DE19741375C2 - Transgenic plants, the above-ground parts of which ripen earlier and die off completely - Google Patents
Transgenic plants, the above-ground parts of which ripen earlier and die off completelyInfo
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Abstract
Beschrieben werden transgene Pflanzen, insbesondere Kartoffelpflanzen, deren oberirdische Teile früher und schneller reifen als bei Wildtyp-Pflanzen und vollständig absterben, ohne daß dies den Ertrag unterirdischer Pflanzenteile beeinflußt. Diese Pflanzen sind gekennzeichnet durch eine Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase in den Zellen. DOLLAR A Beschrieben werden ferner Verfahren zur Herstellung solcher Pflanzen, sowie Nucleinsäuremoleküle, die pflanzliche GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.Transgenic plants are described, in particular potato plants, the above-ground parts of which ripen earlier and faster than in wild-type plants and die completely, without this affecting the yield of underground plant parts. These plants are characterized by a decrease in the activity of GDP-mannose pyrophosphorylase in the cells. DOLLAR A also describes processes for the production of such plants, and also nucleic acid molecules which encode plant GDP-mannose pyrophosphorylase.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen, deren oberirdische Teile früher und schneller reifen als bei Wild typ-Pflanzen und vollständig absterben, ohne daß dies den Ertrag unterirdischer Pflanzenteile beeinflußt. Die Pflanzen sind gekennzeichnet durch eine Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase in den Zellen. Ferner be trifft die Erfindung die Verwendung von Nucleinsäuremolekü len, die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren, oder von Fragmenten solcher Moleküle zur Herstellung von Pflanzen mit einer verringerten Aktivität dieses Enzyms. Ebenso be trifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die pflanzliche Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.The present invention relates to transgenic plants whose Above-ground parts ripen earlier and faster than in game type plants and die completely without this Yield of parts of plants affected. The plants are characterized by a decrease in activity the GDP-mannose pyrophosphorylase in the cells. Furthermore be the invention relates to the use of nucleic acid molecules len encoding a GDP-mannose pyrophosphorylase, or of fragments of such molecules for the production of plants with a reduced activity of this enzyme. Likewise be the present invention relates to nucleic acid molecules that vegetable proteins with the enzymatic activity of a Encode GDP-mannose pyrophosphorylase.
In der Produktionstechnik beim Anbau vieler landwirtschaft licher Kulturen werden durch den Einsatz von Herbiziden ge zielt oberirdische vegetative Pflanzenteile abgetötet, um eine gleichmäßige Abreife, d. h. das Reifen und Absterben, oberirdischer Pflanzenteile zu erreichen. Dies ermöglicht eine leichtere Ernte der wertgebenden Organe oder Pflanzen teile und gewährleistet eine bessere Pflanzenhygiene. So werden insbesondere beim Anbau von Baumwolle und der Kar toffel die Pflanzen vor der Abreife mit Herbiziden behan delt. Bei der Baumwolle wird dadurch bewirkt, daß die Blät ter abfallen und somit die maschinelle Ernte der Fasern er leichtert wird. Bei der Kartoffel wird das Abtöten des Krau tes aus einer Vielzahl von Gründen durchgeführt:In production technology when growing a lot of agriculture Cultures are cultivated through the use of herbicides aims to kill vegetative plant parts above ground even ripening, d. H. the ripening and dying, to reach above-ground parts of plants. this makes possible easier harvesting of valuable organs or plants share and ensure better plant hygiene. So especially when growing cotton and the Kar toffel the plants with herbicides before ripening delt. In the case of cotton, this causes the leaves and the machine harvesting of the fibers is lightened. In the case of the potato, killing the kraut tes done for a variety of reasons:
Das Abtöten des Krauts bewirkt eine Verminderung der Kraut masse und verursacht so ein besseres Abtrocknen der Dämme. Dies bewirkt eine Zunahme der Schalenfestigkeit und vermin dert so die bei der Ernte verursachten Beschädigungen der Kartoffelknollen und somit das Auftreten von Lagerfäulen. Weiterhin sind die Verschmutzungen der geernteten Knollen durch die bessere Trocknung geringer. Außerdem erlaubt das Abtöten des Krauts eine höhere Fahrgeschwindigkeit beim Ro den und somit eine höhere Flächenleistung. Die Trennung von Knolle und Kraut erfolgt effektiver, wodurch eventuelle Ern teverluste verringert werden. Die phytosanitären Aspekte des Krautabtötens liegen in einer Verminderung der Knolleninfek tion mit Phytophthora und einer Vielzahl von Kartoffelviren. Insbesondere beim Anbau bei spätreifenden Wirtschaftsorten wird durch das Krautabtöten eine Ernte erst ermöglicht. Das Abtöten und Entfernen des Kartoffelkrauts mit Herbiziden wird in der Regel unterstützt durch den Einsatz eines Kraut schlägers, oder ausschließlich damit durchgeführt. Diese Verfahren sind arbeits- und kostenintensiv und würden sich im Falle eines termingerechten vollständigen Abreifens des Krauts erübrigen. Killing the herb causes the herb to diminish mass and causes the dams to dry better. This causes an increase in the shell strength and min damage caused during harvesting Potato tubers and thus the appearance of stock rot. Furthermore, the contaminations of the harvested tubers are thanks to better drying. It also allows Killing the herb a higher driving speed with the ro and thus a higher area coverage. The separation of Tuber and cabbage are more effective, which means that any nourishment loss of tea can be reduced. The phytosanitary aspects of Herb killing is a reduction in tuberous infections tion with Phytophthora and a variety of potato viruses. Especially when growing in late ripening economic locations harvesting is made possible by killing herbs. Killing and removing the potato herb with herbicides is usually supported by the use of an herb racket, or performed exclusively with it. This Processes are labor and cost intensive and would be in the event that the No need for herbs.
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die der Verminde rung des Einsatzes von Herbiziden in der Landwirtschaft in letzter Zeit beigemessen wird, ist es eine der Aufgaben der biotechnologischen Forschung, sich um eine Anpassung der Pflanzen an die Anforderungen der Anbautechnik zu bemühen, so daß gegebenenfalls auf den Einsatz von Herbiziden ver zichtet werden kann.In view of the increasing importance that of the people tion of the use of herbicides in agriculture in is attributed recently, it is one of the tasks of biotechnological research to adapt the To strive plants to the requirements of the cultivation technology, so that if necessary ver on the use of herbicides can be waived.
Es erscheint daher wünschenswert, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die bei voller Ertragsleistung termingerecht und vollständig abreifen, um so den Einsatz chemischer oder me chanischer Verfahren zum Abtöten des Kartoffelkrauts mini mieren zu können oder gegebenenfalls vollständig darauf ver zichten zu können.It therefore appears desirable to have plants available places that are on schedule and with full yield fully ripen so as to use chemical or me chanic process for killing the potato herb mini be able to lubricate or if necessary completely ver to be able to do.
Der vorliegenden Anmeldung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, deren oberirdische Teile früher und schneller als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen reifen und vollständig absterben ohne eine Ertragsminderung anderer, insbesondere unterirdischer, Pflanzenteile aufzu weisen.The present application is therefore based on the task To provide plants, their aerial parts earlier and faster than with corresponding wild-type plants ripen and die completely without a reduction in yield other, especially underground, plant parts point.
Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen be zeichneten Ausführungsformen gelöst.This task is by be in the claims Drawn embodiments solved.
Somit betrifft die vorliegende Anmeldung transgene Pflanzen enthaltend Pflanzenzellen, die genetisch modifiziert sind, wobei die genetische Modifikation zur Verringerung der Akti vität einer endogenen in der Pflanzenzelle vorkommende GDP- Mannose Pyrophosphorylase (EC 2.7.7.22) führt im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen sol cher Pflanzen.The present application thus relates to transgenic plants containing plant cells that are genetically modified, the genetic modification to reduce the acti vity of an endogenous GDP occurring in the plant cell Mannose pyrophosphorylase (EC 2.7.7.22) leads in comparison to corresponding non-genetically modified cells sol plants.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei die GDP-Man
nose Pyrophosphorylase, deren Aktivität reduziert wird, ein
pflanzliches Protein, das codiert wird von einem Nucleinsäu
remolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
In a preferred embodiment, the GDP man-made pyrophosphorylase, the activity of which is reduced, is a vegetable protein which is encoded by a nucleic acid molecule selected from the group consisting of:
- a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;a) Nucleic acid molecules that encode a protein that the under Seq ID No. 2 includes amino acid sequence indicated;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 ange gebene codierende Region umfassen;b) Nucleic acid molecules which are listed under Seq ID No. 1 attached include given coding region;
- c) Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in dem Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird;c) nucleic acid molecules that encode a protein that the Amino acid sequence encompassed by the insertion in the Plasmid pGMPase (DSM 11746) is encoded;
- d) Nucleinsäuremoleküle, die die codierende Region umfas sen, die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthalten ist;d) nucleic acid molecules encompassing the coding region sen in the insertion of the plasmid pGMPase (DSM 11746) is included;
- e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) hy bridisieren; unde) nucleic acid molecules, which with a strand of a Nucleic acid molecule according to (a), (b), (c) and / or (d) hy bridify; and
- f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Dege neration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.f) nucleic acid molecules whose sequence is due to the Dege generation of the genetic code from the sequence of a Nucleic acid molecule deviates according to (e).
Für die Definition des Begriffs "Hybridisierung" wird dabei auf weiter unten verwiesen.For the definition of the term "hybridization" referenced below.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß bei Kartof felpflanzen, bei denen die Expression und somit die Aktivi tät der GDP-Mannose Pyrophosphorylase aufgrund der Expres sion einer entsprechenden antisense-RNA verringert ist, die oberirdischen Teile (das Kraut) wesentlich schneller abrei fen als bei entsprechenden nicht modifizierten Wildtyp- Pflanzen. Ferner reifen sie in relativ kurzer Zeit vollstän dig ab. Dadurch wird jedoch der Knollenertrag der Pflanzen nicht beeinträchtigt.It has now surprisingly been found that Kartof felp plants in which the expression and thus the activi the GDP-mannose pyrophosphorylase due to the express sion of a corresponding antisense RNA is reduced, the Above-ground parts (the herb) rip off much faster than with corresponding unmodified wild-type Plants. Furthermore, they ripen completely in a relatively short time dig from. However, this will increase the tuber yield of the plants not affected.
Der Begriff "entsprechende Wildtyp-Pflanzen" bedeutet dabei, daß es sich um Pflanzen handelt, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen Pflanzen dienten, d. h. deren genetische Information abgesehen von der einge führten genetischen Modifikation der einer erfindungsgemäßen Pflanze entspricht. The term "corresponding wild-type plants" means that it is plants that are used as starting material served for the production of the plants according to the invention, d. H. whose genetic information apart from the one performed genetic modification of an inventive Plant corresponds.
Der Begriff "Abreifen" bedeutet dabei das Reifen und Abster ben der oberirdischen Teile der Pflanzen. Vorzugsweise be deutet dabei Reifen und Absterben das Auftreten dunkler Flecken zuerst an Stengeln, das Auftreten von Läsionen an Blättern in Form kleiner schwarzer Punkte, sowie das Ver trocknen der Blätter. Bevorzugt vertrocknet das Blatt dabei von der Spitze her fortschreitend bis zum Stengel. Darüber hinaus vertrocknen vorzugsweise die Blätter der Pflanze zu erst, die unten am Stengel ansetzen, und das Vertrocknen der Blätter setzt sich an der Pflanze fortschreitend von unten nach oben fort, bis schließlich alle oberirdischen Pflanzen teile abgereift sind.The term "ripening" means ripening and destroying ben of the aerial parts of the plants. Preferably be ripening and dying indicate the occurrence darker Stains on stems first, the appearance of lesions Scroll in the form of small black dots, as well as the ver dry the leaves. The sheet preferably dries up progressing from the tip to the stem. About that in addition, the leaves of the plant preferably dry up first, the bottom of the stem, and the drying of the Leaves progressively settle on the plant from below continue up until finally all aerial plants parts have matured.
Daß die genetisch modifizierten Pflanzen schneller abreifen bedeutet dabei, daß zum einen das Absterben der oberirdi schen Teile, insbesondere der Blätter, Stengel und gegebe nenfalls Früchte früher einsetzt als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen und/oder daß der gesamte Prozeß des Abrei fens wesentlich schneller verläuft als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen und früher abgeschlossen ist.That the genetically modified plants mature faster means that on the one hand the death of the above ground parts, in particular of the leaves, stems and given if necessary, fruit starts earlier than with corresponding ones Wild-type plants and / or that the whole process of wiping fens runs much faster than the corresponding ones Wild-type plants and completed earlier.
Daß der Prozeß "früher" einsetzt bedeutet dabei vorzugs weise, daß das Reifen und Absterben der oberirdischen Teile mindestens eine Woche, bevorzugt mindestens 2 bis 3 Wochen und besonders bevorzugt ca. 4 Wochen früher einsetzt als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen.That the process starts "earlier" means preferentially evidence that the ripening and death of the aerial parts at least one week, preferably at least 2 to 3 weeks and particularly preferably starts about 4 weeks earlier than at corresponding wild-type plants.
Daß der Prozeß des Abreifens "schneller" erfolgt bedeutet dabei vorzugsweise, daß der Prozeß des Reifens und Abster bens der oberirdischen Teile der Pflanzen insgesamt schnel ler verläuft als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen, bevor zugt um mindestens eine Woche schneller und besonders bevor zugt um mindestens zwei Wochen schneller.That the ripening process means "faster" preferably that the process of ripening and abster bens of the aerial parts of the plants as a whole It runs before than with corresponding wild-type plants moves at least a week faster and especially before moves at least two weeks faster.
Daß der Prozeß des Reifens und Absterbens früher abgeschlos sen ist, bedeutet dabei, daß die oberirdischen Teile der er findungsgemäßen Pflanzen vorzugsweise mindestens 1 bis 4 Wo chen, bevorzugt mindestens 2 bis 4 Wochen und besonders be vorzugt mindestens 3 bis 4 Wochen früher abgestorben sind als die oberirdischen Teile entsprechender Wildtyp-Pflanzen. That the process of ripening and dying ended earlier sen means that the aerial parts of the er plants according to the invention preferably at least 1 to 4 weeks chen, preferably at least 2 to 4 weeks and especially be preferably died at least 3 to 4 weeks earlier than the above-ground parts of corresponding wild-type plants.
Daß der Prozeß des Reifens früher abgeschlossen ist, bedeu tet ferner vorzugsweise, daß die oberirdischen Teile der er findungsgemäßen Pflanzen bereits vollständig abgestorben sind, bevor bei den oberirdischen Teilen entsprechender Wildtyp-Pflanzen der Prozeß des Reifens begonnen hat.That the process of ripening is completed earlier is important tet preferably also that the aerial parts of the he plants according to the invention have already died completely are more appropriate before the above-ground parts Wild-type plants have started the process of ripening.
Insbesondere sterben die oberirdischen Teile erfindungsge mäßer Pflanzen ca. 4 Wochen früher als die von entsprechen den Wildtyp-Pflanzen ab, wenn die Pflanzen unter folgenden Bedingungen gehalten werden: in 16er-Töpfen mit Topferde (Pikiererde)/Sand-Mischung 3 : 1; Luftfeuchtigkeit 60%; Tem peratur 22°C tags/15°C nachts; 16 h Licht/ 8 h Dunkel-Rhyth mus,; Lichtintensität ca. 150 µE.In particular, the aerial parts die according to the invention moderate plants about 4 weeks earlier than that of the wild-type plants if the plants are among the following Conditions are kept: in 16-piece pots with potting soil (Prickly soil) / sand mixture 3: 1; Humidity 60%; Tem temperature 22 ° C during the day / 15 ° C at night; 16 h light / 8 h dark rhythm mus ,; Light intensity approx. 150 µE.
Daß die erfindungsgemäßen Pflanzen vollständig abreifen be deutet, daß alle oberirdischen Teile der Pflanze absterben, insbesondere, daß diese Teile komplett absterben.That the plants according to the invention mature completely indicates that all aerial parts of the plant are dying, especially that these parts die completely.
Derartige erfindungsgemäße Pflanzen haben beispielsweise den Vorteil, daß vollständig auf den Einsatz von Herbiziden ver zichtet werden kann, um eine gleichmäßige Abreife der ober irdischen Pflanzenteile zu erreichen. Im Zusammenhang bei spielsweise mit an sich spätreifenden Kartoffelpflanzen be steht nun die Möglichkeit, diese derart zu verändern, daß ihr Kraut früher und vollständig reift und abstirbt.Such plants according to the invention have, for example Advantage that ver completely on the use of herbicides can be waived in order to ripen evenly the upper to reach earthly plant parts. Related to for example, with potato plants that mature in themselves there is now the possibility to change them in such a way that her herb ripens and dies earlier and completely.
Weiterhin ergibt sich generell ein Vorteil daraus, daß das Kraut der erfindungsgemäßen Pflanzen vollständig abstirbt. Selbst bei den bisher in der Landwirtschaft verwendeten frü her reifenden Kartoffelpflanzen besteht das Problem, daß das Kraut nie komplett abstirbt und somit in jedem Fall der Ein satz von Herbiziden und Krautschlägern erforderlich ist. Durch den Anbau von Pflanzen, bei denen das Kraut vollstän dig abstirbt, könnte auf den Einsatz dieser Maßnahmen voll kommen verzichtet werden.Furthermore, there is generally an advantage that the Herb of the plants according to the invention dies completely. Even with the early hitherto used in agriculture The problem with ripening potato plants is that Herb never dies completely and therefore in any case the one set of herbicides and herb beaters is required. By growing plants where the herb is complete dig dies, could use these measures fully come to be waived.
Der Begriff "transgen" bedeutet, daß Zellen der erfindungs gemäßen Pflanzen in ihrem Genom eine fremde DNA-Sequenz ent halten, die in entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen entsprechender Wildtyp-Pflanzen nicht vorkommt. "Fremde DNA-Sequenz" bedeutet dabei eine DNA-Sequenz, die entweder natürlicherweise gar nicht in den entsprechenden pflanzlichen Zellen vorkommt, d. h. die heterolog zu den Zellen ist, die in der konkreten räumlichen Anordnung so nicht natürlicherweise in den Pflanzenzellen vorkommt oder die an einem Ort im Genom der Pflanzenzelle lokalisiert ist, an dem sie natürlicherweise nicht vorkommt. Bevorzugt ist die fremde DNA-Sequenz ein rekombinantes Molekül, das aus verschiedenen Elementen besteht, dessen Kombination oder spezifische räumliche Anordnung natürlicherweise in pflanz lichen Zellen nicht auftritt.The term "transgenic" means that cells of the invention plants according to their genome a foreign DNA sequence ent keep that in appropriate non-genetically modified Cells of corresponding wild-type plants do not occur. "Foreign DNA sequence" means a DNA sequence that either naturally not at all in the corresponding plant cells occurs, d. H. the heterologous too the cells is like that in the concrete spatial arrangement does not occur naturally in the plant cells or located in the genome of the plant cell on which it does not naturally occur. Is preferred the foreign DNA sequence is a recombinant molecule that consists of different elements, its combination or specific spatial arrangement naturally in plants cells does not occur.
Das Vorhandensein, die Lokalisation sowie die räumliche An ordnung der fremden DNA-Sequenz im Genom der Zellen erfin dungsgemäßer Pflanzen läßt sich beispielsweise durch Southern-Blot-Analyse nachweisen.The existence, the location and the spatial location order of the foreign DNA sequence in the genome of the cells invented Plants according to the invention can be, for example, by Detect Southern blot analysis.
Der Begriff "genetisch modifiziert" bedeutet, daß die Pflan zenzelle durch Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls in ihrer genetischen Information verändert ist und daß das Vorhandensein oder die Expression des fremden Nucleinsäure moleküls zu einer phänotypischen Veränderung führt. Phänoty pische Veränderung bedeutet dabei vorzugsweise eine meßbare Veränderung einer oder mehrerer Funktionen der Zellen. Die genetisch modifizierten Pflanzenzellen der erfindungsgemäßen Pflanzen zeigen aufgrund des Vorhandenseins oder bei Expres sion des eingeführten fremden Nucleinsäuremoleküls eine Ver ringerung der Aktivität einer endogen in der Pflanze vorkom menden GDP-Mannose Phosphorylase. Das Enzym GDP-Mannose Py rophosphorylase (EC 2.7.7.22) katalysiert die Umwandlung von GTP und Mannose-1-Phosphat zu GDP-Mannose und Pyrophosphat. Der Begriff "Verringerung der Aktivität" bedeutet dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verringerung der Ex pression endogener Gene, die eine GDP-Mannose Pyrophospho rylase codieren, eine Verringerung der Menge an GDP-Mannose Pyrophosphorylase in den Zellen und/oder eine Verringerung der enzymatischen Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphory lase in den Zellen. The term "genetically modified" means that the plant cell by introducing a foreign nucleic acid molecule is changed in their genetic information and that the Presence or expression of the foreign nucleic acid leads to a phenotypic change. Phenoty This change preferably means a measurable one Change one or more functions of the cells. The genetically modified plant cells of the invention Plants show due to the presence or with express sion of the introduced foreign nucleic acid molecule a ver decrease in the activity of an endogenous plant mend GDP-mannose phosphorylase. The enzyme GDP-Mannose Py rophosphorylase (EC 2.7.7.22) catalyzes the conversion of GTP and Mannose-1-Phosphate to GDP-Mannose and Pyrophosphate. The term "reduction in activity" means in Within the scope of the present invention, a reduction in Ex pression of endogenous genes that constitute a GDP-mannose pyrophospho encode rylase, a reduction in the amount of GDP mannose Pyrophosphorylase in the cells and / or a decrease the enzymatic activity of GDP-Mannose Pyrophosphory read in the cells.
Die Verringerung der Expression kann beispielsweise bestimmt werden durch Messung der Menge an GDP-Mannose Pyrophospho rylase codierenden Transkripten, z. B. durch Northern-Blot- Analyse. Eine "Verringerung" bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung der Menge an Transkripten im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um min destens 10%, bevorzugt um mindestens 30%, insbesondere um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70% und insbesondere um mindestens 90%.The reduction in expression can be determined, for example are determined by measuring the amount of GDP-Mannose Pyrophospho transcripts encoding rylase, e.g. B. by Northern blot Analysis. A "reduction" preferably means a reduction in the amount of transcripts compared to corresponding non-genetically modified cells by min at least 10%, preferably by at least 30%, in particular by at least 50%, particularly preferably at least 70% and in particular by at least 90%.
Die Verringerung der Menge an GDP-Mannose Pyrophosphorylase kann beispielsweise bestimmt werden durch Western-Blot-Ana lyse. Eine "Verringerung" bedeutet dabei vorzugsweise eine Verringerung der Menge an GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Pro tein im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifi zierten Zellen um mindestens 10%, bevorzugt um mindestens 30%, insbesondere um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70% und insbesondere um mindestens 90%.Reducing the amount of GDP-mannose pyrophosphorylase can be determined, for example, by Western blot ana lysis. A "reduction" preferably means one Reduction in the amount of GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Pro tein compared to corresponding non-genetically modifi decorated cells by at least 10%, preferably by at least 30%, in particular by at least 50%, particularly preferred by at least 70% and in particular by at least 90%.
Die Verringerung der enzymatischen Aktivität kann beispiels weise bestimmt werden durch die Umwandlung von GTP und Man nose-1-Phosphat zu GDP-Mannose und Pyrophosphat.The reduction in the enzymatic activity can, for example can be determined wisely by converting GTP and Man nose-1-phosphate to GDP-mannose and pyrophosphate.
Die Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase läßt sich beispielsweise bestimmen wie beschrieben in Asua et al. (Biochim. Biophys. Acta 128 (1966), 582-585) oder in Szumilo et al. (J. Biol. Chem. 268 (1993), 17943-17950). Eine "Ver ringerung" der enzymatischen Aktivität bedeutet dabei vor zugsweise eine Verringerung im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um mindestens 10%, be vorzugt um mindestens 30%, insbesondere um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70% und insbesondere um mindestens 90%.The activity of GDP-mannose pyrophosphorylase can be for example, as described in Asua et al. (Biochim. Biophys. Acta 128 (1966), 582-585) or in Szumilo et al. (1993, J. Biol. Chem. 268: 17943-17950). A "Ver Reduction "of the enzymatic activity means before preferably a reduction compared to the corresponding non-genetically modified cells by at least 10%, be preferably by at least 30%, in particular by at least 50%, particularly preferably by at least 70% and in particular by at least 90%.
Die genetische Modifikation mittels eines fremden Nuclein säuremoleküls, das in die Zellen der erfindungsgemäßen Pflanzen eingeführt wurde und dessen Vorhandensein oder Ex pression zur Verringerung der GDP-Mannose Pyrophosphorylase- Aktivität führt, kann unterschiedlicher Natur sein. The genetic modification using a foreign nuclein acid molecule that enters the cells of the invention Plants was introduced and its presence or ex pression to reduce GDP-mannose pyrophosphorylase Activity leads can be of different types.
Zum einen kann die genetische Modifikation darin bestehen, daß ein endogen in der Pflanzenzelle vorliegendes Gen, das eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codiert, durch Einführen eines fremden Nucleinsäuremoleküls derart verändert wird, daß seine Expression verringert oder vollständig unterdrückt ist. Eine Verringerung bedeutet dabei vorzugsweise eine Ver ringerung der Transkription um mindestens 10%, bevorzugt um mindestens 30%, insbesondere um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, insbesondere mindestens 90% im Vergleich zu nicht genetisch modifizierten Zellen. Dies kann z. B. über Northern-Blot-Analyse bestimmt werden. Diese Verringerung der Transkription bewirkt vorzugsweise eine entsprechende Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Py rophosphorylase. Eine derartige genetische Modifikation kann beispielsweise in einer Insertion oder Deletion im codieren den Bereich oder in der Promotorregion eines GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Gens bestehen.On the one hand, the genetic modification can consist in that an endogenous gene present in the plant cell, the encoded a GDP-mannose pyrophosphorylase by insertion of a foreign nucleic acid molecule is changed in such a way that its expression is reduced or completely suppressed is. A reduction preferably means a Ver reduction in transcription by at least 10%, preferably by at least 30%, especially at least 50%, especially preferably by at least 70%, in particular at least 90% compared to non-genetically modified cells. This can e.g. B. be determined by Northern blot analysis. This Reducing transcription preferably causes one corresponding reduction in the activity of GDP-Mannose Py rophosphorylase. Such a genetic modification can for example in an insertion or deletion in the code the area or promoter region of a GDP mannose Pyrophosphorylase gene exist.
Ferner kann die genetische Modifikation die Synthese einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase hervorrufen, die keine enzyma tische Aktivität mehr aufweist. Dies kann z. B. auf Mutatio nen in der codierenden Region des Gens beruhen, die zu einem Verlust der enzymatischen Aktivität führen oder zu einem fehlerhaften Splicing der mRNA.Furthermore, the genetic modification can be the synthesis of a GDP-Mannose Pyrophosphorylase cause that no enzyma table activity has more. This can e.g. B. on mutation are based in the coding region of the gene leading to a Loss of enzymatic activity will result in or faulty splicing of the mRNA.
Verfahren, um genetische Modifikationen in Gene oder deren regulatorische Bereiche einzuführen, die zur Verringerung oder zum Verlust der Expression des Gens führen, sind dem Fachmann bekannt. Dazu gehören z. B. Transposon-Mutagenese oder gene-tagging.Process to make genetic modifications in genes or their introduce regulatory areas to reduce or lead to loss of expression of the gene are the Known specialist. These include e.g. B. Transposon mutagenesis or gene tagging.
Denkbar ist ferner die Einführung eines fremden Nucleinsäu remoleküls, das einen Inhibitor der GDP-Mannose Pyrophospho rylase codiert, z. B. einen Antikörper, dessen Bindung an das Enzym zur Inhibierung der enzymatischen Aktivität führt.The introduction of a foreign nucleic acid is also conceivable remolecule, which is an inhibitor of GDP-mannose pyrophospho rylase encoded, e.g. B. an antibody whose binding to the Enzyme leads to inhibition of the enzymatic activity.
Vorzugsweise besteht die genetische Modifikation in der Ein führung eines fremden Nucleinsäuremoleküls in das Genom der Pflanzenzelle, dessen Expression zur Inhibierung der Expres sion endogener Gene führt, die eine GDP-Mannose Pyrophospho rylase codieren, insbesondere auf der Transkriptions- oder auf der Translationsebene.The genetic modification preferably consists of the one introduction of a foreign nucleic acid molecule into the genome of the Plant cell, the expression of which inhibits the expression sion of endogenous genes that leads to GDP-mannose pyrophospho encode rylase, especially on the transcription or at the translation level.
Bevorzugt sind hierbei Nucleinsäuremoleküle, die eine ge eignete antisense-RNA, ein geeignetes Ribozym oder eine ge eignete Cosuppressions-RNA codieren.Preferred are nucleic acid molecules that have a ge suitable antisense RNA, a suitable ribozyme or a ge encode suitable cosuppression RNA.
Bei einem antisense-Effekt wird eine entsprechende DNA-Se quenz in antisense-Orientierung exprimiert, so daß in den Zellen eine antisense-RNA synthetisiert wird, die zu Trans kripten von GDP-Mannose Pyrophosphvrylase Genen oder zu Tei len solcher Transkripte homolog ist. Diese hat vorzugsweise eine Länge von mindestens 30 Nucleotiden, bevorzugt von min destens 50 Nucleotiden und besonders bevorzugt von minde stens 100 Nucleotiden. Die exprimierte antisense-RNA sollte eine hohe Homologie zu den endogen in der Pflanze exprimier ten Transkripten, die GDP-Mannose Pyrophosphorylase codie ren, haben. Die Homologie beträgt vorzugsweise mindestens 90%, bevorzugt mindestens 95% und besonders bevorzugt minde stens 99%. Bei einem Ribozym-Effekt wird eine RNA expri miert, die spezifisch Transkripte einer GDP-Mannose Pyro phosphorylase-Gens spalten kann. Die Expression von Ribozy men zur Verringerung der Aktivität von bestimmten Enzymen in Zellen ist dem Fachmann ebenfalls bekannt und ist beispiels weise beschrieben in EP 0 321 201 B1. Die Expression von Ri bozymen in pflanzlichen Zellen wurde z. B. beschrieben in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338). Der Cosuppressions-Effekt beruht auf der Expression einer sense- RNA, die die Expression von endogener GDP-Mannose Pyrophos phorylase-mRNA unterdrückt. Die Ausführung dieser Techniken sind dem Fachmann bekannt. Das Verfahren der Cosuppression ist beispielsweise beschrieben in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell et al. (Curr. Top Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui und Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159). Vaucheret et al. (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) und an deren Quellen. With an antisense effect, a corresponding DNA Se expressed in antisense orientation, so that in the Cells an antisense RNA is synthesized, which leads to Trans scripting of GDP-mannose pyrophosphrylase genes or to Tei len such transcripts is homologous. This preferably has a length of at least 30 nucleotides, preferably of min at least 50 nucleotides and particularly preferably of minde at least 100 nucleotides. The expressed antisense RNA should a high homology to the endogenously expressed in the plant transcripts that code GDP-mannose pyrophosphorylase ren, have. The homology is preferably at least 90%, preferably at least 95% and particularly preferably minde at least 99%. In the case of a ribozyme effect, an RNA is expressed miert, the specific transcripts of a GDP-Mannose Pyro phosphorylase gene can cleave. The expression of Ribozy to reduce the activity of certain enzymes in Cells are also known to the person skilled in the art and is exemplary Wisely described in EP 0 321 201 B1. The expression of Ri bozymen in plant cells was e.g. B. described in Feyter et al. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338). Of the Cosuppression effect is based on the expression of a sense RNA, the expression of endogenous GDP-Mannose Pyrophos suppressed phorylase mRNA. The execution of these techniques are known to the person skilled in the art. The process of cosuppression is described for example in Jorgensen (Trends Biotechnol. 8: 340-344 (1990), Niebel et al. (Curr.Top. Microbiol. Immunol. 197: 91-103 (1995), Flavell et al. (Curr. Top Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui and Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159). Vaucheret et al. (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne et al. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) and an their sources.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorlie
genden Erfindung wird die Verringerung der Aktivität einer
GDP-Mannose Phosphorylase in den Zellen dadurch erreicht,
daß das fremde Nucleinsäuremolekül folgende Elemente umfaßt:
In a particularly preferred embodiment of the present invention, the reduction in the activity of a GDP-mannose phosphorylase in the cells is achieved in that the foreign nucleic acid molecule comprises the following elements:
- a) einen Promotor, der die Transkription in pflanzlichen Zellen ermöglicht; unda) a promoter that translates into vegetable Cells enabled; and
- b) eine in antisense-Orientierung mit diesem Promotor ver knüpfte DNA-Sequenz, deren Transkripte ganz oder teil weise komplementär sind zu Transkripten eines endogen in Pflanzenzellen vorliegenden Gens, das eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codiert.b) ver in an antisense orientation with this promoter linked DNA sequence, whose transcripts in whole or in part are complementary to transcripts of an endogenous in Plant cells present gene that is a GDP mannose Encoded pyrophosphorylase.
Promotoren, die die Expression in pflanzlichen Zellen ge währleisten sind in großem Umfang beschrieben. Für eine kon stitutive Expression eignet sich z. B. der 35S-Promotor des CaMV (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-292) oder die Pro motoren der Polyubiquitingene (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18 (1992), 675-689). Für eine Expression in pho tosynthetisch aktivem Gewebe eignet sich z. B. der ST-LS1- Promotor (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451; Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947).Promoters that ge expression in plant cells Guarantees are described on a large scale. For a con stitutive expression is suitable for. B. the 35S promoter of CaMV (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-292) or the Pro motors of the polyubiquitin genes (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689 (1992). For an expression in pho To synthetically active tissue is suitable for. B. the ST-LS1- Promoter (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451; Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947).
Nucleinsäuremoleküle, die pflanzliche GDP-Mannose Pyrophos phorylase codieren, werden durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt. Die in Seq ID No. 1 dargestellte Nucleinsäuresequenz codiert eine GDP-Mannose Pyrophospho rylase aus Kartoffel. Mit Hilfe dieser Sequenz ist es dem Fachmann möglich, mittels gängiger molekularbiologischer Me thoden entsprechende Sequenzen aus anderen Pflanzen bzw. Pflanzenspezies zu isolieren (siehe unten).Nucleic acid molecules, the vegetable GDP-Mannose Pyrophos encode phorylase are by the present invention made available. The in Seq ID No. 1 shown Nucleic acid sequence encodes a GDP-mannose pyrophospho rylase from potato. With the help of this sequence it is Expert possible, using common molecular biological measurement corresponding sequences from other plants or Isolate plant species (see below).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden für die Expres sion einer antisense-RNA die weiter unten beschriebenen er findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle aus Kartoffel oder Teile davon verwendet. In a preferred embodiment, for the express sion of an antisense RNA he described below nucleic acid molecules according to the invention from potato or Parts of it used.
In der Regel weisen alle Zellen oder im wesentlichen alle Zellen der erfindungsgemäßen Pflanzen die genetische Modifi kation auf. Dagegen ist es nicht unbedingt erforderlich, daß alle Zellen eine Verringerung der Aktivität der GDP-Mannose Pyrophosphorylase aufweisen. In einer ersten Ausführungsform ist vorgesehen, daß alle bzw. im wesentlichen alle Zellen der Pflanze eine verringerte GDP-Mannose Pyrophosphorylase- Aktivität aufweisen.As a rule, all cells or essentially all of them Cells of the plants according to the invention have the genetic modification cation on. On the other hand, it is not absolutely necessary that all cells decrease the activity of GDP mannose Have pyrophosphorylase. In a first embodiment it is intended that all or essentially all cells the plant has a reduced GDP-mannose pyrophosphorylase Have activity.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen nur Zellen ober irdischer Pflanzenteile, vorzugsweise nur Zellen in den Blättern oder nur Zellen in den Blättern und Stengeln eine verringerte GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Aktivität auf auf grund der Expression des fremden Nucleinsäuremoleküls.In a preferred embodiment, only cells have upper terrestrial parts of plants, preferably only cells in the Leaves or just cells in the leaves and stems one decreased GDP-mannose pyrophosphorylase activity on up due to the expression of the foreign nucleic acid molecule.
Bei den erfindungsgemäßen Pflanzen kann es sich im Prinzip um eine Pflanze jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl um monokotyle als auch um dikotyle Pflanzen. Vorzugsweise handelt es sich um eine landwirtschaftliche Nutzpflanze, besonders bevorzugt um Baumwolle oder Kartoffel und insbesondere um spätreifende Kartoffelpflanzen.In principle, it can be the case with the plants according to the invention is a plant of any plant species, d. H. both monocot and dicot plants. It is preferably an agricultural one Useful plant, particularly preferred around cotton or potatoes and especially around late ripening potato plants.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch transgene Pflanzen zellen, die durch die Einführung eines fremden Nucleinsäure moleküls genetisch modifiziert sind, wobei das Vorhandensein oder die Expression dieses Nucleinsäuremoleküls die Verrin gerung der Aktivität einer endogen in der Pflanzenzelle vor kommenden GDP-Mannose Pyrophosphorylase bewirkt.The present invention also relates to transgenic plants cells by the introduction of a foreign nucleic acid molecules are genetically modified, the presence of which or the expression of this nucleic acid molecule the verrin an endogenous activity in the plant cell upcoming GDP-mannose pyrophosphorylase.
Hinsichtlich der genetischen Modifikation der Zellen trifft das bereits oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Pflanzen Gesagte zu.Regarding the genetic modification of the cells that already above in connection with the invention Plant what has been said.
Derartige erfindungsgemäße Pflanzenzellen können zur Regene ration ganzer Pflanzen verwendet werden.Such plant cells according to the invention can rain ration of whole plants can be used.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus auch ein
Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, deren oberir
dische Teile früher und schneller reifen als bei entspre
chenden Wildtyp-Pflanzen und vollständig absterben, wobei
The present invention also relates to a process for the production of transgenic plants, the above-mentioned parts of which ripen earlier and faster than in corresponding wild-type plants and die off completely
- a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls und die genetische Modifikation zur Verringerung der Aktivi tät einer endogen in pflanzlichen Zellen vorkommenden GDP-Mannose Pyrophosphorylase führt; unda) a plant cell is genetically modified by the introduction of a foreign nucleic acid molecule and the genetic modification to reduce activity activity of an endogenously occurring in plant cells GDP-mannose pyrophosphorylase leads; and
- b) aus der Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und gegebe nenfallsb) a plant is regenerated from the cell; and give otherwise
- c) aus der Pflanze nach (b) weitere Pflanzen erzeugt wer den.c) who produces plants from the plant according to (b) the.
Für die laut Schritt (a) in die Pflanzenzelle eingeführte Modifikation gilt dasselbe, was bereits oben im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Pflanzen erläutert wurde.For the one introduced into the plant cell according to step (a) Modification is the same as what is already related above was explained with the plants according to the invention.
Die Regeneration der Pflanzen gemäß Schritt (b) kann nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.The regeneration of the plants according to step (b) can be started methods known to the person skilled in the art.
Die Erzeugung weiterer Pflanzen gemäß Schritt (c) des Ver fahrens kann z. B. erfolgen durch vegetative Vermehrung (bei spielsweise über Stecklinge, Knollen oder über Calluskultur und Regeneration ganzer Pflanzen) oder durch sexuelle Ver mehrung. Die sexuelle Vermehrung findet dabei vorzugsweise kontrolliert statt, d. h. es werden ausgewählte Pflanzen mit bestimmten Eigenschaften miteinander gekreuzt und vermehrt.The production of further plants according to step (c) of Ver driving z. B. done by vegetative propagation (at for example via cuttings, tubers or via callus culture and regeneration of whole plants) or through sexual ver increase. Sexual reproduction takes place preferentially controlled instead of d. H. selected plants are included certain characteristics crossed and increased.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Erzeugung transgener Kartoffelpflanzen verwendet.In a preferred embodiment, the method for Production of transgenic potato plants used.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ermöglicht das eingeführte fremde Nucleinsäuremolekül die Synthese einer antisense-RNA, die zu Transkripten von GDP-Mannose Pyrophos phorylase-Genen komplementär ist.In a further preferred embodiment, this enables introduced foreign nucleic acid molecule the synthesis of a antisense RNA leading to transcripts from GDP-Mannose Pyrophos phorylase genes is complementary.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die durch das erfin dungsgemäße Verfahren erhältlichen Pflanzen. The present invention also relates to the invention plants available according to the method according to the invention.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial erfindungsgemäßer Pflanzen sowie der gemäß dem erfindungsge mäßen Verfahren hergestellten transgenen Pflanzen, das er findungsgemäße genetisch modifizierte Zellen enthält. Der Begriff Vermehrungsmaterial umfaßt dabei jene Bestandteile der Pflanze, die geeignet sind zur Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder sexuellem Weg. Für die vegetative Ver mehrung eignen sich beispielsweise Stecklinge, Calluskul turen, Rhizome oder Knollen. Anderes Vermehrungsmaterial um faßt beispielsweise Früchte oder Samen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial um Samen und besonders bevorzugt um Knollen.The present invention also relates to propagation material plants according to the invention and that according to the invention Transgenic plants produced according to the method, which he contains genetically modified cells according to the invention. Of the The term propagation material includes those components the plant that is suitable for the production of offspring vegetatively or sexually. For vegetative ver For example, cuttings, calluskul are suitable structures, rhizomes or tubers. Other propagation material around holds fruit or seeds, for example. Preferably acts the propagation material is seeds and especially preferably around tubers.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Nucleinsäuremolekülen, die eine GDP-Mannose Pyrophospho rylase codieren, von deren Komplementen oder von Teilen sol cher Moleküle zur Verringerung der GDP-Mannose Pyrophospho rylase-Aktivität in pflanzlichen Zellen, zur Erzeugung von Pflanzenzellen mit einer verringerten Aktivität der GDP-Man nose Pyrophosphorylase, zur Erzeugung von Pflanzen, enthal tend solche Pflanzenzellen und/oder zur Erzeugung von trans genen Pflanzen, deren oberirdische Teile schneller reifen und absterben als bei entsprechenden Wildtyp-Pflanzen und die vollständig absterben. Bei den Nucleinsäuremolekülen handelt es sich vorzugsweise um die im folgenden beschrie benen erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen.The present invention also relates to the use of nucleic acid molecules that form a GDP-mannose pyrophospho encode rylase, of their complements or parts of sol Cher molecules to reduce GDP-mannose pyrophospho rylase activity in plant cells, for the production of Plant cells with reduced GDP-Man activity nose pyrophosphorylase, for the production of plants, ent tend such plant cells and / or to produce trans plants whose above-ground parts mature more quickly and die off than in corresponding wild-type plants and who die completely. For the nucleic acid molecules it is preferably the described below benen nucleic acid molecules of the invention.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren Nucleinsäu
remoleküle, die ein pflanzliches Protein codieren, dessen
reife Form die enzymatische Aktivität einer GDP-Mannose Py
rophosphorylase aufweist, ausgewählt aus der Gruppe beste
hend aus:
The present invention further relates to nucleic acid molecules which encode a vegetable protein, the mature form of which has the enzymatic activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase, selected from the group consisting of:
- a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;a) Nucleic acid molecules that encode a protein that the under Seq ID No. 2 includes amino acid sequence indicated;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 ange gebene codierende Region umfassen; b) Nucleic acid molecules which are listed under Seq ID No. 1 attached include given coding region;
- c) Nucleinsäuremoleküle, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in dem Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird;c) nucleic acid molecules that encode a protein that the Amino acid sequence encompassed by the insertion in the Plasmid pGMPase (DSM 11746) is encoded;
- d) Nucleinsäuremoleküle, die die codierende Region umfas sen, die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthalten ist;d) nucleic acid molecules encompassing the coding region sen in the insertion of the plasmid pGMPase (DSM 11746) is included;
- e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) hy bridisieren; unde) nucleic acid molecules, which with a strand of a Nucleic acid molecule according to (a), (b), (c) and / or (d) hy bridify; and
- f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Dege neration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.f) nucleic acid molecules whose sequence is due to the Dege generation of the genetic code from the sequence of a Nucleic acid molecule deviates according to (e).
Die Erfindung betrifft auch die jeweils komplementären Stränge der oben beschriebenen Moleküle.The invention also relates to the respective complementary Strands of the molecules described above.
Die in Seq ID No. 1 dargestellte Nucleinsäuresequenz ist eine vollständige cDNA, die eine GDP-Mannose-Pyrophospho rylase aus Kartoffel (Solanum tuberosum) codiert. Ein Plas mid enthaltend diese cDNA wurde hinterlegt als DSM 11746. Mit Hilfe dieser Sequenz bzw. dieses Moleküls ist es dem Fachmann nun möglich, homologe Sequenzen aus anderen Pflan zen und Pflanzenarten zu isolieren. Dies kann beispielsweise mit Hilfe konventioneller Methoden, wie dem Durchmustern von cDNA oder genomischen Banken mit geeigneten Hybridisierungs proben erfolgen. Auf diese Weise ist es beispielsweise mög lich, Nucleinsäuremoleküle zu identifizieren und isolieren, die mit der unter Seq ID No. 1 angegebenen Sequenz hybridi sieren und die eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.The in Seq ID No. 1 is the nucleic acid sequence shown a complete cDNA containing a GDP mannose pyrophospho Coded rylase from potato (Solanum tuberosum). A Plas mid containing this cDNA was deposited as DSM 11746. With the help of this sequence or this molecule it is Those skilled in the art can now make homologous sequences from other plants isolate zen and plant species. For example using conventional methods such as screening cDNA or genomic banks with suitable hybridization samples are taken. In this way it is possible, for example to identify and isolate nucleic acid molecules, those with the Seq ID No. 1 specified sequence hybridi and encode a GDP-mannose pyrophosphorylase.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzi piell eine GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus jedem beliebi gen pflanzlichen Organismus codieren, vorzugsweise eine aus einer höheren Pflanze, insbesondere einer monokotylen oder einer dikotylen Pflanze. Besonders bevorzugt codiert das Nucleinsäuremolekül ein Protein aus einer landwirtschaftli chen Nutzpflanze, insbesondere aus einer Getreidepflanze (z. B. Gerste, Roggen, Hafer, Weizen etc.), oder aus Mais, Reis, Erbse, Lein usw.. In einer besonders bevorzugten Aus führungsform codiert das Nucleinsäuremolekül ein Protein aus Kartoffel oder Baumwolle.The nucleic acid molecules according to the invention can be in principle a GDP-mannose pyrophosphorylase from any encode a plant organism, preferably one from a higher plant, especially a monocot or a dicotyledonous plant. This is particularly preferably encoded Nucleic acid molecule a protein from an agricultural Chen crop, especially from a cereal plant (e.g. barley, rye, oats, wheat etc.), or from corn, Rice, pea, flax etc. In a particularly preferred way In the embodiment, the nucleic acid molecule codes out a protein Potato or cotton.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen der vorlie genden Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) be schrieben sind. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jeder beliebigen Pflanze stammen, die ent sprechende Proteine exprimiert. Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremoleküle kann dabei unter Verwendung der erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) oder durch Amplifikation mittels PCR. Als Hybridisierungsprobe können z. B. Nucleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die un ter Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile die ser Sequenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe ver wendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Frag mente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfin dungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, sollte eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaf ten der von dieser Sequenz codierten Proteine erfolgen, um festzustellen, ob es sich um eine GDP-Mannose Pyrophospho rylase handelt. Hierzu eignen sich insbesondere Homologie vergleiche auf der Ebene der Nucleinsäure- oder Aminosäure sequenz sowie die Bestimmung der enzymatischen Aktivität. Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi sierenden Moleküle umfassen insbesondere Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäu remoleküle, die ein pflanzliches Protein codieren mit der Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebe nen Nucleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenz identität über die gesamte Länge von mindestens 60%, insbe sondere eine Identität von mindestens 70%, vorzugsweise über 80%, besonders bevorzugt über 90% und insbesondere von mindestens 95%. Die Abweichungen zu den oben beschrie benen Nucleinsäuremolekülen können dabei z. B. durch Dele tion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.The term "hybridization" means in the context of this invention a hybridization under conventional Hybridization conditions, preferably under stringent ones Conditions such as those described in Sambrock et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) are written. Nucleic acid molecules with the inventions hybridize according to the invention, can principally come from any plant that ent speaking proteins expressed. Nucleic acid molecules that can hybridize with the molecules according to the invention e.g. B. isolated from genomic or from cDNA libraries become. The identification and isolation of such Nucleic acid molecules can use the invent nucleic acid molecules according to the invention or parts of these molecules or the reverse complement of these molecules take place, for. B. by means of hybridization according to standard procedures (see e.g. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) or by amplification using PCR. As a hybridization sample, e.g. B. Nucleic acid molecules are used that exactly the or essentially the un ter Seq ID No. 1 specified nucleotide sequence or parts of the have this sequence. In the ver as hybridization sample fragments used can also be synthetic frag act with the help of common synthetic techniques were prepared and their sequence essentially with the of a nucleic acid molecule according to the invention. Has one identified and isolated genes that are related to the inventions? hybridize according to the invention, should a determination of the sequence and an analysis of the properties th of the proteins encoded by this sequence determine if it is a GDP-Mannose Pyrophospho rylase acts. Homology is particularly suitable for this compare at the level of the nucleic acid or amino acid sequence and the determination of the enzymatic activity. The hybridi with the nucleic acid molecules of the invention Molecules in particular include fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid described above remolecules that encode a vegetable protein with the Activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase. The expression In this context, derivative means that the sequences of these molecules differ from the sequences described above Nucleic acid molecules at one or more positions differ and have a high degree of homology to these Have sequences. Homology means a sequence Identity over the entire length of at least 60%, especially in particular an identity of at least 70%, preferably over 80%, particularly preferably over 90% and in particular of at least 95%. The deviations from those described above benen nucleic acid molecules can z. B. by Dele tion, addition, substitution, insertion or recombination have arisen.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struk turelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremo lekülen oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschrie benen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstel len, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Mo leküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologi sche Funktion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürli cherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Pflanzen, insbesondere anderen Getrei depflanzen oder -sorten, oder um Mutationen, wobei diese Mu tationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequen zen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA- Techniken erzeugte Varianten.Homology also means that functional and / or struc tural equivalence between the relevant nucleic acid mo lekulen or the proteins encoded by them. At the nucleic acid molecules homologous to those described above are molecules and represent derivatives of these molecules len, these are usually variations of these mo readings that represent modifications that are the same biologi perform a specific function. It can be both natural Variations that usually occur are, for example, Sequences from other plants, especially other crops plants or varieties, or for mutations, these Mu tations may have occurred naturally or through targeted mutagenesis. Furthermore, it can the variations on synthetically produced sequences act zen. With the allelic variants it can be act both naturally occurring variants, as well for synthetically produced or by recombinant DNA Techniques generated variants.
Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge meinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. biologische Aktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromato graphisches Verhalten, Sedimentationskoeffizienten, Löslich keit, spektroskopische Eigenschaften, Stabilität; pH-Opti mum, Temperatur-Optimum etc.The of the different variants of the invention Proteins encoded nucleic acid molecules have certain ge common characteristics. For this, e.g. B. biological Activity, molecular weight, immunological reactivity, Conformation, etc., as well as physical properties such as B. the running behavior in gel electrophoresis, chromato graphic behavior, sedimentation coefficient, soluble speed, spectroscopic properties, stability; pH opti mum, optimum temperature etc.
Wichtige Charakteristika einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase sind (i) ihre Lokalisation im Cytosol pflanzlicher Zellen, (ii) ihre Fähigkeit zur Synthese von GDP-Mannose unter Ver wendung von GTP und Mannose-1-Phosphat als Substrat. Diese Aktivität kann beispielsweise bestimmt werden nach den in Asua et al. (a. a. O.) oder in Szumilo et al. (a. a. O.) be schriebenen Methoden.Important characteristics of a GDP-mannose pyrophosphorylase are (i) their location in the cytosol of plant cells, (ii) their ability to synthesize GDP mannose under Ver use of GTP and mannose-1-phosphate as substrate. This Activity can be determined, for example, according to the in Asua et al. (op. cit.) or in Szumilo et al. (loc. cit.) be written methods.
Das von der Aminosäuresequenz abgeleitete Molekulargewicht der GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Kartoffel beträgt 39.578 Dalton. Das abgeleitete Molekulargewicht eines erfin dungsgemäßen Proteins liegt daher vorzugsweise im Bereich von 35 kDa bis 45 kDa, bevorzugt im Bereich von 38 kDa bis 42 kDa und besonders bevorzugt bei ca. 40 kDa. Der errech nete isoelektrische Punkt des Proteins aus Kartoffel liegt bei 7.21.The molecular weight derived from the amino acid sequence the GDP-mannose pyrophosphorylase from potatoes 39,578 daltons. The derived molecular weight of an invented protein according to the invention is therefore preferably in the range from 35 kDa to 45 kDa, preferably in the range from 38 kDa to 42 kDa and particularly preferably around 40 kDa. The calculated nete isoelectric point of the protein from potato lies at 7.21.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können beliebige Nucleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Mole küle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Sie können natürlich vorkommende Moleküle sein, oder durch gen technische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Mo leküle. Sie können einzelsträngige Moleküle sein, die entwe der den codierenden oder den nicht codierenden Strang ent halten, oder doppelsträngige Moleküle. The nucleic acid molecules according to the invention can be any Be nucleic acid molecules, especially DNA or RNA moles cool, for example cDNA, genomic DNA, mRNA etc. you can be naturally occurring molecules, or by gen Mo or technical or chemical synthesis processes read. They can be single-stranded molecules that either of the coding or the non-coding strand ent hold, or double-stranded molecules.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole küle von mindestens 15, vorzugsweise mehr als 50 und beson ders bevorzugt mehr als 200 Nucleotiden Länge, die spezi fisch mit mindestens einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremo lekül hybridisieren. Spezifisch hybridisieren bedeutet hier bei, daß diese Moleküle mit Nucleinsäuremolekülen hybridi sieren, die ein erfindungsgemäßes Protein codieren, jedoch nicht mit Nucleinsäuremolekülen, die andere Proteine codie ren. Hybridisieren bedeutet dabei vorzugsweise Hybridisieren unter stringenten Bedingungen (s. o.). Insbesondere betrifft die Erfindung solche Nucleinsäuremoleküle, die mit Trans kripten von erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi sieren und dadurch deren Translation verhindern können. Sol che Nucleinsäuremoleküle, die spezifisch mit den erfindungs gemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, können bei spielsweise Bestandteile von antisense-Konstrukten oder Ri bozymen sein oder können als Primer für die Amplifikation mittels PCR verwendet werden.The present invention further relates to nucleic acid moles cool of at least 15, preferably more than 50 and especially ders preferably more than 200 nucleotides in length, the speci fish with at least one nucleic acid mo according to the invention hybridize lekül. Hybridizing specifically means here in that these molecules hybridi with nucleic acid molecules sieren, which encode a protein according to the invention, however not with nucleic acid molecules that encode other proteins Ren. Hybridization preferably means hybridization under stringent conditions (see above). In particular concerns the invention is such nucleic acid molecules that with Trans scripts of nucleic acid molecules according to the invention hybridi be able to prevent their translation. Sol che nucleic acid molecules that are specific to the Invention appropriate nucleic acid molecules can hybridize at for example components of antisense constructs or Ri be bozymen or can be used as primers for the amplification be used by PCR.
Weiterhin betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen er findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle enthalten.The invention further relates to vectors, in particular Plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and others in the Genetic engineering common vectors that he described above contain nucleic acid molecules according to the invention.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vekto ren enthaltenen Nucleinsäuremoleküle in sense Orientierung verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen gewährlei sten. Der Begriff "Expression" kann dabei Transkription als auch Transkription und Translation bedeuten.In a preferred embodiment, those in the vectors contained nucleic acid molecules in sense orientation linked to regulatory elements that drive expression in prokaryotic or eukaryotic cells most. The term "expression" can be used as a transcription also mean transcription and translation.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in prokaryontischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli, ermöglicht beispielsweise eine genauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der codierten Proteine. Dar über hinaus ist es möglich, mittels gängiger molekular biologischer Techniken (siehe z. B. Sambrook et al., a. a. O.) verschiedenartige Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle einzuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen Eigen schaften kommt. Möglich ist die Erzeugung von Deletionsmu tanten, bei denen durch fortschreitende Deletionen vom 5'- oder vom 3'-Ende der codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremo leküle erzeugt werden, die zur Synthese entsprechend ver kürzter Proteine führen. Möglich ist auch die Einführung von Punktmutationen an Positionen, die einen Einfluß beispiels weise auf die Enzymaktivität oder die Regulierung des Enzyms haben. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt wer den, die einen veränderten Km-Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle vorliegenden Regulationsme chanismen über allosterische Regulation oder kovalente Modi fizierung unterliegen. Des weiteren können Mutanten herge stellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Pro duktspezifität aufweisen. Weiterhin können Mutanten herge stellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur- Profil aufweisen. Die gentechnische Manipulation in proka ryontischen Zellen können nach dem Fachmann bekannten Metho den erfolgen (vgl. Sambrook et al., a. a. O.).The expression of the nucleic acid molecules according to the invention in prokaryotic cells, for example in Escherichia coli, enables, for example, a more precise characterization of the enzymatic activities of the encoded proteins. In addition, it is possible to introduce various types of mutations into the nucleic acid molecules according to the invention by means of common molecular biological techniques (see, for example, Sambrook et al., Loc. Cit.), Which leads to the synthesis of proteins with possibly changed biological properties. It is possible to generate deletion mutants in which nucleic acid molecules are generated by progressive deletions from the 5 'or 3' end of the coding DNA sequence, which lead to the synthesis of correspondingly shortened proteins. It is also possible to introduce point mutations at positions that have an influence, for example, on the enzyme activity or the regulation of the enzyme. In this way, e.g. B. mutants who who have a changed K m value or are no longer subject to the regulatory mechanisms normally present in the cell via allosteric regulation or covalent modification. Furthermore, mutants can be produced which have an altered substrate or product specificity. Furthermore, mutants can be produced which have a changed activity-temperature profile. Genetic engineering manipulation in procokaontic cells can be carried out according to methods known to the person skilled in the art (cf. Sambrook et al., Loc. Cit.).
Für die Expression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremole küls in pflanzlichen Zellen stehen eine Vielzahl von Promo toren zur Verfügung. Im Prinzip kann jeder in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale Promotor ver wendet werden. Der Promotor kann homolog oder heterolog in bezug auf die verwendete Pflanzenspezies sein. Geeignet ist beispielsweise der 355-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812), der eine konsti tutive Expression in allen Geweben einer Pflanze gewährlei stet und das in der WO/9401571 beschriebene Promo torkonstrukt. Ein anderes Beispiel sind die Promotoren der Polyubiquitingene aus Mais (Christensen et al., a. a. O.). Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt akti viert werden (siehe beispielsweise WO/9307279). Von beson derem Interesse können hierbei Promotoren von heat-shock- Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können die Promotoren verwendet werden, die in einem be stimmten Gewebe der Pflanze zu einer Expression nachge schalteter Sequenzen führen (siehe z. B. Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), beispielsweise der ST-LS1-Pro motor, der lediglich in photosynthetisch aktivem Gewebe ak tiv ist (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947). Zu erwähnen sind ferner Promotoren, die in den stärkespeichernden Organen von zu transformierenden Pflanzen aktiv sind. Dies sind z. B. bei Mais die Maiskörner, während es bei der Kartoffel die Knollen sind. Zur Überex pression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in der Kartoffel kann beispielsweise der knollenspezifische B33- Promotor (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) ver wendet werden. Samenspezifische Promotoren sind bereits für verschiedene Pflanzenspezies beschrieben worden. So z. B. der USP-Promotor aus Vicia faba, der eine samenspezifische Ex pression in V. faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumleinet al., Mol Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). In Mais gewährleisten beispielsweise Promotoren der Zein-Gene eine spezifische Expression im Endosperm der Maiskörner (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93).For the expression of a nucleic acid mole according to the invention A lot of promotions are available in plant cells gates available. In principle, everyone can in the for Transformation selected plants functional promoter ver be applied. The promoter can be homologous or heterologous in relation to the plant species used. Suitable is for example the 355 promoter of the Cauliflower mosaic virus (Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812) who published a consti Ensure tutive expression in all tissues of a plant stet and the promo described in WO / 9401571 gate construction. Another example are the promoters of Maize polyubiquitene genes (Christensen et al., Supra). It however, promoters can also be used that are only available a point in time determined by external influences fourth (see for example WO / 9307279). By beson their interest can be promoted by heat-shock Be proteins that allow easy induction. Further the promoters can be used in a be tuned tissue of the plant for expression switch sequences (see e.g. Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), for example the ST-LS1-Pro motor that only works in photosynthetically active tissue tiv is (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947). Also worth mentioning are promoters that in the starch-storing organs to be transformed Plants are active. These are e.g. B. in maize the corn kernels, while the potatoes are tubers. To the Überex pression of the nucleic acid molecules according to the invention in the Potato, for example, the bulb-specific B33 Promoter (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) ver be applied. Seed-specific promoters are already for different plant species have been described. So z. B. the USP promoter from Vicia faba, which is a seed-specific Ex guaranteed in V. faba and other plants (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol Gen. Genet. 225: 459-467 (1991)). In Maize, for example, ensures promoters of the zein genes a specific expression in the endosperm of the maize kernels (Pedersen et al., Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio et al., Plant Mol. Biol., 15: 81-93 (1990).
Regulatorische Sequenzen zur Expression in prokaryontischen Organismen, z. B. E. coli, sind ausreichend in der Literatur beschrieben, ebenso wie solche zur Expression in Hefe, ins besondere in Saccharomyces cerevisiae.Regulatory sequences for expression in prokaryotic Organisms, e.g. B. E. coli are sufficient in the literature described, as well as those for expression in yeast, ins special in Saccharomyces cerevisiae.
Terminationssignale für die Transkription in pflanzlichen Zellen sind beschrieben und sind beliebig gegeneinander aus tauschbar. Verwendet werden kann beispielsweise die Termina tionssequenz des Octopinsynthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens.Termination signals for transcription in plant Cells are described and are arbitrarily different from each other exchangeable. For example, the terms can be used tion sequence of the octopine synthase gene from Agrobacterium tumefaciens.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryonti sche Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nucleinsäure molekül oder einem Vektor transformiert wurden, sowie Zel len, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die be schriebenen Nucleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien- (z. B. E. coli) oder Pilz zellen (z. B. Hefe, insbesondere S. cerevisiae), sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein. Der Begriff "trans formiert" bedeutet dabei, daß die erfindungsgemäßen Zellen mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül genetisch modifiziert sind insofern als sie zusätzlich zu ihrem natür lichen Genom mindestens ein erfindungsgemäßes Nucleinsäure molekül enthalten. Dieses kann in der Zelle frei, gegebenen falls als selbstreplizierendes Molekül, vorliegen oder es kann stabil in das Genom der Wirtszelle integriert vorlie gen.In a further embodiment, the invention relates Host cells, especially prokaryotic or eukaryotic cells with a nucleic acid described above molecule or a vector were transformed, as well as Zel len derived from such host cells and the be contain written nucleic acid molecules or vectors. The host cells can be bacterial (e.g. E. coli) or fungal cells (e.g. yeast, especially S. cerevisiae), and plant or animal cells. The term "trans formed "means that the cells of the invention genetically with a nucleic acid molecule according to the invention are modified in that they are in addition to their natural Lichen genome at least one nucleic acid according to the invention molecule included. This can be freely given in the cell if present as a self-replicating molecule, or it can be stably integrated into the genome of the host cell gene.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Her stellung einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase, bei dem er findungsgemäße Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert wer den, die die Expression des Proteins erlauben, und das Pro tein aus der Kultur, d. h. aus den Zellen und/oder dem Kul turmedium gewonnen wird.Furthermore, the present invention relates to methods for the manufacture position of a GDP-mannose pyrophosphorylase, in which he host cells according to the invention are cultivated under conditions those that allow expression of the protein and the pro tein from culture, d. H. from the cells and / or the Kul turmedium is obtained.
Die Erfindung betrifft auch Proteine, die durch die erfin dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, oder die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich sind.The invention also relates to proteins which are invented by the inventors nucleic acid molecules according to the invention are encoded, or the are obtainable by a method according to the invention.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Antikörper, die spezifisch ein erfindungsgemäßes Protein erkennen. Diese können z. B. monoclonale oder polyclonale Antikörper sein. Es können auch Fragmente von Antikörpern sein, die erfindungs gemäße Proteine erkennen. Methoden zur Herstellung derarti ger Antikörper bzw. Fragmente sind dem Fachmann geläufig.The present invention further relates to antibodies which specifically recognize a protein according to the invention. This can e.g. B. be monoclonal or polyclonal antibodies. It can also be fragments of antibodies, the fiction recognize appropriate proteins. Methods for the preparation of such Antibodies or fragments are known to the person skilled in the art.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsge mäßen Wirtszellen transgene pflanzliche Zellen, die aufgrund der Gegenwart eines eingeführten erfindungsgemäßen Nuclein säuremoleküls eine erfindungsgemäße GDP-Mannose Pyrophospho rylase exprimieren.In a preferred embodiment, the fiction According to host cells, transgenic plant cells, which are due to the presence of an introduced nuclein according to the invention acid molecule a GDP-mannose pyrophospho according to the invention express rylase.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure moleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine neue oder eine zusätzliche pflanzliche GDP-Man nose Pyrophosphorylase exprimieren.By providing the nucleic acid of the invention Molecules now have the ability to plant cells to change by means of genetic engineering methods, that they are a new or an additional herbal GDP-Man express nose pyrophosphorylase.
Solche transgenen Pflanzenzellen unterscheiden sich von nicht-transformierten Zellen dadurch, daß das eingeführte Nucleinsäuremolekül entweder heterolog zu der transformier ten Zelle ist, d. h. aus einer Zelle mit einem anderen geno mischen Hintergrund stammt, oder dadurch daß das eingeführte Nucleinsäuremolekül, wenn es homolog zur transformierten Pflanzenspezies ist, im Genom an einem Ort lokalisiert ist, an dem es in nicht-transformierten Zellen natürlicherweise nicht vorkommt. Dabei kann das eingeführte Nucleinsäuremole kül entweder unter der Kontrolle seines natürlichen Promo tors stehen oder mit regulatorischen Elementen fremder Gene verknüpft sein.Such transgenic plant cells differ from non-transformed cells in that the introduced Nucleic acid molecule either heterologous to the transform is th cell, i. H. geno from one cell with another mix background, or by the fact that the imported Nucleic acid molecule if it is homologous to the transformed Plant species is located in one place in the genome, on which it is naturally found in non-transformed cells does not occur. The introduced nucleic acid mole cool either under the control of his natural promo tors stand or with regulatory elements of foreign genes be linked.
Ferner unterscheiden sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzel len von entsprechenden nicht-transformierten Pflanzenzellen vorzugsweise dadurch, daß sie eine erhöhte Menge an erfin dungsgemäßem Protein aufweisen. Dies läßt sich mit dem Fach mann bekannten Nachweismethoden bestimmen, wie z. B. Western- Blot-Analyse. Eine erhöhte Menge bedeutet dabei vorzugsweise eine Steigerung um mindestens 5%, bevorzugt um mindestens 10% und besonders bevorzugt um mindestens 20%.Furthermore, the plant cells according to the invention differ len from corresponding non-transformed plant cells preferably by inventing an increased amount of have protein according to the invention. This can be done with the subject determine known detection methods such. B. Western Blot analysis. An increased amount preferably means an increase of at least 5%, preferably at least 10% and particularly preferably by at least 20%.
Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das syntheti sierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der pflanz lichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation in einem bestimmten Kompartiment der Zelle zu erreichen, muß gegebenenfalls die codierende Region mit DNA-Sequenzen ver knüpft werden, die die Lokalisierung in dem jeweiligen Kom partiment gewährleisten. Derartige Sequenzen sind bekannt (Siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219- 3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106). There is basically the possibility that the syntheti protein in any compartment of the plant Lichen cell can be localized. To localize in to reach a certain compartment of the cell optionally ver the coding region with DNA sequences be linked, the localization in the respective com ensure division. Such sequences are known (See, for example, Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219- 3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106).
Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten. Bei der Pflanze, die erfindungsgemäße Pflanzenzellen ent hält, kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze han deln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Pflanze, insbesondere eine landwirtschaftliche Nutzpflanze, beispielsweise eine stärkespeichernde Pflanze, wie z. B. Ge treidepflanzen (Roggen, Gerste, Hafer, Weizen etc), Reis, Mais, Leguminosen (z. B. Erbse), Maniok oder Kartoffel, oder eine Zierpflanze.The invention further relates to transgenic plants which contain transgenic plant cells described above. In the plant, the plant cells according to the invention ent holds, it can in principle be any plant deln. It is preferably a monocot or dicot Plant, especially an agricultural crop, for example a starch-storing plant, such as B. Ge cereal plants (rye, barley, oats, wheat etc.), rice, Corn, legumes (e.g. pea), cassava or potato, or an ornamental plant.
Unter Getreidepflanzen werden insbesondere monokotyle Pflan zen verstanden, die zur Ordnung Poales, bevorzugt solche, die zur Familie der Poaceae gehören. Beispiele hierfür sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) etc. gehö ren. Besonders bevorzugt ist Hordeum (Gerste). Stärkespei chernde Leguminosen sind z. B. manche Arten der Gattung Pisum (z. B. Pisum sativum), Vicia (z. B. Vicia faba), Cicer (z. B. Cicer arietinum), Lens (z. B. Lens culinaris), Phaseolus (z. B. Phaseolus vulgaris und Phaseolus coccineus), etc.Cereal plants include monocotyledon plants zen understood that to order Poales, preferably those belonging to the Poaceae family. examples for this are the plants belonging to the genera Avena (oat), Triticum (Wheat), secale (rye), oryza (rice), panicum, Pennisetum, Setaria, sorghum (millet), Zea (corn) etc. belong ren. Hordeum (barley) is particularly preferred. Starch spit breeding legumes are e.g. B. some species of the genus Pisum (e.g. Pisum sativum), Vicia (e.g. Vicia faba), Cicer (e.g. Cicer arietinum), Lens (e.g. Lens culinaris), Phaseolus (e.g. Phaseolus vulgaris and Phaseolus coccineus), etc.
Gegenstand der Erfindung ist ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke, Calli, Zellkul turen etc., wobei dieses Vermehrungsmaterial oben beschrie bene transgene Pflanzenzellen enthält.The invention also relates to propagation material from transgenic plants according to the invention, for example seeds, Fruits, cuttings, tubers, rhizomes, calli, cell culture structures etc., this propagation material described above bene contains transgenic plant cells.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflan zenzellen, bei denen die Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins verringert ist aufgrund der Inhibition der Trans kription oder Translation von endogenen Nucleinsäuremolekü len, die ein derartiges Protein codieren. Dies kann bei spielsweise dadurch erreicht werden, daß ein erfindungsge mäßes Nucleinsäuremolekül oder ein Teil davon in den ent sprechenden Pflanzenzellen in antisense-Orientierung expri miert wird und es aufgrund eines antisense-Effektes zur Ver ringerung der Menge an erfindungsgemäßem Protein kommt. Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung der Menge des erfin dungsgemäßen Proteins in pflanzlichen Zellen besteht in der Expression von geeigneten Ribozymen, die spezifisch Trans kripte der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle spalten. Möglich ist auch die Expression von Molekülen, die sowohl einen antisense- als auch einen Ribozymeffekt in Kombination aus üben. Alternativ kann die Verringerung der Menge an erfin dungsgemäßem Protein in den Pflanzenzellen auch durch einen Cosupressionseffekt erfolgen.The present invention further relates to transgenic plants cells in which the activity of the invention Protein is decreased due to the inhibition of trans description or translation of endogenous nucleic acid molecules len encoding such a protein. This can happen with can be achieved, for example, that a fiction moderate nucleic acid molecule or a part thereof in the ent speaking plant cells in antisense orientation expri is lubricated and because of an antisense effect ver decrease in the amount of protein according to the invention comes. A another way to reduce the amount of inventions protein according to the invention in plant cells consists in the Expression of suitable ribozymes that specifically trans cleave scripts of the DNA molecules according to the invention. Possible is also the expression of molecules that have both a antisense as well as a ribozyme effect in combination to practice. Alternatively, reducing the amount of inventions protein according to the invention in the plant cells also by a Cosupression effect take place.
Derartige Verfahren sind dem Fachmann bekannt (s.o.).Such methods are known to the person skilled in the art (see above).
Die Verringerung der Aktivität des erfindungsgemäßen Pro teins kann wie oben beschrieben bestimmt werden.The reduction in the activity of the Pro according to the invention Teins can be determined as described above.
Die Erfindung betrifft ferner transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten.The invention further relates to transgenic plants which contain transgenic plant cells described above.
Die Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial der vorste hend beschriebenen transgenen Pflanzen, beispielsweise Sa men, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke, Calli, Zellkulturen, etc., wobei dieses vorstehend beschriebene transgene Pflanzenzellen enthält.The invention also relates to propagation material of the first described transgenic plants, for example Sa men, fruits, cuttings, tubers, rhizomes, calli, Cell cultures, etc., this described above contains transgenic plant cells.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten.For the introduction of DNA into a plant host cell a variety of techniques are available. This Techniques include transforming plant cells with T-DNA using Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as a transformation agent, the Fusion of protoplasts, injection, electroporation of DNA, the introduction of DNA by means of biolistic Method as well as other possibilities.
Die Verwendung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 0 120 516 A1; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287 beschrieben worden. Für die Transformation von Kartoffel, siehe z. B. Rocha Sosa et al. (EMBO J. 8 (1989), 29-23).The use of Agrobacterium-mediated transformation of plant cells has been intensively examined and sufficient in EP 0 120 516 A1; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287. For the Transformation of potato, see e.g. B. Rocha Sosa et al. (1989, EMBO J. 8: 29-23).
Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobakterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282, Deng et al., Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al. Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13 (1995), 486-492; Conner und Domisse; Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al., Transgenic Res. 2 (1993), 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1992), 667-674; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transforntation von Mais wird in der Literatur mehrfach be schrieben (vgl. z. B. WO95/06128, EP 0 513 849 A1; EP 0 465 875 A1, EP 0 292 435 A1; Fromm et al., Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theoretical Appl. Genet. 80 (1990), 721-726).The transformation of monocotyledonous plants by means of Agrobacterium-based vectors have been described (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22: 491-506 (1993); Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282, Deng et al., Science in China 33 (1990), 28-34; Wilmink et al. Plant Cell Reports 11 (1992), 76-80; May et al., 1995, Bio / Technology 13: 486-492; Conner and domisse; Int. J. Plant Sci. 153: 550-555 (1992); Ritchie et al., Transgenic Res. 2: 252-265 (1993). alternative Systems for transforming monocotyledonous plants are the Transformation using the biolistic approach (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104: 37-48 (1994); Vasil et al., Bio / Technology 11: 667-674 (1992); Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24: 317-325 (1994); Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625-631), the protoplast transformation, the electroporation of partially permeabilized cells, the introduction of DNA using glass fibers. especially the Transforntation of maize is used several times in the literature (see e.g. WO95 / 06128, EP 0 513 849 A1; EP 0 465 875 A1, EP 0 292 435 A1; Fromm et al., 1990 Biotechnology 8: 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theoretical Appl. Genet. 80: 721-726 (1990)).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s. o.; Ritala et al., s. o.; Krens et al., Nature 296 (1982), 72-74) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5 (1994), 285- 297).Also the successful transformation of other types of grain has already been described, e.g. B. for barley (Wan and Lemaux, s. O.; Ritala et al., P. O.; Krens et al., Nature 296 (1982), 72-74) and for wheat (Nehra et al., Plant J. 5 (1994), 285- 297).
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Mole küle, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase codieren.Another object of the present invention is Use of the nucleic acid molecules according to the invention or Parts of these molecules or their reverse complement Molecules for the identification and isolation of homologous moles cool, the proteins with the enzymatic activity of a Encode GDP-mannose pyrophosphorylase.
Das im Rahmen der vorliegenden Erfindung hergestellte Plas mid pGMPase wurde bei der als internationale Hinterlegungs stelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland entspre chend den Anforderungen des Budapester Vertrages am 15. Sep tember 1997 unter der Hinterlegungsnummer DSM 11746 hinter legt.The Plas manufactured within the scope of the present invention mid pGMPase was registered as an international recognized German collection of microorganisms (DSM) in Braunschweig, Federal Republic of Germany in accordance with the requirements of the Budapest Treaty on September 15 tember 1997 under the deposit number DSM 11746 behind sets.
Fig. 1 zeigt schematisch das Plasmid pGMPase. Die fein ge zogene Linie entspricht der Sequenz von pBluescript II SK(-). Die starke Linie repräsentiert die cDNA, die die GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Solanum tuberosum codiert. Restriktionsschnittstellen der Insertion sind angegeben. Die cDNA-Insertion ist zwischen die EcoRI- und XhoI-Schnittstellen des Po lylinkers des Plasmids ligiert. Die DNA-Sequenz der cDNA-Insertion ist unter Seq ID No. 1 angegeben. Fig. 1 shows schematically the plasmid pGMPase. The fine line corresponds to the sequence of pBluescript II SK (-). The strong line represents the cDNA encoding the GDP mannose pyrophosphorylase from Solanum tuberosum. Restriction sites of the insertion are given. The cDNA insert is ligated between the EcoRI and XhoI sites of the polylinker of the plasmid. The DNA sequence of the cDNA insertion is under Seq ID No. 1 specified.
Fig. 2 zeigt schematisch das Plasmid p355-antiGMPase. Figure 2 shows schematically the plasmid p355-antiGMPase.
Aufbau des Plasmids:
A = Fragment A: CaMV35S-Promotor des Blumenkohlmo
saikvirus, 540 bp.
B = Fragment B: cDNA aus Solanum tuberosum codie
rend die GDP-Mannose Pyrophosphorylase; Orien
tierung zum Promotor: antisense.
C = Fragment C: ocs Terminator des Octopin Synthase
Gens aus Agrobacterium tumefaciens.Construction of the plasmid:
A = fragment A: caMV35S promoter of cauliflower moss virus, 540 bp.
B = fragment B: cDNA from Solanum tuberosum encoding GDP-mannose pyrophosphorylase; Orientation to the promoter: antisense.
C = fragment C: ocs terminator of the octopine synthase gene from Agrobacterium tumefaciens.
Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von GDP-Mannose Pyrophosphorylasen aus Saccharomyces cerevisiae (jeweils untere Zeile und Solanum tuberosum (jeweils obere Zeile). Fig. 3 shows a comparison of the amino acid sequences of GDP-mannose pyrophosphorylases from Saccharomyces cerevisiae (lower row and Solanum tuberosum (upper line, respectively).
Fig. 4 zeigt eine Northern Blot-Analyse der Expression der GMPase in Knollen von GDP-Mannose Pyrophosphorylase "antisense" Pflanze (Linien 6, 28 und 37) im Ver gleich zu entsprechenden nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzen (WT). Fig. 4 shows a Northern blot analysis of the expression of the GMPase in tubers of GDP-mannose pyrophosphorylase "antisense" plant (lines 6, 28 and 37) in comparison to the same corresponding non-transformed wild-type plants (WT).
Fig. 5 zeigt einen Vergleich von 3 Monate alten transgenen GMPase "antisense" Pflanzen (rechts und Mitte) und einer gleichalten Wildtyp-Pflanze (links). FIG. 5 shows a comparison of 3-month-old transgenic GMPase "antisense" plants (right and middle) and an identical wild-type plant (left).
Fig. 6 zeigt das Auftreten von dunklen Flecken an Stengel und Blättern von 3 Monate alten transgenen GMPase "antisense" Pflanzen sowie das fortschreitende Ver trocknen der Blätter. Fig. 6 shows the appearance of dark spots on stems and leaves of 3 month old transgenic GMPase "antisense" plants and the progressive drying of the leaves.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
Zur Identifizierung einer cDNA, die eine GDP-Mannose Pyro phosphorylase aus Kartoffel codiert, wurden 6,5 × 105 Pha genplaques einer cDNA-Bibliothek, hergestellt aus Blättern von Kartoffelpflanzen (Koßmann et al., Planta 188 (1992), 7- 12), nach darin enthaltenen Fragmenten durchgemustert, die spezifisch mit der verwendeten Sonde hybridisieren. Die Sonde war abgeleitet aus einem EST (expressed sequence tag) aus Arabidopsis thaliana, dessen Sequenz Homologie zu einer Mannose-1-Phosphat Guanyltransferase (EC 2.7.7.13) aus Hefe aufweist (Gen Bank Zugriffsnummer T 21688).To identify a cDNA encoding a potato GDP-mannose pyrophosphorylase, 6.5 × 10 5 phage gene plaques from a cDNA library prepared from leaves of potato plants (Koßmann et al., Planta 188 (1992), 7-12 ), screened for fragments contained therein that hybridize specifically with the probe used. The probe was derived from an EST (expressed sequence tag) from Arabidopsis thaliana, the sequence of which has homology to a yeast mannose-1-phosphate guanyl transferase (EC 2.7.7.13) (Gen Bank accession number T 21688).
Phagenplaques wurden dafür auf Nylonmembranen Hybond N (Amersham, UK) übertragen und die DNA durch NaOH-Behandlung denaturiert, die Filter neutralisiert und die DNA durch UV- Behandlung auf den Filtern fixiert. Die Filter wurden in 0,25 M NaHPO4, pH 7,2, 0,25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% Formamid, 10% PEG für 2 Stunden bei 42°C vorhybridisiert. Anschließend wurden die Filter in 0,25 M NaHPO4, pH 7,2, 0,25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% Formamid, 10% PEG nach Zugabe der entsprechenden radioaktiv markierten Sonde für 10 h bei 42°C hybridisiert. Die Filter wurden anschließend 30 min in 1 × SSC, 0,5% SDS und 15 min in 0,5 × SSC, 0,5% SDS jeweils bei 42°C gewaschen und auf Röntgenfilmen exponiert. Positive Phagenclone wurden unter Anwendung von Standardver fahren weiter gereinigt. Mit Hilfe der in-vivo-excision-Me thode wurden von positiven Phagenclonen E. coli-Clone gewon nen, die ein doppelsträngiges pBluescript-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmusters der Insertionen wurde ein geeigneter Clon, cGMPase, weiter analysiert.For this purpose, phage plaques were transferred to Hybond N nylon membranes (Amersham, UK) and the DNA was denatured by NaOH treatment, the filters were neutralized and the DNA was fixed on the filters by UV treatment. The filters were prehybridized in 0.25 M NaHPO 4 , pH 7.2, 0.25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% formamide, 10% PEG for 2 hours at 42 ° C. The filters were then placed in 0.25 M NaHPO 4 , pH 7.2, 0.25 M NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 25% formamide, 10% PEG after addition of the corresponding radio-labeled probe for 10 h at 42 ° C hybridizes. The filters were then washed for 30 min in 1 × SSC, 0.5% SDS and for 15 min in 0.5 × SSC, 0.5% SDS each at 42 ° C. and exposed on X-ray films. Positive phage clones were further purified using standard procedures. Using the in vivo excision method, E. coli clones were obtained from positive phage clones which contain a double-stranded pBluescript plasmid with the respective cDNA insert. After checking the size and restriction pattern of the inserts, a suitable clone, cGMPase, was further analyzed.
Aus dem Clon wurde das Plasmid pGMPase (Fig. 1) isoliert und seine cDNA-Insertation durch Standardverfahren mittels der Didesoxymethode (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467) bestimmt.The plasmid pGMPase ( FIG. 1) was isolated from the clone and its cDNA insertion was determined by standard methods using the dideoxy method (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).
Die Insertion ist 1524 kb lang und stellt eine vollständige cDNA dar. Ein Teil der Nucleotidsequenz (1478 bp) ist unter Seq ID No. 1 angegeben. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist in Seq ID No. 2 angegeben. Sequenzvergleiche zeigten, daß diese DNA-Sequenz sowie die abgeleitete Aminosäurese quenz in verschiedenen Bereichen starke Homologie zu der cDNA aus Saccharomyces cerevisiae aufwies, die eine GDP-Man nose Pyrophosphorylyase codiert, bzw. zu der entsprechenden Aminosäuresequenz (siehe Fig. 3).The insertion is 1524 kb long and represents a complete cDNA. A part of the nucleotide sequence (1478 bp) is under Seq ID No. 1 specified. The deduced amino acid sequence is in Seq ID No. 2 specified. Sequence comparisons showed that this DNA sequence and the deduced amino acid sequence showed, in different areas, strong homology to the cDNA from Saccharomyces cerevisiae, which encodes a GDP man-made pyrophosphorylyase, or to the corresponding amino acid sequence (see FIG. 3).
Aus dem Plasmid pGMPase wurde mit Hilfe der Restriktionsen donucleasen Asp718 und BamHI ein ca. 1,5 kb großes DNA-Frag ment isoliert, das die codierende Region für die GDP-Mannose Pyrophosphorylase umfaßt, und in den mit Asp718 und BamHI geschnittenen Vektor pBinAR (DSM 9505) ligiert.The plasmid pGMPase was converted using the restrictions donucleases Asp718 and BamHI an approx. 1.5 kb DNA fragment ment isolates the coding region for the GDP mannose Pyrophosphorylase includes, and in those with Asp718 and BamHI cut vector pBinAR (DSM 9505) ligated.
Durch die Insertion des cDNA-Fragmentes entsteht eine Ex pressionskassette, die folgendermaßen aus den Fragmenten A, B und C aufgebaut ist (Fig. 2):The insertion of the cDNA fragment creates an expression cassette which is constructed from fragments A, B and C as follows ( FIG. 2):
Das Fragment A (540 bp) enthält den 35 S Promotor aus dem Blumenkohlmosaikvirus.Fragment A (540 bp) contains the 35 S promoter from the Cauliflower mosaic virus.
Das Fragment B enthält neben flankierenden Bereichen die proteincodierende Region einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase aus Solanum tuberosum. Diese wurde wie oben beschrieben aus pGMPase isoliert und in antisense-Orientierung an den 35 S- Promotor in pBinAR fusioniert.In addition to flanking areas, fragment B contains the protein-coding region of a GDP-mannose pyrophosphorylase from Solanum tuberosum. This was made up as described above pGMPase isolated and in antisense orientation at the 35 S Promoter fused in pBinAR.
Fragment C (215 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Octopin Synthase Gens aus Agrobacterium tumefaciens.Fragment C (215 bp) contains the polyadenylation signal of Octopin synthase gene from Agrobacterium tumefaciens.
Die Größe des Plasmids p35S-antiGMPase beträgt ca. 13,5 kb. Das Plasmid wurde mit Hilfe von Agrobakterien in Kartoffel pflanzen transferiert.The size of the plasmid p35S-antiGMPase is approximately 13.5 kb. The plasmid was placed in potato using agrobacteria plants transferred.
Dazu wurden 100 kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum, L.cv. Desiree) in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog Physiol. Plant. 15 (1962), 473) mit 2% Sachcarose gelegt, welches 50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Über nachtkultur enthielt. Nach 3-5 minütigem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylami nopurin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 µg/l Naphthylessig säure, 20 µg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto Agar gelegt. Aus den transformier ten Zellen wurden ganze Pflanzen regeneriert.In addition 100 small leaves were wounded with the scalpel a potato sterile culture (Solanum tuberosum, L.cv. Desiree) in 10 ml MS medium (Murashige & Skoog Physiol. Plant. 15 (1962), 473) with 2% Sachcarose, which 50 µl one under selection grown Agrobacterium tumefaciens-Über night culture included. After shaking for 3-5 minutes another incubation for 2 days in the dark. Thereupon the leaves were used for callus induction on MS medium 1.6% glucose, 5 mg / l naphthylacetic acid, 0.2 mg / l benzylami nopurin, 250 mg / l claforan, 50 mg / l kanamycin and 0.8% bacto Agar placed. After a week's incubation at 25 ° C and 3000 The leaves were used for induction of shoots on MS medium 1.6% glucose, 1.4 mg / l zeatin ribose, 20 µg / l naphthylacetic acid acid, 20 µg / l giberellic acid, 250 mg / l claforan, 50 mg / l Kanamycin and 0.8% Bacto Agar. From the transformier Whole plants were regenerated in the cells.
Die erhaltenen transgenen Kartoffelpflanzen wurden im Ge
wächshaus unter folgenden Bedingungen gehalten:
Lichtperiode: 16 h bei 25000 Lux und 22°C
Dunkelperiode: 8 h bei 15°C
Luftfeuchtigkeit: 60%.The transgenic potato plants obtained were kept in the greenhouse under the following conditions:
Light period: 16 h at 25000 lux and 22 ° C
Dark period: 8 h at 15 ° C
Air humidity: 60%.
Als Ergebnis der Transformation zeigten transgene Kartoffel pflanzen eine Verringerung der Aktivität einer GDP-Mannose Pyrophosphorylase sowie eine Verminderung der GDP-Mannose Pyrophosphorylase mRNA (siehe Fig. 4). Dies wurde mittels Northern Blot Analyse nachgewiesen.As a result of the transformation, transgenic potato plants showed a decrease in the activity of a GDP-mannose pyrophosphorylase and a decrease in the GDP-mannose pyrophosphorylase mRNA (see FIG. 4). This was demonstrated by Northern blot analysis.
Dazu wurde RNA nach Standardprotokollen aus Blattgewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg RNA wurden auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1x MEN-Puffer, 16,6% Formalde hyd). Nach der Elektrophorese wurde die RNA mit 20 × SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran Hybond N (Amersham, UK) übertragen. Die RNA wurde auf der Membran durch UV-Bestrahlung fixiert.For this purpose, RNA was extracted from leaf tissue according to standard protocols Plants isolated. 50 µg RNA were on an agarose gel separated (1.5% agarose, 1x MEN buffer, 16.6% formaldehyde hyd). After electrophoresis, the RNA was exposed to 20 × SSC using capillary blot on a nylon membrane Hybond N (Amersham, UK). The RNA was on the membrane fixed by UV radiation.
Die Membran wurde in Phosphat-Hybridisierungspuffer (Sambrook et al., a. a. O.) für 2 h prähybridisiert und an schließend durch Zugabe der radioaktiv markierten Sonde für 10 h hybridisiert.The membrane was in phosphate hybridization buffer (Sambrook et al., Op. Cit.) Prehybridized for 2 h and on closing by adding the radiolabelled probe for Hybridized for 10 h.
Transgene Pflanzen zeigten sowohl in der Sterilkultur als auch bis zu zwei Monaten nach Transfer in Gewächshaushaltung in ihrem Erscheinungsbild keine Unterschiede gegenüber untransformierten Pflanzen. Nach zwei Monaten bildeten sich am Stengel dunkle Flecken. An den Blättern wurden Läsionen in Form von kleinen schwarzen Punkten sichtbar (Fig. 6). Außerdem begannen die Blätter der Pflanzen zu vertrocknen. Dabei vertrockente zuerst die Spitze der endständigen Fieder eines Blattes bis das ganze Blatt bis zum Stengel hin braun und vertrocknet war. Dieses Abreifen der Blätter setzte sich, von unten nach oben fortschreitend, fort, bis schließ lich alle oberirdischen Pflanzenteile abgereift waren (Fig. 5).Transgenic plants showed no differences in their appearance compared to untransformed plants both in sterile culture and up to two months after transfer to greenhouses. After two months, dark spots formed on the stem. Lesions in the form of small black dots were visible on the leaves ( FIG. 6). In addition, the leaves of the plants started to dry up. The tip of the terminal leaflet of a leaf first dried up until the entire leaf was brown and dried up to the stem. This ripening of the leaves continued, progressing from bottom to top, until finally all above-ground parts of the plants had ripened ( Fig. 5).
Transgene GDP-Mannose antisense Pflanzen unterscheiden sich in ihrem Knollenertrag nicht von untransformierten Kartof felpflanzen. Knollen von 15 Wochen alten untransformierten Kartoffelpflanzen wogen durchschnittlich 169,7 g pro Pflanze. Die Erträge für drei unabhängig transformierte Li nien betrugen durchschnittlich 168,6 g (Linie 37), 162,5 g (Linie 28) beziehungsweise 160,7 g (Linie 6). Transgenic GDP-mannose antisense plants differ in her tuber yield not from untransformed potato potted plants. Tubers from 15 weeks old untransformed Potato plants weighed an average of 169.7 g each Plant. The returns for three independently transformed Li on average, 168.6 g (line 37) and 162.5 g (Line 28) or 160.7 g (line 6).
Claims (29)
- a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene codierende Region umfassen;
- c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird;
- d) Nucleinsäuremoleküle, die die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthaltene codierende Region umfassen;
- e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) hybridisiert; und
- f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.
- a) Nucleic acid molecules which encode a protein which has the properties listed under Seq ID No. 2 includes amino acid sequence indicated;
- b) Nucleic acid molecules which are listed under Seq ID No. 1 indicated coding region;
- c) nucleic acid molecules encoding a protein comprising the amino acid sequence encoded by the insertion in plasmid pGMPase (DSM 11746);
- d) nucleic acid molecules comprising the coding region contained in the insertion of the plasmid pGMPase (DSM 11746);
- e) nucleic acid molecules which hybridize with a strand of a nucleic acid molecule according to (a), (b), (c) and / or (d); and
- f) nucleic acid molecules whose sequence deviates from the sequence of a nucleic acid molecule according to (e) due to the degeneration of the genetic code.
- a) antisense-RNAs, die zu Transkripten von GDP-Mannose Pyrophosphorylase-Genen oder zu Teilen solcher Transkripte komplementär ist;
- b) Ribozymen, die spezifisch Transkripte eines GDP-Man nose Pyrophosphorylase-Gens spalten können; und
- c) Cosuppressions-RNAs zu einer mRNA, die eine GDP-Man nose Pyrophosphorylase codiert.
- a) antisense RNAs which is complementary to transcripts of GDP-mannose pyrophosphorylase genes or to parts of such transcripts;
- b) ribozymes which can specifically cleave transcripts of a GDP man-made pyrophosphorylase gene; and
- c) cosuppression RNAs to an mRNA encoding a GDP-nose pyrophosphorylase.
- a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines fremden Nucleinsäuremole küls, und die genetische Modifikation zur Verringe rung der Aktivität einer endogen in pflanzlichen Zellen vorkommenden GDP-Mannose Pyrophosphorylase führt; und
- b) aus der Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und ge gebenenfalls
- c) aus der Pflanze nach (b) weitere Pflanzen erzeugt werden.
- a) a plant cell is genetically modified by the introduction of a foreign nucleic acid molecule, and the genetic modification leads to a reduction in the activity of an endogenously occurring GDP-mannose pyrophosphorylase occurring in plant cells; and
- b) a plant is regenerated from the cell; and if necessary
- c) further plants are produced from the plant according to (b).
- a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
- b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 angegebene codierende Region umfassen;
- c) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die Aminosäuresequenz umfaßt, die von der Insertion in Plasmid pGMPase (DSM 11746) codiert wird;
- d) Nucleinsäuremoleküle, die die in der Insertion des Plasmids pGMPase (DSM 11746) enthaltene codierende Region umfassen;
- e) Nucleinsäuremolekülen, die mit einem Strang eines Nucleinsäuremoleküls nach (a), (b), (c) und/oder (d) hybridisiert; und
- f) Nucleinsäuremolekülen, deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von der Sequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach (e) abweicht.
- a) Nucleic acid molecules which encode a protein which has the properties listed under Seq ID No. 2 includes amino acid sequence indicated;
- b) Nucleic acid molecules which are listed under Seq ID No. 1 indicated coding region;
- c) nucleic acid molecules encoding a protein comprising the amino acid sequence encoded by the insertion in plasmid pGMPase (DSM 11746);
- d) nucleic acid molecules comprising the coding region contained in the insertion of the plasmid pGMPase (DSM 11746);
- e) nucleic acid molecules which hybridize with a strand of a nucleic acid molecule according to (a), (b), (c) and / or (d); and
- f) nucleic acid molecules whose sequence deviates from the sequence of a nucleic acid molecule according to (e) due to the degeneration of the genetic code.
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Citations (7)
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- 1998-09-18 WO PCT/EP1998/005973 patent/WO1999015674A2/en active Application Filing
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