DE19738800A1

DE19738800A1 - Inactivating spore-forming microorganisms

Info

Publication number: DE19738800A1
Application number: DE1997138800
Authority: DE
Inventors: Rudi F Prof Dr Vogel; Volker Dipl Ing Herdegen; Roland Prof Dr Meyer-Pittroff
Original assignee: MEYER PITTROFF ROLAND
Current assignee: MEYER PITTROFF ROLAND
Priority date: 1997-09-06
Filing date: 1997-09-06
Publication date: 1999-03-11

Abstract

Spore-forming microorganisms are inactivated by inducing germination of the spores by application of high static or alternating pressure and inactivating the resulting vegetative cells by a second high pressure treatment. The pressure-induced germination is accomplished by application of static or alternating pressures of at least 50 MPa. The process is also referred to as 'High Pressure Tyndallisation'.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren, die auf der Grundlage der Hochdruckinaktivierung von sporenbildenden Mikroorganismen deren Auskeimung und nachfolgend durch weitere Hochdruckbehandlungen eine Inaktivierung dieser bewirken.The invention relates to methods based on the high pressure inactivation of spore-forming microorganisms, their germination and subsequently by others High pressure treatments inactivate them.

1 INTRODUCTION

Die mit Ultrahochdruck am schwierigsten zu inaktivierenden Mikroorganismen sind endosporenbildende Bakterien. Der genaue Mechanismus für die hohe Resistenz der Sporen gegenüber Streßfaktoren wie z. B. Druck oder Hitze konnte bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt werden.The microorganisms most difficult to inactivate with ultra high pressure are endospore-forming bacteria. The exact mechanism for the high resistance of the spores against stress factors such as B. To date, pressure or heat has not been completely able be cleared up.

Niedrige Drücke von bis zu 200 MPa können die Keimung von Sporen beschleunigen, während sehr hohe Drücke zu deren Inaktivierung führen. Die Initialphase der Auskeimung während einer Hochdruckbehandlung von Bacillus subtilis- und Bacillus stearothennophilus- Sporen konnte durch die Freisetzung von Dipikolinsäure und Ca²⁺-Ionen gemessen werden. Es konnte gezeigt werden, daß eine Vorbehandlung bei relativ niedrigen Drücken zwischen 60 und 100 MPa und nachfolgend hohen Drücken die Inaktivierung von Sporen beschleunigen konnte [1]. Aufgrund dieser Ergebnisse konnte eine ideale Auskeimung von Bacillus subtilis- Sporen bei Drücken zwischen 60 und 150 MPa erreicht werden. Erst ein alternierender Druck zwischen 60 und 500 MPa in 30minütigen Intervallen bei einer Gesamtzeit von 180 Minuten bei 50°C führte zu einer vollständigen Inaktivierung der Sporen [2]. Die Auswirkungen einer Kombination von hohen Drücken mit elektrischen Wechselspannungen [3], Bakteriozinen [4] oder anderen Konservierungsmitteln wurde auch untersucht.Low pressures of up to 200 MPa can accelerate the germination of spores, while very high pressures lead to their inactivation. The initial phase of germination during high-pressure treatment of Bacillus subtilis and Bacillus stearothennophilus spores could be measured by the release of dipicolinic acid and Ca ²⁺ ions. It could be shown that pretreatment at relatively low pressures between 60 and 100 MPa and subsequent high pressures could accelerate the inactivation of spores [1]. Based on these results, ideal germination of Bacillus subtilis spores was achieved at pressures between 60 and 150 MPa. Only an alternating pressure between 60 and 500 MPa at 30 minute intervals with a total time of 180 minutes at 50 ° C led to a complete inactivation of the spores [2]. The effects of a combination of high pressures with alternating voltages [3], bacteriocins [4] or other preservatives were also examined.

Mit den genannten Parametern benötigt die Hochdrucktechnologie unter wirtschaftlichen Aspekten eine Prozeßzeit, die noch viel zu lang ist, um kostendeckend zu sein. Daher ist es notwendig, eine Hochdruckbehandlung zur Inaktivierung endosporenbildender Bakterien zu finden, die eine möglichst kurze Prozeßzeit zur Reduzierung der Energiekosten und ohne Verwendung von zusätzlichen Additiven benötigt. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit alle Versuche bei Raumtemperatur durchgeführt und maximal eine Stunde für den gesamten Inaktivierungsprozeß veranschlagt.With the parameters mentioned, high-pressure technology requires economical Aspects a process time that is still too long to cover costs. Therefore, it is high pressure treatment to inactivate endospores forming bacteria find the shortest possible process time to reduce energy costs and without Use of additional additives is required. For this reason, this work all tests carried out at room temperature and a maximum of one hour for the whole Inactivation process estimated.

2 MATERIAL AND METHODS

Für alle Versuche wurden Endosporen eines Bacillus subtilis-Stammes (Merck, No. 1.10649) verwendet. 1 ml der Sporensuspension wurde mit 100 ml sterilem Peptonwasser, pH 7,5 verdünnt. Dieses Gemisch wurde für alle Erhitzungsexperimente in sterile Röhrchen aliquotiert und sofort verschiedenen Temperaturbehandlungen zwischen 40 und 80°C für jeweils 5 oder 15 Minuten unterzogen. Anschließend wurden die Proben bei 37°C für 8 Stunden inkubiert. Die Proben für die Hochdruckbehandlung wurden in sterile Kunststoffröhrchen aliquotiert, vakuumverschweißt, und anschließend hochdruckbehandelt. Endospores of a Bacillus subtilis strain (Merck, No. 1.10649) were used for all experiments. used. 1 ml of the spore suspension was mixed with 100 ml of sterile peptone water, pH 7.5 diluted. This mixture was aliquoted into sterile tubes for all heating experiments and immediately different temperature treatments between 40 and 80 ° C for 5 or Subjected to 15 minutes. The samples were then incubated at 37 ° C for 8 hours. The high pressure treatment samples were aliquoted into sterile plastic tubes, vacuum welded and then high pressure treated.

Die "Hochdruck-Tyndallisierung" wurde mit verschiedenen Kombinationen einer 15minütigen Keimungsinduktion unter verschiedenen Drücken, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C für 30 Minuten unter Normaldruck, und einer zweiten Hochdruckbehandlung für 15 Minuten durchgeführt. Die Anzahl der Überlebenden Sporen wurde in allen Proben nach einer 10minütigen Pasteurisierung bei 80°C durch Verdünnungsreihen und anschließender Bebrütung auf Nähragar bei 37°C, 24 Stunden bestimmt.The "high pressure tyndallization" was done with various combinations of a 15 minute Germination induction at various pressures, followed by incubation at 37 ° C for 30 minutes under normal pressure, and a second high pressure treatment for 15 minutes carried out. The number of surviving spores was determined in all samples after one Pasteurization for 10 minutes at 80 ° C by dilution series and subsequent Incubation on nutrient agar at 37 ° C, determined 24 hours.

3 RESULTS 3.1 heat induction

In allen Experimenten konnte die Anzahl an Endosporen reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl zunehmende Temperaturen als auch ansteigende Drücke das Auskeimen der Sporen beschleunigen konnten.The number of endospores could be reduced in all experiments. It could be shown that both increasing temperatures and increasing pressures will germinate the spores could accelerate.

Abb. 1 zeigt die Anzahl der Überlebenden Sporen nach verschiedenen 5minütigen Hitzeinduktionen im Laufe einer 8stündigen Bebrütung bei 37°C. Die Kontrollprobe ohne Hitzeinduktion zeigte eine langsamere Auskeimung der Endosporen. Andererseits nahm die Anzahl vegetativer Zellen nach einer 15minütigen Hitzeinduktion schneller zu (Abb. 2). Die Induktionsrate war bei niederen Temperaturen effektiver als bei höheren. Daraus könnte geschlossen werden, daß Endosporen vor dem Beginn der Auskeimung eine gewisse Adaptationsphase benötigen. Sowohl die 5minütigen als auch die 15minütigen Proben hatten nach einer einstündigen Inkubationszeit bei allen Temperaturen fast die gleiche Anzahl an überlebenden Sporen. Fig. 1 shows the number of surviving spores after various 5-minute heat induction during an 8-hour incubation at 37 ° C. The control sample without heat induction showed a slower germination of the endospores. On the other hand, the number of vegetative cells increased faster after 15 minutes of heat induction ( Fig. 2). The induction rate was more effective at lower temperatures than at higher ones. From this it could be concluded that endospores need a certain adaptation phase before germination begins. Both the 5 minute and 15 minute samples had almost the same number of surviving spores after an hour of incubation at all temperatures.

Aufgrund der bisher gewonnen Erkenntnisse wurde nun eine Kombination einer Druckinduktion mit nachfolgender Inkubationsphase und einer zweiten Druckbehandlung durchgeführt. Diese "Hochdruck-Tyndallisierung" war bei einer ersten Druckbehandlung von 500 MPa, 15 Minuten, einer Inkubation für 30 Minuten bei 37°C und Normaldruck und eine Inaktivierung bei 600 MPa, 15 Minuten erfolgreich (Abb. 5). In allen Experimenten über 200 MPa konnte die Endosporenanzahl bemerkenswert reduziert werden. In einigen Proben konnte sogar eine vollkommene Sterilisierung erreicht werden. Diese wurde z. B. bei einer Kombination von 500 MPa als ersten Druck, und 600 MPa als nachfolgender Druckstufe erzielt werden.Based on the knowledge gained so far, a combination of pressure induction with subsequent incubation phase and a second pressure treatment has now been carried out. This "high-pressure Tyndallisierung" was successful with a first pressure treatment of 500 MPa, 15 minutes, an incubation for 30 minutes at 37 ° C and normal pressure and an inactivation at 600 MPa, 15 minutes ( Fig. 5). The number of endospores was remarkably reduced in all experiments above 200 MPa. Complete sterilization was even achieved in some samples. This was e.g. B. with a combination of 500 MPa as the first pressure, and 600 MPa as the subsequent pressure stage.

4 SUMMARY

Das druckabhängige Verhalten endosporenbildender Bakterien diente als Grundlage zur Entwicklung einer Strategie, diese zu inaktivieren. Es konnte gezeigt werden, daß durch Ultrahochdruck eine vollkommene Inaktivierung von Endosporen eines Bacillus subtilis- Stammes erreicht werden konnte. Dabei betrug die Gesamtbehandlungszeit nur eine Stunde. Eine Erhitzung der Proben war dabei nicht notwendig.The pressure-dependent behavior of endospore-forming bacteria served as the basis for Develop a strategy to inactivate it. It could be shown that by Ultra high pressure a complete inactivation of endospores of a Bacillus subtilis Tribe could be achieved. The total treatment time was only one hour. It was not necessary to heat the samples.

5 LITERATURE

[1] Butz, P., Ries, J., Traugott, U., Weber, H., Ludwig, H. Hochdruckinaktivierung von Bakterien und Bakteriensporen, Pharm. Ind. 52, 487-491 (1990).
[2] Sojka, B., Ludwig, H. Pressure-induced germination and inactivation of Bacillus subtilis spores, Pharm. Ind. 56, 660-663 (1994).
[3] Shimada, K. Effect of combination treatment with high pressure and alternating current on the lethal damage of Escherichia coli cells and Bacillus subtilis spores, High Pressure and Biotechnology, John Libbey Eurotext Ltd. Vol. 224, 49-51(1992).
[4] Roberts, C.M., Hoover, D.G. Sensitivity of Bacillus coagulans spores to combinations of high hydrostatic pressure, heat, acidity and nisin, J. Appl. Bact. 81 (4), 363-368 (1996).[1] Butz, P., Ries, J., Traugott, U., Weber, H., Ludwig, H. High pressure inactivation of bacteria and bacterial spores, Pharm. Ind. 52, 487-491 (1990).
[2] Sojka, B., Ludwig, H. Pressure-induced germination and inactivation of Bacillus subtilis spores, Pharm. Ind. 56, 660-663 (1994).
[3] Shimada, K. Effect of combination treatment with high pressure and alternating current on the lethal damage of Escherichia coli cells and Bacillus subtilis spores, High Pressure and Biotechnology, John Libbey Eurotext Ltd. Vol. 224, 49-51 (1992).
[4] Roberts, CM, Hoover, DG Sensitivity of Bacillus coagulans spores to combinations of high hydrostatic pressure, heat, acidity and nisin, J. Appl. Bact. 81 (4), 363-368 (1996).

Claims

Process for inactivating spore-forming microorganisms by repeated high-pressure application ("high-pressure tyndallization"), characterized in that spores are stimulated to germinate by high static, dynamic and / or alternating pressures (≧ 50 MPa), and subsequently the vegetative lines formed by a second high pressure treatment can be deactivated.