DE19750237A1

DE19750237A1 - Detecting nucleic acid in many samples by amplification useful for diagnosing genetic diseases or tumors

Info

Publication number: DE19750237A1
Application number: DE19750237A
Authority: DE
Inventors: Gerd Dipl Biol Dr Haberhausen; Peter Dipl Biol Dr Wenzig
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1997-11-13
Filing date: 1997-11-13
Publication date: 1999-05-20
Also published as: WO1999025867A1

Abstract

A method for detecting nucleic acid (I) in many samples comprises: (i) making (I) accessible; (ii) eliminating inhibitors of amplification; (iii) simultaneously generating amplification products (II) of fragments of (I) in each sample; (iv) stopping the amplification reaction; and (v) sequentially, automatically detecting simultaneously generated (II). Independent claims are also included for the following: (1) a kit for detecting (I) containing, in separate containers, reagents for amplifying fragments of (I), with or without primers; reagents for inactivation of uracil-N-glycosylase (UNG) and reagents for detecting (II), with or without primers; and (2) an apparatus for detecting (I) comprising a sample carousel with holders for vessels containing samples containing amplified (I), denaturing reagent and hybridization reagents, a unit for transferring samples and reagents from the sample carousel to a reaction carousel having numerous reaction vessels for hybridization, a detection unit and a control unit for timed processing of samples from denaturation to detection.

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in mehreren Proben enthaltend die Schritte Verfügbarmachen der Nukleinsäuren, Abreicherung von Inhi bitoren der Amplifikation, Erzeugung von Amplifikationsprodukten, Abstoppen der Ampli fikationsreaktion und Detektion der Amplifikationsprodukte.The invention relates to a method for the detection of nucleic acids in several Samples containing the steps of exposing the nucleic acids, depleting Inhi bit of amplification, generation of amplification products, stopping of ampli fiction reaction and detection of the amplification products.

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren stellen immer mehr eine echte Alternative zu den bislang üblichen auf der Anwesenheit von Enzymen oder immunologisch nachweisbaren Analyten basierenden Verfahren dar. Besondere Anwendung hat die Nukleinsäureanalytik bei den Infektionskrankheiten sowie in der Onkologie gefunden, da auf der Basis von Nukleinsäuren selbst geringste Unterschiede, z. B. Subtypen oder Polymorphismen, nachgewiesen werden können, selbst wenn diese immunologisch nicht ausreichend differenziert werden können. Hierbei spielt die Etablierung von Amplifikationsverfahren für Nukleinsäuren eine große Rolle. In der Regel sind nämlich die Nukleinsäuren in den zur Verfügung stehenden Proben nur in sehr geringen Mengen und nur in einer Mischung mit anderen, nicht nachzuweisenden Nukleinsäuren vorhanden. Amplifikationsverfahren, wie die Polymerase- Kettenreaktion (PCR, US-A-4,683,202), sorgen für eine überproportionale Vermehrung von Teilen der nachzuweisenden Nukleinsäuren verglichen mit nicht nachzuweisenden Nukleinsäuren. Der Nachweis der Amplifikate wird in der Regel durch Einbau einer Markierung in die Amplifikationsprodukte (Amplifikate) möglich. Aus der Menge an einge bauten Markierungen kann auf die Anwesenheit oder die Menge der nachzuweisenden Nukleinsäuren geschlossen werden.Methods for the detection of nucleic acids increasingly represent a real alternative to the hitherto usual on the presence of enzymes or immunologically detectable Analyte-based methods. Nucleic acid analysis has particular application the infectious diseases as well as found in oncology because on the basis of Nucleic acids even slightest differences, e.g. B. subtypes or polymorphisms, can be detected even if these are not sufficiently differentiated immunologically can be. The establishment of amplification processes for nucleic acids plays a role here a major role. As a rule, the nucleic acids are available Samples only in very small quantities and only in a mixture with others, not nucleic acids to be detected. Amplification methods, such as the polymerase Chain reaction (PCR, US-A-4,683,202), ensure a disproportionate increase in Parts of the nucleic acids to be detected compared to those not to be detected Nucleic acids. The verification of the amplificates is usually done by installing a Labeling in the amplification products possible. From the amount of turned on Built markings can be based on the presence or amount of evidence Nucleic acids are closed.

In jüngerer Zeit sind Geräte mit einer Kombination von Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäuren auf dem Markt erhältlich. In einem ersten Gerät, welches die PCR zur Ampli fikation verwendet, werden die Proben in PCR-Gefäßen amplifiziert, die Proben manuell nach einander mit Natronlauge versetzt, um die Nukleinsäuren zu denaturieren und anschließend die Lösungen nacheinander manuell in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte übertragen und mit einem Hybridisierungsreagenz versetzt, wobei die Amplifikate an die Wand gebunden werden. Hier ist zu berücksichtigen, daß die Immobilisierung über festphasengebundene (immo bilisierte) analytspezifische Fangsonden erfolgt und somit eine starke Einschränkung der Variabilität der Teste vorliegt. Die gebundenen Hybride werden nacheinander gewaschen und mit einer Lösung eines Nachweisreagenzes (Enzymsubstrat) versetzt. Die Detektion erfolgt einzeln oder für 8 Proben gleichzeitig. Dieses Verfahren ist nicht standardisiert und die Prä zision ist abhängig von der Geschicklichkeit und Erfahrung des Anwenders. Der dynamische Meßbereich des auf einer Enzymreaktion beruhenden Nachweisverfahrens ist gering, was die Verwendung mehrerer Verdünnungen für jede Probe erforderlich macht, damit für jede Probe mindestens ein Signal im Meßbereich liegt.More recently, devices with a combination of amplification and detection of Nucleic acids available on the market. In a first device, which uses the PCR for ampli used, the samples are amplified in PCR tubes, the samples manually after mixed with sodium hydroxide solution to denature the nucleic acids and then the Manually transfer solutions into the wells of a microtiter plate one after the other and use added to a hybridization reagent, the amplificates being bound to the wall. It should be noted here that the immobilization via solid phase (immo bilized) analyte-specific capture probes and thus severely limits the There is variability of the tests. The bound hybrids are washed successively and mixed with a solution of a detection reagent (enzyme substrate). The detection takes place individually or for 8 samples at the same time. This procedure is not standardized and the pre precision depends on the skill and experience of the user. The dynamic Measuring range of the detection method based on an enzyme reaction is small, which the Using multiple dilutions required for each sample, so for each sample at least one signal is in the measuring range.

In einem ähnlichen, aber weiter automatisierten Verfahren werden die Proben nach der batchweisen Amplifikation bei 4°C gelagert, um die Polymerase-Aktivität zu reduzieren, bis die Detektion gestartet wird. Hierzu werden die Proben nacheinander mit einer Lösung von Natronlauge zur Denaturierung der Nukleinsäuren in eine Nadel aufgenommen und in ein Inkubationsgefäß überführt, wo die Hybridisierung mit wandgebundenen analytspezifischen Fangsonden stattfindet. Die Detektion erfolgt sequentiell wie oben beschrieben. Dieses Ver fahren hat den Nachteil, daß es nicht ohne erheblichen Verlust an Sensitivität möglich ist, eine größere Anzahl von Proben durchzusetzen. Die Gesamt-Assay-Zeit ist in diesem Verfahren ebenfalls verhältnismäßig hoch.In a similar but more automated process, the samples are processed according to the Batch amplification stored at 4 ° C to reduce the polymerase activity until the Detection is started. For this purpose, the samples are washed with a solution of Sodium hydroxide solution for denaturing the nucleic acids is taken up in a needle and in a Transfer incubation vessel where the hybridization with wall-bound analyte-specific Capture probes takes place. The detection takes place sequentially as described above. This ver driving has the disadvantage that it is not possible without a significant loss of sensitivity, a to enforce a larger number of samples. The total assay time is in this procedure also relatively high.

Ein weiteres kommerziell erhältliches System beruht auf einer Amplifikation durch eine Kom bination von Ligase und Polymerase. Eine enzymatische Dekontamination ist nicht gegeben. Dieses komplexe System hat darüber hinaus auch noch den Nachteil eines recht geringen Probendurchsatzes.Another commercially available system is based on amplification by a comm combination of ligase and polymerase. There is no enzymatic decontamination. This complex system also has the disadvantage of being rather small Sample throughput.

In einem anderen Gerät, welches auf einem isothermen Amplifikationsverfahren (NASBA, EP-A-0 329 822) beruht, wird ein sehr komplexes und damit störanfälliges 3-Enzym-System verwendet. Es ist darüber hinaus nicht automatisiert und standardisiert. Die Varianzen in der Assay-Präzision sind hoch.In another device, which is based on an isothermal amplification process (NASBA, EP-A-0 329 822) is a very complex and therefore fault-prone 3-enzyme system used. It is also not automated and standardized. The variances in the Assay precision is high.

Es war Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren, bei dem die Nachteile des Standes der Technik zumindest teilweise vermieden werden, und insbesondere ein Verfahren zur Ver fügung zu stellen, bei dem die auf die Amplifikation folgenden Schritte automatisch in sehr kurzer Zeit bearbeitet werden bzw. bei dem die Präzision hoch ist. It was an object of the present invention, a method in which the disadvantages of the prior art of technology at least partially avoided, and in particular a method for ver to provide, in which the steps following the amplification automatically in very processed in a short time or where the precision is high.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in mehreren Proben enthaltend die Schritte Verfügbarmachen der Nukleinsäuren in den Proben, Abrei cherung von Inhibitoren der Amplifikation, (gleichzeitige) Erzeugung von Amplifikations produkten von Teilabschnitten der nachzuweisenden Nukleinsäuren, Abstoppen der Amplifi kationsreaktionen und sequentielle automatische Detektion der simultan erzeugten Amplifi kationsprodukte.The invention relates to a method for the detection of nucleic acids in several Samples containing the steps of exposing the nucleic acids in the samples, stripping Securing amplification inhibitors, (simultaneous) generation of amplification products of sections of the nucleic acids to be detected, stopping the amplifi cation reactions and sequential automatic detection of the simultaneously generated amplifi cation products.

In Fig. 1 ist ein Gesamtablauf eines beispielhaften erfindungsgemäßen Nukleinsäurenachweis verfahrens gezeigt.In Fig. 1 an overall flow of an exemplary nucleic acid detection method according to the invention is shown.

In Fig. 2 ist die Taktung der Probenbearbeitung schematisch dargestellt.The timing of the sample processing is shown schematically in FIG .

In Fig. 3 ist der Variationskoeffizient über einen weiten Konzentrationsbereich grafisch dargestellt.In Fig. 3, the coefficient of variation is plotted over a wide concentration range.

Nukleinsäuren, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden können, können beliebigen Ursprungs sein, beispielsweise virale, bakterielle oder zelluläre Nukleinsäuren. Die sie enthaltende Probe kann eine Lösung (z. B. eine Körperflüssigkeit, wie Urin, oder eine davon abgeleitete Flüssigkeit, wie Serum oder Plasma) oder eine Suspension sein, aber auch ein Festkörper oder ein zellhaltiges Medium wie Vollblut, ein Zellabstrich, fixierte Zellen, ein Gewebsschnitt oder ein fixierter Organismus.Nucleic acids that can be detected with the method according to the invention, can be of any origin, for example viral, bacterial or cellular Nucleic acids. The sample containing them can be a solution (e.g. a body fluid, such as Urine, or a liquid derived therefrom, such as serum or plasma) or a suspension be, but also a solid or a cell-containing medium such as whole blood, a cell smear, fixed cells, a tissue section or a fixed organism.

Die Reaktionssequenz wird gestartet durch Verfügbarmachung der nachzuweisenden Nuklein säure mit entsprechenden Reagenzien. Hierbei können sowohl Veränderungen des pHs (alkalisch), Hitze, Wiederholung extremer Temperaturveränderungen (Einfrieren/Auftauen), Veränderung der physiologischen Wachstumsbedingungen (Osmotischer Druck), Druck (French press), Glasperlen, Einwirkung von Detergenzien, chaotropen Salzen oder Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen), alleine oder in Kombination zur Freisetzung der Nukleinsäuren beitragen.The reaction sequence is started by making the nucleos to be detected available acid with appropriate reagents. Both changes in pH (alkaline), heat, repetition of extreme temperature changes (freezing / thawing), Change in physiological growth conditions (osmotic pressure), pressure (French press), glass beads, exposure to detergents, chaotropic salts or enzymes (e.g. proteases, lipases), alone or in combination to release the nucleic acids contribute.

Beispielsweise kann ein Verfahren zum Nachweis eines speziellen Virus in einer Körperflüssig keit (z. B. Serum) als ersten Schritt die Lyse der Virushülle enthalten. Verfahren zur Lyse von Virushüllen sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann die Lyse durch Behandlung mit Alkalihydroxydlösungen vorgenommen werden. Auch der Zusatz von Hilfsstoffen, z. B. Detergenzien, ist möglich. For example, a method for detecting a specific virus in a body can be fluid as a first step (lysing the virus envelope). Process for the lysis of Virus envelopes are known to the person skilled in the art. For example, the lysis by treatment with Alkali hydroxide solutions are made. The addition of auxiliary substances, e.g. B. Detergents is possible.

Bei einem Nachweis von Bakterien, beispielsweise in Lebensmitteln, können dem erfindungs gemäßen Verfahren ebenfalls mehrere Schritte vorgeschaltet werden. Im allgemeinen werden Bakterienproben, ggf. nach in vivo Vermehrung der Bakterien, unter Bedingungen, welche die Lyse der Bakterienzellwand bewirken (z. B. Proteinasen, Alkali), aufgeschlossen.If bacteria, for example in food, are detected, this can be done according to the invention According to the method, several steps can also be carried out. Generally will Bacterial samples, if necessary after in vivo multiplication of the bacteria, under conditions which the Lysis of the bacterial cell wall cause (e.g. proteinases, alkali), disrupted.

Resultat der diversen Vorbehandlungen ist in der Regel eine Probenflüssigkeit, welche die nachzuweisenden Nukleinsäuren gelöst enthält, und in der ggf. die in den vorbereitenden Schritten eingesetzten Reagenzien sowie gegebenenfalls zerstörte Zellbestandteile enthalten sind.The result of the various pretreatments is usually a sample liquid, which the contains dissolved nucleic acids to be detected, and in which, if necessary, those in the preparatory Steps used reagents and possibly destroyed cell components are.

Diese Probenflüssigkeit enthält einerseits die Nukleinsäuren, insbesondere die nachzuweisen den Nukleinsäuren, in sehr geringen Mengen, andererseits enthält sie darüber hinaus noch Stoffe, welche eine enzymatische Amplifikation stark beeinträchtigen können. Aus diesem Grund wird im Laufe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung eine Abtrennung von Inhibitoren vorgesehen. Hierzu werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren oder auch die Gesamtnukleinsäuren oder ein Teil davon, welcher die nachzuweisenden Nukleinsäuren umfaßt, an eine feste Phase gebunden, und die flüssige Phase entfernt. Hierfür stehen dem Fachmann eine Reihe von Verfahren zur Verfügung. In einer ersten Ausführungsform werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren zusammen mit anderen in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren an einer Glasoberfläche unspezifisch gebunden. In einer ersten Ausführungsform, welche in WO 96/41811 beschrieben ist, wird der Probenflüssigkeit, die die freigesetzten Nukleinsäuren enthält, Glasmagnetpartikel zugesetzt. Die Nukleinsäuren binden an die Glasoberfläche, während Inhibitoren der Polymerase-Aktivität, z. B. Eisen, Hämin oder Bilirubin in der Flüssigkeit verbleiben. Sofern sich die Probenflüssigkeit mit den Magnetpartikeln in einem Gefäß befindet, kann ein Magnet in die Nähe der Gefäßwand gebracht werden, so daß die Magnetpartikel an die Gefäßwand wandern und dort festgehalten werden, während die sie um gebende Flüssigkeit entfernt, z. B. abpipettiert wird. Gewünschtenfalls können noch anhaftende Flüssigkeitsreste durch Waschen und erneutes Absaugen entfernt werden. Danach werden die Magnetpartikel in einer Lösung mit geringem Salzgehalt aufgeschlemmt, wodurch sich die Nukleinsäuren wieder von den Glasmagnetpartikeln ablösen. Durch erneutes Anlegen eines Magneten an der Gefäßwand werden die Magnetpartikel wieder an die Wand gezogen und der nukleinsäurehaltige Überstand kann dem Gefäß entnommen werden. Sofern die Magnetpartikel der WO 96/41811 verwendet werden, können die Nukleinsäuren in im wesentlichen nativer Form erhalten werden. On the one hand, this sample liquid contains the nucleic acids, in particular those to be detected the nucleic acids, in very small amounts, on the other hand it also contains Substances that can severely impair enzymatic amplification. For this Reason is in the course of the method according to the present invention, a separation of Inhibitors provided. For this purpose, the nucleic acids to be detected or the Total nucleic acids or a part thereof, which is the nucleic acids to be detected comprises, bound to a solid phase, and the liquid phase removed. This is what A number of methods are available to those skilled in the art. In a first embodiment the nucleic acids to be detected together with others present in the sample Nucleic acids non-specifically bound to a glass surface. In a first embodiment, which is described in WO 96/41811, the sample liquid that the released Contains nucleic acids, added glass magnetic particles. The nucleic acids bind to the glass surface, while inhibitors of polymerase activity, e.g. B. iron, hemin or bilirubin in the liquid remain. If the sample liquid with the magnetic particles in one Vessel, a magnet can be placed near the vessel wall so that the Magnetic particles migrate to the vessel wall and are held there while they are around giving liquid removed, e.g. B. is pipetted off. If desired, can still be adhesive Liquid residues can be removed by washing and vacuuming again. After that, the Magnetic particles suspended in a solution with a low salt content, which causes the Detach nucleic acids from the glass magnetic particles. By creating another Magnets on the vessel wall pull the magnetic particles back onto the wall and the supernatant containing nucleic acid can be removed from the vessel. Unless the magnetic particles WO 96/41811 can be used, the nucleic acids in essentially native Shape are preserved.

In einer alternativen Ausführungsform werden die Nukleinsäuren in einer Vorrichtung gemäß EP-A-0 738 733 gereinigt. Hierbei handelt es sich um ein Zentrifugationsröhrchen, welches in seinem Inneren ein Glasvlies enthält, durch welches die Probenflüssigkeit durch Zentrifugation hindurchtransportiert wird. In Anwesenheit eines chaotropen Salzes binden die Nukleinsäuren beim Durchtritt durch das Vlies, während die Inhibitoren mit der übrigbleibenden Flüssigkeit in ein Auffanggefäß durchtreten. Die Nukleinsäuren können durch Aufgabe eines Niedrigsalzpuffers während der Zentrifugation in ein neues Auffanggefäß wieder aus dem Vlies eluiert werden.In an alternative embodiment, the nucleic acids in a device according to EP-A-0 738 733 cleaned. This is a centrifugation tube, which in inside contains a glass fleece through which the sample liquid by centrifugation is transported through. The nucleic acids bind in the presence of a chaotropic salt when passing through the fleece, while the inhibitors with the remaining liquid in pass through a receptacle. The nucleic acids can by a Low salt buffer from the fleece again during centrifugation in a new collecting vessel be eluted.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist es vorteilhaft, die Freisetzung der Nukleinsäuren und deren Immobilisierung in getrennten Verfahrensschritten vorzunehmen. Beispielsweise wird hierzu die feste Phase erst nach praktisch vollständigem Aufschluß von Zellkompartimenten zugegeben bzw. wird die Flüssigkeit erst nach möglichst vollständigem Aufschluß in das Zentrifugationsröhrchen eingefüllt. Die genannten Schritte zur Freisetzung von Nukleinsäuren können einerseits manuell, andererseits jedoch auch weitgehend automatisiert durchgeführt werden. Für den Fall einer automatisierten Durchführung kann beispielsweise ein Gerät gemäß DE-A-195 123 68 eingesetzt werden. Auf die diesbezügliche Offenbarung wird vollinhaltlich Bezug genommen. Eine besonders bevorzugte Probenvorbereitung ist in DE 197 43 518 beschrieben. Auf den Inhalt dieser Anmeldung wird vollinhaltlich Bezug genommen.For the purposes of the present invention, it is advantageous to release the nucleic acids and to carry out their immobilization in separate process steps. For example the solid phase only after practically complete disruption of cell compartments added or the liquid is only after complete digestion into the Centrifugation tube filled. The steps mentioned for the release of nucleic acids can be done manually on the one hand, but also largely automated on the other become. In the case of an automated implementation, for example, a device according to DE-A-195 123 68 can be used. The disclosure in this regard becomes full Referred. A particularly preferred sample preparation is in DE 197 43 518 described. Full reference is made to the content of this application.

Nach diesen Schritten steht eine von Amplifikations-Inhibitoren im wesentlichen befreite und an Nukleinsäuren aufkonzentrierte Probenflüssigkeit zur Verfügung. Sie kann zur Dekonta mination von verschleppten Amplifikaten anderer Proben, mit Uracil-N-Glykosylase versetzt werden. Dieses Verfahren ist in EP-B-0 401 037 ausführlich beschrieben.After these steps, an amplification inhibitor is essentially freed and sample liquid concentrated on nucleic acids is available. It can be used for deconta Mination of carried over amplicons of other samples, mixed with uracil-N-glycosylase become. This process is described in detail in EP-B-0 401 037.

Ein wesentlicher Schritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die gleichzeitige Erzeugung von Amplifikationsprodukten von Teilabschnitten der nachzuweisenden Nukleinsäuren in jeder der erzeugten Probenflüssigkeiten. Hierzu ist es bevorzugt, die Probenflüssigkeit aus dem Abreicherungsschritt in eine Wegwerfvorrichtung zu überführen, die mehrere Vertiefungen zur Aufnahme einer Vielzahl von Proben enthält. Hierbei handelt es sich bevorzugt um eine Vor richtung, bei der jede Vertiefung nur für die Aufnahme einer einzigen Probe eingesetzt und nach einmaligem Gebrauch nicht mehr wiederverwendet wird. Beispielsweise handelt es sich daher um ein Kunststoffdevice, in dem eine Vielzahl von sogenannten Tubes oder Reagenz gefäßen miteinander verbunden sind. Diese Vorrichtung ist bevorzugt in ihrer geometrischen Form auf die Aufnahmen des Gerätes angepaßt, in welchem die Amplifikation durchgeführt wird. Für den Fall einer in Thermocyclen vorgenommenen Amplifikation, wie bei der PCR, ist es bevorzugt, daß die Vorrichtung geometrisch auf die kommerziell erhältlichen Thermocycler angepaßt ist. Ein entsprechendes Gerät ist in EP-B-0 236 069 beschrieben. Auf die Offen barung wird vollinhaltlich Bezug genommen. Bevorzugt enthält die Vorrichtung 8 oder mehr, bevorzugt weniger als 100, besonders bevorzugt 16 bis 32 solcher Vertiefungen. Dies ermög licht die gleichzeitige Durchführung einer Amplifikation gleicher oder unterschiedlicher Nukleinsäuren in einer entsprechenden Anzahl von Proben. Besonders bevorzugt sind diese Wegwerfvorrichtungen gegen passive und aktive Kontamination der Proben bzw. der Umwelt geschützt. Dies kann beispielsweise geschehen durch Vorsehen eines Deckels, der zumindest während der Amplifikation mehrere Vertiefungen der Vorrichtung gasdicht verschließt. Besonders bevorzugt sind Einzeldeckel, die sich automatisch öffnen und schließen lassen. Möglich ist auch eine in den Deckel integrierte Dichtmatte aus elastischem Material, z. B. Silikon, die durch den Deckel bzw. die Deckelheizung des Thermocyclers auf die obere Öffnung der Vertiefung gedrückt wird und somit auch gegen während der Erhitzung der Pro benflüssigkeit entstehenden Druck dicht hält. Eine besonders bevorzugte Wegwerfvorrichtung im Sinne dieser Beschreibung ist in DE-196 43 320 beschrieben. Auf den Inhalt dieser Patent anmeldung wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen.An essential step in the method according to the invention is the simultaneous generation of amplification products from sections of the nucleic acids to be detected in each of the sample liquids generated. For this purpose, it is preferred to remove the sample liquid from the Depletion step to transfer into a disposable device, the multiple wells for Includes a variety of samples. This is preferably a pre direction in which each well is used only for receiving a single sample and is not reused after one use. For example, it is therefore a plastic device in which a multitude of so-called tubes or reagents vessels are interconnected. This device is preferred in its geometric Form adapted to the recordings of the device in which the amplification was carried out becomes. In the case of an amplification carried out in thermocycles, as in the case of PCR it preferred that the device be geometrically adapted to the commercially available thermal cyclers is adjusted. A corresponding device is described in EP-B-0 236 069. To the open Full reference is made to the agreement. The device preferably contains 8 or more, preferably less than 100, particularly preferably 16 to 32 such depressions. This enables light the simultaneous implementation of an amplification of the same or different Nucleic acids in an appropriate number of samples. These are particularly preferred Disposable devices against passive and active contamination of the samples or the environment protected. This can be done, for example, by providing a cover that at least seals several wells of the device in a gastight manner during the amplification. Single lids that can be opened and closed automatically are particularly preferred. An integrated sealing mat made of elastic material, e.g. B. Silicon, through the lid or the lid heater of the thermal cycler on the upper Opening of the depression is pressed and thus also during the heating of the Pro liquid keeps the resulting pressure tight. A particularly preferred disposable device in the sense of this description is described in DE-196 43 320. On the content of this patent registration is hereby fully referenced.

Zur Amplifikation werden die erforderlichen Reagentien, bevorzugt in Form von Reagenz lösungen, den in der Wegwertvorrichtung enthaltenen Proben entweder nacheinander oder gleichzeitig zugegeben, z. B. zupipettiert, oder umgekehrt. Sofern die Wegwerfvorrichtung in ihren Vertiefungen Proben für den Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren enthält, ist die sequentielle Zugabe jeder Reagenzlösung zu den einzelnen Vertiefungen bevorzugt. Dies kann einerseits manuell geschehen, z. B. mit Hilfe einer Kolbenhubpipette, andererseits jedoch auch automatisiert, z. B. mit Hilfe eines Pipettierautomaten. Im Falle einer Amplifikation mittels PCR wird die Vorrichtung in ein Gerät zur Erzeugung von Thermocyclen eingeführt und so viele Thermocyclen durchgeführt, wie für die ausreichende Amplifikation der Nukleinsäuren erforderlich sind. Hier wird insbesondere auf EP-B-0 201 184 oder US-A-4,683,202 Bezug genommen.The reagents required for the amplification are preferably in the form of a reagent solutions, the samples contained in the displacement device either one after the other or added at the same time, e.g. B. pipetted in, or vice versa. If the disposable device in their wells contains samples for the detection of different nucleic acids, is the sequential addition of each reagent solution to the individual wells is preferred. This can done manually, z. B. with the aid of a piston pipette, but also on the other hand automated, e.g. B. with the help of an automatic pipette. In the case of amplification using PCR the device is inserted into a device for generating thermocycles and so many thermocycles performed, as for the sufficient amplification of the nucleic acids required are. Here, reference is made in particular to EP-B-0 201 184 or US-A-4,683,202 taken.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden den der Amplifikation zu unterziehenden Proben mit unterschiedlichen nachzuweisenden Nukleinsäuren (z. B. Proben, die auf virale Parameter zu untersuchen sind, neben Proben, die auf bakterielle Parameter zu untersuchen sind) Reagenzlösungen mit standardisierten Konzentrationen einer DNA- oder/und RNA-Polymerase, Nukleosidtriphosphaten, Puffersubstanzen und bevorzugt auch Primern zugegeben. Nukleosidtriphosphate (NTP) sind Ribo (rNTP)- oder Desoxyribo nukleosidtriphosphate (dNTP). Die für die Amplifikation erforderlichen Reagenzien und deren Konzentrationen sind für die einzelnen Amplifikationsverfahren, z. B. die PCR oder NASBA, einem Fachmann ausreichend bekannt. Im Sinne der Erfindung wird jedoch ein verhältnismäßig geringes Verhältnis der Volumina an Probenflüssigkeit (z. B. 10-50 µl) zum Gesamtvolumen von 50 bis 100 µl der Reaktionsmischung eingesetzt. In Zusammenhang mit einer effizienten Inhibitorenabtrennung läßt sich so eine erhöhte Sensitivität erzielen. Für PCR hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Polymerase der Probe so zuzusetzen, daß ihre Endkonzentration in einem Bereich zwischen 1 und 30 Units, bevorzugt zwischen 2.5 und 15 U liegt. Die Nukleosidtriphosphate werden in einer Konzentration von 0.1 bis 1 mM, bevorzugt zwischen 0.2 und 0.6 mM eingesetzt. Als DNA-Polymerase kommen beispielsweise solche aus T.aq. oder T.th. in Frage. Die Puffersubstanzen richten sich auch nach der eingesetzten Polymerase. Die Pufferkonzentration in der fertigen PCR-Mischung beträgt bevorzugt 1 mM bis 100 mM, besonders bevorzugt 10 bis 50 mM. Geeignete Puffersubstanzen sind Tris oder Bicine. Primer sind dem Fachmann prinzipiell bekannt. Sie müssen im wesentlichen die Bedingung erfüllen, daß sie mit einem Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure und dem Gegenstrang hybridisieren, durch die Enzymaktivität der Polymerase mit Hilfe von Nukleosidtriphosphaten unter Verwendung der nachzuweisenden Nukleinsäure als Templatnukleinsäure verlängerbar sind und daß, im Falle der PCR, die Verlängerungsprodukte des einen Primers als Templatnukleinsäure für die Verlängerung eines anderen Primers dienen können. Eine Templatnukleinsäure ist eine Nukleinsäure, zu der insbesondere zu einem Teil davon ein im wesentlichen komplementärer Nukleinsäurestrang neu gebildet wird. In bezug auf die Sequenzinformation dient die Templatnukleinsäure als Matrize für die Umschreibung. Die Basensequenz der Primer wird sich nach der gewünschten Spezifität der Amplifikationsreaktion richten. Ist eine spezifische Amplifikation gewünscht, werden die Sequenzen der Primer so ausgewählt, daß sie möglichst nur mit einem Strang der nachzuweisenden Nukleinsäure hybridisiert, nicht jedoch mit anderen in der Probenflüssigkeit vorhandenen Nukleinsäuren. Es ist selbstverständlich, daß es auch erwünscht sein kann, eine Gruppe von Nukleinsäuren zu amplifizieren, z. B. Nukleinsäuren einer bestimmten Gattung von Bakterien. Aus diesem Grund ist es selbstverständlich, daß sich die Reagenzlösungen für den Nachweis unterschiedlicher Nukleinsäuren in der Beschaffenheit der enthaltenen Primer, insbesondere deren Sequenz, unterscheiden, bevorzugt jedoch nicht in deren Konzentration.In a particularly preferred embodiment of the present invention, the Amplification of samples to be subjected to different nucleic acids to be detected (e.g. samples to be tested for viral parameters, in addition to samples for bacterial Parameters to be examined) reagent solutions with standardized concentrations of a DNA or / and RNA polymerase, nucleoside triphosphates, buffer substances and preferred also added to primers. Nucleoside triphosphates (NTP) are ribo (rNTP) - or deoxyribo nucleoside triphosphates (dNTP). The reagents required for amplification and their Concentrations are for the individual amplification methods, e.g. B. the PCR or NASBA, well known to a person skilled in the art. For the purposes of the invention, however, is a proportional low ratio of the volumes of sample liquid (e.g. 10-50 µl) to the total volume from 50 to 100 ul of the reaction mixture. In connection with an efficient Inhibitor separation can thus achieve increased sensitivity. For PCR it turned out to be proven advantageous to add the polymerase to the sample so that its final concentration in a range between 1 and 30 units, preferably between 2.5 and 15 U. The Nucleoside triphosphates are used in a concentration of 0.1 to 1 mM, preferably between 0.2 and 0.6 mM used. As DNA polymerase, for example, those from T.aq. or T.th. in question. The buffer substances also depend on the polymerase used. The buffer concentration in the finished PCR mixture is preferably 1 mM to 100 mM, particularly preferably 10 to 50 mM. Suitable buffer substances are Tris or Bicine. Primer are known in principle to the person skilled in the art. You essentially have to meet the condition that they are with a strand of the nucleic acid to be detected and the opposite strand hybridize through the enzyme activity of the polymerase with the help of nucleoside triphosphates extendable as template nucleic acid using the nucleic acid to be detected and that, in the case of PCR, the extension products of one primer as Template nucleic acid can be used to extend another primer. A Template nucleic acid is a nucleic acid to which a part of it is an im essential complementary nucleic acid strand is newly formed. Regarding the The template nucleic acid serves as a template for the description of the sequence information. The Base sequence of the primers will vary according to the desired specificity Straighten amplification reaction. If a specific amplification is desired, the Sequences of the primers selected so that if possible with only one strand of The nucleic acid to be detected hybridizes, but not with others in the sample liquid existing nucleic acids. It goes without saying that it may also be desirable to have one Amplify group of nucleic acids, e.g. B. nucleic acids of a certain genus of bacteria. For this reason, it goes without saying that the reagent solutions for the detection of different nucleic acids in the nature of the primers they contain, distinguish in particular their sequence, but preferably not in their concentration.

In einem besonders bevorzugten Format wird im Sinne der vorliegenden Erfindung während der Amplifikation mindestens einer der Primer so gewählt, daß er ein oder mehrere zur Immobilisierung befähigende Gruppen I aufweist. Zur Immobilisierung befähigende Gruppen I sind beispielsweise chemische Gruppen, die normalerweise in natürlichen Nukleinsäuren nicht vorhanden sind und die kovalent, beispielsweise über eine chemische oder eine Photoreaktion an eine feste Phase gebunden werden können, oder Gruppen bzw. Molekülteile, die über grup penspezifische Wechselwirkungen von einem anderen Molekül oder Molekülteil erkannt und gebunden werden können. Solche Gruppen sind daher z. B. Haptene, Antigene und Anti körper, Nukleotidsequenzen, Rezeptoren, Regulationssequenzen, Glykoproteine, beispiels weise Lectine, oder auch die Bindungspartner von Bindeproteinen, wie Biotin oder Imino biotin. Bevorzugt sind Vitamine und Haptene, besonders bevorzugt sind Biotin, Fluorescein oder Steroide, wie Digoxigenin oder Digoxin.In a particularly preferred format, for the purposes of the present invention the amplification of at least one of the primers chosen so that it one or more for Has groups I which enable immobilization. Groups I capable of immobilization For example, chemical groups are not normally found in natural nucleic acids are present and which are covalent, for example via a chemical or a photoreaction can be bound to a solid phase, or groups or parts of molecules which via group p-specific interactions recognized by another molecule or part of a molecule and can be bound. Such groups are therefore z. B. haptens, antigens and anti body, nucleotide sequences, receptors, regulatory sequences, glycoproteins, for example wise lectins, or the binding partners of binding proteins, such as biotin or imino biotin. Vitamins and haptens are preferred, and biotin and fluorescein are particularly preferred or steroids such as digoxigenin or digoxin.

Im Anschluß an die Amplifikation wird die Amplifikationsreaktion, bevorzugt durch Zugabe eines die Polymerase-Aktivität inhibierenden und die UNG inaktivierenden Reagenz, gestoppt. Während im Stand der Technik hierfür insbesondere Natronlauge (NaOH) eingesetzt wurde, wobei gleichzeitig eine Denaturierung der Nukleinsäuren stattfand, oder zum anderen Teil die Reaktionsmischung stark gekühlt wurde, ist es im Sinne der vorliegenden Erfindung bevorzugt, die Inaktivierung der Polymerase und der UNG von der Denaturierung der Nukleinsäuren zeit lich zu trennen. Als Reagenzien zur Inaktivierung der Polymerase und UNG haben sich insbesondere Detergenzien, bevorzugt anionische Detergenzien, als zweckmäßig erwiesen. Besonders bevorzugt ist die Klasse der N-acylaminosäuren, wobei der Acylrest zwischen 5 und 30 Kohlenstoffatome enthält und die Aminosäure bevorzugt Sarcosin ist. Als besonders bevor zugtes Reagenz hat sich N-Lauroylsarcosin erwiesen.Following the amplification, the amplification reaction is carried out, preferably by addition of a reagent that inhibits polymerase activity and inactivates the UNG. While in the prior art sodium hydroxide solution (NaOH) was used in particular, denaturation of the nucleic acids taking place at the same time, or the other part of the Reaction mixture has been strongly cooled, it is preferred for the purposes of the present invention the inactivation of the polymerase and the UNG from the denaturation of the nucleic acids separate. As reagents to inactivate the polymerase and UNG detergents in particular, preferably anionic detergents, have proven to be expedient. The class of N-acylamino acids is particularly preferred, the acyl radical being between 5 and Contains 30 carbon atoms and the amino acid is preferably sarcosine. As special before added reagent has been shown to be N-lauroylsarcosine.

Durch dieses Reagenz werden unspezifische Reaktionen der Polymerase, z. B. Auffüllreak tionen, unterdrückt, welche den Nachweis der nachzuweisenden Nukleinsäuren beeinträchtigen könnten. Das Stoppreagenz kann simultan in alle Vertiefungen der Wegwertvorrichtung gege ben werden, bevorzugt ist jedoch ein sequentielles Einpipettieren der Lösung in die einzelnen Vertiefungen, sobald die Reaktionsmischung aus der Amplifikation etwas abgekühlt ist. Diese Zugabe kann einerseits schon vor Amplifikation oder kurz nach Amplifikation auf dem Thermocycler, andererseits aber auch nach Überführung der Wegwerfvorrichtung oder der Reaktionsmischung in eine andere Aufnahme vorgenommen werden. Die Behandlung der Amplifikate mit Detergentien verschafft dem System ein vergrößertes Zeitfenster vor der anschließenden Detektion, innerhalb dem keine weiteren unspezifischen Reaktionen stattfinden können, z. B. Abbau der Amplifikate durch UNG-Reaktivierung bei Raumtemperatur und unerwünschte Weiterreaktion der Polymerase. Auch das lange Verbleiben der Amplifikate in Natronlauge hat sich als unvorteilhaft erwiesen. Dadurch kann der Probendurchsatz (Batchgröße bzw. maximale Bestückung des Gerätes oder Rotors) deutlich erhöht werden.With this reagent, non-specific reactions of the polymerase, e.g. B. Refill freak ions suppressed, which impair the detection of the nucleic acids to be detected could. The stop reagent can be placed simultaneously in all wells of the displacement device ben, but preferably a sequential pipetting of the solution into the individual Wells as soon as the reaction mixture has cooled somewhat from the amplification. This On the one hand, addition can take place before amplification or shortly after amplification on the Thermal cycler, but also after transfer of the disposable device or Reaction mixture can be made in another recording. Treatment of the Amplificates with detergents give the system an extended time window before subsequent detection, within which no further unspecific reactions take place can, e.g. B. Degradation of the amplificates by UNG reactivation at room temperature and unwanted further reaction of the polymerase. Also the long stay of the amplificates in Sodium hydroxide solution has proven to be disadvantageous. This allows the sample throughput (Batch size or maximum equipment of the device or rotor) can be increased significantly.

Des weiteren ermöglicht das vergrößerte Zeitfenster, die nach der getakteten Probenvor bereitung aufgegebene konsequente Taktung der Proben erneut aufzunehmen und eine getaktete Detektion anzuschließen.Furthermore, the enlarged time window allows the pre-clocked samples preparation of the consequent pacing of the samples and a to connect clocked detection.

Die vorzugsweise abgekühlte Reaktionsmischung aus der Amplifikationsreaktion wird nun bevorzugt in Gefäße in einer weiteren Aufnahme transportiert. Dies kann einerseits direkt durch Transport der Wegwerfvorrichtung in die Aufnahme geschehen, bevorzugt wird die Wegwertvorrichtung jedoch in eine erste Aufnahme transportiert, von der Aliquots der einzel nen Proben getrennt und automatisch in Einzelgefäße in einer weiteren Aufnahme transportiert werden. Bevorzugt befindet sich die Wegwertvorrichtung auf einem Rotor, und wird ähnlich behandelt wie eine Primärprobe in einer konventionellen automatisierten immunologischen Bestimmung.The preferably cooled reaction mixture from the amplification reaction is now preferably transported in vessels in another receptacle. On the one hand, this can be done directly by transporting the disposable device into the receptacle, preferred is the However, the travel device is transported in a first receptacle, from the aliquots of the individual Samples are separated and automatically transported into individual containers in another holder become. The displacement device is preferably located on a rotor and becomes similar treated like a primary sample in a conventional automated immunological Determination.

An das Abstoppen schließt sich die sequentielle automatische Detektion der simultan erzeugten Amplifikationsprodukte an. Ein wesentliches Merkmal des Detektionsverfahrens ist die zeitlich getaktete automatische Denaturierung der Amplifikate. Denaturierung von Nukleinsäuren bedeutet Auftrennung von Nukleinsäuredoppelsträngen in Einzelstränge. Dem Fachmann stehen prinzipiell eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Verfügung, z. B. Behandlung durch Alkalihydroxide, durch Hitze, oder durch Chemikalien. Bevorzugt wird die Denaturierung durch Zugabe einer 0.01 bis 1.0 N Natronlaugelösung bewirkt. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens finden nun sämtliche Reaktionsschritte und Zugaben von Reagenzien ab der Zugabe der Denaturierungsreagenzien bis zur Messung zeitlich getaktet statt. Unter einer zeitlichen Taktung wird eine Vorgehensweise verstanden, bei der jede einzelne Probe in einem genau festgelegten zeitlichen Abstand (Takt) zur vorangehenden bzw. nächsten Probe prozessiert wird. In der vorliegenden Erfindung sind die Abstände besonders kurz wählbar, insbesondere zwischen 30 und 200 sec. Dies führt zu einer höheren Intra- (gleich Probe nochmal bestimmt) und Interassay (andere Probe gleicher Analyt) Präzision. Darüber hinaus können die Inkubationszeiten für alle Proben und alle Teste ( unabhängig vom Analyt) gleich sein. Eine beispielhafte Taktung ist in Fig. 2 gezeigt. Die getakteten Arbeitsschritte sind Denaturierung (z. B. 1), Sondenhybridisierung (Inkubation) (2), Anlagerung an die Festphase (Inkubation mit Magnetbeads (3) und Messung (Inkubation in Meßzelle und Signalmessung) (4).The sequencing is followed by the sequential automatic detection of the simultaneously generated amplification products. An essential feature of the detection method is the time-based automatic denaturation of the amplificates. Denaturation of nucleic acids means separation of nucleic acid double strands into single strands. In principle, a multitude of possibilities are available to the person skilled in the art, e.g. B. Treatment by alkali hydroxides, by heat, or by chemicals. Denaturation is preferably effected by adding a 0.01 to 1.0 N sodium hydroxide solution. In a preferred embodiment of the method according to the invention, all reaction steps and additions of reagents take place in timed fashion from the addition of the denaturing reagents to the measurement. A timing is understood to be a procedure in which each individual sample is processed at a precisely defined time interval (cycle) from the preceding or next sample. In the present invention, the intervals can be chosen to be particularly short, in particular between 30 and 200 seconds. This leads to a higher intra (same sample again determined) and interassay (other sample of the same analyte) precision. In addition, the incubation times can be the same for all samples and all tests (regardless of the analyte). An exemplary timing is shown in FIG. 2. The cycle steps are denaturation (e.g. 1 ), probe hybridization (incubation) ( 2 ), attachment to the solid phase (incubation with magnetic beads ( 3 ) and measurement (incubation in measuring cell and signal measurement) ( 4 ).

Ferner finden bevorzugt alle Reaktionsschritte startend mit dem Abstoppen bis zur Über führung der Probenflüssigkeit in die Meßzelle (d. h. insbesondere die Schritte Denaturierung, Hybridisierung und Beadanlagerung) bei einer konstanten Temperatur statt, bevorzugt bei zwischen 18 und 80°, besonders bevorzugt bei 30 bis 45°C, insbesondere 37°C. Hierfür werden die Proben in einer entsprechenden Aufnahme konstant temperiert, insbesondere reicht hierfür ein Heizsystem aus, ein Kühlgerät ist nicht erforderlich. Dies erlaubt technische Vereinfachun gen.Furthermore, preferably all reaction steps start from stopping to over feeding the sample liquid into the measuring cell (i.e. in particular the steps of denaturing, Hybridization and bead attachment) at a constant temperature, preferably at between 18 and 80 °, particularly preferably at 30 to 45 ° C, in particular 37 ° C. For that be the temperature of the samples in a corresponding receptacle is constant, in particular this is sufficient a heating system off, a cooling device is not required. This allows technical simplifications gene.

Für den Fall, daß die Probenflüssigkeiten getrennt in Einzelgefäße einer weiteren Aufnahme transportiert werden, muß die Aufnahme für die Wegwerfvorrichtung nicht konstant temperiert werden. Es genügt beispielsweise, die Probenflüssigkeiten in der Wegwerfvorrichtung bei Raumtemperatur aufzubewahren. Dies ist ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Abstoppens der Amplifikationsreaktion mit einem Abstoppreagenz, welches nicht Natronlauge enthält. Es hat sich nämlich herausgestellt, daß ein Abstoppen mit Natronlauge mit der Zeit zu einem Signalverlust führt, so daß Probenflüssigkeiten, die in der sequentiellen Detektion später bearbeitet werden, eher zu falschnegativen Ergebnissen führen. Das erfindungsgemäße Vor gehen hingegen bewirkt, daß auch die Denaturierung der Nukleinsäuren in die Taktung ein bezogen werden kann, so daß, sofern ein Signalverlust stattfindet, dieser bei allen Proben gleichmäßig geschieht. Darüber hinaus erlaubt die Inkubation bei Raumtemperatur weitere technische Vereinfachungen.In the event that the sample liquids are separated into individual vessels of another receptacle transported, the receptacle for the disposable device does not have to be kept at a constant temperature become. For example, it is sufficient to add the sample liquids in the disposable device Store at room temperature. This is an essential advantage of the invention Stopping the amplification reaction with a stopping reagent that is not sodium hydroxide solution contains. It has been found that stopping with caustic soda increases over time signal loss, causing sample fluids to be used in sequential detection later are processed, rather lead to false negative results. The invention before go however, causes the denaturation of the nucleic acids in the timing can be obtained so that if there is a signal loss, this occurs in all samples happens evenly. In addition, incubation at room temperature allows more technical simplifications.

Bevorzugt werden also die Probenflüssigkeiten nach Überführung in die Gefäße der zweiten Aufnahme nacheinander folgenden Reaktionsschritten unterzogen. Zunächst werden die Nukleinsäuren durch Zugabe von Natronlauge denaturiert. Die Denaturierung findet bevorzugt während eines Zeitraumes zwischen 1 und 10 Minuten statt. The sample liquids are therefore preferred after transfer into the vessels of the second Recording subjected to successive reaction steps. First, the Denatured nucleic acids by adding sodium hydroxide solution. Denaturation is preferred during a period of between 1 and 10 minutes.

Darauf wird den Probenflüssigkeiten eine Lösung zugegeben, welche eine auf die in der jewei ligen Probe nachzuweisende Nukleinsäure abgestimmte Nachweissonde enthält. Bevorzugt enthält die Lösung der Sonde einen Puffer, mit dem die ursprünglich alkalische Lösung so neutralisiert wird, daß Hybridisierungsbedingungen eingestellt sind.A solution is then added to the sample liquids, which is based on the solution in each case contains a coordinated detection probe. Prefers the solution of the probe contains a buffer with which the originally alkaline solution is neutralized that hybridization conditions are set.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahrensschritt handelt es sich um eine spezielle Ausführungs form der sogenannten Hybridisierungstests, die in ihren Grundzügen dem Fachmann auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik bekannt sind. Soweit experimentelle Details im folgenden nicht ausgeführt sind, wird dazu vollinhaltlich auf "Nucleic acid hybridisation", Herausgeber B.D. Hames und S.J. Higgins, IRL Press, 1986, z. B. in den Kapiteln 1 (Hybridisation Stra tegy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridisation) und 4 (Quantitative Filter Hybridi sation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, und Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989, Bezug genommen.The method step according to the invention is a special embodiment form of the so-called hybridization tests, the basic features of which are known to the person skilled in the art Are known in the field of nucleic acid diagnostics. So far experimental details in the following are not set out, the full content of this is "Nucleic acid hybridization", publisher B.D. Hames and S.J. Higgins, IRL Press, 1986, e.g. B. in chapters 1 (Hybridization Stra tegy), 3 (Quantitative Analysis of Solution Hybridization) and 4 (Quantitative Filter Hybridi sation), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. F.M. Ausubel et al., J. Wiley and Son, 1987, and Molecular Cloning, Ed. J. Sambrook et al., CSH, 1989.

Bevorzugt ist die Hybridisierungssonde spezifisch für die jeweils nachzuweisende Nukleinsäure und enthält eine Markierung.The hybridization probe is preferably specific for the nucleic acid to be detected in each case and contains a marker.

Eine Markierung im Sinne der vorliegenden Erfindung besteht aus einer direkt oder indirekt nachweisbaren Gruppe L. Direkt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise radioaktive (32P), farbige, oder fluoreszierende Gruppen oder Metallatome. Indirekt nachweisbare Gruppen sind beispielsweise immunologisch oder enzymatisch wirksame Verbindungen, wie Antikörper Antigene, Haptene oder Enzyme oder enzymatisch aktive Teilenzyme. Diese werden in einer nachfolgenden Reaktion oder Reaktionssequenz detektiert. Besonders bevorzugt sind Haptene, da an mit ihnen markierte Nukleosidtriphosphate im allgemeinen besonders gut als Substrate von Polymerasen einsetzbar sind und eine anschließende Reaktion mit einem markierten Anti körper gegen das Hapten oder das haptenisierte Nukleosid leicht vorgenommen werden kann. Solche Nukleosidtriphosphate sind beispielsweise Brom-Nukleosidtriphosphate oder Digoxi genin-, Digoxin- oder Fluorescein-gekoppelte Nukleosidtriphosphate. Als besonders geeignet haben sich die in EP-A-0 324 474 genannten Steroide und deren Detektion erwiesen. Ganz besonders bevorzugt sind jedoch Direktmarkierungen, insbesondere solche, die mit Hilfe der Elektrochemolumineszenz nachgewiesen werden können, z. B. Ruthenium-bispyridyl-Kom plexe, wie sie in EP-94 108 442 beschrieben sind. A marking in the sense of the present invention consists of a direct or indirect detectable group L. Directly detectable groups are radioactive (32P), colored, or fluorescent groups or metal atoms. Indirectly detectable groups are for example immunologically or enzymatically active compounds, such as antibodies Antigens, haptens or enzymes or enzymatically active partial enzymes. These are in one subsequent reaction or reaction sequence is detected. Haptens are particularly preferred, since nucleoside triphosphates labeled with them are generally particularly good as substrates of polymerases can be used and a subsequent reaction with a labeled anti body against the hapten or the haptenized nucleoside can easily be made. Such nucleoside triphosphates are, for example, bromine nucleoside triphosphates or digoxi genin, digoxin or fluorescein-coupled nucleoside triphosphates. As particularly suitable the steroids mentioned in EP-A-0 324 474 and their detection have been found. All However, direct markings are particularly preferred, in particular those which are created using the Electrochemiluminescence can be detected, e.g. B. ruthenium bispyridyl com plexes as described in EP-94 108 442.

Unter einem spezifischen Nachweis wird ein Verfahren verstanden, durch welches gewünsch tenfalls selektiv bestimmte Nukleinsäuren auch in Gegenwart anderer Nukleinsäuren nach gewiesen werden können. Es ist jedoch auch möglich, eine Gruppe von Nukleinsäuren mit teilweise übereinstimmender oder ähnlicher Nukleotidsequenz nachzuweisen. Zum Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuren kann jeder der beiden komplementären Stränge einbezogen werden. Unter einer zu einer Nukleinsäure im wesentlichen komplementären Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz werden Nukleinsäuren oder Sequenzen verstanden, die mit der ent sprechenden Nukleinsäure hybridisieren können, deren Nukleotidsequenz im hybridisierenden Bereich entweder genau komplementär zu der anderen Nukleinsäure ist oder sich in wenigen Basen von der genau komplementären Nukleinsäure unterscheidet. Die Spezifität richtet sich dabei sowohl nach dem Grad der Komplementarität als auch nach den Hybridisierungsbedin gungen. Da aus einer Amplifikationsreaktion mehrere Hybridisierungen möglich sind, erlaubt das Verfahren auch eine automatische Genotypisierung.Specific detection is understood to mean a process by which the desired If necessary, selectively determine certain nucleic acids in the presence of other nucleic acids can be pointed. However, it is also possible to use a group of nucleic acids to detect partially identical or similar nucleotide sequence. As proof Double-stranded nucleic acids can include either of the two complementary strands become. Under a nucleic acid which is essentially complementary to a nucleic acid or Nucleic acid sequence is understood to mean nucleic acids or sequences which start with the ent can hybridize speaking nucleic acid whose nucleotide sequence in the hybridizing The area is either exactly complementary to the other nucleic acid or is in a few Bases from the exactly complementary nucleic acid. The specificity depends both according to the degree of complementarity and the hybridization conditions gung. Since several hybridizations are possible from one amplification reaction, allowed the procedure also includes automatic genotyping.

Während der Inkubation der Sonden mit den nachzuweisenden einzelsträngigen Nukleinsäuren hybridisieren diese miteinander unter Bildung von Hybriden D. Sofern die Hybridisierung weiterer Nukleinsäuren, z. B. Nachweissonden, mit einzelsträngigen Teilen der Hybride D beabsichtigt ist, können diese schon in diese Mischung eingebracht werden und wie gewünscht zur Hybridisierung gebracht werden. Die Inkubation wird so lange durchgeführt, bis zu erwar ten ist, daß eine für den Nachweis ausreichende Anzahl von Hybriden aus nachzuweisender Nukleinsäure und Hybridisierungssonde gebildet wurden. Bevorzugte Inkubationszeiten liegen gemäß dem vorliegenden Verfahren zwischen 1 und 120 Minuten, besonders bevorzugt zwischen 15 und 45 Minuten. Bevorzugt sind die Inkubationszeiten für unterschiedliche Proben, unabhängig von der nachzuweisenden Nukleinsäure gleich. Dies erleichtert die sequentielle und automatische Abarbeitung der Proben.During the incubation of the probes with the single-stranded nucleic acids to be detected they hybridize with one another to form hybrids D. If the hybridization further nucleic acids, e.g. B. detection probes, with single-stranded parts of the hybrid D is intended, these can already be introduced into this mixture and as desired are brought to hybridization. The incubation is carried out until expected ten is that a sufficient number of hybrids to be detected from the Nucleic acid and hybridization probe were formed. Preferred incubation times are according to the present method between 1 and 120 minutes, particularly preferred between 15 and 45 minutes. The incubation times are preferred for different ones Samples, regardless of the nucleic acid to be detected. This makes it easier sequential and automatic processing of samples.

Bevorzugt werden die gebildeten Hybride anschließend an einer festen Phase immobilisiert. Dies kann über immobilisierte Fangsonden geschehen. Bevorzugt geschieht dies aber über die zur Immobilisierung befähigenden Gruppen I der Primer, welche in die Amplifikationsprodukte eingebaut wurden. Die Flüssigkeit, welche die Nukleinsäurehybride D gelöst enthält, wenn die nachzuweisenden Nukleinsäuren in den Proben vorhanden war, wird hierzu mit festen Phasen in Kontakt gebracht, welche das Hybrid D über die immobilisierbaren Gruppen der Nuklein säuresonde spezifisch binden können. The hybrids formed are then subsequently immobilized on a solid phase. This can be done using immobilized capture probes. This is preferably done via the Immobilizing groups I of the primers, which in the amplification products were installed. The liquid which contains the nucleic acid hybrid D dissolved when the The nucleic acids to be detected were present in the samples using solid phases brought into contact which the hybrid D via the immobilizable groups of the nuclein can specifically bind acid probe.

Die Art der Festphase richtet sich nach der zur Immobilisierung befähigenden Gruppe I. Bevor zugt weist sie eine immobilisierende Gruppe R auf, die eine bindende Wechselwirkung mit I eingehen kann. Ist die immobilisierbare Gruppe I beispielsweise ein Hapten, dann kann eine Festphase verwendet werden, die an ihrer Oberfläche Antikörper gegen dieses Hapten auf weist. Ist die immobilisierbare Gruppe ein Vitamin, wie z. B. Biotin, dann kann die Festphase diese bindende Proteine, wie Avidin oder Streptavidin immobilisiert enthalten. Besonders bevorzugte Reste I und R sind Biotin und Streptavidin (SA). Die Immobilisierung über eine nicht-nukleoidische Gruppe I an der modifizierten Nukleinsäure ist besonders vorteilhaft, da sie unter milderen Bedingungen stattfinden kann als beispielsweise Hybridisierungsreaktionen. Bevorzugt werden zur Immobilisierung der gebildeten Nukleinsäuren den Reaktionsmischun gen nach Bildung der Nukleinsäurehybride D Magnetpartikel zugegeben, welche an ihrer Oberfläche mit der immobilisierbaren Gruppe reagieren können, und zwar universell, unab hängig von der Sequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure. Das Gefäß für die Reaktion ist bevorzugt eine Küvette, ein Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte. Die feste Phase sollte min destens so viele Bindungsstellen für die immobilisierbare Gruppe der Sonde haben, wie Nukleinsäurehybride D und damit nachzuweisende Nukleinsäuren vorhanden sind. Die Her stellung einer bevorzugten festen Phase ist in der EP-A-0 344 578 beschrieben, auf welche vollinhaltlich Bezug genommen wird.The type of solid phase depends on the group I capable of immobilization. Before zuzug she has an immobilizing group R, which has a binding interaction with I can come in. If the immobilizable group I is a hapten, for example, one can Solid phase are used which have antibodies against this hapten on their surface points. Is the immobilizable group a vitamin, such as. B. biotin, then the solid phase these contain binding proteins such as avidin or streptavidin immobilized. Especially preferred residues I and R are biotin and streptavidin (SA). Immobilization via a non-nucleoid group I on the modified nucleic acid is particularly advantageous as it can take place under milder conditions than, for example, hybridization reactions. The reaction mixture is preferred for immobilization of the nucleic acids formed gene after formation of the nucleic acid hybrids D added magnetic particles, which on their Can react surface with the immobilizable group, and that universal, independent depending on the sequence of the nucleic acid to be detected. The vessel for the reaction is preferably a cuvette, a tube or a microtiter plate. The solid phase should be min at least have as many binding sites for the immobilizable group of the probe as Nucleic acid hybrids D and thus nucleic acids to be detected are present. The Her Position of a preferred solid phase is described in EP-A-0 344 578, to which full reference is made.

Nach einer Inkubationszeit von bevorzugt zwischen 1 und 60, besonders bevorzugt 5 und 15 Minuten, während der die Immobilisierungsreaktion stattfindet, werden die Flüssigkeiten aus den Gefäßen entfernt.After an incubation period of preferably between 1 and 60, particularly preferably 5 and The liquids become 15 minutes during which the immobilization reaction takes place removed from the vessels.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, in der es sich bei der Festphase um suspen dierte Magnetpartikel handelt, werden die Magnetpartikel mit den gebundenen Amplifika tionsprodukten von der sie ungebunden Flüssigkeit, insbesondere einen Überschuß nicht gebundener Nachweissonde abgetrennt und gewünschtenfalls gewaschen. Anschließend wird ein Aliquot, bevorzugt von zwischen 100 und 200 µl, einer Suspension jeder der Flüssigkeiten aus den Gefäßen mit Hilfe einer automatischen Pipettiereinrichtung entfernt und nacheinander zu einer Meßzelle transportiert.In a particularly preferred embodiment, in which the solid phase is suspen dated magnetic particles, the magnetic particles with the bound amplifica tion products from the unbound liquid, especially not an excess bound detection probe separated and washed if desired. Then will an aliquot, preferably between 100 and 200 µl, of a suspension of each of the liquids removed from the vessels using an automatic pipetting device and successively transported to a measuring cell.

Bei direkt nachweisbaren Gruppen, beispielsweise Fluoreszenslabeln, wird die Menge an Mar kierung fluorometrisch bestimmt. Ist die nachweisbare Gruppe indirekt nachweisbar z. B. ein Hapten, so wird die modifizierte Nukleinsäure bevorzugt mit einem markierten Antikörper gegen das Hapten umgesetzt, wie analog in der EP-A-0 324474 beschrieben. Die Markierung am Antikörper kann beispielsweise eine Farb- oder Fluoreszenzmarkierung oder bevorzugt eine Enzymmarkierung, wie β-Galactosidase, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, sein. Im Falle der Enzymmarkierung wird die Menge an Nukleinsäure über die meist photometrische, chemoluminometrische oder fluorometrische Verfolgung einer Reaktion des Enzyms mit einem chromogenen, chemoluminogenen oder fluorogenen Substrat gemessen. Das Meßsignal ist ein Maß für die Menge ursprünglich vorhandener nachzuweisender Nukleinsäure und somit ggf. an nachzuweisenden Organismen.In the case of directly detectable groups, for example fluorescent labels, the amount of Mar fluorometric determination. Is the detectable group indirectly detectable e.g. B. a Hapten, the modified nucleic acid is preferred with a labeled antibody implemented against the hapten, as described analogously in EP-A-0 324474. The mark for example, a color or fluorescent label on the antibody or preferred an enzyme label such as β-galactosidase, alkaline phosphatase or peroxidase. in the In the case of enzyme labeling, the amount of nucleic acid is determined via the mostly photometric, chemiluminometric or fluorometric tracking of a reaction of the enzyme with a Chromogenic, chemiluminogenic or fluorogenic substrate measured. The measurement signal is a Measure of the amount of originally present nucleic acid to be detected and thus possibly organisms to be detected.

Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Markierung um eine Elektrochemilumineszenz markierung, wie sie beispielsweise in WO 93/102 67 beschrieben ist. Als besonders zweck mäßig haben sich hier Bispyridylkomplexe von Ruthenium erwiesen. Diese können mit Hilfe einer Lösung von Kaliumphosphat, Tropropylamin und Thesit® unter Anlegen einer Spannung über das dann erzeugte Blitzsignal bestimmt werden. Hierzu wird die Suspension von Magnet partikeln, an welche die Hybride aus nachzuweisender Nukleinsäure und Rutheniumkomplex markierte Hybridisierungssonde gebunden sind, in eine Meßzelle überführt. Eine solche Meß zelle ist beispielsweise in EP-A-0 658 760 beschrieben. Die Magnetpartikel werden über einen Magneten in der Meßzelle zurückgehalten. Anschließend wird die bisherige Flüssigkeit durch die oben genannte Detektionslösung ersetzt. Anschließend wird die Chemilumineszenz durch Anlegen einer Spannung an der Meßzelle erzeugt. Als Signal wird die Stärke des erzeugten Lichtblitzes gemessen. Die Höhe des Signals ist ein Anzeichen für die Anwesenheit oder die Menge der nachzuweisenden Nukleinsäure in der ursprünglichen Probe.The marking is particularly preferably electrochemiluminescence marking, as described for example in WO 93/102 67. As a special purpose Bispyridyl complexes of ruthenium have been found to be moderate. This can be done with the help a solution of potassium phosphate, tropropylamine and Thesit® under voltage can be determined via the flash signal then generated. For this, the suspension of magnet particles to which the hybrid of the nucleic acid and ruthenium complex to be detected labeled hybridization probe are bound, transferred to a measuring cell. Such a measurement cell is described for example in EP-A-0 658 760. The magnetic particles are over a Magnets retained in the measuring cell. Then the previous liquid is passed through replaced the above detection solution. Then the chemiluminescence is through Applying a voltage to the measuring cell. The strength of the generated signal Flash of light measured. The level of the signal is an indication of presence or presence Amount of nucleic acid to be detected in the original sample.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren kann zum Nachweis von Organismen (z. B. Viren oder Bakterien) in der Probe, zum Feststellen eines genetischen Zustands (z. B. genetische Erkrankungen oder Dispositionen), zur Diagnose von Tumoren oder zur Identifizierung von Individuen (z. B. in der Pathologie oder Forensik) eingesetzt werden. Es hat den Vorteil einer sehr kurzen TAT (total assay time). Darüber hinaus hat es im Vergleich zu Verfahren, die nicht mit Direktmarkierungen arbeiten, eine hohe Sensitivität und einen für unterschiedliche nachzuweisende Nukleinsäuren ähnlichen dynamischen Meßbereich. Die Intraassay- und die Interassay-Präzision ist hoch. Aufgrund der standardisierten Bedin gungen mit standardisiertem Probenfluß ist eine separate Anpassung der Software für die ein zelnen Analyten nicht erforderlich. Alle individuellen Proben, die auf dieselbe Nukleinsäure untersucht werden sollen, können bezüglich Reaktionszeiten, Reaktionstemperaturen, Puffer- Zusammensetzung) Taktung und TAT in Amplifikation und Detektion gleich behandelt werden.The method according to the invention for the detection of nucleic acids can be used for the detection of Organisms (e.g. viruses or bacteria) in the sample to detect a genetic Condition (e.g. genetic diseases or dispositions) for the diagnosis of tumors or used to identify individuals (e.g. in pathology or forensics) become. It has the advantage of a very short TAT (total assay time). In addition, it has High sensitivity and compared to methods that do not work with direct markings a dynamic measuring range similar for different nucleic acids to be detected. The intraassay and interassay precision is high. Due to the standardized Bedin with standardized sample flow is a separate adaptation of the software for the individual analytes are not required. All individual samples based on the same nucleic acid should be investigated, with regard to reaction times, reaction temperatures, buffer Composition) clocking and TAT are treated equally in amplification and detection.

Darüber hinaus können alle Proben, auch bei unterschiedlichen nachzuweisenden Nuklein säuren bezüglich Reaktionszeiten, Reaktionstemperaturen, Taktung und TAT in der Detektion gleich behandelt werden. Auch für den Betreiber des Gerätes ergeben sich durch die automa tisierte Testführung Vorteile.In addition, all samples can be taken, even with different nucleotides to be detected acids with regard to reaction times, reaction temperatures, clocking and TAT in the detection be treated equally. The automa. Also results for the operator of the device Tested benefits.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Reagenzkits und Geräte, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, insbesondere ein Reagenzkit zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend in unterschiedlichen Behältern:
The invention also relates to reagent kits and devices which are suitable for carrying out the method according to the invention, in particular a reagent kit for the detection of nucleic acids, containing in different containers:

a Reagentien zur Amplifikation von Teilsequenzen dieser Nukleinsäuren mit oder ohne Primer,
b ein Reagenz zur Inaktivierung von UNG und
c Reagentien zum Nachweis von Amplifikaten ohne oder mit einer markierten Sonde bzw. ein Gerät zum Nachweis von Nukleinsäuren, enthaltend:
a reagents for the amplification of partial sequences of these nucleic acids with or without primer,
b a reagent to inactivate UNG and
c Reagents for the detection of amplificates without or with a labeled probe or a device for the detection of nucleic acids, containing:

a einen Probenrotor enthaltend Aufnahmen für Gefäße enthaltend Proben mit amplifizierten Nukleinsäuren, Gefäße mit Denaturierungsreagentien und Gefäße mit Hybridisierungsreagentien und
b eine Einheit zum Transfer von Proben und Reagentien aus dem Probenrotor in einen Reaktionsrotor,
c einen Reaktionsrotor mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen für die Hybridisierung,
d eine Detektionseinheit und
e eine Steuerungseinheit zur getakteten Bearbeitung von Proben von der Denaturierung bis zur Detektion.a sample rotor containing receptacles for vessels containing samples with amplified nucleic acids, vessels with denaturing reagents and vessels with hybridization reagents and
b a unit for transferring samples and reagents from the sample rotor into a reaction rotor,
c a reaction rotor with a large number of reaction vessels for hybridization,
d a detection unit and
e a control unit for the timed processing of samples from denaturation to detection.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher: The following examples illustrate the invention:

example 1 Automated determination of Chlamydia trachomatis

- Sample preparation (PV)
The nucleic acids were isolated analogously to the method described in WO 96/41811 and DE 197 43 518 and freed from inhibitors. The sample pretreatment was done sequentially for the samples, clocked.
- amplification
Chlamydia plasmid was used in the PCR in 10 -1 to 10 7 copies as the standard material. 10 µl of the purified sample material from each of the eluates from the PV or standard material was successively mixed with 90 µl of the reagents for the PCR reaction, so that the following concentrations were present in the final amplification mixture:

Die PCR wurde für einen Batch (Reaktionsansätze) von 96 Proben in einem Thermocycler PE 9600 nach folgendem Cyclerprogramm durchgeführt:
The PCR was carried out for a batch (reaction batches) of 96 samples in a thermocycler PE 9600 according to the following cycler program:

- detection
After the amplification, the entire reaction mixture was cooled to room temperature, and the stop reagent (5 μl of a 1% strength aqueous solution of N-lauroyl sarcosine) was added to each of the mixtures and mixed. This stopped reaction mixture is then placed in the entrance area of an automatic analyzer (Boehringer Mannheim GmbH (BM), Elecsys 1010), on which the detection reaction takes place fully automatically and in a clocked manner. 10 μl of the mixture were removed from each amplification mixture and incubated with 35 μl denaturing solution (BM Enzymun Denaturation solution Id. No. 146 9053) in a new reaction vessel for 5 min at 37 ° C. (maximum 128 mixtures). After adding 120 μl of hybridization solution (BM Enzymun Hybridization solution Id. No 146 9045), mixed with 25 ng / ml of ruthenium-labeled probe (5'-Ru CAT AGC ACT ATA GAA CTC TG-3 '), the mixture was stirred at 37 for 30 min ° C incubated. Binding to the solid phase was carried out by successively adding 35 .mu.l Elecsys SA magnetic bead solution (BM Id. No. 171 9556) to each mixture and incubation for 10 min at 37 ° C. 130 μl of the reaction solution were then sucked into the measuring cell of the device in succession and the content of bound ruthenium-labeled targets was determined.
For the timed determination of 80 samples, the detection sequence was started every 75 seconds for a new stopped reaction mixture until all samples had been processed (see FIG. 2). Up to 48 further determinations (also clocked) were made from selected mixtures of the same reaction mixture, however amplicons were detected which had been formed from the original sample in a known amount of internal standard nucleic acids added. Hybridization solutions were used for this purpose, which contained a probe with a nucleotide sequence specific for the internal standard instead of the Chlamydia-specific probe. Alternatively, the starting nucleic acid, e.g. B. hybridized with additional genotyping probes.

Example 2 Precision of the proof

In Tabelle 1 werden Meßwerte (jeweils 1000 ECL-Einheiten) für eine Verdünnungsreihe von Proben mit bekanntem Gehalt an Chlamydia-Plasmiden (Analyt) gegeben, die in einem Batch nach Beispiel 1 erhalten werden (63 Bestimmungen aus 9 Proben unterschiedlicher Konzen tration).Table 1 shows measured values (1000 ECL units each) for a dilution series of Samples with known levels of Chlamydia plasmids (analyte) are given in a batch obtained according to Example 1 (63 determinations from 9 samples of different concentrations tration).

Table 1 Intraassay precision ECL measurement Dilution series Chlamydia trachomatis

7 Messungen
Integriertes Signal in tausend counts
7 measurements
Integrated signal in a thousand counts

Es wird klar, daß der Variationskoeffizient (d. h. die Intraassay-Präzision) über den enormen Konzentrationsbereich exzellent ist. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 visualisiert. It becomes clear that the coefficient of variation (ie the intra-assay precision) is excellent over the enormous concentration range. The results are visualized in Fig. 3.

Sequenzprotokoll Sequence listing

Claims

1. A method for the detection of nucleic acids in several samples containing the steps

a) exposing the nucleic acids in the samples,
b) depletion of inhibitors of amplification,
c) simultaneous generation of amplification products of subsections of the nucleic acids to be detected in each of the samples,
d) stopping the amplification reactions and
e) sequential automatic detection of the simultaneously generated amplification products.

2. The method according to claim 1, characterized in that in step c) with samples different nucleic acids to be detected Reagent solutions with standardized Concentrations of a DNA polymerase, nucleoside triphosphates, buffer substances and Primers are added.

3. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that Step c) in a disposable device containing several recesses for receiving a variety of samples is performed.

4. The method according to claim 3, characterized in that the sample liquid after Step c) is transported into vessels of another receptacle, from where the individual Samples can be transported separately to a measuring cell.

5. The method according to claim 4, characterized in that each of the samples after Transfer to the recording automatically and timed one for the individual the respective nucleic acid-specific hybridization probe to be added becomes.

6. The method according to claim 5, characterized in that it is the subsequent one for all Samples of the same length of incubation to form a hybrid from the nucleus to be detected acid and hybridization probe included.

7. The method according to claim 4-6, characterized in that each of the samples after Transfer to the recording automatically and timed a standardized Amount of solid phase added to immobilize the amplification products becomes.

8. The method according to any one of claims 4-7, characterized in that the samples in temperature of the recording.

9. The method according to any one of claims 4-8, characterized in that each sample after the incubation, it is automatically transferred separately to a measuring cell in which a the signal associated with hybrid formation is measured.

10. The method according to claim 9, characterized in that the detection for several Samples for timing and sensitivity settings for the Detection used device is standardized.

11. Reagent kit for the detection of nucleic acids, contained in different containers:

a Reagents for the amplification of partial sequences of these nucleic acids with or without primer,

b a reagent to inactivate UNG and

c Reagents for the detection of amplicons with or without a labeled Probe.

12. Device for the detection of nucleic acids, containing:

a with a sample rotor containing receptacles for vessels containing samples amplified nucleic acids, vessels with denaturing reagents and vessels with Hybridization reagents and

b a unit for transferring samples and reagents from the sample rotor into a reaction rotor,

c a reaction rotor with a variety of reaction vessels for the Hybridization,

d a detection unit and

e a control unit for the timed processing of samples from the Denaturation to detection.