA kann zudem als Standard für den Test eingesetzt werden. Die untere Nachweisgrenze eines solchen Hybridisierungstests beträgt etwa 0,3 pg/10 000 lU EPO. Der Keim- und Endotoxingehalt in der EPO-Präparation kann nach standardisierten Methoden bestimmt werden, wie sie in Pharm. Eu. oder USP beschrieben sind.The DNA content can be determined using a hybridization test radioactive or fluorescently labeled DNA. As probe DNA is used z. B. commercially available purified human DNA is used. The Human DNA can also be used as a standard for the test. The The lower detection limit of such a hybridization test is approximately 0.3 pg / 10,000 IU EPO. The germ and endotoxin content in the EPO preparation can be determined according to standardized methods like them in Pharm. Eu. or USP.

Eine EPO-Zusammensetzung in erfindungsgemäß erwünschten Merkmalen ist erhältlich durch mindestens eine der folgenden Maßnahmen:
An EPO composition with features desired according to the invention can be obtained by at least one of the following measures:

  • (a) Auswahl einer geeigneten Produktionszellinie, welche in der Lage ist, Kohlenhydratketten mit einem hohen Anteil tetraantennärer Struktu­ ren oder/und N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten zu erzeugen,(a) Selection of a suitable production cell line which is able to Carbohydrate chains with a high proportion of tetra-antenna structure to generate ren or / and N-acetyl-lactosamine units,
  • (b) Auswahl von geeigneten Kultivierungsbedingungen bei der Zellkultur, um Kohlenhydratketten mit einem hohen Anteil tetraantennärer Struktur oder/und N-Acetyl-Lactosamineinheiten zu erzeugen und(b) Selection of suitable cultivation conditions for cell culture, around carbohydrate chains with a high proportion of tetra-antennas To produce structure or / and N-acetyl-lactosamine units and
  • (c) Abtrennung unerwünschter Bestandteile aus einer bekannten Zusammensetzung von EPO-Molekülen unter Anreicherung von EPO-Molekülen, die Kohlenhydratketten mit einem hohen Anteil tetraan­ tennärer Strukturen oder/und N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten enthalten.(c) Separation of unwanted components from a known one Composition of EPO molecules with enrichment of EPO molecules, the carbohydrate chains with a high percentage of tetraan tennary structures and / or N-acetyl-lactosamine units contain.

Maßnahme (a) umfaßt die Auswahl einer geeigneten Produktionszelle. Einerseits kann man hier Zellen verwendet, von denen bekannt ist, daß sie eine Tendenz aufweisen, die gewünschten Kohlenhydratkettenstrukturen mit großer Ausbeute herzustellen. Beispiele für solche Zellinien sind vom Hamster abgeleitete Zellen wie CHO oder BHK und humane Zellinien wie HeLa, Namalwa, HT1080 oder davon abgeleitete Zellinien. Besonders bevorzugt sind HeLaS3-Zellen oder modifizierte CHO-Zellen.Measure (a) comprises the selection of a suitable production cell. On the one hand, one can use cells here that are known to be have a tendency to have the desired carbohydrate chain structures high yield. Examples of such cell lines are from Hamster derived cells like CHO or BHK and human cell lines like HeLa, Namalwa, HT1080 or cell lines derived therefrom. Especially HeLaS3 cells or modified CHO cells are preferred.

Andererseits können geeignete Produktionszellen auch gezielt erzeugt werden, indem bestimmte Glykosilierungsenzyme in der Zelle überexprimiert werden, z. B. durch rekombinante Expression oder/und durch endogene Genaktivierung. Beispiele solcher Glykosilierungsenzyme sind Sialyltrans­ ferasen und N-Acetyl-Lactosamintransferasen.On the other hand, suitable production cells can also be created in a targeted manner are overexpressed by certain glycosylation enzymes in the cell be e.g. B. by recombinant expression and / or by endogenous Gene activation. Examples of such glycosylation enzymes are sialyltrans ferases and N-acetyl-lactosamine transferases.

Maßnahme (b) umfaßt die Auswahl geeigneter Kultivierungsbedingungen bei der Zellkultur. Beispielsweise kann durch Zusatz von bestimmten zuckerhal­ tigen Nährmedien der Anteil an tetraantennären Kohlenhydratstrukturen oder/und N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten in den Kohlenhydratketten erhöht werden. Beispielsweise sind Nährmedien geeignet, die Galactose oder/und Mannose enthalten.Measure (b) comprises the selection of suitable cultivation conditions the cell culture. For example, by adding certain sugary nutrient media, the proportion of tetra-antennary carbohydrate structures or / and increased N-acetyl-lactosamine units in the carbohydrate chains become. For example, nutrient media are suitable that contain galactose and / or Contain mannose.

Maßnahme (c) umfaßt die Abtrennung unerwünschter Bestandteile aus einer bekannten EPO-Zusammensetzung, die in ihrer Kohlenhydratstruktur die Spezifikationen der vorliegenden Anmeldung nicht erfüllt. Dies kann beispielsweise erfolgen durch chromatographische Aufreinigung der EPO-Präparationen, z. B. durch Affinitätschromatographie an Triazinfarbstoff- Gelen, vorzugsweise Cibacron Blue-Farbstoffgelen. Eine weitere Abtrennung unerwünschter Bestandteile kann auch mit hydrophober Interaktions­ chromatographie und Reversed Phase Chromatographie durchgeführt werden. Dafür geeignete Liganden sind Butyl-, Octyl- und Phenyl-Reste. Mit Kapillarzonenelektrophorese-Analytik (CZE) können geeignete Fraktionen ermittelt, gepoolt und schließlich weiterverarbeitet werden. Außerdem kann unter Verwendung von Lectinen aus Tomaten oder Kartoffeln (Merkle, Cummings, J. Biol. Chem. 262 (1987), 8179-8189) eine direkte Anreiche­ rung von EPO-Molekülen mit einem hohen Anteil an N-Acetyl-Lactosamin- Einheiten erfolgen. Bevorzugt werden solche Lectine in imrnobilisierter Form eingesetzt.Measure (c) comprises the separation of undesired constituents from a well-known EPO composition, which in its carbohydrate structure the Specifications of the present application not met. This can for example done by chromatographic purification of the EPO preparations, e.g. B. by affinity chromatography on triazine dye Gels, preferably Cibacron Blue dye gels. Another separation unwanted constituents can also interact with hydrophobic chromatography and reversed phase chromatography performed become. Suitable ligands for this are butyl, octyl and phenyl radicals. With Capillary zone electrophoresis analysis (CZE) can use suitable fractions determined, pooled and finally processed further. Also can using lectins from tomatoes or potatoes (Merkle, Cummings, J. Biol. Chem. 262: 8179-8189 (1987)) a direct range tion of EPO molecules with a high proportion of N-acetyl-lactosamine Units are made. Such lectins are preferred in immobilized form used.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der spezifischen Aktivität einer EPO-Zusammensetzung, wobei man EPO-Moleküle mit einem hohen Anteil an tetraantennären Kohlenhydratstrukturen oder/und N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten in der Zusammensetzung anrei­ chert. Diese Anreicherung kann durch eine oder mehrere der oben genannten Maßnahmen (a), (b) und (c) erfolgen.Another object of the invention is a method for increasing the specific activity of an EPO composition, where one EPO molecules with a high proportion of tetra-antenna carbohydrate structures or / and N-acetyl-lactosamine units in the composition chert. This enrichment can be through one or more of the above measures mentioned (a), (b) and (c) are carried out.

Weiterhin wird die vorliegende Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.The present invention is further illustrated by the following examples explained.

Beispiel 1example 1 Aufreinigung von EPO aus Kulturüberständen von ZellinienPurification of EPO from culture supernatants of cell lines

Im wesentlichen wurden zur Aufreinigung von EPO aus Zellkulturüber­ ständen von humanen Zellen oder CHO-Zellen zwei Methoden verwendet, die sich in Anzahl und Prinzip der Chromatographieschritte unterschieden und abhängig von der Zusammensetzung des Mediums und der EPO-Konzentration eingesetzt wurden:
Essentially, two methods were used to purify EPO from cell culture supernatants of human cells or CHO cells, which differ in the number and principle of the chromatography steps and were used depending on the composition of the medium and the EPO concentration:

  • Methode 1:Method 1:
  • 1. Schritt: Blue-Sepharose-SäuIe1st step: Blue Sepharose column
  • 2. Schritt: Butyl-Sepharose-Säule2nd step: Butyl-Sepharose column
  • 3. Schritt: Hydroxyapatit-Säule3rd step: hydroxyapatite column
  • 4. Schritt: Aufkonzentrierung.
    Methode 2:    4th step: concentration.
    Method 2:
  • 1. Schritt: Blue-Sepharose-Säule1st step: Blue Sepharose column
  • 2. Schritt: Hydroxyapatit-Säule2nd step: hydroxyapatite column
  • 3. Schritt: Aufkonzentrierung (alternativer 3. Schritt: RP-HPLC).3rd step: concentration (alternative 3rd step: RP-HPLC).

Beispiel für eine Aufreinigung eines Hela S3-Zellkulturüberstandes mit 2% (v/v) fötalem Kälberserum (FKS) nach Methode 1:Example of a purification of a Hela S3 cell culture supernatant with 2% (v / v) fetal calf serum (FCS) according to method 1:

1. Blue Sepharose-Säule1. Blue Sepharose column

Eine 5 ml Hi-Trap-Blue-Säule (Blue-Sepharose-Fertigsäule von Pharmacia) wurde mit mindestens 5 Säulenvolumina (SV) Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH, 7,0; 5 mM CaCl2; 100 mM NaCl) äquilibriert. Anschließend wurden 70 ml Hela-Zellüberstand (ca. 245 µg EPO und 70-100 mg Gesamtprotein enthaltend) über Nacht bei einem Fluß von 0,5 ml/min im Kreislaufverfahren aufgezogen.A 5 ml Hi-Trap-Blue column (Blue-Sepharose ready-made column from Pharmacia) was filled with at least 5 column volumes (SV) of buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2 ; 100 mM NaCl ) equilibrated. Then 70 ml of Hela cell supernatant (containing approx. 245 μg EPO and 70-100 mg total protein) were drawn up overnight at a flow rate of 0.5 ml / min in the circulatory process.

Die Säule wurde mit mindestens 5 SV Puffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2; 250 mM NaCl) und mindestens 5 SV Puffer C (20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 0,2 mM CaCl2, 250 mM NaCl) bei 0,5 ml/min gewaschen. Der Wascherfolg wurde über die Messung des Proteingehalts bei OD280 verfolgt.The column was filled with at least 5 SV buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2 ; 250 mM NaCl) and at least 5 SV buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0, 2 mM CaCl 2 , 250 mM NaCl) at 0.5 ml / min. The washing success was followed by measuring the protein content at OD280.

Die Elution von EPO erfolgte mit Puffer D (100 mM Tris-HCl, pH 7,0; 0,2 mM CaCl2; 2 M NaCl) bei einem Fluß von 0,5 ml/min. Die Elutionslösung wurde in 1-2 ml Fraktionen gesammelt.EPO was eluted with buffer D (100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl 2 ; 2 M NaCl) at a flow rate of 0.5 ml / min. The elution solution was collected in 1-2 ml fractions.

Der EPO-Gehalt der Fraktionen, der Waschlösungen und des Durchlaufs wurden über Reverse-Phase (RP)-HPLC durch Auftrag eines Aliquots auf eine POROS R2/H-Säule (Boehringer Mannheim) bestimmt. Alternativ wurde zur qualitativen Identifizierung EPO-haltiger Fraktionen ein immunologischer Dotblot durchgeführt.The EPO content of the fractions, wash solutions and run-through were based on reverse phase (RP) HPLC by applying an aliquot a POROS R2 / H column (Boehringer Mannheim) is determined. Alternatively it was an immunological one for the qualitative identification of EPO-containing fractions Dot blot performed.

EPO-haltige Fraktionen (8-12 ml) wurden gepoolt und auf eine Butyl- Sepharose-Säule aufgetragen. EPO-containing fractions (8-12 ml) were pooled and transferred to a butyl Sepharose column applied.

Die Ausbeute nach der Blue-Sepharose-Säule betrug ca. 175 µg EPO (entspricht ca. 70%). Im Allgemeinen betrug die Ausbeute nach Blue- Sepharose zwischen 50-75%.The yield after the Blue Sepharose column was approx. 175 μg EPO (corresponds to approx. 70%). In general, the yield according to Blue- Sepharose between 50-75%.

2. Butyl-Sepharose-Säule (Hydrophobe-lnteraktions-Chromatographie)2. Butyl-Sepharose column (hydrophobic interaction chromatography)

Eine selbsthergestellte 2-3 ml Butyl-Sepharose-Säule (Material: Toyopearl Butyl S650) wurde mit mindestens 5 SV Puffer D (100 mM Tris-HCl, pH 7,0; 0,2 mM CaCl2; 2 M NaCl) äquilibriert und anschließend der EPO-haltige Blue-Sepharose-Pool aus 1. (ca. 1 50 µg EPO) bei einem Fluß von 0,5 ml/min aufgezogen.A 2-3 ml butyl-Sepharose column (material: Toyopearl Butyl S650) that had been produced by the company was equilibrated with at least 5 SV of buffer D (100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 0.2 mM CaCl 2 ; 2 M NaCl) and then the EPO-containing Blue Sepharose pool from 1. (approx. 1 50 µg EPO) was drawn up at a flow rate of 0.5 ml / min.

Die Säule wurde mit mindestens 5 SV Puffer E (20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 2 M NaCl und 10% Isopropanol) bei 0,5 ml/min gewaschen. Der Wascherfolg wurde über die Messung des Proteingehalts bei OD280 verfolgt.The column was filled with at least 5 SV of buffer E (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl and 10% isopropanol) at 0.5 ml / min. The washing success was followed by measuring the protein content at OD280.

Die Elution von EPO erfolgte mit Puffer F (20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 2 M NaCl und 20% Isopropanol) bei einem Fluß von 0,5 ml/min. Die Elutions­ lösung wurde in 1-2 ml Fraktionen gesammelt.EPO was eluted with buffer F (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl and 20% isopropanol) at a flow rate of 0.5 ml / min. The elutions solution was collected in 1-2 ml fractions.

Der EPO-Gehalt der Fraktionen, der Waschlösungen und des Durchlaufs wurden über RP-HPLC durch Auftrag eines Aliquots auf eine POROS R2/H- Säule bestimmt. Alternativ wurde zur qualitativen Identifizierung EPO-haltiger Fraktionen ein immunologischer Dotblot durchgeführt.The EPO content of the fractions, wash solutions and run-through were via RP-HPLC by applying an aliquot to a POROS R2 / H- Pillar determined. Alternatively, it was used for qualitative identification An immunological dot blot is carried out on EPO-containing fractions.

EPO-haltige Fraktionen (10-15 ml) wurden gepoolt und auf eine Hydroxy­ apatit-Säule aufgetragen.EPO-containing fractions (10-15 ml) were pooled and on a hydroxy apatit column applied.

Die Ausbeute der Butyl-Sepharose-Säule betrug ca. 130 µg EPO (entspricht ca. 85%). Im Allgemeinen betrug die Ausbeute der Butyl-Sepharose zwischen 60-85% vom Auftrag der Blue-Sepharose-Pools. The yield of the butyl Sepharose column was approx. 130 µg EPO (corresponds to approx. 85%). In general the yield of the butyl sepharose was between 60-85% of the order of the Blue Sepharose pools.

3. Hydroxyapatit-Säule3. Hydroxyapatite column

Eine 5 ml Hydroxyapatit-Säule (Econo-Pac CHT II-Fertigsäule von BioRAD) wurde mit mindestens 5 SV Puffer F (20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 2 M NaCl; 20% Isopropanol) äquilibriert und anschließend der EPO-haltige Butyl- Sepharose-Pool aus 2. (ca. 125 µg EPO) bei einem Fluß von 0,5 ml/min aufgezogen.A 5 ml hydroxyapatite column (Econo-Pac CHT II ready-made column from BioRAD) was with at least 5 SV buffer F (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl; 20% isopropanol) and then the EPO-containing butyl Sepharose pool from 2. (approx. 125 µg EPO) at a flow rate of 0.5 ml / min raised.

Die Säule wurde mit mindestens 5 SV Puffer G (20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 2 M NaCl) bei 0,5 ml/min gewaschen. Der Wascherfolg wurde über die Messung des Proteingehalts bei OD280 verfolgt.The column was filled with at least 5 SV of buffer G (20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 2 M NaCl) at 0.5 ml / min. The washing success was about that Measurement of protein content followed at OD280.

Die Elution von EPO erfolgte mit Puffer H (10 mM Na-Phosphat, pH 7,0; 80 mM NaCI) bei einem Fluß von 0,5 ml/min. Die Elutionslösung wurde in 1-2 ml Fraktionen gesammelt.EPO was eluted with buffer H (10 mM Na phosphate, pH 7.0; 80 mM NaCl) at a flow rate of 0.5 ml / min. The elution solution was in 1-2 ml fractions collected.

Der EPO-Gehalt der Fraktionen, der Waschlösungen und des Durchlaufs wurden über RP-HPLC durch Auftrag eines Aliquots auf eine POROS R2/H-Säule bestimmt.The EPO content of the fractions, wash solutions and run-through were via RP-HPLC by applying an aliquot to a POROS R2 / H column certainly.

EPO-haltige Fraktionen (3-6 ml) wurden gepoolt. Die Ausbeute der Hydroxyapatit-Säule betrug ca. 80 µg EPO (entspricht ca. 60%). Im Allgemeinen betrug die Ausbeute der Hydroxyapatit-Säule zwischen 50-65% vom Auftrag der Butyl-Sepharose-Pools.EPO-containing fractions (3-6 ml) were pooled. The yield of the The hydroxyapatite column contained approx. 80 µg EPO (corresponds to approx. 60%). in the In general, the yield from the hydroxyapatite column was between 50-65% of the order of the Butyl-Sepharose-Pools.

4. Aufkonzentrierung4. Concentration

Die gepoolten EPO-Fraktionen aus dem Hydroxyapatit-Schritt wurden in Zentrifugationseinheiten mit einer Ausschlußgröße von 10 kD (z. B. Microsep von Filtron) auf eine Konzentration von 0,1-0,5 mg/ml aufkonzentriert, mit 0,01% Tween 20 versetzt und in Aliquots bei -20°C gelagert. The pooled EPO fractions from the hydroxyapatite step were in Centrifugation units with an exclusion size of 10 kD (e.g. Microsep von Filtron) concentrated to a concentration of 0.1-0.5 mg / ml, with 0.01% Tween 20 added and stored in aliquots at -20 ° C.

Ausbeuteschema Yield scheme

Die Reinheit des isolierten EPO war etwa < 90%, in der Regel sogar <95%.The purity of the isolated EPO was about <90%, as a rule even <95%.

Zur Erhöhung der EPO-Ausbeute wurde auch die Methode 2 verwendet, bei der der Butyl-Sepharose-Schritt fehlte. Vor allem bei Zellkulturüberständen ohne oder mit 1% (v/v) FKS-Zusatz ist diese Methode anwendbar und liefert isoliertes EPO von ungefähr gleicher Reinheit (90-95%). Die Anwesenheit von 5 mM CaCl2 im Äquilibrierungspuffer (Puffer F) für die Hydroxyapatit- Säule führte bei dieser Methode zu einer verbesserten Bindung und damit auch zu einem reproduzierbaren Elutionsverhalten von EPO beim Hydroxy­ apatit-Schritt. Deshalb wurde bei Methode 2 bei prinzipiell gleichem Ablauf wie Methode 1 mit folgenden Puffern durchgeführt:Method 2, in which the butyl-Sepharose step was absent, was also used to increase the EPO yield. This method can be used especially for cell culture supernatants with or without 1% (v / v) FCS addition and provides isolated EPO of approximately the same purity (90-95%). The presence of 5 mM CaCl 2 in the equilibration buffer (buffer F) for the hydroxyapatite column led in this method to an improved binding and thus also to a reproducible elution behavior of EPO in the hydroxyapatite step. Therefore, with method 2, basically the same procedure as method 1 was carried out with the following buffers:

1. Blue-Sepharose-Säule1. Blue Sepharose column

Äquilibrierpuffer (Puffer A): 20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 Equilibration buffer (buffer A): 20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2

; 100 mM NaCl
Waschpuffer 1 (Puffer B): 20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 100 mM NaCl
Wash buffer 1 (buffer B): 20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2

; 250 mM NaCl
Waschpuffer 2 (Puffer C): 20 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 250 mM NaCl
Wash Buffer 2 (Buffer C): 20 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2

, 250 mM NaCl
Elutionspuffer (Puffer D): 100 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 , 250 mM NaCl
Elution buffer (buffer D): 100 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2

; 2 M NaCl; 2 M NaCl

2. Hydroxyapatit-Säule2. Hydroxyapatite column

Äquilibrierpuffer (Puffer F): 50 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 Equilibration buffer (buffer F): 50 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2

; 1 M NaCl
Waschpuffer (Puffer G): 10 mM Tris-HCl, pH 7,0; 5 mM CaCl2 ; 1 M NaCl
Wash Buffer (Buffer G): 10 mM Tris-HCl, pH 7.0; 5 mM CaCl 2

; 80 mM NaCl
Elutionspuffer (Puffer H): 10 mM Na-Phosphat, pH 7,0; 0,5 mM CaCl2 ; 80 mM NaCl
Elution buffer (buffer H): 10 mM Na phosphate, pH 7.0; 0.5 mM CaCl 2

; 80 mM NaCl; 80 mM NaCl

Ausbeuteschema Yield scheme

Der Zusatz von 5 mM KCI in die Puffer B und G bei Methode 1 führte ebenfalls zu einer besseren Bindung und definierteren Elution von der Hyd roxyapatit-Säule.The addition of 5 mM KCI to buffers B and G in method 1 resulted also leads to better binding and more defined elution from the Hydroxyapatite column.

Alternativ bzw. zusätzlich können für die Aufreinigung von EPO noch folgende Schritte verwendet werden:
Alternatively or additionally, the following steps can be used for the purification of EPO:

  • - RP-HPLC z. B. mit Vydac C4-Material- RP-HPLC e.g. B. with Vydac C4 material
  • - DEAE-Sepharose ff Chromatographie- DEAE-Sepharose ff chromatography
  • - Diafiltration- diafiltration
Beispiel 2Example 2 Bestimmung der spezifischen Aktivität in vivo von EPO (Bioassay an der normozythämischen Maus)Determination of the specific activity in vivo of EPO (Bioassay on the normocythemic mouse)

Die dosisabhängige Aktivität von EPO auf die Vermehrung und Differenzie­ rung von Erythrozyten-Vorläuferzellen wurde in vivo in Mäusen über den Anstieg der Reticulocyten im Blut nach EPO-Gabe bestimmt.The dose-dependent activity of EPO on multiplication and differentiation Erythrocyte progenitor cells were transformed in vivo in mice via the Increase in reticulocytes in the blood determined after administration of EPO.

Hierzu wurde jeweils acht Mäusen verschiedene Dosen der zu analysieren­ den EPO-Probe und eines EPO-Standards (abgeglichen gegen den EPO-WHO-Standard) parenteral verabreicht. Die Mäuse wurden anschließend unter konstanten definierten Bedingungen gehalten. 4 Tage nach EPO-Gabe wurde den Mäusen Blut entnommen und die Reticulocyten mit Acridin­ orange angefärbt. Die Bestimmung der Reticulocytenzahl pro 30 000 Erythrocyten erfolgte mikrofluorimetrisch im Durchflußcytometer durch Analyse des Rotfluoreszenz-Histogramms.For this purpose, eight mice were analyzed at different doses the EPO sample and an EPO standard (compared against the EPO WHO standard) administered parenterally. The mice were subsequently kept under constant defined conditions. 4 days after administration of EPO the mice were bled and the reticulocytes with acridine stained orange. Determination of the number of reticulocytes per 30,000 Erythrocytes were carried out microfluorimetrically in a flow cytometer Analysis of the red fluorescence histogram.

Die Berechnung der biologischen Aktivität erfolgte aus den Werten für die Reticulocytenzahlen der Probe und des Standards bei unterschiedlichen Dosen nach dem von Linder beschriebenen Verfahren der paarweisen Gehaltsbestimmung mit parallelen Geraden (Linder, Planen und Auswerten von Versuchen, 3. Auflage, 1969, Birkenhäuser Verlag, Basel).The biological activity was calculated from the values for the Reticulocyte counts of the sample and the standard with different Doses according to the paired method described by Linder Determination of salary with parallel straight lines (Linder, planning and evaluation von attempts, 3rd edition, 1969, Birkenhäuser Verlag, Basel).

Bei der Aufreinigung von EPO aus Kulturüberständen von in serumfreiem Medium kultivierten CHO-Zellen wurde ein EPO-Präparat erhalten, welches eine biologische Aktivität von 203 000 lU/mg hatte. In vier Ansätzen, bei denen EPO aus Kulturüberständen von humanen Zellen aufgereinigt wurde, erhieIt man Produkte mit spezifischen Aktivitäten von 220 000 (Präparat 1), 198 000 (Präparat 2), 204 000 (Präparat 3) bzw. 100 000 lU/mg (Präparat 4). When purifying EPO from culture supernatants from in serum-free Medium-cultured CHO cells, an EPO preparation was obtained which had a biological activity of 203,000 IU / mg. In four approaches, at which EPO was purified from culture supernatants of human cells, you get products with specific activities of 220,000 (preparation 1), 198,000 (preparation 2), 204,000 (preparation 3) or 100,000 IU / mg (preparation 4).

Beispiel 3Example 3 Bestimmung des Gehalts an SialinsäurerestenDetermination of the content of sialic acid residues

Die Bestimmung des Sialinsäuregehaltes erfolgte chromatographisch über HPAEC-PAD (High pH Anion Exchange Chromatography mit Pulsed Amperometric Detection) auf einem Dionex System nach enzymatischer Abspaltung der Sialinsäuren mit Neuraminidase aus Arthrobacter ureafaciens (A. ureaf., Boehringer Mannheim).The sialic acid content was determined by chromatography HPAEC-PAD (High pH Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) on a Dionex system according to enzymatic Splitting off of the sialic acids with neuraminidase from Arthrobacter ureafaciens (A. ureaf., Boehringer Mannheim).

Ansätze mit je 22 µg EPO aus verschiedenen Präparationen aus CHO- und humanen Zellinien (z. B. HeLa S3) wurden auf eine EPO-Konzentration von 0,2 mg/ml in 5 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7f 2 eingestellt. Je eine Hälfte jedes Ansatzes wurde für die genaue Bestimmung der EPO Menge über RP-HPLC verwendet. Zur 2. Hälfte der Ansätze wurde je 5 mM U Neuramini­ dase von A. ureaf. gegeben und über Nacht (ca. 18 h) bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Verdauansätze halbiert, 20-fach auf 500 µl mit H2O verdünnt und 50 µl davon (entspricht ca. 27 pmol EPO) auf das Dionex System aufgetragen. Hierzu wurden folgende Chromatographie-Parameter verwendet:
Säule: CarboPac PA 100
Fluß: 1,0 ml/min
Detektorempfindlichkeit: 300 nA
Gradient:
Mixtures with 22 µg EPO each from different preparations from CHO and human cell lines (e.g. HeLa S3) were adjusted to an EPO concentration of 0.2 mg / ml in 5 mM Na phosphate buffer, pH 7f 2. Half of each batch was used for the exact determination of the amount of EPO via RP-HPLC. For the second half of the batches, 5 mM U Neuramini dase from A. ureaf. and incubated at 37 ° C. overnight (approx. 18 h). The digestion batches were then halved, diluted 20 times to 500 μl with H 2 O and 50 μl of this (corresponds to approx. 27 pmol EPO) applied to the Dionex system. The following chromatography parameters were used for this:
Column: CarboPac PA 100
Flow: 1.0 ml / min
Detector sensitivity: 300 nA
Gradient:

t (min)t (min) % Puffer B% Buffer B 00 1717th 77th 1717th 99 100100 1212th 100100 1313th 00 2020th 00

Puffer A: 0,1 M NaOH
Puffer B: 0,1 M NaOH; 0,5 M Na-Acetat. Buffer A: 0.1 M NaOH
Buffer B: 0.1 M NaOH; 0.5 M Na acetate.

Die Menge an Sialinsäuren in der aufgetragenen Probe wurde mit Hilfe einer Eichgerade, die aus Werten eines mitgeführten Sialinsäurestandards (Boehringer Mannheim) erhalten wurde, ermittelt. Der Sialinsäuregehalt (mol Sialinsäure/mol EPO) wurde aus dem Ergebnis der Sialinsäurebestimmung (Dionex System) und der Bestimmung der eingesetzten EPO-Menge über RP- HPLC berechnet.The amount of sialic acids in the applied sample was measured using a Calibration line derived from values of a sialic acid standard carried along (Boehringer Mannheim) was obtained. The sialic acid content (mol Sialic acid / mol EPO) was obtained from the result of the sialic acid determination (Dionex System) and the determination of the amount of EPO used via RP- HPLC calculated.

Das EPO aus CHO-Zellen hatte einen mittleren Gehalt von 11,3 mol Sialinsäure pro mol EPO. Die aus humanen Zellen stammenden EPO- Präparationen hatten einen Anteil von 13,1 mol (Präparat 1), 13,2 mol (Präparate 2 und 3) bzw. 11,5 mol (Präparat 4) Sialinsäure pro mol EPO.The EPO from CHO cells had an average content of 11.3 mol Sialic acid per mole of EPO. The EPO originating from human cells Preparations had a proportion of 13.1 mol (preparation 1), 13.2 mol (Preparations 2 and 3) or 11.5 mol (Preparation 4) of sialic acid per mol of EPO.

Beispiel 4Example 4 Bestimmung des Anteils an tetraantennären StrukturenDetermination of the proportion of tetra-antenna structures

Die Analytik der N-gebundenen Kohlenhydratstrukturen erfolgte chromato­ graphisch über HPAEC-PAD auf einem Dionex System. Die asialo Oligosa­ ccharide von EPO-Präparationen aus CHO- und humanen Zellinien (z. B. HeLa S3) wurden durch enzymatische Abspaltung mit N-Glycosidase F (Boehrin­ ger Mannheim) und Neuraminidase aus A.ureaf. (Boehringer Mannheim) gewonnen.The N-bonded carbohydrate structures were analyzed using chromatography graphically via HPAEC-PAD on a Dionex system. The asialo oligosa ccharides from EPO preparations from CHO and human cell lines (e.g. HeLa S3) were obtained by enzymatic cleavage with N-glycosidase F (Boehrin ger Mannheim) and neuraminidase from A.ureaf. (Boehringer Mannheim) won.

Ca. 30 µg EPO je Ansatz wurden mittels MicroCon-Ultrazentrifugationsein­ heiten (Amicon, Ausschlußgröße 10 kD) entsalzt und mit 10 mM Na- Phosphat-Puffer, pH 7,2 auf eine Konzentration von 0,2 bis 0,3 mg/ml eingestellt. Anschließend wurde jeder Ansatz mit 1 U N-Glycosidase F und 10 mU Neuraminidase versetzt und über Nacht (ca 18 h) bei 37 °C inkubiert. Zur Abtrennung des EPO-Polypeptidanteils von den abgespaItenen Oligosacchariden wurden die Ansätze nach der Inkubation durch Ultrafree- Zentrifugationseinheiten (Millipore, Ausschlußgröße 10 kD) zentrifugiert und das Ultrafree-Device zweimal mit 20 µl H2O nachgewaschen. Die im Durchlauf enthaltenen Oligosaccharide wurden mit H2O auf 150 µl aufgefüllt und 100 µl davon auf dem Dionex System analysiert. Hierzu wurden folgende Chromatographie-Parameter verwendet:
Säule: CarboPac PA 100
Fluß: 1,0 ml/min
Detektorempfindlichkeit: 300 nA
Gradient:
About 30 µg EPO per batch were desalinated using MicroCon ultracentrifugation units (Amicon, exclusion size 10 kD) and adjusted to a concentration of 0.2 to 0.3 mg / ml with 10 mM Na phosphate buffer, pH 7.2 . Then 1 U N-glycosidase F and 10 mU neuraminidase were added to each batch and incubated at 37 ° C. overnight (approx. 18 h). To separate the EPO polypeptide fraction from the separated oligosaccharides, the batches were centrifuged after incubation by Ultrafree centrifugation units (Millipore, exclusion size 10 kD) and the Ultrafree device was washed twice with 20 μl H 2 O. The oligosaccharides contained in the run were made up to 150 µl with H 2 O and 100 µl of them were analyzed on the Dionex system. The following chromatography parameters were used for this:
Column: CarboPac PA 100
Flow: 1.0 ml / min
Detector sensitivity: 300 nA
Gradient:

t (min)t (min) % Puffer B% Buffer B 00 00 22 00 6060 1010 6262 100100 6767 100100 6969 00 8080 00

Puffer A: 0,1 M NaOH
Puffer B: 0,1 M NaOH; 0,5 M Na-Acetat.Buffer A: 0.1 M NaOH
Buffer B: 0.1 M NaOH; 0.5 M Na acetate.

Die Identifikation der Peaks in einem Chromatogramm von N-Zuckern des komplexen Typs erfolgte durch Standard-Oligosaccharide (Glyco Systems) und wurde durch den enzymatischen Verdau der Oligosaccharide von EPO mit dem Enzym Endo-β-Galactosidase bzw. Fucosidase und anschließender Analytik auf dem Dionex System verifiziert. Die Berechnung der prozentua­ len Anteile an bi-, tri- und tetraantennären Strukturen erfolgte über die Flächen der Peaks, die die entsprechenden N-Zuckerstruktur repräsentieren, bezogen auf die Gesamtpeakfläche (Summe der Peakflächen von bi-, tri- und tetraantennären Strukturen).The identification of the peaks in a chromatogram of N-sugars des complex type was made by standard oligosaccharides (Glyco Systems) and was made by the enzymatic digestion of the oligosaccharides of EPO with the enzyme endo-β-galactosidase or fucosidase and then Analytics verified on the Dionex system. Calculating the percentua len shares of bi-, tri- and tetra-antennary structures took place via the Areas of the peaks that represent the corresponding N-sugar structure, based on the total peak area (sum of the peak areas of bi-, tri- and tetra-antenna structures).

Das aus CHO-Zellen stammende EPO hatte einen Anteil von 4,8% biantennären Kohlenhydratstrukturen, 17,3% triantennären Kohlenhydrat­ strukturen und 77,9% tetraantennären Kohlenhydratstrukuren. Bei den Präparationen von EPO aus humanen Zellinien wurden Anteile an biantennä­ ren/triantennären/tetraantennären Strukturen für Präparat 1 von 5,8/8,8/85,4%, für Präparat 2 von 5,1/12,7/82,2%, für Präparat 3 von 4,1/17,7/78,2% und für Präparat 4 9,6/24,8/65,6% erhalten.The EPO derived from CHO cells had a share of 4.8% biantennary carbohydrate structures, 17.3% triantennary carbohydrate structures and 77.9% tetra-antennary carbohydrate structures. Both Preparations of EPO from human cell lines were parts of biantennä ren / triantennary / tetra-antenna structures for preparation 1 of 5.8 / 8.8 / 85.4%, for preparation 2 of 5.1 / 12.7 / 82.2%, for preparation 3 of 4.1 / 17.7 / 78.2% and for preparation 4 9.6 / 24.8 / 65.6%.

Beispiel 5Example 5 Bestimmung des Anteils an N-Acetyl-Lactosamin-EinheitenDetermination of the proportion of N-acetyl-lactosamine units

Die Anteile an N-gebundenen Kohlenhydratstrukturen von EPO mit zusätzlichen N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten wurden aus den Chromatogra­ phie-Ergebnissen der Experimente von Beispiel 4 berechnet. Die Berechnung der prozentualen Anteile N-gebundener Kohlenhydratstrukturen von EPO mit zusätzlichen N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten erfolgte über die Summe der Flächen der entsprechenden Peaks und der Gesamtfläche aller N-Zucker repräsentierender Peaks.The proportions of N-linked carbohydrate structures of EPO with additional N-acetyl-lactosamine units were obtained from the chromatography phie results of the experiments of Example 4 calculated. The calculation the percentage of N-bonded carbohydrate structures of EPO with additional N-acetyl-lactosamine units took place via the sum of the Areas of the corresponding peaks and the total area of all N-sugars representative peaks.

Bei EPO aus CHO-Zellen wurde eine Anzahl von 4,56 N-Acetyl-Lactosamin- Disaccharideinheiten pro Glykosilierungsstelle gefunden. Bei den EPO- Präparationen aus humanen Zellen wurde eine Anzahl an N-Acetyl-Lactosa­ min-Disaccharideinheiten von 4,0 (Präparat 1), 3,98 (Präparat 2), 3,89 (Präparat 3) bzw. 3,5 (Präparat 4) gefunden.In EPO from CHO cells, a number of 4.56 N-acetyl-lactosamine Disaccharide units found per glycosylation site. At the EPO Preparations from human cells were made from a number of N-acetyl-lactosa min disaccharide units of 4.0 (preparation 1), 3.98 (preparation 2), 3.89 (Preparation 3) and 3.5 (preparation 4) found.

Die Berechnung der Anzahl (n) von N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten pro Glykosilierungsstelle war wie folgt.
n = Σ % (bi)x2 + % (tri) x3 + % (tetra) x4 + % (tri+1r)x4 + % (tetra+1r) x5 + % (tri+2r)x5 +% (tetra+2r)x6
wobei % (bi) = prozentualer Anteil biantennärer Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydrat­ ketten
% (tri) = prozentualer Anteil triantennärer Strukturen ohne zusätzliche N-Acetyl-Lactosamin-Einheit
% (tetra) = prozentualer Anteil tetraantennärer Strukturen ohne zusätzliche N-Acetyl-Lactosamin-Einheit
% (tri+1r) = prozentualer Anteil triantennärer Struktu­ ren mit 1 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa­ min-Einheit
% (tetra+1r) = prozentualer Anteil tetraantennärer Struk­ turen mit 1 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa­ min-Einheit
% (tri+2r) = prozentualer Anteil triantennärer Struktu­ ren mit 2 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa­ min-Einheiten
% (tetra+2r) = prozentualerAnteil tetraantennäerer Struk­ turen mit 2 zusätzlichen N-Acetyl-Lactosa­ min-Einheiten.The calculation of the number (n) of N-acetyl-lactosamine units per glycosylation site was as follows.
n = Σ% (bi) x2 +% (tri) x3 +% (tetra) x4 +% (tri + 1r) x4 +% (tetra + 1r) x5 +% (tri + 2r) x5 +% (tetra + 2r ) x6
where% (bi) = percentage of biantennary structures based on the total number of carbohydrate chains
% (tri) = percentage of triantennary structures without an additional N-acetyl-lactosamine unit
% (tetra) = percentage of tetra-antenna structures without an additional N-acetyl-lactosamine unit
% (tri + 1r) = percentage of triantennary structures with 1 additional N-acetyl-lactosa min unit
% (tetra + 1r) = percentage of tetra-antenna structures with 1 additional N-acetyl-lactosa min-unit
% (tri + 2r) = percentage of triantennary structures with 2 additional N-acetyl-lactosa min units
% (tetra + 2r) = percentage of tetraanthic structures with 2 additional N-acetyl-lactosa min units.

Das Produkt aus Anzahl der N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten pro Glykosilie­ rungsstelle multipliziert mit dem jeweiligen Sialinsäuregehalt ergab bei EPO aus CHO-Zellen einen Wert von 53,7. Bei den 4 EPO-Präparaten aus humanen Zellen waren die entsprechenden Werte 58,9 (Präparat 1), 52,5 (Präparat 2), 51,3 (Präparat 3) und 40,4 (Präparat 4).The product of the number of N-acetyl-lactosamine units per glycosyl point multiplied by the respective sialic acid content resulted in EPO from CHO cells a value of 53.7. With the 4 EPO preparations from human cells the corresponding values were 58.9 (preparation 1), 52.5 (Preparation 2), 51.3 (Preparation 3) and 40.4 (Preparation 4).

Claims (20)

1. EPO-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus glykosilierten EPO-Molekülen besteht, die einen Anteil von mindestens 75% tetraantennären Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydratketten enthalten.1. EPO composition, characterized in that it consists essentially of glycosylated EPO molecules which contain a proportion of at least 75% tetra-antenna structures based on the total number of carbohydrate chains. 2. EPO-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus glykosylierten EPO-Molekülen besteht, die einen mittleren Anteil von mindestens 75% tetraantennären Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydratketten enthalten.2. EPO composition, characterized, that it consists of glycosylated EPO molecules that have a mean Share of at least 75% tetra-antenna structures based on contain the total number of carbohydrate chains. 3. EPO-Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil der tetraantennären Strukturen mindestens 80% ist.3. EPO composition according to claim 1 or 2, characterized, that the proportion of tetra-antenna structures is at least 80%. 4. EPO-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen aus glykosylierten EPO-Molekülen besteht, die eine Anzahl von mindestens 3,7 N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf eine Glykosilierungsstelle der EPO-Moleküle enthalten.4. EPO composition, characterized, that it consists essentially of glycosylated EPO molecules, which have a number of at least 3.7 N-acetyl-lactosamine units based on a glycosylation site of the EPO molecules. 5. EPO-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus glykosylierten EPO-Molekülen besteht, die eine Anzahl von mindestens 3,7 N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf eine Glykosilierungsstelle der EPO-Moleküle enthalten. 5. EPO composition, characterized, that it consists of glycosylated EPO molecules that have a number of at least 3.7 N-acetyl-lactosamine units based on one Contain glycosylation site of EPO molecules. 6. EPO-Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl von N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten mindestens 4,0 ist.6. EPO composition according to claim 4 or 5, characterized, that the number of N-acetyl-lactosamine units is at least 4.0 is. 7. EPO-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Merkmale von mindestens zwei der Ansprüche 1, 2, 4 und 5 aufweist.7. EPO composition, characterized, that they have the features of at least two of claims 1, 2, 4 and 5 has. 8. EPO-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Gemisch aus 2 bis 5 Isoformen umfaßt.8. EPO composition according to one of the preceding claims, characterized, that it comprises a mixture of 2 to 5 isoforms. 9. EPO-Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Gemisch aus 3 bis 4 Isoformen umfaßt.9. EPO composition according to claim 8, characterized, that it comprises a mixture of 3 to 4 isoforms. 10. EPO-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine spezifische Aktivität in vivo von mindestens 200 000 lU/mg Protein aufweist.10. EPO composition according to one of the preceding claims, characterized, that they have a specific activity in vivo of at least 200,000 IU / mg protein. 11. EPO-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Sialinsäuregehalt pro Molekül mindestens 11 beträgt.11. EPO composition according to one of the preceding claims, characterized, that the mean sialic acid content per molecule is at least 11. 12. EPO-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die EPO-Moleküle das Produkt einer Expression exogener DNA in Säugerzellen sind. 12. EPO composition according to one of the preceding claims, characterized, that the EPO molecules are the product of an expression of exogenous DNA are in mammalian cells. 13. EPO-Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die EPO-Moleküle das Produkt einer Expression endogener DNA in humanen Zellen sind.13. EPO composition according to one of the preceding claims, characterized, that the EPO molecules are the product of an expression of endogenous DNA are in human cells. 14. EPO-Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der Zellen in einem serumfreien Medium erfolgt ist.14. EPO composition according to claim 12 or 13, characterized, that the cells are cultivated in a serum-free medium is. 15. Pharmazeutisches Präparat, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff eine EPO-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 als Wirkstoff gegebenenfalls zusammen mit üblichen pharmazeutischen Verdünnungs-, Hilfs- und Trägermitteln enthält.15. Pharmaceutical preparation, characterized, that it is an EPO composition according to one of the active ingredients Claims 1 to 14 as an active ingredient, optionally together with customary pharmaceutical diluents, auxiliaries and carriers contains. 16. Verfahren zur Gewinnung einer EPO-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die EPO-Zusammensetzung mit den gewünschten Merkma­ len erhält durch mindestens eine der Maßnahmen:
  • (a) Auswahl einer geeigneten Produktionszelle, welche in der Lage ist, Kohlenhydratketten mit einem hohen Anteil tetraantennärer Strukturen oder/und N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten zu erzeu­ gen,
  • (b) Auswahl von geeigneten Kultivierungsbedingungen bei der Zellkultur, um Kohlenhydratketten mit einem hohen Anteil tetraantennärer Struktur oder/und N-Acetyl-Lactosamin- Einheiten zu erzeugen und
  • (c) Abtrennung unerwünschter Bestandteile aus einer bekannten Zusammensetzung von EPO-Molekülen unter Anreicherung von EPO-Molekülen, die Kohlenhydratketten mit einem hohen Anteil tetraantennärer Strukturen oder/und N-Acetyl-Lactosa­ min-Einheiten enthalten.
16. A method for obtaining an EPO composition according to any one of claims 1 to 14, characterized in that the EPO composition with the desired Merkma len is obtained by at least one of the measures:
  • (a) Selection of a suitable production cell which is able to produce carbohydrate chains with a high proportion of tetra-antenna structures and / or N-acetyl-lactosamine units,
  • (b) Selection of suitable cultivation conditions in the cell culture in order to produce carbohydrate chains with a high proportion of tetra-antenna structure and / or N-acetyl-lactosamine units and
  • (c) Separation of undesired constituents from a known composition of EPO molecules with enrichment of EPO molecules which contain carbohydrate chains with a high proportion of tetra-antenna structures and / or N-acetyl-lactosa min units.
 17. Verfahren zur Erhöhung der spezifischen Aktivität einer EPO-Zu­ sammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man EPO-Moleküle mit einem hohen Anteil an tetraantennären Kohlenhydratstrukturen oder/und N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten in der Zusammensetzung anreichert.17. Method for increasing the specific activity of an EPO-Zu composition, characterized, that you have EPO molecules with a high proportion of tetra-antennae Carbohydrate structures and / or N-acetyl-lactosamine units in enriches the composition. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Anreicherung bis auf einen mittleren Anteil von mindestens 75% tetraantennären Strukturen bezogen auf die Gesamtzahl von Kohlenhydratketten erfolgt.18. The method according to claim 17, characterized, that the enrichment down to an average proportion of at least 75% tetra-antenna structures based on the total number of Carbohydrate chains takes place. 19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Anreicherung bis auf eine mittlere Anzahl von mindestens 3,7 N-Acetyl-Lactosamin-Einheiten bezogen auf eine Glykosilie­ rungsstelle des EPO-Moleküls erfolgt.19. The method according to claim 17, characterized, that the enrichment down to an average number of at least 3.7 N-acetyl-lactosamine units based on a glycosyl tion site of the EPO molecule takes place. 20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17-19, dadurch gekennzeichnet, daß die Anreicherung durch eine oder mehrere der Maßnahmen (a), (b) und (c) gemäß Anspruch 16 erfolgt.20. The method according to any one of claims 17-19, characterized, that the enrichment through one or more of the measures (a), (b) and (c) according to claim 16 takes place.
DE1997153681 1997-07-23 1997-12-03 Erythropoietin composition has a highly specific activity Withdrawn DE19753681A1 (en)

Priority Applications (52)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1997153681 DE19753681A1 (en) 1997-12-03 1997-12-03 Erythropoietin composition has a highly specific activity
US09/113,692 US6548296B1 (en) 1997-07-23 1998-07-10 Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human lines identified thereby, and uses thereof
AU89786/98A AU754619B2 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation
JP2000504243A JP4541539B2 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation
AT98941401T ATE341625T1 (en) 1997-07-23 1998-07-22 PRODUCTION OF ERYTHROPOIETIN BY ENDOGENOUS GENE ACTIVATION WITH VIRAL PROMOTORS
BRPI9811031-4 BRPI9811031B8 (en) 1997-07-23 1998-07-22 process for preparing a human epo producing cell, process for preparing human epo, constructing DNA for activating endogenous epo gene as well as plasmid.
US09/463,380 US6391633B1 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation
PT98941401T PT986644E (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation with viral promoters
KR1020007000677A KR100641969B1 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation
CA2298015A CA2298015C (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation
DE59813758T DE59813758D1 (en) 1997-07-23 1998-07-22 PREPARATION OF ERYTHROPOIETIN BY ENDOGENOUS GENETIC ACTIVATION WITH VIRAL PROMOTERS
EP98941401A EP0986644B1 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation with viral promoters
TR2000/00175T TR200000175T2 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Preparation of erythropoietin with endogenic gene activation.
PCT/EP1998/004590 WO1999005268A1 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Production of erythropoietin by endogenous gene activation
DK98941401T DK0986644T3 (en) 1997-07-23 1998-07-22 Preparation of erythropoietin by endogenous gene activation with viral promoters
CNB988074826A CN1151258C (en) 1997-07-23 1998-07-22 Prodn. of erythropoietin by endogenous gene activation
ES98941401T ES2273434T3 (en) 1997-07-23 1998-07-22 OBTAINING ERYTHROPOYETIN THROUGH GENETIC ACTIVATION ENDOGENA.
CO98042019A CO4790181A1 (en) 1997-07-23 1998-07-23 MANUFACTURE OF Erythropoietin BY ENDOGENOUS GENE ACTIVATION
ARP980103619A AR016537A1 (en) 1997-07-23 1998-07-23 A HUMAN CELL FOR THE MANUFACTURE OF ERYTHROPOYETIN BY ENDOGENA GENE ACTIVATION, A PROCEDURE FOR THE MANUFACTURE OF THE SAME AND A CONSTRUCTION OF DNA TO BE USED IN THE SAME, A PROCEDURE FOR THE MANUFACTURE OF HUMAN EPO, HUMAN EPO ISOLATED OBTAINED BY THE FARMA PREPARED
TW87116028A TW574372B (en) 1997-07-23 1998-09-24 Preparation of erythropoietin by endogenic gene activation
DK98965223.5T DK1036179T4 (en) 1997-12-03 1998-12-02 Process for the preparation of polypeptides with suitable glycosylation
AT98965223T ATE309350T1 (en) 1997-12-03 1998-12-02 METHOD FOR PRODUCING POLYPEPTIDES WITH SUITABLE GLYCOSYLATION
ZA9811003A ZA9811003B (en) 1997-12-03 1998-12-02 Erythropoietin with specific activity.
US09/555,533 US6673575B1 (en) 1997-12-03 1998-12-02 Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
EP98965223.5A EP1036179B2 (en) 1997-12-03 1998-12-02 Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
ZA9811004A ZA9811004B (en) 1997-12-03 1998-12-02 Process for the production of polypeptides with suitable glycosylation.
PCT/EP1998/007819 WO1999028455A1 (en) 1997-12-03 1998-12-02 Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
AU20518/99A AU2051899A (en) 1997-12-03 1998-12-02 Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
DE59813187T DE59813187D1 (en) 1997-12-03 1998-12-02 PROCESS FOR THE PREPARATION OF POLYPEPTIDES WITH APPROPRIATE GLYCOSILATION
ES98965223.5T ES2252876T5 (en) 1997-12-03 1998-12-02 Process to prepare polypeptides with adequate glycolization
JP2000523332A JP3394240B2 (en) 1997-12-03 1998-12-02 Method for producing appropriately glycosylated polypeptides
ARP980106125A AR022358A1 (en) 1997-12-03 1998-12-03 AN EPO COMPOSITION, A PROCEDURE FOR OBTAINING IT, A PHARMACEUTICAL PREPARATION CONTAINING IT AND A PROCEDURE TO INCREASE THE SPECIFIC ACTIVITIES OF AN EPO COMPOSITION
KR10-2000-7006085A KR100390325B1 (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
ES98965756.4T ES2523599T3 (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin of great specific activity
TR2000/01580T TR200001580T2 (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
CA2309810A CA2309810C (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
PCT/EP1998/007876 WO1999028346A1 (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
EP98965756.4A EP1037921B1 (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
AU21581/99A AU744086B2 (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
JP2000523237A JP4220125B2 (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
CNB988117924A CN1280309C (en) 1997-12-03 1998-12-03 Erythropoietin with high specific activity
BRPI9813391A BR9813391C1 (en) 1997-12-03 1998-12-03 process to produce an epo composition and process to increase the specific activity of an epo composition
ARP980106124A AR018023A1 (en) 1997-12-03 1998-12-03 PROCEDURE FOR THE MANUFACTURE OF POLYPEPTIDES WITH APPROPRIATE GLYCOSILATION
ARP990105069A AR020735A1 (en) 1997-12-03 1999-10-07 A PROCEDURE FOR OBTAINING A GLUCOSYLED POLYPEPTIDE FROM EUCARIOTIC CELLS
US09/607,277 US6555373B1 (en) 1997-07-23 2000-06-30 Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation isolated human cell lines identified thereby, and uses thereof
US09/985,357 US6544748B2 (en) 1997-07-23 2001-11-02 Preparation of erythropoietin by endogenous gene activation
JP2002321415A JP4384400B2 (en) 1997-12-03 2002-11-05 Process for producing appropriately glycosylated polypeptides
US10/351,397 US7214532B2 (en) 1997-07-23 2003-01-27 Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation, isolated human cell lines identified thereby, and uses thereof
US10/353,767 US7186529B2 (en) 1997-07-23 2003-01-29 Preparation of erythropoietin by endogenous gene activation
JP2003055499A JP3673261B2 (en) 1997-12-03 2003-03-03 Erythropoietin with high specific activity
JP2004219290A JP4234647B2 (en) 1997-12-03 2004-07-27 Erythropoietin with high specific activity
US11/201,006 US7659373B2 (en) 1997-12-03 2005-08-09 Erythropoietin with high specific activity

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE1997153681 DE19753681A1 (en) 1997-12-03 1997-12-03 Erythropoietin composition has a highly specific activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE19753681A1 true DE19753681A1 (en) 1999-07-22

Family

ID=7850642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE1997153681 Withdrawn DE19753681A1 (en) 1997-07-23 1997-12-03 Erythropoietin composition has a highly specific activity

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE19753681A1 (en)
ZA (2) ZA9811004B (en)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005050580A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Siegfried Biologics Gmbh A method for characterizing the quality of sialoglycoproteins via an isoform number I and its use

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005050580A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Siegfried Biologics Gmbh A method for characterizing the quality of sialoglycoproteins via an isoform number I and its use
US8150630B2 (en) 2005-10-21 2012-04-03 Peter Hermentin Method for characterisation of the quality of sialoglycoproteins via an isoform number I

Also Published As

Publication number Publication date
ZA9811003B (en) 2000-06-02
ZA9811004B (en) 2000-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1037921B1 (en) Erythropoietin with high specific activity
EP1036179B2 (en) Method for preparing polypeptides with appropriate glycosilation
DE69029370T2 (en) Erythropoietin isoforms
EP0538300B1 (en) O-glycosylated ifn-alpha
EP2155871B1 (en) Ace2 polypeptide
EP1131422B1 (en) Recombinant glycoproteins, method for the production thereof, medicaments containing said glycoproteins and use thereof
DE69224858T2 (en) Essentially pure human parathyroid hormone
EP1224940B1 (en) Liquid interferon-beta formulations
EP0409113A1 (en) Human erythropoietin muteins, their production and their use
EP1904522B1 (en) Method for the purification of g-csf
CH681625A5 (en)
DE10235248A1 (en) Novel fusion protein having enhanced in vivo activity useful for treating anemia, comprises carboxy terminal peptide of thrombopoietin fused with carboxy terminal of human erythropoietin
DE69726571T2 (en) Recombinant human erythropoietin with an advantageous glycosylation pattern
DE69102651T2 (en) PROTEASER-RESISTANT PDGF AND ITS USES.
DE19753681A1 (en) Erythropoietin composition has a highly specific activity
DE69029040T2 (en) MEGAKARYOCYTOPOIETIC FACTOR
EP2108695A1 (en) Ace2 polypeptide
DE29820466U1 (en) Recombinant glycoproteins and medicinal products containing them
DE4035877A1 (en) O-glycosylated alpha interferon
MXPA00005048A (en) Erythropoietin with high specific activity

Legal Events

Date Code Title Description
8139 Disposal/non-payment of the annual fee