DE19736715A1 - Reagent for tumour diagnosis - Google Patents
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- G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Mittel und seine Verwendung zur komplexen molekularen Tumordiagnostik. Unter komplexer Tumordiagnostik werden die Früherkennung, die Charakterisierung des Entwicklungsstadiums, die Prognose und die Therapieverlaufs kontrolle verstanden.The invention relates to an agent and its use for complex molecular tumor diagnostics. Under complex Tumor diagnostics become early detection, characterization the developmental stage, the prognosis and the course of therapy control understood.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.Areas of application of the invention are medicine and Pharmaceutical Industry.
Die sichere Diagnose von Tumoren in den verschiedenen Wachstumsstadien ist ein Ziel, mit dem sich weltweit eine große Zahl von Wissenschaftlern beschäftigt. Im Mittelpunkt solcher Arbeiten steht der Tumornachweis mit Hilfe von Tumormarkern. Bekannte Tumormarker, die auch schon diagnostisch genutzt werden, sind p53 (Clinical applications of the p53 tumor suppressor gene., Clin-Chim-Acta. 1995 Jun 15; 327 (1-2): 79-90) und p16 (Alterations of the p16 (MTS1) gene in testicular, ovarian, and endometrial malignancies, J-Urol. 1995 Nov; 154 (5): 1954-7).The safe diagnosis of tumors in the different Stages of growth is a goal with which a major worldwide Number employed by scientists. At the center of such The tumor detection works with the help of tumor markers. Known tumor markers that have also been used diagnostically are p53 (Clinical applications of the p53 tumor suppressor gene., Clin-Chim-Acta. 1995 Jun 15; 327 (1-2): 79-90) and p16 (Alterations of the p16 (MTS1) gene in testicular, ovarian, and endometrial malignancies, J-Urol. 1995 Nov; 154 (5): 1954-7).
Diagnosen auf der Basis von einzelnen Tumormarkern haben nur einen begrenzten Prognosewert, weil sie nur für einen speziellen Tumor(bzw. mehrere Tumoren) spezifisch sind und dadurch die gesamte Komplexität einer Tumorerkrankung nicht erfassen. Die Genauigkeit der Diagnose liegt daher nur bei ca. 60%.Have diagnoses based on individual tumor markers only a limited forecast value because it's only for a special Tumor (or several tumors) are specific and therefore the do not grasp the entire complexity of a tumor disease. The The accuracy of the diagnosis is therefore only around 60%.
Die Erfindung hat das Ziel, die molekulare Tumordiagnostik so zu vereinfachen, daß eine routinemäßige Anwendung in der Labordiagnostik möglich wird. Ihre Aufgabe besteht darin, ein Mittel und ein Verfahren zu entwickeln, welches die Aussagesicherheit hinsichtlich Prognose und Therapie möglichkeiten erhöht.The aim of the invention is to improve molecular tumor diagnosis simplify that a routine application in the Laboratory diagnostics becomes possible. Your job is to create a To develop means and a method which the Reliability regarding prognosis and therapy possibilities increased.
Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Mittel gemäß Anspruch 1 und den Unteransprüchen 2-20 sowie durch seine Verwendung gemäß Anspruch 21 und den Unteransprüchen 22-36 gelöst.The object of the invention is achieved by a means according to claim 1 and subclaims 2-20 and by its use solved according to claim 21 and the subclaims 22-36.
Das erfindungsgemäße Mittel zur komplexen molekularen Tumordiagnostik ist dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 2 verschiedene Oligonukleotide oder Polynukleotide mit definierter Komplementarität zu einem Tumormarkergen oder zu mehreren Tumormarkergenen enthält.The inventive agent for complex molecular Tumor diagnosis is characterized in that it is at least 2 different oligonucleotides or polynucleotides with defined Complementarity to one or more tumor markers Contains tumor marker genes.
Vorzugsweise enthält es 2, 3 oder 4 bis 12 Oligonukleotide oder Polynukleotide, wobei die Oligonukleotide oder Polynukleotide komplementär zu Tumorsuppressoren sind, vorzugsweise komplementär zu Onkogenen. Insbesondere komplementär zu den Tumormarkergenen p53, Rb, p16, cyclinD1, cdk4, Ki-ras, APC, DCC, DPC4 bcl-2, bax, PSA, HpV, mdr1 oder zu membran-gebundenen humanen Metallomatrixproteasen wie z. B. MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP oder MT4-MMP.It preferably contains 2, 3 or 4 to 12 oligonucleotides or Polynucleotides, the oligonucleotides or polynucleotides are complementary to tumor suppressors, preferably complementary to oncogenes. Complementary to the Tumor marker genes p53, Rb, p16, cyclinD1, cdk4, Ki-ras, APC, DCC, DPC4 bcl-2, bax, PSA, HpV, mdr1 or membrane-bound human Metallomatrixproteases such as. B. MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP or MT4-MMP.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante sind mindestens 2 verschiedene Oligonukleotide oder Polynukleotide mit definierter Komplementarität zu einem, bevorzugt mehreren, Tumormarkergenen an eine feste Phase gebunden.In a preferred embodiment variant, at least 2 different oligonucleotides or polynucleotides with defined Complementarity to one, preferably several, tumor marker genes bound to a solid phase.
Als feste Phase im Sinne der Erfindung kommt in Frage die Oberfläche eines Lichtwellenleiters oder eines Evaneszentfeld-Transducers (einschließlich Oberflächenplasmonenresonanz, SPR), die Oberfläche eines Schwingquarzes eines elektroakustischen Oberflächenschwinders (SAW), die Oberfläche einer Elektrode oder einer Interdigitalelektrode. Sie besteht bevorzugt aus Glas, Quarzglas, Silizium oder Siliziumoxid oder Gemischen davon, Tantaloxid, Gold, Platin oder einem anderen Edelmetall sowie Legierungen davon oder aus einem Kunststoff wie Polystyrol oder Polycarbonat.As a solid phase in the sense of the invention, the Surface of an optical fiber or an evanescent field transducer (including surface plasmon resonance, SPR), the surface of a quartz crystal of an electroacoustic Surface shrinker (SAW), the surface of an electrode or an interdigital electrode. It is preferably made of glass, Quartz glass, silicon or silicon oxide or mixtures thereof, Tantalum oxide, gold, platinum or another precious metal as well Alloys thereof or from a plastic such as polystyrene or Polycarbonate.
Besonders bevorzugt weist die feste Phase die Form eines Mikrochips auf.The solid phase particularly preferably has the form of a Microchips on.
Dabei sind die Oligonukleotide oder Polynukleotide vorzugsweise auf der festen Phase systematisch, z. B. in Streifen oder Rechtecken, angeordnet, um eine eindeutige Zuordnung zu gewährleisten oder sie sind auf der festen Phase kovalent gebunden, z. B. durch Knüpfen einer 5′-Phosphordiesterbindung, oder durch direkte Synthese auf einem Chip.The oligonucleotides or polynucleotides are preferred systematically on the solid phase, e.g. B. in strips or Rectangles, arranged to be unique ensure or they are covalent on the solid phase bound, e.g. B. by forming a 5'-phosphorus diester bond, or by direct synthesis on a chip.
In einer weiteren Ausführungsvariante können sie auf der festen Phase über irreversible Brückenfunktionen wie Biotin-Avidin gekoppelt sein, wobei Avidin bzw. Streptavidin kovalent über Vernetzung an die Oberfläche gekoppelt ist oder auch über Brückenfunktionen reversibel gebunden ist, wie z. B. durch Disulfidbindungen.In a further variant, they can be fixed Phase over irreversible bridge functions such as biotin-avidin be coupled, with avidin or streptavidin covalently via Networking is coupled to the surface or via Bridge functions is reversibly bound, such as. B. by Disulfide bonds.
Die erfindungsgemäßen Mittel werden zur komplexen Tumordiagnostik verwendet, indem sie mit Nukleinsäuren (DNS, RNS oder virale Nukleinsäuren) aus Tumormaterial inkubiert werden, wobei entweder das Mittel oder die Nukleinsäure an eine feste Phase gebunden und der jeweils andere Partner markiert ist, und das an die Festphase gebundene Hybridisierungsprodukt über die Markierung detektiert und quantifiziert wird.The agents according to the invention become complex Tumor diagnostics used by using nucleic acids (DNA, RNA or viral nucleic acids) are incubated from tumor material, wherein either the agent or the nucleic acid is attached to a solid Phase bound and the other partner is marked, and the hybridization product bound to the solid phase via the Label is detected and quantified.
Gemäß der Erfindung ist das Mittel an der Festphase gebunden und wird mit markierten Nukleinsäuren aus Tumormaterial inkubiert.According to the invention, the agent is bound to the solid phase and is made with labeled nucleic acids from tumor material incubated.
Bevorzugt werden die Nukleinsäuren aus Tumormaterial an der Festphase gebunden und mit dem markierten Mittel inkubiert.The nucleic acids from tumor material are preferred on the Solid phase bound and incubated with the labeled agent.
In einer Ausführungsvariante werden die Nukleinsäuren aus Tumormaterial durch Lyse dieser Zellen mit Lösungen, die chaotrope Salze enthalten, oder mittels Proteinase K, Bindung der Nukleinsäuren an mineralische Trägermaterialien, vorzugsweise nichtporöse SiO₂-Partikel mit einer Größe von kleiner 50 nm und Elution der gebundenen Nukleinsäuren mit Puffern, die geringe Ionenstärken enthalten, isoliert.In one embodiment, the nucleic acids are made from Tumor material by lysing these cells with solutions that contain chaotropic salts, or by means of proteinase K, binding the nucleic acids on mineral carrier materials, preferably non-porous SiO₂ particles with a size of less than 50 nm and elution of the bound nucleic acids with Buffers containing low ionic strengths are isolated.
Die Nukleinsäuren (DNS, RNS oder virale Nukleinsäuren) werden insbesondere aus nichtinvasiven verfügbaren Ausgangsmaterialien gewonnen.The nucleic acids (DNA, RNA or viral nucleic acids) are especially from non-invasive raw materials available won.
Der Nachweis von Veränderungen der Tumormarkergene erfolgt erfindungsgemäß über basenkomplementäre Hybridisierungsreaktionen an fester Phase, wobei sich entweder ein Sequenzabschnitt des Tumormarkergens oder das Oligonukleotid oder Polynukleotid an fester Phase befinden und mit dem jeweiligen basenkomplementären Oligonukleotid, Polynukleotid bzw. dem Sequenzabschnitt des Tumormarkergens inkubiert wird.Changes in the tumor marker genes are detected according to the invention via complementary bases Solid phase hybridization reactions, with either a sequence segment of the tumor marker gene or the oligonucleotide or polynucleotide on the solid phase and with the respective base-complementary oligonucleotide, polynucleotide or the sequence section of the tumor marker gene is incubated.
Außerdem kann der Nachweis der Hybridisierungsreaktion auch direkt über laserinduzierte Anregung einer oder mehrerer Fluoreszenzsonden erfolgen.In addition, the detection of the hybridization reaction can also directly via laser-induced excitation of one or more Fluorescence probes take place.
Eine Detektion kann deshalb im evaneszenten Feld eines Lichtwellenleiters oder eines strukturierten Lichtwellenleiters oder durch Oberflächenplasmonenresonanz oder mittels eines elektroakustischen Transducers (Schwingquarz oder SAW) stattfinden.Detection can therefore take place in the evanescent field Optical fiber or a structured optical fiber or by surface plasmon resonance or by means of a electroacoustic transducers (quartz crystal or SAW) occur.
In weiteren Varianten erfolgt die Detektion mittels einer Elektrode oder Interdigital-Elektrode, vorzugsweise unterstützt durch elektroaktive DNA-Binder oder sie wird durch Fluorochrome vermittelt, die entweder zugegeben oder kovalent an die immobilisierten Nukleotide gebunden oder kovalent an die feste Phase gebunden werden.In further variants, the detection is carried out using a Electrode or interdigital electrode, preferably supported through electroactive DNA binders or it is through fluorochromes mediates that either added or covalently to the immobilized nucleotides bound or covalently to the fixed Phase.
Zur Detektion werden dabei Fluorochrome eingesetzt, die an die DNA binden oder Fluorochrome, die an die DNA binden und mit den immobilisierten Nukleotiden kovalent verknüpft sind.Fluorochromes are used for the detection Bind DNA or fluorochromes that bind to the DNA and with the immobilized nucleotides are covalently linked.
Desweiteren können zur Detektion elektroaktive Interkallatoren oder andere DNA-Binder eingesetzt werden, elektroaktive Interkallatoren oder andere DNA-Binder, die an die DNA binden und mit den immobilisierten Nukleotiden kovalent verknüpft sind oder die Detektion wird durch elektroaktive DNA-Binder vermittelt, die entweder zugegeben oder kovalent an die immobilisierten Nukleotide gebunden oder kovalent an die feste Phase gebunden werden.Furthermore, electroactive intercallers can be used for detection or other DNA binders are used, electroactive Intercallators or other DNA binders that bind to the DNA and are covalently linked to the immobilized nucleotides or the detection is done by electroactive DNA binders mediates that either added or covalently to the immobilized nucleotides bound or covalently to the fixed Phase.
Mit der Erfindung werden ein Mittel und ein Verwendungsverfahren zur Verfügung gestellt, mit denen eine sehr präzise Diagnose der jeweiligen Tumorerkrankung möglich ist. Ein wesentlicher Vorteil besteht darin, daß jede Art von Tumorzellen erkannt und nachgewiesen werden kann. Dadurch kann eine optimale Therapie des jeweiligen Falles durchgeführt werden.With the invention, an agent and a method of use provided with which a very precise diagnosis of the respective tumor disease is possible. A major advantage is that every type of tumor cell is recognized and can be demonstrated. This allows optimal therapy of the respective case.
Claims (36)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19736715A DE19736715A1 (en) | 1996-08-17 | 1997-08-18 | Reagent for tumour diagnosis |
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
DE19633228 | 1996-08-17 | ||
DE19736715A DE19736715A1 (en) | 1996-08-17 | 1997-08-18 | Reagent for tumour diagnosis |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19736715A1 true DE19736715A1 (en) | 1998-02-19 |
Family
ID=7802916
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19736715A Withdrawn DE19736715A1 (en) | 1996-08-17 | 1997-08-18 | Reagent for tumour diagnosis |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19736715A1 (en) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999001573A2 (en) * | 1997-07-01 | 1999-01-14 | Invitek Gmbh | Method and test kit for detecting malignant tumours |
JP2004505611A (en) * | 2000-04-03 | 2004-02-26 | コリクサ コーポレイション | Methods, compositions, and kits for breast cancer detection and monitoring |
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1997
- 1997-08-18 DE DE19736715A patent/DE19736715A1/en not_active Withdrawn
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WO1999001573A3 (en) * | 1997-07-01 | 1999-04-01 | Invitek Gmbh | Method and test kit for detecting malignant tumours |
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EP1272668B1 (en) * | 2000-04-03 | 2007-02-14 | Corixa Corporation | Methods, compositions and kits for the detection and monitoring of breast cancer |
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