DE19745001A1

DE19745001A1 - Affinity-labelling of oligomers or polymers

Info

Publication number: DE19745001A1
Application number: DE1997145001
Authority: DE
Inventors: Eloisa Dr Lopez-Calle; Karsten Dr Henco
Original assignee: Evotec Biosystems GmbH; Evotec Biosystems AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 1997-10-11
Filing date: 1997-10-11
Publication date: 1999-05-06

Abstract

Affinity-labelling for detecting recombinantly produced oligomers or polymers with a ligand so that affinity-complexes are formed is new.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren mit mindestens einem Liganden, der eine Affinität zum zu markierenden Oligo- oder Polymer und mindestens eine erfaßbare Eigenschaft aufweist, das Oligo- oder Polymer mindestens eine Affinitätsbindungsstelle für den mindestens einen oder mehrere Liganden besitzt und die mindestens eine Affinitätsbindungsstelle des Oligo- oder Polymeren durch rekombinante oder synthetische Methoden in dem Oligo- oder Polymer erzeugt worden ist, sowie Verbindungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.The present invention relates to a method for affinity labeling of oligo or polymers with at least one ligand which has an affinity for labeling oligomer or polymer and at least one detectable property has, the oligomer or polymer at least one affinity binding site for the has at least one or more ligands and the at least one Affinity binding site of the oligomer or polymer by recombinant or synthetic methods in which oligomer or polymer has been produced, as well Compounds for performing the method according to the invention.

Mit verschiedenen modernen Methoden lassen sich einzelne Moleküle in Lösung oder an Oberflächen erfassen. Konfokale Fluoreszenzmethoden wie die in WO 94/16313 (EVOTEC BioSystems GmbH) beschriebene Methode der Fluoreszenz korrelationsspektroskopie oder die in der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 (EVOTEC BioSystems GmbH) beschriebene Methode der molekularen Helligkeitsanalyse sowie auf Ansätzen der Nahfeldspektroskopie beruhende Verfahren, wie sie beispielsweise in DE 44 38 391 (EVOTEC BioSystems GmbH) dargestellt sind, erlauben eine sichere und schnelle Detektion von Molekülen. So können beispielsweise Moleküle aufgrund ihres Diffusionsverhaltens oder aufgrund spektraler Unterschiede von gekoppelten Fluoreszenzmarkern identifiziert werden.Individual molecules can be dissolved using various modern methods or capture on surfaces. Confocal fluorescence methods like those in WO 94/16313 (EVOTEC BioSystems GmbH) described method of fluorescence correlation spectroscopy or that in European patent application 96 116 373.0 (EVOTEC BioSystems GmbH) described method of molecular Brightness analysis and approaches based on near-field spectroscopy Processes such as those in DE 44 38 391 (EVOTEC BioSystems GmbH) are shown, allow reliable and fast detection of molecules. So can, for example, molecules due to their diffusion behavior or identified due to spectral differences of coupled fluorescent markers become.

Die Notwendigkeit, einen Fluoreszenzmarker an biologisch aktive Proteine oder andere Moleküle zu koppeln, ohne daß die biologische Aktivität modifiziert wird, ist eine Schwierigkeit, die oft hohen experimentellen Aufwand erforderlich macht. Dies stellt eine erhebliche Einschränkung bei der Verbreitung der oben genannten Technologien und der Anwendung dieser Technologien z. B. in der Forschung nach neuen pharmakologischen Wirkstoffen dar. Eine spezifische Markierung von Oligo- oder Polymeren wird durch die Vielzahl reaktiver Gruppen in dem jeweiligen Molekül nahezu unmöglich. So erfolgt die Einführung von fluoreszierenden Gruppen oftmals über kovalente Bindung an chemisch reaktive Gruppen wie z. B. Lysine, Cysteine oder Serine bzw. Threonine eines Proteins, sofern diese Gruppen an der Proteinoberfläche sterisch gut zugänglich sind. Häufig sind mehrere dieser Gruppen chemisch modifizierbar, wobei aufgrund verschiedener Reaktions geschwindigkeiten oftmals eine nicht genau definierte Produktmischung entstehen kann. In Analysen können somit Ergebnisse in nicht akzeptabler Weise verfälscht werden. Andererseits ist die Qualitätskontrolle der markierten Reaktionsprodukte als solche schwierig und äußerst kostspielig.The need for a fluorescent marker on biologically active proteins or to couple other molecules without modifying the biological activity a difficulty that often requires a lot of experimentation. This places a significant restriction on the diffusion of the above Technologies and the application of these technologies e.g. B. in research new pharmacological agents. A specific labeling of oligo- or polymers is characterized by the large number of reactive groups in each Molecule almost impossible. So the introduction of fluorescent Groups often via covalent bonding to chemically reactive groups such as. B. Lysine, cysteine or serine or threonine of a protein, provided these groups are sterically accessible on the protein surface. Often, several of these are Groups chemically modifiable, due to different reaction speeds often result in a not precisely defined product mix can. In analysis, the results can be falsified in an unacceptable way become. On the other hand is the quality control of the marked reaction products as such difficult and extremely costly.

Es ist daher wünschenswert, ein allgemein einsetzbares Markierungssystem zu entwickeln, welches auf die große Mehrzahl von Oligo- oder Polymeren, insbesondere biologischen Ursprungs, anwendbar ist. In bevorzugter Weise sollen die Substanzen hierbei keine oder nur eine geringe Veränderung ihrer biologischen Aktivität durch die Markierungsreaktion erfahren.It is therefore desirable to have a general-purpose marking system develop which is based on the vast majority of oligomers or polymers, especially of biological origin. In a preferred manner the substances change little or no experience biological activity through the labeling reaction.

Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Markierungssystem auf Basis einer Affinitätsmarkierung bereit. Es handelt sich hierbei um ein Verfahren zur Affinitätsmarkierung von Oligo- oder Polymeren mit mindestens einem Liganden, der eine Affinität zum zu markierenden Oligo- oder Polymer und mindestens eine erfaßbare Eigenschaft aufweist, das Oligo- oder Polymer mindestens eine Affinitätsbindungsstelle für den mindestens einen oder mehrere Liganden besitzt und die mindestens eine Affinitätsbindungsstelle des Oligo- oder Polymeren durch rekombinante oder synthetische Methoden in dem Oligo- oder Polymer erzeugt worden ist, wobei das zu markierende Oligo- oder Polymer mit dem mindestens einen Liganden versetzt wird und nach Eingehen der Affinitätsbindung ein Affinitätskomplex entsteht, der durch die Bindung des mindestens einen Liganden eine auf den Liganden zurückführbare erfaßbare Eigenschaft erhält, die mittels eines Detektionssystems erfaßbar wird.The present invention provides such a marking system on the basis of a Affinity tag ready. It is a procedure for Affinity labeling of oligomers or polymers with at least one ligand, which has an affinity for the oligomer or polymer to be labeled and at least one has detectable property, the oligomer or polymer at least one Has affinity binding site for the at least one or more ligands and the at least one affinity binding site of the oligomer or polymer recombinant or synthetic methods generated in the oligomer or polymer has been, the oligomer or polymer to be labeled with the at least a ligand is added and after affinity binding Affinity complex arises through the binding of at least one ligand obtains a traceable property attributable to the ligand, which by means of a detection system can be detected.

Das Oligo- oder Polymer ist insbesondere ein Oligo- oder Polypeptid, ein Protein, ein Oligonukleotid, eine Nukleinsäure oder ein Derivat hiervon. The oligo or polymer is in particular an oligo or polypeptide, a protein, an oligonucleotide, a nucleic acid or a derivative thereof.

In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die rekombinant oder synthetisch eingeführte Affinitätsbindungsstelle eine Abfolge von chemischen Gruppen oder das Oligo- oder Polymere aufbauenden Struktureinheiten, die eine Affinität zu Liganden aufweisen. Viele in Assays eingesetzte Reagenzien sind synthetischen oder rekombinanten Ursprungs, so daß sich beispielsweise kurze Aminosäuresequenzen, sog. Tags, in einer dem Fachmann bekannten Weise einbauen lassen.In a preferred embodiment, it has recombinant or synthetic introduced affinity binding site a sequence of chemical groups or the structural units constituting oligomers or polymers, which have an affinity for Have ligands. Many of the reagents used in assays are synthetic or of recombinant origin, so that, for example, short Amino acid sequences, so-called tags, in a manner known to the person skilled in the art have it installed.

So ist die N- oder C-terminale Verlängerung von Proteinen oder Peptiden um sechs Histidinbausteine vorbeschrieben. Sie wird jedoch nicht, wie erfindungsgemäß dargelegt, zur Affinitätsmarkierung dieser Biopolymere eingesetzt, sondern zur Reinigung der Substanzen an Metall-Chelat-Oberflächen in der Affinitätschromatographie. Die Effizienz dieses Verfahrens beruht wahrscheinlich auf der Tatsache, daß zwei von sechs Histidinresten zwei freie Koordinationsstellen an einem zweiwertigen Nickelion besetzen, dessen übrige vier Koordinationsstellen von Nitrilotriessigsäure-Seitengruppen (NTA) des Harzes belegt werden.So is the N- or C-terminal extension of proteins or peptides six histidine building blocks described above. However, she won't like set out according to the invention, for affinity labeling of these biopolymers used, but for cleaning the substances on metal chelate surfaces in affinity chromatography. The efficiency of this process is based probably due to the fact that two out of six histidine residues are two free Occupy coordination points on a divalent nickel ion, the rest four coordination sites of nitrilotriacetic acid side groups (NTA) of the resin be occupied.

Erfindungsgemäß kann die zur Markierung verwendete Affinitätsbindungsstelle aus Histidinmolekülen aufgebaut sein. Insbesondere kann die Affinitätsbindungsstelle aus vier bis 10 Histidinmolekülen bestehen, die sequenzieil aufeinanderfolgen oder durch bevorzugt ein bis drei Struktureinheiten, insbesondere ein bis drei beliebige andere Aminosäuren, getrennt voneinander angeordnet sind.According to the invention, the affinity binding site used for labeling can be from Histidine molecules. In particular, the affinity binding site consist of four to 10 histidine molecules, which follow each other sequentially or by preferably one to three structural units, in particular one to three any other amino acids are arranged separately.

Es ist insbesondere bevorzugt, mehrzähnige Liganden zu verwenden. So kann z. B. ein Ligand verwendet werden, der mindestens zwei Nitrilotriessigsäure- Seitenketten aufweist, die entsprechend über Metallionen einen Affinitätskomplex mit dem zu markierenden Oligo- oder Polymer eingehen. Durch in geeigneter sterischer Konformation angeordnete, mehrere NTA-Seitenketten, die über sogenannte Linker miteinander und insbesondere mit einem Fluoreszenzfarbstoff verbunden sind, läßt sich die Affinität des Liganden zum zu markierenden Oligo- oder Polymer erhöhen. Geeignete Fluoreszenzfarbstoffe (wie z. B. Rhodamine, Texas Red, TAMRA, Fluorescein, Resorufine) sind dem Fachmann aus der Literatur bekannt.It is particularly preferred to use multidentate ligands. So z. B. a ligand can be used which contains at least two nitrilotriacetic acid Has side chains that have an affinity complex corresponding to metal ions deal with the oligomer or polymer to be marked. By in suitable steric conformation, several NTA side chains arranged over so-called linkers with each other and in particular with a fluorescent dye are linked, the affinity of the ligand for the oligo to be labeled can be or increase polymer. Suitable fluorescent dyes (such as Rhodamine, Texas Red, TAMRA, fluorescein, resorufine) are known to those skilled in the art known in literature.

Erfindungsgemäß ist es ebenfalls möglich, das Oligo- oder Polymer wie z. B. ein Protein um die Sequenz von Proteinen oder Peptiddomänen zu erweitern, die ihrerseits hochaffine Wechselwirkungen zu niedermolekularen lumineszenten Liganden ausbilden können. So lassen sich auch Peptide oder Proteine generieren, deren N- oder C-terminale Leserahmen z. B. durch Streptavidin oder Avidin erweitert sind. Die Markierungsreaktion kann durch Bindung lumineszenter Biotinmoleküle erfolgen.According to the invention it is also possible to use the oligomer or polymer such. B. a Protein to expand the sequence of proteins or peptide domains that in turn, high-affinity interactions with low-molecular luminescence Can form ligands. This is how peptides or proteins can be made generate whose N- or C-terminal reading frames z. B. by streptavidin or Avidin are expanded. The labeling reaction can be luminescent by binding Biotin molecules take place.

Die spektroskopisch erfaßbaren Eigenschaften sind insbesondere die molekulare Helligkeit, Fluoreszenzlebensdauer, Polarisation und/oder Winkelabhängigkeit gestreuter und/oder emittierter elektromagnetischer Strahlung. Es ist besonders bevorzugt, diese Eigenschaften auf der Basis der konfokalen Fluoreszenzspektros kopie und/oder der Nahfeldspektroskopie zu detektieren. Geeignete Detektions methoden sind in WO 94/16313 (EVOTEC BioSystems GmbH), der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 (EVOTEC BioSystems GmbH) sowie in DE 44 38 391 (EVOTEC BioSystems GmbH) detailliert beschrieben.The properties which can be detected spectroscopically are in particular the molecular ones Brightness, fluorescence lifetime, polarization and / or angle dependence scattered and / or emitted electromagnetic radiation. It is special preferred these properties based on the confocal fluorescence spectros to detect copy and / or near-field spectroscopy. Suitable detection methods are described in WO 94/16313 (EVOTEC BioSystems GmbH), the European Patent application 96 116 373.0 (EVOTEC BioSystems GmbH) and in DE 44 38 391 (EVOTEC BioSystems GmbH) described in detail.

Die Kombination des erfindungsgemäßen Markierungsverfahrens mit Methoden zum Nachweis von Einzelmolekülen läßt sich - neben Assays zur Auffindung neuer biologisch aktiver Substanzen für weitere wirtschaftlich und wissenschaftlich äußerst bedeutende Fragestellungen einsetzen. Die Methoden der Genomforschung bemühen sich zur Zeit um die Aufklärung der genetischen Erbinformation bei verschiedenen Organismen inklusive des Menschen, um die biologischen Regulations- und Differenzierungsvorgänge kausal zu verstehen. Daraus erhofft man sich neue Ansätze zur Bekämpfung menschlicher Erbkrankheiten und Infektionserkrankungen. Die Ergebnisse der Aufklärung der genetischen Sequenzen ergeben jedoch häufig keine Hinweise auf die Information und die funktionale Bedeutung der entsprechenden Sequenzabschnitte. Wichtig ist jedoch die Kenntnis der biologischen Funktion, insbesondere jedoch der Wechsel wirkungseigenschaften von Molekülen mit anderen Molekülen, wie z. B. zwischen Proteinen untereinander oder zwischen regulativen Gensegmenten und Proteinen, sowie die Störung dieser Eigenschaften im Falle pathologischer Zustände.The combination of the marking method according to the invention with methods for the detection of single molecules - in addition to assays to find new ones biologically active substances for further economically and scientifically use extremely important questions. The methods of Genome research is currently trying to elucidate genetic Genetic information in various organisms, including humans, around the to understand causal biological regulation and differentiation processes. This is hoped for new approaches to combat human beings Hereditary diseases and infectious diseases. The results of the enlightenment of the however, genetic sequences often do not provide any information and the functional significance of the corresponding sequence sections. Important is however, the knowledge of the biological function, especially the change properties of molecules with other molecules, such as. B. between Proteins with each other or between regulatory gene segments and proteins, as well as the disturbance of these properties in the case of pathological conditions.

Fig. 1 zeigt in schematischer Weise die Wechselwirkung zweier Peptide bzw. Proteine, weiche jeweils am N- bzw. C-Terminus mit einer aus 6 Histidinmolekülen versehenen Affinitätsbindungsstelle versehen sind. Diese Peptide bzw. Proteine sind jeweils durch mehrzähnige Liganden, welche einen Farbstoffanteil (F) aufweisen, markiert. Durch die Komplexierung von vier Histidinseitenketten im Falle eines zweizähnigen Liganden bzw. von sechs Histidinseitenketten im Falle eines dreizähnigen Liganden bleiben pro Histidin-Tag keine zweiten Bindungsplätze hoher Affinität für weitere NTA-Komplexbildung verfügbar. Das einzelne Molekül besitzt somit eine molekulare Helligkeit oder Leuchtkraft der Stärke 1. Bei Interaktion der beiden Moleküle entsteht ein Molekülkomplex, der eine molekulare Helligkeit oder Leuchtkraft der Stärke 2 aufweist. Die molekularen Helligkeiten der Einzelmoleküle bzw. des Molekülkomplexes können mittels des in der europäischen Patentanmeldung 96 116 373.0 (EVOTEG BioSystems GmbH) dargelegten Verfahren nachgewiesen werden. Hier zeigt sich der besondere Vorteil der spezifischen Markierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens. Bei herkömmlichen Markierungsreaktionen besteht die Gefahr, daß die beiden Moleküle nicht nur einen, sondern gegebenenfalls mehrere Farbstoffanteile aufweisen, so daß eine zuverlässige Detektion möglicherweise entstandener Molekülkomplexe erschwert wird. Fig. 1 shows the interaction schematically two peptides or proteins, each soft at the N- or C-terminus with a 6 histidine molecules provided from affinity binding site are provided. These peptides or proteins are each marked by multidentate ligands which have a dye component (F). By complexing four histidine side chains in the case of a bidentate ligand or six histidine side chains in the case of a tridentate ligand, no second binding sites of high affinity remain available for further NTA complex formation per histidine day. The individual molecule thus has a molecular brightness or luminosity of strength 1. When the two molecules interact, a molecular complex is formed which has a molecular brightness or luminosity of strength 2. The molecular brightness of the individual molecules or the molecular complex can be detected using the method described in European patent application 96 116 373.0 (EVOTEG BioSystems GmbH). This shows the particular advantage of specific marking using the method according to the invention. In conventional labeling reactions, there is a risk that the two molecules may have not only one, but possibly several dye components, so that a reliable detection of possible molecular complexes is made more difficult.

Fig. 2 zeigt in schematischer Weise eine über dritte Moleküle vermittelte Wechsel wirkung zweier nach dem erfindungsgemäßen Verfahren markierter Oligo- bzw. Polymere. Fig. 2 shows schematically an interaction mediated by third molecules interaction of two oligomers or polymers labeled according to the inventive method.

In Fig. 3 ist schematisch eine zweidimensionale Matrix dargestellt, die die Analyse der Wechselwirkung zwischen hochexprimierten, vorzugsweise sezernierten offenen Leserahmen als Funktion der molekularen Helligkeit oder Leuchtkraft wiedergibt. Es wurden jeweils die molekularen Helligkeiten der am stärksten fluoreszierenden Partikelpopulationen mit der molekularen Helligkeit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren markierten Einzelmoleküle (Leuchtkraft der Stärke 1) verglichen. Die Matrixverteilung legt bezüglich der Analyse der Wechselwirkungen von Molekülen M2 und M5 untereinander bzw. mit sich selbst nahe, daß M2-Moleküle im Gegensatz zu M5-Molekülen mit sich selbst Dimere ausbilden können. Ein aus drei Komponenten bestehender Komplex sollte eine molekulare Helligkeit der Stärke 3 aufweisen. Die Matrixverteilung legt einen derartigen Komplex aus zwei M2-Molekülen und einem M5-Molekül nahe. Das Paar M5/M6 legt eine Heteroduplexbildung nahe. Eine derartige Matrix ist geeignet, funktionale Wechselwirkungen zwischen Molekülen aufzufinden, die beide den Orphan-Status haben. Die miteinander in Wechselwirkung tretenden Moleküle können jeweils aus verschiedenen rekombinanten Zellen sezerniert werden, wobei auch Mischungen von Zellen oder kokultivierte Zellen eingesetzt werden können, die jeweils unterschiedliche Moleküle exprimieren. Die Proteine müssen nicht notwendigerweise sezerniert werden. Die Komplexe können auch in Zellen oder in Lysaten analysiert werden. Auch der Einsatz von in vitro Expressionssystemen ist möglich. FIG. 3 schematically shows a two-dimensional matrix which shows the analysis of the interaction between highly expressed, preferably secreted, open reading frames as a function of the molecular brightness or luminosity. The molecular brightnesses of the most fluorescent particle populations were compared in each case with the molecular brightness of the individual molecules marked by the method according to the invention (luminosity of strength 1). With regard to the analysis of the interactions of molecules M2 and M5 with one another or with oneself, the matrix distribution suggests that, in contrast to M5 molecules, M2 molecules can form dimers with themselves. A complex consisting of three components should have a molecular brightness of strength 3. The matrix distribution suggests such a complex of two M2 molecules and one M5 molecule. The pair M5 / M6 suggests heteroduplex formation. Such a matrix is suitable for finding functional interactions between molecules, both of which have the orphan status. The molecules which interact with one another can each be secreted from different recombinant cells, it also being possible to use mixtures of cells or co-cultivated cells which each express different molecules. The proteins do not necessarily have to be secreted. The complexes can also be analyzed in cells or in lysates. The use of in vitro expression systems is also possible.

In einer analogen Problemstellung ist einer der Partner bereits funktional zugeordnet, gesucht wird aber ein unbekannter Ligand oder interagierender Gofaktor aus einer Expressionsbank. Für diesen Fall würde die Matrix eindimensional.In an analogous problem, one of the partners is already functional assigned, but is searched for an unknown ligand or interacting Gofactor from an expression bank. In this case, the matrix one-dimensional.

Für den Fall, daß ein spezifisches Wechselwirkungssystem identifiziert ist, kann unmittelbar nach neuen Wirkstoffen (Agonisten, Antagonisten) gescreent werden.In the event that a specific interaction system is identified, be screened immediately for new active substances (agonists, antagonists).

Fig. 4 zeigt einen Signaltransduktions-Zellassay anhand sezernierter Botenstoffe. Es ist ein zelluläres Assay-System beschrieben, das sich insbesondere für die Miniaturisierung und hohe Parallelisierung eignet. In Probeträgerstrukturen, wie sie beispielsweise in DE 41 32 379 (Kernforschungszentrum Karlsruhe GmbH) beschrieben sind, lassen sich Zellpopulationen kultivieren, die anschließend anhand spezifisch sezernierter Produkte auf ihre Reaktion gegenüber potentiellen pharmakologischen Wirkstoffen analysiert werden können. Die Methode ist beispielsweise geeignet um die Produktion von Proteinen oder Peptiden zu verfolgen, die mindestens zwei Erkennungsstellen für markierte Antikörper aufweisen. Fig. 4 shows a signal transduction cell assay based secreted messengers. A cellular assay system is described which is particularly suitable for miniaturization and high parallelization. In sample carrier structures, as described for example in DE 41 32 379 (Kernforschungszentrum Karlsruhe GmbH), cell populations can be cultivated, which can then be analyzed for their reaction to potential pharmacologically active substances using specifically secreted products. The method is suitable, for example, to track the production of proteins or peptides that have at least two recognition sites for labeled antibodies.

Fig. 5 zeigt schematisch einen zweizähnigen NTA-Liganden mit einem Fluoreszenzfarbstoff F. Fig. 5 shows schematically a bidentate NTA ligand with a fluorescent dye F.

Fig. 6 zeigt schematisch die funktionale Genomanalyse von sezernierten orphan- Expressionsprodukten aus kokultivierten Klonen. Fig. 6 shows schematically the functional genome analysis of secreted orphan expression products from co-cultured clones.

Fig. 7 zeigt die Wechselwirkung eines mit dem Farbstoff TAMRA markierten zweizähnigen Liganden auf Ni-NTA-Basis mit einem Protein, das einen aus acht Histidinen bestehenden Tag aufweist. Figure 7 shows the interaction of a Ni-NTA-based bidentate ligand labeled with TAMRA with a protein having a tag consisting of eight histidines.

Fig. 8 zeigt schematisch die Wechselwirkung eines mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens markierten Protein A, das an einen Antikörper bindet. FIG. 8 schematically shows the interaction of a protein A labeled by means of the method according to the invention, which binds to an antibody.

Fig. 9 zeigt einen mit dem Farbstoff TAMRA markierten zweizähnigen Liganden auf NTA-Basis. FIG. 9 shows a bidentate NTA-based ligand labeled with the dye TAMRA.

Fig. 10 zeigt einen mit dem Farbstoff TAMRA markierten dreizähnigen Liganden auf NTA-Basis. Fig. 10 shows a labeled with the dye TAMRA tridentate ligand NTA basis.

Claims

1. A method for affinity labeling of oligomers or polymers with at least a ligand which has an affinity for the oligomer or polymer to be labeled and the oligomer or polymer has at least one detectable property at least one affinity binding site for the at least one or more Has ligands and the at least one affinity binding site of the oligo- or Polymers by recombinant or synthetic methods in the oligo- or Polymer has been generated, the oligomer or polymer to be labeled with to which at least one ligand is added and after the affinity has entered binding an affinity complex arises, which by binding the at least a ligand is a detectable property attributable to the ligand receives, which can be detected by means of a detection system.

2. The method according to claim 1, characterized in that the oligo or Polymer an oligo- or polypeptide, a protein, an oligonucleotide, a Is nucleic acid or derivatives thereof.

3. The method according to claim 1 and / or 2, characterized in that the recombinantly or synthetically introduced affinity binding site a sequence of chemical groups or the oligomer or polymer building Has structural units that have an affinity for ligands.

4. The method according to at least one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the affinity binding site by a sequence of Amino acids is determined using chelating agents via metal ion complexes or enter into an affinity complex with biotin.

5. The method according to claim 4, characterized in that the Affinity binding site is built up from histidine molecules.

6. The method according to claim 5, characterized in that the Affinity binding site consists in particular of 4 to 10 histine molecules that sequentially or by preferably 1 to 3 structural units, in particular 1 to 3 any other amino acids, separated from one another are arranged.

7. The method according to claim 4, characterized in that the Affinity binding site consists of avidin, streptavidin or fragments thereof.

8. The method according to at least one of claims 1 to 7, characterized characterized in that the ligand is a spectroscopic, in particular has luminometric, detectable property.

9. The method according to claim 8, characterized in that the ligand Contains dye.

10. The method according to claim 8, characterized in that the spectroscopic detectable property molecular brightness, fluorescence lifetime, polarization and / or angular dependence of scattered and / or emitted electromagnetic Radiation is.

11. The method according to at least one of claims 1 to 10, characterized characterized in that the detection based on confocal fluorescence spectroscopy or near-field spectroscopy.

12. Connection to carry out the method according to one of the Claims 1 to 11 with a structural element that by Chelati binding to another molecule and another structure Has element that is detectable spectroscopically.