DE19749277A1 - Removing albumin from liquid by affinity chromatography, for purification of fluids or albulmin recovery - Google Patents
Removing albumin from liquid by affinity chromatography, for purification of fluids or albulmin recoveryInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Albumin aus biologi schen Flüssigkeiten zum Zwecke der Reinigung solcher Lösungen.The invention relates to a method for separating albumin from biological liquids for the purpose of cleaning such solutions.
Zum Abtrennen von Albumin aus wäßrigen Lösungen, insbesondere aus bio logischen Flüssigkeiten, sind zwei Arten von Verfahren bekannt: die Ionen austauschchromatographie und die Affinitätschromatographie. Beide Verfah ren sind zur Albuminentfernung aus Lösungen der beschriebenen Art geeig net, jedoch weisen sie einige Nachteile auf.For separating albumin from aqueous solutions, especially from bio logical liquids, two types of processes are known: the ions exchange chromatography and affinity chromatography. Both procedures Ren are suitable for removing albumin from solutions of the type described net, but they have some disadvantages.
Die Ionenaustauschchromatographie ist als Methode zum Abtrennen von Albumin unspezifisch und erfordert in ihrer Anwendung und Durchführung einen hohen Zeitaufwand. Die zu geringe Spezifität ist darin begründet, daß die elektrischen Ladungen des Albumins und weiterer Gemischkomponenten ähnlich sind, diese deshalb im Chromatographieprozeß nicht differenziert werden können. Der hohe Zeitaufwand erklärt sich aus der methodisch not wendigen Arbeitsweise. Es ist erforderlich, die Lösung in Fraktionen zu tren nen, den Albumingehalt in den Fraktionen zu bestimmen und die albuminfrei en Fraktionen wieder zu vereinigen. Dabei ist die Peakidentifikation mühsam und aufwendig, auch zeitaufwendig.Ion exchange chromatography is a method of separating from Albumin is unspecific and requires its application and implementation a lot of time. The too low specificity is due to the fact that the electrical charges of the albumin and other mixture components are similar, therefore they are not differentiated in the chromatography process can be. The high expenditure of time is explained by the methodologically necessary agile working method. It is necessary to separate the solution into fractions to determine the albumin content in the fractions and the albumin-free reunite fractions. The peak identification is tedious and elaborate, also time consuming.
Ein weiterer Nachteil der Ionenaustauschchromatographie ist darin zu sehen, daß die Arbeitsweise notwendig zu einer Instabilität der Analysenlösung führt. Die Ursache liegt in der notwendigen Pufferzuführung und der dadurch bedingten Ionengradientenänderung. Diese muß aber während des Trennpro zesses kompensiert werden. Das erfolgt durch Einbringen weiterer Fremd stoffe in die Lösung, was zwangsläufig zur Instabilität derselben führt. Another disadvantage of ion exchange chromatography is that that the way of working is necessary to instability of the analytical solution leads. The reason for this lies in the necessary buffer feed and thereby conditional change in ion gradient. But this must during the separation pro process are compensated. This is done by introducing additional third parties substances into the solution, which inevitably leads to instability thereof.
Die Affinitätschromatographie wird ebenfalls zur Abtrennung von Albumin aus biologischen Flüssigkeiten eingesetzt. Eine dabei angewendete Methode ist die Abtrennung des Albumins mit monoklonalen Antikörpern, eine zweite die Verwendung von Farbstoffen wie Cibacronblau oder dergleichen.Affinity chromatography is also used to separate albumin used from biological fluids. An applied method is the separation of albumin with monoclonal antibodies, a second the use of dyes such as cibacron blue or the like.
Der Einsatz monoklonaler Antikörper verspricht aus theoretischen Überlegun gen heraus guten Erfolg. Dieser hat sich aber nicht eingestellt. Es hat sich gezeigt, daß die monoklonalen Antikörper letztlich zu teuer sind. Das ist in ihrer Herstellung begründet. Auch wenn die Hybridome in vitro kultiviert wer den, sind die Antikörper nur aufwendig abzutrennen und zur Verfügung zu stellen. Des weiteren hat sich gezeigt, daß die monoklonalen Antikörper in ihrem Einsatz zur Albuminabtrennung nur eine geringe Lebensdauer aufwei sen. Das ist dadurch bedingt, daß sie bei Mehrfachnutzung denaturieren. Weiterhin ist es so, daß sie schon bei längerfristiger Aufbewahrung in ihrer Aktivität merklich nachlassen und deshalb als kommerzielles Produkt aus fallen.The use of monoclonal antibodies promises theoretical considerations good success. However, this has not occurred. It has demonstrated that the monoclonal antibodies are ultimately too expensive. Is in justified their manufacture. Even if the hybridomas are cultivated in vitro The antibodies are difficult to separate and are available put. Furthermore, it has been shown that the monoclonal antibodies in their use for albumin separation only have a short lifespan sen. This is due to the fact that they denature when used multiple times. Furthermore, it is the case that they are stored in their Activity will noticeably decrease and therefore look like a commercial product fall.
Der Einsatz von Farbstoffen in der Affinitätschromatographie erfüllt die Er wartungen ebenfalls nicht, weil Cibacronblau und andere verwendete Farb stoffe unspezifisch sind. Albumin wird mit oder neben vielen anderen Protei nen abgetrennt, weil ihre Wechselwirkung mit dem Farbstoff ähnlich ist. Wei terhin ist nachteilig, daß die Trennleistung recht schnell nach läßt. Die Ursa che liegt in der nur unzureichend zu verwirklichenden Immobilisierung des Farbstoffs an einem Trägermaterial. Die Säule "blutet aus" und bringt keine Leistung mehr.The use of dyes in affinity chromatography fulfills the Er also do not maintain because cibacron blue and other colors used substances are non-specific. Albumin comes with or alongside many other protei separated because their interaction with the dye is similar. Wei terhin is disadvantageous that the separation performance decreases quite quickly. The Ursa che lies in the immobilization of the Dye on a support material. The column "bleeds" and brings none Performance more.
Die Erfindung hat den Zweck, ein Verfahren zur Abtrennung von Albumin aus biologischen Flüssigkeiten anzubieten, das ein spezifisches Abtrennen des Albumins ermöglicht. Es soll schnell ablaufen und die biologische Flüssigkeit soll stabil bleiben. Das Verfahren muß kostengünstig arbeiten, das zur Ver fügung gestellte Adsorbens soll langfristig haltbar sein und eine dauerhafte Trennleistung sichern. The invention has the purpose of a method for the separation of albumin biological fluids that require a specific separation of the Albumins enables. It should drain quickly and the biological fluid should remain stable. The process must work inexpensively, the Ver Supplied adsorbent should be long-term and permanent Ensure separation performance.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in einem Verfahren, das seinem Wesen nach ein affinitätschromatographisches Verfahren bleibt, eine spezifi sche Bindung zwischen Albumin und dem Adsorbens herzustellen. In nur wenigen Arbeitsschritten soll eine biologische Flüssigkeit albuminfrei erhal ten werden. Es soll unter physiologischen Bedingungen gearbeitet werden und das mit einer langfristig stabilen Matrix.The invention has for its object in a method that its Essentially an affinity chromatographic procedure remains, a speci to create a specific bond between albumin and the adsorbent. In just A biological liquid should be albumin-free in just a few steps be. It should work under physiological conditions and that with a long-term stable matrix.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß eine albuminhaltige
biologische Flüssigkeit auf eine chromatographische Säule aufgegeben wird,
die mit einer Füllung aus an sich bekanntem Trägermaterial beschickt worden
ist, welches aus Agarose in Kugelform, Polyacrylbeads, Silicagel oder der
gleichen besteht. Das Trägermaterial ist mit chemisch aktiven Gruppen modi
fiziert wie zum Beispiel
The object is achieved in that an albumin-containing biological liquid is applied to a chromatographic column which has been charged with a filling made of carrier material known per se, which consists of spherical agarose, polyacrylic beads, silica gel or the like. The carrier material is modified with chemically active groups, for example
- A. EAH-Sepharose 4B in Anwesenheit von Carbodiimid (Firma Pharmacia)A. EAH-Sepharose 4B in the presence of carbodiimide (company Pharmacia)
- B. Affigel 102 in Anwesenheit von Carbodiimid (Firma BioRad)B. Affigel 102 in the presence of carbodiimide (BioRad company)
oder dergleichen. Das derart vorbereitete Trägermaterial wird mit einer Pep tidlösung inkubiert, wobei das Peptid erfindungsgemäß eine definierte Se quenz von H2 or similar. The carrier material prepared in this way is incubated with a peptide solution, the peptide according to the invention having a defined sequence of H 2
N-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH aufweist. Nach Blockieren der freien aktiven Gruppen am Trägermaterial wie z. B. Agarose oder derglei chen wird mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und das Trägermaterial in die Säule eingeschwemmt. Die aufgegebene albuminhaltige biologische Flüssigkeit passiert die Säule. Das albuminfreie Eluat wird ge sammelt. Die Säule wird nach erfolgter Beladung regeneriert, indem man die Säule mit einem Puffer (200 mM Glycin-HCl, pH 2,2) wäscht. Anschließend wird die Säule mit PBS neutral gewaschen.N-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH. After blocking the free active groups on the support material such. B. agarose or the like Chen is washed with phosphate buffered saline (PBS) and the Carrier material washed into the column. The abandoned albuminous biological fluid passes through the column. The albumin-free eluate is ge collects. The column is regenerated after loading by the Wash column with a buffer (200 mM glycine-HCl, pH 2.2). Subsequently the column is washed neutral with PBS.
Das erfindungsgemäße Abtrennen von Albumin aus biologischen Flüssigkei ten ist ebenso im batch-Verfahren möglich. The separation of albumin from biological liquids according to the invention Batching is also possible.
Das Verfahren kann auch verwendet werden, um Albumin in reiner Form aus biologischen Flüssigkeiten zu isolieren.The process can also be used to make albumin in pure form isolate biological fluids.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß unerwartet und aufgrund theoretischer Überlegungen nicht vorhersehbar die Peptidsequenz H2N-Phe- His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH für die Bindung des Albumins verantwortlich ist. Erfindungsgemäß ist deshalb ebenfalls die Sequenz, ein Peptid, beste hend aus dieser Sequenz und generell Peptide, die diese Sequenz enthalten.The invention is based on the knowledge that the peptide sequence H 2 N-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH is responsible for the binding of the albumin unexpectedly and, due to theoretical considerations, not foreseeable. According to the invention is therefore also the sequence, a peptide consisting of this sequence and generally peptides containing this sequence.
Peptide, die die bezeichnete erfindungsgemäße Sequenz enthalten, sind nach an sich bekannten Methoden herstellbar.Peptides that contain the designated sequence according to the invention are according to known methods can be produced.
Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese beschränkt zu sein.The invention will be explained in more detail below using exemplary embodiments without being limited to them.
- 1. 16 mg des oben genannten Peptids werden mit 8 ml EAH-Sepharose 4B in Anwesenheit von Carbodiimid inkubiert. Das so hergestellte Trägermaterial ist bis zur Anwendung durch Zusatz von 0,02% Thimerosal bei 4°C stabil.1. 16 mg of the above peptide are mixed with 8 ml of EAH-Sepharose 4B Incubated presence of carbodiimide. The carrier material thus produced is stable at 4 ° C by adding 0.02% thimerosal.
- 2. Das Trägermaterial (8 ml) wird in eine handelsübliche Chromatographiesäu le gefüllt und mit PBS neutral gewaschen.2. The carrier material (8 ml) is put into a commercially available chromatography column filled and washed neutral with PBS.
- 3. Albuminhaltige biologische Flüssigkeiten werden über die Säule gegeben. Ein Milliliter des Trägermaterials kann 20 µg Albumin binden.3. Biological liquids containing albumin are passed over the column. One milliliter of the carrier material can bind 20 µg albumin.
- 4. Der albuminfreie Säulendurchlauf wird gesammelt.4. The albumin-free column run is collected.
- 5. Zur Regeneration wird die Säule mit 4 Säulenvolumen Puffer (200 mM Gly cin-HCl, pH 2,2) und anschließend mit 5 Säulenvolumen PBS gewaschen.5. For regeneration, the column with 4 column volumes of buffer (200 mM Gly cin-HCl, pH 2.2) and then washed with 5 column volumes of PBS.
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