DE19740339A1 - Oligonucleotides for human HLA-A and HLA-B subtyping - Google Patents

Oligonucleotides for human HLA-A and HLA-B subtyping

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Juergen Enczmann
Andreas Knipper
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WERNET PETER PD DR MED
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes

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Abstract

At least one of the following oligonucleotides are used for the reverse-transcription of human HLA-A and HLA-B RNA and for amplification and sequencing of the resulting cDNA: (1) 5' CCC ATC TCA GGG TGA 3' (2) 5' GCT CCC ACT CCA TGA GGT ATT TC 3' (3) 5' ATC TCA GGG TGA GGG GCT TG 3' (4) 5' TGC CCA CTT CTG GAA GGT TCT 3' (5) 5' CTC GCT CTG GTT GTA G 3' (6) 5' TTC CCG TTC TCC AGG T 3' (7) 5' TGC TGG CCT GGT CTC CAC 3'.

Description

Einführungintroduction

Ein entscheidendes Problem bei der Transplantation von Organen ist die Definition der Gewebeverträglichkeit zwischen Spender und Empfänger. Zu den Hauptgewebeverträglichkeitsantigenen gehören u. a. die HLA-A und HLA-B Antigene, die durch die HLA-A und HLA-B Gene kodiert werden. Diese Gene sind polymorph, so daß die genaue Bestimmung der jeweils vorhandenen Allele ein technisch schwieriges Problem darstellt. Im Rahmen einer Transplantation ist die Definition dieser Gene von großer Bedeutung.A crucial problem in organ transplantation is the definition of Tissue compatibility between donor and recipient. To the main tissue tolerance antigens belong u. a. the HLA-A and HLA-B antigens encoded by the HLA-A and HLA-B genes. These genes are polymorphic, so that the exact determination of the alleles present is a technical one represents a difficult problem. In the context of a transplant, the definition of these genes is of great importance Meaning.

Stand der TechnikState of the art

Zur Zeit werden für die HLA-A- und HLA-B-Typisierung hauptsächlich serologische Verfahren eingesetzt, die in der Regel nicht in der Lage, sind die HLA-A oder HLA-B-Subtypen zu bestimmen. Desweiteren werden die Isoelektrische Fokussierung, die Hybridisierung mit Oligonukleotiden oder eine Amplifikation mit bestimmten Primern zur Bestimmung der HLA-A und HLA-B Antigene (oder Gene) eingesetzt. Berücksichtigt man den hohen Polymorphismus dieser Gene in Europa ist die DNA-Sequenzierung die einzige Methode, die eine ausreichend hohe Auflösung besitzt, um in den meisten Fällen eine Subtypisierung durchzuführen. Im folgenden soll auf die Ansätze eingegangen werden, die eine DNA- Sequenzierung zur HLA-A oder HLA-B Subtypisierung einsetzten.At present, mainly serological methods are used for HLA-A and HLA-B typing, who are usually unable to determine the HLA-A or HLA-B subtypes. Furthermore are isoelectric focusing, hybridization with oligonucleotides or amplification used with certain primers for the determination of HLA-A and HLA-B antigens (or genes). Taking into account the high polymorphism of these genes in Europe, DNA sequencing is the only method that has a sufficiently high resolution to in most cases Perform subtyping. In the following, the approaches that a DNA Use sequencing for HLA-A or HLA-B subtyping.

Eine Publikation (Cereb et al.) beschreibt eine Locus-spezifische Amplifikation von HLA-A, -B und -C Genen. Dabei werden Oligonukleotide zur Amplifikation von genomischer DNA verwendet, die in den Introns 1 und 3 liegen. Mit diesem Ansatz werden nur die Exons 2 und 3 erfaßt nicht aber das zur vollständigen Subtypisierung benötigte Exon 4. Da das Amplifikat unter Verwendung von DNA als Template noch das Intron 2 enthält, ist es nicht möglich mit einer Sequenzreaktion den gesamten polymorphen Bereich der Exons 2 und 3 zu erfassen. Somit sind in der Regel zwei separate Sequenzreaktionen pro Locus notwendig. Desweiteren ist zur Zeit nicht bekannt, inwieweit die in den Introns verwendeten Positionen bei den verschiedenen HLA-Allelen spezifisch für die entsprechenden Loci sind.One publication (Cereb et al.) Describes a locus-specific amplification of HLA-A, -B and -C Genes. Oligonucleotides are used for the amplification of genomic DNA, which are in the Introns 1 and 3 lie. With this approach, only exons 2 and 3 are detected, but not for complete subtyping required exon 4. Since the amplificate was using DNA as Template still contains the intron 2, it is not possible with a sequence reaction the entire to capture the polymorphic area of exons 2 and 3. So there are usually two separate ones Sequence reactions per locus necessary. Furthermore, it is currently not known to what extent the Introns used positions in the different HLA alleles specifically for the corresponding ones Are loci.

Eine weitere Publikation (Santamaria et al.) verwendet RNA als Ausgangsmaterial zur HLA-Klasse I Subtypisierung. Nach einer Reversen Transkription werden je nach HLA-Klasse I Typ unterschiedliche Amplifikations- und Sequenzierprimer eingesetzt, wodurch diese Methode in der täglichen Routineanwendung zu komplex ist. Außerdem ist zur Auswahl der zu verwendenden Oligonukleotide die Kenntnis der serologischen HLA-Klasse I Typisierung erforderlich. Die Resultate dieser Methode wurden von Domena et al. analysiert und in Frage gestellt.Another publication (Santamaria et al.) Uses RNA as the starting material for HLA class I Subtyping. After a reverse transcription, depending on the HLA class I type different Amplification and sequencing primers are used, making this method everyday Routine application is too complex. In addition, for the selection of the oligonucleotides to be used Knowledge of the serological HLA class I typing required. The results of this method have been by Domena et al. analyzed and questioned.

Vergleich zum eigenen VerfahrenComparison to your own procedure

Ziel war es, mit einer möglichst minimalen Anzahl an Oligonukleotiden die Bestimmung der HLA-A-Gene und HLA-B-Gene durchzuführen. Dazu wurden durch Vergleich bekannter HLA-A- und HLA-B-DNA- Sequenzen bestimmte Oligonukleotide ausgewählt, so daß hier nur eine minimale Anzahl an unterschiedlichen Oligonukleotiden eingesetzt wird. So liegen das Oligonukleotid für die Reverse Transkription, das 5'-Oligonukleotid der PCR und die drei Oligonukleotide der Sequenzreaktion in konservierten Genbereichen, so daß alle genannten Oligonukleotide unabhängig von dem zu typisierenden Locus eingesetzt werden können. Im Experiment konnte gezeigt werden, daß die für die einzelnen Gene spezifischen Primer tatsächlich nur die gewünschten Gene amplifizieren und daß die Oligonukleotide in den konservierten Bereichen für das Verfahren einsetzbar sind. Durch die Wahl dieser Oligonukleotide wird der Ablauf der HLA-Klasse I Subtypisierung entscheidend vereinfacht, so daß dieses Verfahren kostengünstiger in der Routinediagnostik eingesetzt werden kann.The aim was to determine the HLA-A genes with the smallest possible number of oligonucleotides and HLA-B genes. For this purpose, by comparing known HLA-A and HLA-B DNA Sequences selected certain oligonucleotides, so that only a minimal number of different oligonucleotides is used. This is the oligonucleotide for the reverse Transcription, the 5'-oligonucleotide of the PCR and the three oligonucleotides of the sequence reaction in conserved gene regions, so that all of the oligonucleotides mentioned are independent of that typing locus can be used. In the experiment it could be shown that the for the individual genes specific primers actually amplify only the desired genes and that the Oligonucleotides in the conserved areas can be used for the process. By choosing this Oligonucleotides significantly simplify the process of HLA class I subtyping, so that this Procedures can be used more cost-effectively in routine diagnostics.

Beschreibung der ErfindungDescription of the invention

Die Erfindung besteht in dem Einsatz bestimmter Oligonukleotide zur Reversen Transkription und Amplifikation von HLA-A und HLA-B Genen des Menschen zum Zwecke der nachfolgenden Bestimmung von einem oder mehreren Nukleotiden dieser Gene. Des weiteren werden in der Erfindung nach der Amplifikation bestimmte Oligonukleotide als Primer verwendet, um die Bestimmung eines Teils der Nukleotidsequenz der genannten Gene mittels DNA-Sequenzierung durchzuführen. In den Patentansprüchen wird Schutz für die Verwendung der in Tabelle 1 genannten Oligonukleotide zur Reversen Transkription und Amplifikation von HLA-A und HLA-B Genen und die anschließende Bestimmung von DNA-Sequenzen der HLA-A und HLA-B Merkmale begehrt. Außerdem wird für die Verwendung der in Tabelle 1 genannten Oligonukleotide zur Durchführung der DNA-Sequenzierung Schutz begehrt.The invention consists in the use of certain oligonucleotides for reverse transcription and Amplification of human HLA-A and HLA-B genes for the purpose of the determination below of one or more nucleotides of these genes. Furthermore, according to the invention Amplification certain oligonucleotides used as primers to determine part of the Perform nucleotide sequence of the genes mentioned by means of DNA sequencing. In the Claims will protection for the use of the oligonucleotides listed in Table 1 for Reverse transcription and amplification of HLA-A and HLA-B genes and the subsequent Determination of DNA sequences of the HLA-A and HLA-B characteristics is sought after. In addition, for the Use of the oligonucleotides listed in Table 1 to carry out DNA sequencing Protection is sought.

Beschreibung zur Durchführung des VerfahrensDescription of the procedure

  • 1. Isolierung von Gesamt-RNA1. Isolation of total RNA
  • 2. Reverse Transkription der RNA mit Hilfe eines Oligonukleotids (RT-ABC; siehe Tabelle 1) das in einem konservierten Bereich der klassischen HLA-Klasse I Gene (HLA-A,B,C) liegt, so daß in einer Reaktion alle relevanten Transkripte erfaßt werden.2. Reverse transcription of the RNA using an oligonucleotide (RT-ABC; see Table 1) in one conserved area of the classic HLA class I genes (HLA-A, B, C), so that in one reaction all relevant transcripts are recorded.
  • 3. Getrennte Vervielfältigung der cDNAs von HLA-A und HLA-B mit der Polymerase Kettenreaktion durch Oligonukleotide, die spezifisch HLA-A (3'-A+5'ABC; siehe Tabelle 1) oder HLA-B (3'-B+5ABC; siehe Tabelle 1) amplifizieren.3. Separate amplification of the HLA-A and HLA-B cDNAs by the polymerase chain reaction Oligonucleotides that specifically HLA-A (3'-A + 5'ABC; see Table 1) or HLA-B (3'-B + 5ABC; see Table 1) amplify.
  • 4. Sequenzierung der Amplifikate mit Hilfe von Fluoreszenz-markierten Oligonukleotiden. Um den gesamten polymorphen Bereich der HLA-Gene erfassen zu können, werden bis zu drei verschiedene Oligonukleotide (51, 52, 53; siehe Tabelle 1) in getrennten Sequenzreaktionen eingesetzt.4. Sequencing of the amplificates using fluorescence-labeled oligonucleotides. To the To be able to capture the entire polymorphic range of the HLA genes is up to three different Oligonucleotides (51, 52, 53; see Table 1) used in separate sequence reactions.

Tabelle I Table I

Nukleotidsequenzen und Positionen der Oligonukleotide Nucleotide sequences and positions of the oligonucleotides

Literaturliterature

Cereb, N. Maye, P., Lee, S., Kong, Y., Yang, S. Y. Locus-specific amplification of HLA class I genes from genomic DNA: locus-specific sequences in the first and third introns of HLA-A, -B, and -C alleles. Tissue Antigens 45: 1-11, 1995
Domena, J D., Little A. M., Arnett, K. L., Adams, E. J., Marsh, S. G., Parham, P. A small test of a sequence-based typing method: definition of the B* 1520 allele. Tissue Antigens 44: 217-24, 1994
Santamaria, P. Lindstrom, A. L., Boyce Jacino, M. T., Myster, S. H., Barbosa, J. J. Faras, A. J., Rich, S. S. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol 37: 39-50, 1993Cereb, N. Maye, P., Lee, S., Kong, Y., Yang, SY Locus-specific amplification of HLA class I genes from genomic DNA: locus-specific sequences in the first and third introns of HLA-A, -B, and -C alleles. Tissue Antigens 45: 1-11, 1995
Domena, J D., Little AM, Arnett, KL, Adams, EJ, Marsh, SG, Parham, P. A small test of a sequence-based typing method: definition of the B * 1520 allele. Tissue Antigens 44: 217-24, 1994
Santamaria, P. Lindstrom, AL, Boyce Jacino, MT, Myster, SH, Barbosa, JJ Faras, AJ, Rich, SS HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol 37: 39-50, 1993

Claims (4)

1. Einsatz bestimmter Oligonukleotide zur Reversen Transkription und Amplifikation von HLA-A und HLA-B Genen des Menschen zum Zwecke der nachfolgenden Bestimmung von einem oder mehreren Nukleotiden dieser Gene dadurch gekennzeichnet, daß eines oder mehrere der in der Tabelle 1 aufgeführten Oligonukleotide verwendet werden.1. Use of certain oligonucleotides for reverse transcription and amplification of HLA-A and HLA-B genes in humans for the purpose of the subsequent determination of one or more nucleotides of these genes, characterized in that one or more of the oligonucleotides listed in Table 1 are used. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligonukleotid RT-ABC (Tabelle 1) zur Reversen Transkription der HLA-A Gene oder HLA-B Gene des Menschen eingesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the oligonucleotide RT-ABC (Table 1) for reverse transcription of the HLA-A genes or HLA-B genes of humans are used. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eines oder mehrere der Oligonukleotide 5'-ABC, 3'-A oder 3'-B (Tabelle 1) zur Amplifikation von HLA-A oder HLA-B Genen des Menschen eingesetzt wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that one or more of the oligonucleotides 5'-ABC, 3'-A or 3'-B (Table 1) is used to amplify human HLA-A or HLA-B genes. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3 dadurch gekennzeichnet, daß daß eines oder mehrere der Oligonukleotide S1, S2 oder S3 (Tabelle 1) als Primer zur DNA-Sequenzierung von HLA-A oder HLA-B Genen des Menschen eingesetzt wird.4. The method according to claim 1, 2 or 3 characterized in that one or more of the oligonucleotides S1, S2 or S3 (Table 1) is used as a primer for DNA sequencing of HLA-A or HLA-B genes in humans.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999054496A3 (en) * 1998-04-20 2000-03-02 Innogenetics Nv Method for typing of hla alleles

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