DE19731609A1 - Cholesterylester-Transferprotein (CETP)-mRNA als Zielmolekül in der Therapie von Atherosklerose - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft CETP-mRNA als Zielmolekül für die Behandlung Atherosklerose durch Suppression der CETP-Genexpression. Insbesondere betrifft die Erfindung CETP-Translationsinhibitoren sowie Verfahren zum Auffinden von CETP- Translationsinhibitoren. Insbesondere betrifft die Erfindung synthetische Oligonukleotide mit Sequenzen, die wenigsten teilweise komplementär zur humanen CETP-mRNA sind, und deren Verwendung in der Therapie von Gefäßerkrankungen.

Cholesterylester-Transferprotein (CETP) katalysiert den Transfer und Austausch von Cholesterylester und Triglyzeriden zwischen Lipoproteinen hoher Dichte (High Density Lipoproteins, HDL) aus dem Serum und Triglyzerid enthaltenden Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (Very Low Density Lipoproteins, VLDL) sowie Lipoproteinen niedriger Dichte (Low Density Lipoproteins, LDL). In normolipämischen Individuen fördert dieser Austausch den reversen Cholesterintransport aus der Peripherie zu katabolischen Orten in der Leber. In hyperlipämischen Patienten jedoch, bei denen der Abbau von VLDL und LDL verschlechtert ist, erhöht er die Menge an Cholesterylester in LDL und verstärkt dessen atherogenes Potential. Deshalb wird die Modulation der CETP-Aktivität entweder durch direkte Inhibition oder durch Herunterregulierung der CETP-Expression als möglicher therapeutischer Interventionspunkt betrachtet (Kushwaha et al, J. of Lipid Research, 34, 1285-1297, 1993). Dies wird durch den Befund gestützt, daß CETP-Defizienz, die in einigen japanischen Familien gefunden wurde, zu hohen HDL-Spiegeln führt (Koizumi et al., Atherosclerosis, 58, 175-186, 1985). Inhibition von CETP führt zu einer HDL-Chole­ sterin-Erhöhung und einer parallelen β-Upoprotein-Cholesterin-Erniedrigung, wie durch die Verabreichung eines CETP-Antikörpers bei Hamstern gezeigt werden kann. In transgenen Mäusen, die hohe CETP-Spiegel exprimieren, sind die HDL-Spiegel deutlich reduziert, und es entwickeln sich atherosklerotische Lesionen (Nature, 364, 73, 1993).

CETP als ein Protein mit einer allgemeinen Affinität für lipophile Liganden ist ein bemerkenswert schlechtes Zielmolekül für pharmakologische Zwecke. Bis heute sind die einzigen behaupteten Inhibitoren entweder peptidähnlich (WO 9504755, Kanda et al.; WO 9605227, Buttner et al.) oder Liganden mit niedriger Affinität (WO 9506626, WO 950309, JP 09059155-A). Diese Beschränkungen könnten überwunden werden, wenn das Zielmole­ kül auf anderen Ebenen der biologischen Hierarchie angesprochen wird, im allgemeinen Signalübertragung (G.R. Crabtree, Science, 262, 1019-1024, 1993) mit anschließender Transkription des CETP-Gens (M.D. Lane, Annu. Rev. Biochem., 64, 347-373, 1995; V.R. Baichwal, Tibtech, 11, 11-18, 1993), als auch die Translation der mRNA in das Präprotein (WO 9629279; L. Couture et al.) und seine Prozessierung in das reife Protein. Wenn solche Strategien verfolgt werden, könnte ein Zielmolekül wie CETP direkt auf Ebene seines Gens oder seiner mRNA angesprochen werden.

Ein bekannter Ansatz für solche Nukleinsäure-Zielmoleküle ist die sogenannte nu­ kleinsäure-bindende (antisense) Oligonukleotid-Technologie (siehe z. B. Agrawal, Trends in Biotech. 10, 152, 1992). Durch Bindung an die komplementäre Nukleinsäuresequenz innerhalb einer gegebenen mRNA sind nukleinsäure-bindende Oligonukleotide in der Lage, die Translation in das korrespondierende Protein zu inhibieren. Für diesen Zweck muß die Sequenz wenigsten teilweise komplementär zum Zielmolekül sein. Statistische Auswertun­ gen, die auf der Größe des Genomes beruhen, legen einer Sequenzlänge von 17 Basen für eine selektive Erkennung nahe.

In den meisten Fällen jedoch sind nicht modifizierte nukleinsäure-bindende Oligonu­ kleotide für die Verwendung in in-vivo-Systemen wegen ihrer Anfälligkeit gegenüber nukleolytischem Abbau ungeeignet. Deshalb wurden große Anstrengungen unternommen, Oligonukleotide zu modifizieren, um sie widerstandsfähig gegen solche Angriffe zu machen, wobei die Moleküle für Verwendung in vivo stabilisiert wurden. Ein Schwerpunkt lag dabei in der Modifikation der internukleotidischen Phosphatreste (Phosphorothloate: Raparort et al. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8577-8580), den Nukleosideinheiten (2'-O-Alkyl: M.L. Birnstiel et al. [1991] Nucl. Acids Res. 19, 10, 2629-2635), Bindungsinversionen (Seliger et al. [1991] Nucleosides & Nucleotides, 10, 469477), oder Einführung anderer Elemente anstelle der Internukleotidphosphate (PNA: J.C. Hanvey et al. [1992] Science, 258, 1481-1485). Solche modifizierten nukleinsäure-bindenden Oligonukleotide sind in der Lage, dem nukleolytischen Abbau zu widerstehen, und können trotzdem Hybride mit Zielsequenzen bilden, um die entsprechende biologische Funktion zu modulieren.

Zusätzlich zum Bindungsmechanismus können nukleinsäure-bindende Oligonukleotide durch anschließenden Abbau des Zielmoleküls in ihrer Potenz verstärkt werden. Sequenzen, die eine DNA/RNA ähnliche Heterohelix erzeugen, können RNase H zur mRNA führen und so eine enzymatische Spaltung der mRNA bewirken. Das nukleinsäure-bindende Oligonu­ kleotid selbst kann auch ein Spaltungsagens sein, wenn eine katalytische Hammer­ kopf(hammerhead)-Domäne oder ein synthetischer RNA-Transesterifizierungskatalysator in die Sequenz integriert wird.

Solch ein Ansatz ist Gegenstand der Patentanmeldung WO 9620279, worin endogen freigesetzte Ribozyme als Werkzeuge für CETP-mRNA Spaltung beschrieben werden, zur Vorbeugung oder Behandlung der frühen Entwicklung, des Fortschritts oder der Regression vaskulärer Erkrankungen, insbesondere familiärer Hypercholesterinämie.

Die Entdeckung der zweifachen Funktionalität von RNA als einem Träger von Infor­ mationen über ihre Sequenz als auch funktioneller Tertiärstrukturen (The RNA World: CSHL Press, 1993, R.R. Gesteland, J.F. Atklns Hrsg.) als allgemeines Prinzip führte zu einem überlegenen Konzept, RNA gezielt anzusprechen. Solche Strukturen können für die Entwicklung von Wirkstoffen analog zu den Techniken verwendet werden, wie sie für proteinische Zielmoleküle verwendet werden.

Nukleinsäure-bindende Oligonukleotide sind abhängig von der Erkennung der Pri­ märstruktur des Zielmoleküls durch Basenpaarung. Die normalerweise erforderliche Größe eines Oligomers bestehend aus 15-20 Monomeren führt zu einem Molekulargewicht von 4000 g/mol. Trotz dieser Größe kann die Selektivität auf Grund der Erkennung von schwä­ cheren Bindungsstellen, gekennzeichnet durch die Akzeptanz verschiedener Fehlpaarungen, immer noch gering sein. Die Nutzbarmachung tertiärer Wechselwirkungen, wie für nuklein­ säure-bindende Oligonukleotide für Introns der Gruppe I gezeigt wurde, kann jedoch die Bindungsaktivität und Selektivität um den Faktor 65000 steigern (Biochemistry 32, 19, 5247-5256, 1993).

In Analogie zu solchen verbesserten nukleinsäure-bindenden Oligonukleotiden können auch nicht-nukleotidische Verbindungen mit einem Molekulargewicht unter 2000 g/mol auf Grund exklusiver Erkennung einer komplexen tertiären Struktur in Betracht gezogen werden (C.T. Lauhon et al., J. Am. Chem. Soc., 117, 1246-1257, 1995).

Gegenwärtige Ansätze für die Inhibition der CETP-Aktivität basieren auf peptidischen Komponenten, die in für therapeutische Spiegel relevanten Mengen schwierig zu verabrei­ chen sind, und auf Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, aber nur schlechter Aktivität und Selektivität.

CETP-mRNA als neues Zielmolekül für die Modulation des reversen Cholesterin­ transports: Primärstrukturen für das CETP-Gen wurden von Agellon et al. (Biochemistry, 29, 1372-1376, 1990) und Drayna et al. (Nature, 327, 632, 1987) beschrieben und basieren auf Daten, die aus genomischer DNA erhalten wurden. Wir beschreiben hier eine neue Sequenz, die auf einer in vivo erzeugten CETP-mRNA-Spezies beruht, von einem neuen Transkriptionsstartpunkt abgeleitet ist und sich in der Länge der 5'-nicht-kodierenden Region (5'-UTR) unterscheidet. Sie startet bei der genomischen Position -30 und hat eine Länge von 1687 Monomeren (Sequenz ID NO.: 14). Diese Spezies repräsentiert mehr als 80% der CETP-mRNA und ist deshalb die biologisch relevante Sequenz.

Die vorliegende Erfindung betrifft Cholesterylester-Transferprotein(CETP)-mRNA als Zielmolekül für die Behandlung von Atherosklerose durch Suppression der CETP-Genex­ pression. In einem Aspekt betrifft die Erfindung CETP-Translationsinhibitoren, deren Verwendung in der Therapie von Erkrankungen, bei denen CETP eine Rolle spielt, sowie Verfahren zum Auffinden von CETP-Translationsinhibitoren. Insbesondere betrifft die Erfindung synthetische Oligonukleotide mit Sequenzen, die wenigstens teilweise komple­ mentär zur humanen CETP-mRNA sind, und deren Verwendung in der Therapie von Gefäßerkrankungen.

Ein Aspekt der Erfindung ist ein Transkript des menschlichen Cholesterylester- Transferprotein(CETP)-Gens, das eine 5'-nichttranslatierte Region mit einer regulatorischen Sequenz enthält. Bevorzugt hat diese regulatorische Sequenz eine Haarnadelstruktur (hairpin). Eine bevorzugte Ausführungsform ist ein Transkript, das eine 5'-nichttranslatierte Region von mindestens 30 Nukleotiden enthält. In einer weiteren bevorzugten Ausführungs­ form enthält ein erfindungsgemäßes Transkript in seiner 5'-nichttranslatierten Region die Nukleotidsequenz GGGCCACUU. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält ein erfindungsgemäßes Transkript in seiner 5'-nichttranslatierten Region die Nukleotidse­ quenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC. In einer weiteren bevorzugten Aus­ führungsform enthält ein erfindungsgemäßes Transkript in seiner 5'-nichttranslatierten Region die Nukleotidsequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCU. Ebenfalls bevorzugt ist eine Ausführungsform, in der das Transkript mindestens 80% der menschlichen CETP- mRNA repräsentiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsge­ mäßes Transkript dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz hat oder enthält, die ein Transkript der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14 oder einer allelen Variante dieser Se­ quenz darstellt. In einer weiteren Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Transkript gegenüber der natürlich vorkommenden mRNA am 3'-Ende um ein oder mehrere Nukleo­ tide verkürzt. Das Transkript kann eine CAP-Struktur aufweisen. Das erfindungsgemäße Transkript kann zusätzlich ein transkribiertes Reportergen oder Teile davon enthalten, beispielsweise das Luciferasegen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein rekombinantes DNA-Molekül, das für eines der erfindungsgemäßen Transkripte kodiert. Bevorzugt hat oder enthält ein erfindungsge­ mäßes DNA Molekül die Sequenz SEQ ID NO: 14 oder einen Teil dieser Sequenz, minde­ stens aber die Nukleotidsequenz GGGCCACTT. In einer weiteren Ausführungsform enthält es mindestens die Sequenz GGGCCACTTA CACACCACTG CCTGATAACC. In einer be­ vorzugten Ausführungsform sind die genannten Sequenzen mit einem Reportergen oder Teilen davon verknüpft, beispielsweise mit dem Luciferasegen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei diesem DNA-Molekül um einen Vektor, insbesondere um einen Expressionsvektor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsge­ mäße DNA-Molekül ein Plasmid. In einer anderen Ausführungsform ist das erfindungsge­ mäße DNA-Molekül ein viraler Vektor. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Wirts­ zelle, in die ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül eingeführt wurde. Dies kann eine pro­ karyotische oder eukaryotische Wirtszelle sein. Insbesondere kann es eine bakterielle Wirtszelle oder eine Säugerzelle sein. Besonders bevorzugt als Wirtszellen sind E. coli, HepG2-, CHO-, COS- oder BHK-Zellen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Ribonukleinsäure, entsprechend einer DNA, die die Sequenz SEQ ID NO: 14 oder einer allelen Variante dieser Sequenz oder einem Teil dieser Sequenzen hat oder enthält, wobei diese Ribonukleinsäure mindestens die Sequenz GGGCCACUU enthält. Bevorzugt enthält eine erfindungsgemäße Ribonukleinsäure mindestens die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Ribonukleinsäure dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens einen Teil der translatierten Region des menschlichen CETP-Gens enthält. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Ribonukleinsäure dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 90% der menschlichen CETP-mRNA repräsentiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Ribonukleinsäure dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Transkript einer DNA darstellt, die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14 hat oder enthält. Die erfindungsgemäße Ribonukleinsäure kann eine CAP-Struktur haben. Die erfindungsgemäße Ribonukleinsäure kann zusätzlich ein transkribiertes Reportergen oder Teile davon enthal­ ten, beispielsweise das Luciferasegen.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Transkriptes oder einer erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure zum Auffinden von Substan­ zen, die die CETP-Expression inhibieren können, insbesondere die Translation eines CETP- Transkriptes.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die CETP-Expression inhibieren können, bei dem gemessen wird, ob eine Testsubstanz an die 5'-nichttranslatierte Region eines erfindungsgemäßen Transkriptes oder einer erfin­ dungsgemäßen Ribonukleinsäure binden kann. Eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Verfahrens besteht darin, daß die Bindung einer Testsubstanz an die 5'-nichttransla­ tierte Region des CETP-Gens mit einem Meßverfahren gemessen wird, das auf dem Effekt der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR) beruht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei die BIAcore™-Technologie angewendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein 5'-terminal biotinyliertes RNA-Oligonukleotid, das die 5'-nichttranslatierte Region des CETP-Gens repräsentiert, auf einem kommerziell erhältlichen geeigneten Mikrochip über eine Streptavidin-Biotin-Bindung immobilisiert. Ein geeignetes RNA-Oligonukleotid ist insbesondere in der Lage, die für die 5'-nichttranslatierte Region des CETP-Gens charakteristische Haarnadelstruktur auszubilden. Bevorzugt sind dabei RNA-Oligonukleotide, die die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC AUGCUG (Position -30 bis 6 der Sequenz ID NO.: 14) haben oder enthal­ ten. Weitere bevorzugte Ausführungsformen haben oder enthalten die Sequenzen GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC (Position -30 bis 0 der Sequenz ID NO.: 14) oder GGGCCACUUA CACACCACUG CCU (Position -30 bis -7 der Sequenz ID NO.: 14). Die Testsubstanz, beispielsweise ein nukleinsäure-bindendes Oligonukleotid, wird dann mit dem immobilisierten RNA-Oligonukleotid in Kontakt gebracht, das System gegebenen­ falls gewaschen, und die Resonanzeinheiten gemessen. Bevorzugt wird das RNA-Oligonu­ kleotid in verschiedenen Meßzellen in unterschiedlichen Konzentrationen immobilisiert.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren, bei dem die Translationsrate eines erfindungsgemäßen Transkriptes oder einer erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure in Anwesenheit einer Testsubstanz gemessen und mit der entsprechenden Translationsrate in Abwesenheit der Testsubstanz verglichen wird. Ein solches Verfahren kann in einem zellfreien (in vitro) oder einem zellbasierten System durchgeführt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform eines solchen Verfahrens besteht in einem zellfreien in-vitro-Translations­ system. Eine Ausführungsform eines solchen in-vitro-Translationssystems enthält als Komponenten mindestens Retikulozytenlysat, Aminosäuren und ein erfindungsgemäßes Transkript oder eine erfindungsgemäße Ribonukleinsäure. Bevorzugt wird mit einem erfindungsgemäßen Verfahren (sowohl in der zellfreien als auch in der zellbasierten Ausfüh­ rungsform) die Menge des synthetisierten Proteins in An- bzw. Abwesenheit der Testsub­ stanz gemessen und die erhaltenen Werte miteinander verglichen. Liegt die Menge des pro Zeiteinheit synthetisierten Proteins in Anwesenheit der Testsubstanz niedriger als der Vergleichswert (d. h. Abwesenheit der Testsubstanz), inhibiert die Testsubstanz die Transla­ tion in diesem Test. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes Verfahren im Hochdurchsatz-Musterungs-Format (High throughput screening, HTS) ausgeführt. Dabei wird in einer geeigneten Anordnung eine große Zahl von Testsubstanzen gleichzeitig geprüft. Ein solches HTS-Verfahren kann vorteilhaft voll- oder teilautomatisiert sein und die Auswertung durch elektronische Datenverarbeitung erfolgen. Vorteilhaft wird eine Testsubstanz, die im zellfreien System eine inhibierende Wirkung zeigte, zusätzlich in einem zellbasierten System geprüft.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Substanz, die die CETP-Expression inhi­ bieren kann, erhältlich mit einem der erfindungsgemäßen Verfahren. Bevorzugt sind Sub­ stanzen, die an die 5'-nichttranslatierte Region eines erfindungsgemäßen Transkriptes oder einer erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure, insbesondere einer CETP-mRNA, binden können. Eine solche Bindung kann vorzugsweise in einem physiologischen Milieu erfolgen, wie es zum Beispiel im Zytoplasma einer Säugerzelle herrscht, und ist vorzugsweise spezifisch. Besonders bevorzugt sind Substanzen, die durch die Bindung an die 5'-nicht­ translatierte Region eines erfindungsgemäßen Transkriptes oder einer erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure, insbesondere einer CETP-mRNA, dessen/deren Translation hemmen können. Solche Substanzen sind geeignet, die CETP-Expression zu hemmen. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Substanz an die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC binden. In einer weiteren Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Substanz an die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCU binden. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist eine solche Substanz ein nukleinsäure­ bindendes (antisense) Oligonukleotid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein solches nukleinsäure-bindendes Oligonukleotid ein DNA- oder RNA-Oligonukleotid, oder ein nukleotidisches Derivat, das gegen nukleolytischen Abbau stabilisiert ist, z. B. ein Phosphor­ thioat-Oligonukleotid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungs­ gemäße Substanz ein Hammerkopf-Ribozym. In einer weiteren bevorzugten Ausführungs­ form ist eine erfindungsgemäße Substanz eine nicht-Nukleotid-Verbindung mit einem Molekulargewicht weniger als 2000 g/mol. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Substanz eine nicht-Nukleotid-Verbindung mit einem Molekular­ gewicht von mindestens 250 g/mol und weniger als 2000 g/mol.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Substanz zur pharma­ zeutischen Verwendung. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Substanz zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Gefäßkrankheiten, bei denen CETP eine pathogene Rolle spielt, insbesondere Atherosklero­ se. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung einer erfindungsgemäßen Sub­ stanz zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen oder therapeutischen Be­ handlung von Gefäßkrankheiten, bei denen CETP eine pathogene Rolle spielt, insbesondere Atherosklerose.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein nukleinsäure-bindendes (antisense) Oligo­ nukleotid, das an die 5'-nichttranslatierte Region eines erfindungsgemäßen Transkriptes oder einer erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure, insbesondere einer CETP-mRNA, binden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform hat ein solches nukleinsäure-bindendes Oligonukleotid die Fähigkeit, mit der 5'-nichttranslatierten Region eines erfindungsgemäßen Transkriptes oder einer erfindungsgemäßen Ribonukleinsäure, insbesondere einer CETP- mRNA oder einem Abschnitt davon zu hybridisieren, vorzugsweise in einem physiologi­ schen Milieu. Eine solche Hybridisierung ist vorzugsweise spezifisch für die Zielsequenz. Ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid besteht vorzugsweise aus mindestens 7 und höch­ stens 50 Nukleotiden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht es aus mindestens 15 und höchstens 35 Nukleotiden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungs­ form besteht ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid aus mindestens 7 Nukleotiden, vor­ zugsweise mindestens 10 Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 15 Nukleotiden, und hat oder enthält die Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 12 oder einen Teil einer dieser Sequenzen. In einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform hat ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid die Fähigkeit, an die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC AUGC zu binden. In einer bevorzugten Ausführungsform hat ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid die Fähigkeit, unter physiologi­ schen Bedingungen, wie sie beispielsweise im Zytoplasma einer Säugerzelle herrschen, mit der Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC AUGC oder einem Teil dieser Sequenz zu hybridisieren, insbesondere der Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCU. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid eine DNA oder eine RNA oder ein effektives Derivat davon. Besonders bevorzugt ist ein solches Derivat gegenüber DNA oder RNA im Hinblick auf nukleolytischen Abbau stabilisiert. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid dadurch stabilisiert, daß es 3'-Di­ desoxynukleoside, 3',3'-Inversionen, Phosphorothioat- und/oder Methylphosphonat-Deriva­ te enthält.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid zur pharmazeutischen Verwendung. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotides zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Gefäßkrankheiten, bei denen CETP eine pathogene Rolle spielt, insbeson­ dere Atherosklerose.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Messung der Bindung einer Substanz an eine Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß es auf dem Effekt der Oberflä­ chen-Plasmon-Resonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR) beruht. Bevorzugt wird dabei die Biomolekulare Interaktionsanalyse (BIA) angewendet. In einer bevorzugten Ausfüh­ rungsform wird dafür das BIAcore®-System verwendet. Bevorzugt ist eine Substanz, deren Bindung an eine Nukleinsäure in dem erfindungsgemäßen Verfahren geprüft wird, eine nukleotidische Substanz, bevorzugt ein Oligonukleotid, oder eine nicht-Nukleotid-Verbin­ dung mit einem Molekulargewicht von weniger als 2000 g/mol. Bevorzugt hat die nicht- Nukleotid-Verbindung ein Molekulargewicht von mindestens 250 g/mol und weniger als 2000 g/mol. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die geprüfte Substanz eine DNA, eine RNA, ein Phosphorthioat-Oligonukleotid oder Hammerkopf-Ribozym. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Nukleinsäure auf einem kommerziell erhältlichen geeigneten Mikrochip immobilisiert. Die Testsubstanz, deren Bindung an die Nukleinsäure gemessen werden soll, beispielsweise ein nukleinsäure-bindendes Oligonukleotid, wird dann mit der immobilisierten Nukleinsäure in Kontakt gebracht, das System gegebenenfalls gewaschen, und die Resonanzeinheiten gemessen. Bevorzugt wird die Nukleinsäure in verschiedenen Meßzellen in unterschiedlichen Konzentrationen immobilisiert.

Um den Einfluß der 5'-UTR für die Translation zu bestimmen, wurden die relativen Translationsraten mehrerer verkürzter Konstrukte der CETP-mRNA verglichen. Wie in Beispiel 2 beschrieben, ändert sich die Translationseffizienz signifikant mit der Länge des 5'- UTR. Ein kritischer Schritt, der zu einer 50%igen Reduktion der Rate führte, ist die Kür­ zung der Sequenz um 3 Nukleoside von Position -30 bis Position -27. Dies zeigt klar ein Optimum für die Sequenz an, die in vivo bei Position -30 beginnt. Im Falle kürzerer Längen ist die Translation signifikant verschlechtert. Der Vergleich von mRNAs mit oder ohne Cap ergab, daß CETP-mRNA, die bei Position -30 anfing, in der Lage ist, in vitro die Transla­ tion auch durch einen Cap-unabhängigen Mechanismus zu vermitteln.

Wir verwendeten einen Satz nukleinsäure-bindender Oligonukleotide (Sequenz ID Nos.: 1, 2) als Werkzeuge in einem in vitro Translationstest, um die funktionelle Relevanz des 5'-UTR zu überprüfen. Die Sequenzen, die die Region von -30 bis 4 abdeckten, wurden in einer Konzentration von 4 µM verwendet und inhibierten die CETP Translation zwischen 27% und 82%.

Es ist bekannt, daß nukleinsäure-bindende DNA-Oligonukleotide ihren Effekt auf das Zielmolekül über eine durch RNase-H vermittelte Verdauung des gebildeten DNA/RNA- Hybrides ausüben können. Wir schlossen diese Möglichkeit aus, indem wir nukleinsäure­ bindende RNA-Oligonukleotide (Sequenz ID Nos.: 5, 12) verwendeten, um den Effekt auf Bindungsereignis zu begrenzen. Die Oligonukleotide zeigten nun eine etwas reduzierte Aktivität mit einer IC50 von 1.6 µM, inhibierten jedoch immer noch die Translation relativ zu anderen inaktiven nukleinsäure-bindenden Sequenzen, die gegen die Positionen 225-239 oder 1101-1113 gerichtet waren. Die Modulation der Translationseffizienz durch nuklein­ säure-bindende Oligonukleotide bestätigt die kritische Funktion der Region -30 bis 0 für die Translation.

Die folgenden funktionellen Ergebnisse:

• a) der "Zusammenbruch" der Translation nach Entfernung der 3 kritischen Nukleoside
• b) die Existenz einer Cap-unabhängigen Translationsverstärkung
• c) die Sensitivität des 5'-Endes gegenüber nukleinsäure-bindenden Oligonukleotiden

legen die Existenz eines cis-agierenden Elementes in der 5'-UTR der CETP-mRNA nahe, das einen Verstärker (enhancer) der Cap-abhängigen und -unabhängigen Translation darstellt.

Der Vergleich mit anderen Beispielen von Cap-unabhängigen Translationsmechanis­ men legt die Existenz einer RNA-Struktur nahe, die in diesem regulatorischen Element involviert ist.

Eine Berechnung der mRNA-Sekundärstruktur erfolgte unter Verwendung des FOLD-Programms (Zuker et al. Science, 244, 48-52, 1989), welches an eine Sequenzlänge von bis zu 2 kb angepaßt war.

Um diese Voraussage zu verifizieren, wurden enzymatische Sekundärstrukturuntersu­ chungen durchgeführt, wobei sowohl die komplette mRNA als auch Fragmente aus dem 5'- Ende umfassend 47, 36 und 23 Basen verwendet wurden. Diese Experimente zeigten identische Muster von einzel- und doppelsträngigen spezifischen Spaltstellen, was eine identische Struktur für die Position -30 bis -7 anzeigte. Aufgrund der Experimente mit dem kleinsten Fragment von 23 Basen konnte die Struktur als Haarnadel (hairpin) identifiziert werden (Abb. 1). Neben einem kurzen Stamm von 4 Basenpaaren, verantwortlich dafür, die Haarnadel zu schließen, wurden zusätzliche helikale Schnitte innerhalb der vorausgesagten einzelsträngigen Schleife beobachtet, die ein strukturiertes Element anzeigten. Aufgrund dieser Daten wurde die Sekundärstruktur der Haarnadel durch Einführung zusätzlicher Basenpaare verfeinert.

Die Existenz der Nukleoside G (-30) bis G (-28) ist kritisch für die Bildung dieser Haarnadel, wie oben im Zusammenhang mit ihrer Relevanz für die Translationseffizienz diskutiert. Die Korrelation von funktionellen Ergebnissen und strukturellen Erfordernissen beweist die Existenz einer funktionalen Region innerhalb der CETP-mRNA, die als Haarna­ delstruktur innerhalb des 5'-Endes der CETP-mRNA beschrieben werden kann, wie sie durch die Ermittlung der korrekten Transkriptionsstartstelle und enzymatischen Sekundär­ strukturuntersuchungen bestimmt wurde.

Testsysteme für das CETP-mRNA-Zielmolekül: Ein Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren für die Verwendung von CETP-mRNA als Zielmolekül für die Musterung von Verbindungen mit antiatherogener Aktivität. Drei verschiedene Tests sind in der Erfindung eingeschlossen die einzeln oder in Kombination verwendet werden können:

Ein funktioneller Test, der die Translationseffizienz mißt und auf der Menge des syntheti­ sierten Proteins basiert, wird in einem zellfreien in-vitro System durchgeführt, das Retikulo­ zytenlysat, ein Aminosäuregemisch und CETP-mRNA enthält. Einzelheiten einer möglichen Ausführungsform dieses Tests, der im Hochdurchsatzmusterungsformat (high throughput screening, HTS-Format) verwendet werden kann, werden in Beispiel 4 erläutert.

Zusätzlich zu diesem funktionellen in-vitro-Test kann auch ein funktioneller zellbasier­ ter Test verwendet werden, um insbesondere zwei Aspekte abzudecken:

• 1. In der Umgebung einer lebenden Zelle werden mRNAs im Hinblick auf Prozessie­ rung, Transport, Lokalisierung und Stabilisierung streng reguliert. Während dieser Prozesse wechselwirken sie mit einer Vielzahl von Proteinen und RNPs, die möglicherweise Unter­ schiede in der Zielmolekülstruktur oder Zugänglichkeit bewirken und in einer in-vitro- Umgebung falsche Signale ergeben können.
• 2. Für den Antisense-Ansatz sind die Bioverfügbarkeit und der intrazelluläre Trans­ port der Oligonukleotide kritische Faktoren (J. Clin. Invest., 95, 1814-1823, 1995). Der Einfluß dieser Fragen auf die CETP-Expression sollte auch in einem zellbasierten Test geklärt werden.

Als ein mögliches Werkzeug, die in-vivo-Aktivität zu verifizieren, wird ein funktionel­ ler zellulärer Test in Beispiel 5 beschrieben, der auf der CETP-Biosynthese in lebenden HepG2 Zellen beruht.

Boten-RNAs (mRNAs) sind Moleküle mit einer mehr als 6-fachen Größe im Ver­ gleich zu den korrespondierenden Proteinen. Deshalb sind mehr Bindungsmotive möglich, und die Regioselektivität einer Verbindung, die die Translation moduliert, gewinnt an Wichtigkeit. Um ein Werkzeug für die Verifizierung der Bindungsstelle bereitzustellen, z. B. der Haarnadelstruktur in der 5'-nicht-kodierenden Region der CETP-mRNA, wird mit der vorliegenden Erfindung ein Bindungstest bereitgestellt, der auf der BIAcore-Technologie (Biomolekulare Interaktions-Analyse) basiert. Dieser Test wurde für das 5'-Ende der CETP- mRNA verwendet (Beispiel 6), kann jedoch für jedes identifizierte nukleotidische Struktur­ motiv angepaßt werden.

Die Durchführbarkeit aller Tests wurde für nukleinsäure-bindende Oligonukleotide auf DNA-, RNA- und Phosphorothioat-Basis gezeigt. Die Durchführbarkeit der funktiona­ len Tests wurde zusätzlich für Hammerkopf-Ribozyme gezeigt. Alle Tests können für die Optimierung von nukleinsäure-bindenden Oligonukleotiden ebenso wie für die Hochdurch­ satzmusterung von kleinen nicht-nukleotidischen Verbindungen mit Molekulargewichten von in der Regel weniger als 2000 g/mol verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden CETP-translationsinhibierende Verbindungen, entweder nukleinsäure-bindende Oligonukleotide oder nicht-nukleotidische Verbindungen, in einem ersten funktionellen HTS selektiert, wie in Beispiel 4 beschrieben wird. Nach der Bestätigung der Aktivität durch einen anschließenden zellbasierten Test (Beispiel 5) kann ein Bindungstest (Beispiel 6) ausgeführt werden, um die Regioselektivität des Bindungsmodus zu bestätigen. So identifizierte Inhibitoren der Translation von CETP- mRNA sind für die Behandlung oder Prophylaxe von Atherosklerose bzw. Gefäßerkran­ kungen, bei denen CETP-Expression eine pathogene Rolle spielt, geeignet. Solche Verbin­ dungen können in strukturellen Begriffen als nukleinsäure-bindende Nukleinsäuren oder als jede nicht-nukleotidische Verbindung mit einem niedrigen Molekulargewicht (MW<2000) beschrieben werden.

Nukleinsäure-bindende Oligonukleotide werden vorzugsweise parenteral (intravenös, subkutan, intraperitoneal oder intramuskulär), inhalativ, oder topisch (intranasal oder rectal) verabreicht. Die hierfür benutzten pharmazeutischen Formulierungen können beispielsweise Wasser, Puffer, Lösungsmittel, Trägermaterialien oder Konservierungsmittel enthalten.

Formulierungen als sterile wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen mit optiona­ len Additiven wie Puffer oder Lösungsmittel können beispielsweise für parenterale oder inhalative Anwendungen benutzt werden. Liposomale Formulierungen von Wirkstoffiösun­ gen oder -suspensionen sind als parenterale, inhalative oder topische Verabreichungsform geeignet. Formulierungen als Feststoff oder Puder sind zusätzlich bei inhalativen oder topischen Anwendungen, Formulierungen als Salbe, Lotion, Creme, Gel oder Supposito­ rium bei topischen Anwendungen geeignet.

Die Gabe des Wirkstoffes erfolgt einmal oder mehrmals je Tag und wird so bemessen, daß ein therapeutischer Blutspiegel von 2 nM-100 UM erreicht wird. Optimale Dosierung, Dosierungsformen sowie der geeignete zeitliche Abstand zwischen den Gaben kann von entsprechend erfahrenen Personen leicht ermittelt werden.

Abbildungen

Fig. 1 Abb. 1 zeigt die Sekundärstruktur der 5'-nicht-kodierenden Region (5'- UTR), abgeleitet aus theoretischen Voraussagen und Bindungsexperimenten. Die Wirkung nukleinsäure-bindender Oligonukleotide, die gegen diese Struktur gerichtet sind, zeigt ihre funktionelle Wichtigkeit.
-26 bis 3: ID 1 0.4 uM -59% Translation
-26 bis -12: ID 12 1.2 uM -63% Translation
-24 bis -13: ID 5 1.2 uM -34% Translation
Testbedingungen: Translation für eine Stunde bei 37°C mit Kaninchen-Retikulozyten­ lysat (Promega).

Fig. 2 Abb. 2 zeigt die Autoradiographie, die ein Sequenzlerungsexperiment der menschlichen CETP-mRNA darstellt. Die Identität des 5'-Endes wird durch die Existenz eines zusätzlichen Cap-G in Position-1 bestätigt.

Fig. 3 Abb. 3 faßt die Ergebnisse der enzymatischen Strukturuntersuchungen zusammen, die mit der CETP-mRNA ausgeführt wurden, um die 5'-UTR-Sekundärstruktur zu identifizieren.

Fig. 4 Abb. 4 stellt die Inhibition der CETP-Synthese in HepG2 Zellen in Ab­ hängigkeit bereitgestellter nukleinsäure-bindender Oligonukleotide dar. Der zellbasierte Translationstest, der hier verwendet wurde, ist in Beispiel 5 beschrieben.

Fig. 5 Abb. 5 stellt die Inhibition der CETP-Translation in Abhängigkeit von bereitgestellten nukleinsäure-bindenden Oligonukleotiden dar. Der in-vitro Translationstest, der hier verwendet wurde, ist in Beispiel 2 beschrieben.

Fig. 6 Abb. 6 stellt ein Oberflächen-Plasmonresonanzspektrum eines 9 Basen langen nukleinsäure-bindenden (antisense) Oligonukleotids mit der Sequenz SEQ ID NO: 3 an das 5'-Ende (Positionen -30 bis 6 der SEQ ID NO: 14) der humanen CETP-mRNA unter Anwendung der BIAcore®-Technologie dar.

Beispiele Beispiel 1 Primärstruktur der 5'-nichttranslatierten Region (5'-UTR) der CETP-mRNA

Das 5'-Ende der menschlichen CETP-mRNA wurde durch 5'-RACE (Rapid Amplifi­ cation of cDNA Ends) bestimmt. PolyA(+)-RNA von HepG2-Zellen (ATCC HB-8065) wurde mit dem Quiagen Oligotex Kit entsprechend den Angaben des Herstellers hergestellt (Qiagen, Hilden/Deutschland; siehe auch Kuribayashi, K., Hikata, M., Miyamoto, C. and Furuichi, Y. (1988), Nuc. Acids Res. Symp. Series No. 19, 61-64.). 250 ng der mRNA wurde mit einem CETP-spezifischen nukleinsäure-bindenden Oligonukleotid komplementär zu den Nukleotiden 159-184 der kodierenden Sequenz [Sequenz: CCG TGA TAT CTG GGT AGC TGG CTC GC] und 2 U Retrotherm-Polymerase (Biozym Diagnostic GmbH, Hess. Oldendorf/Deutschland) revers transkribiert. Ein zweites Oligonukleotid (Anker(anchor)-Oligonukleotid aus dem 5'-AmpliFINDER RACE KIT, Clontech, Palo Alto/CA/USA) wurde durch T4-RNA-Ligase an das 3'-Ende ligiert. Die spezifische cDNA wurde mit PCR amplifiziert, wobei das Anker-Oligonukleotid und ein Oligonukleotid komplementär zur Position 115-141 [Sequenz CAC CTT GGC AGT CTC GTG GTT CAA CAC] der die CETP-mRNA kodierenden Sequenz verwendet wurden. Die PCR- Fragmente wurden kloniert und sequenziert. Die Grenze des Anker-Oligonukleotides markiert das 5'-Ende der originalen cDNA. Reverse Transkription einer kompletten mRNA führt zu einem zusätzlichen Guanosin-Rest am 5'-Ende, der in der genomischen Sequenz nicht gefunden werden kann und von der Cap-Struktur stammt (Hirzmann et al., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 3597-3598). Solch ein zusätzliches Guanosin zwischen dem Anker- Oligonukleotid und der CETP-Sequenz definiert klar das tatsächliche 5'-Ende einer mRNA.

Die Untersuchung der CETP-mRNA aus HepG2 Zellen, die von menschlichen Leber­ zellen abgeleitet sind, ergab, daß in mehr als 80% die 5'-untranslatierte Region (5'-UTR) der CETP-mRNA Moleküle bei Position -30 der genomischen Sequenz beginnt (relativ zum ersten Nukleotid des Starcodons AUG, das als +1 gesetzt wird). Nur eine Minderheit der Moleküle hatte ein 5'-UTR von 60 Nukleotiden oder länger. Im Gegensatz dazu war in der Literatur eine RNA Startposition bei -27 berichtet worden (Agellon et al. (1990), Bioche­ mistry 29, 1372-1376), die nicht gefunden wurde.

Beispiel 2 Translationseffizienz verschiedener CETP-mRNA Konstrukte

Konstrukte für die Erzeugung von RNA wurden an den Promotor der T7-RNA- Polymerase fusioniert und in die Mehrfach-Klonierungsstelle des Vektors pUC18 (Boehringer Mannheim, Mannheim/Deutschland) kloniert.

RNA definierter Länge wurde nach Linearisierung des Plasmides mit dem RiboMAX Transkriptionssystem (Promega; Madison/WI/USA) gemäß den Herstellerangaben synthe­ tisiert. RNA mit einer 5'-Cap-Struktur wurde mit dem mMESSAGE mMACHINE kit (Ambion, Austin/TX/USA) gemäß Herstellerangaben synthetisiert.

Für die in-vitro-Translation wurde die RNA für 1 Stunde bei 37°C mit 16.5 µl Flexi Rabbit Reticulocyte Lysate (Promega) und 10 µCi L-[³⁵S]-Methionin (1000 Ci/mmol) in einem Gesamtvolumen von 25 µl inkubiert. Das radiomarkierte Translationsprodukt wurde präzipitiert, durch Filtration auf Glasfiberfiltern gewonnen und durch Szintillationsmessung quantifiziert.

Die Translationseffizienz der beiden CETP-mRNAs, die mit Position -30 bzw. -27 beginnen, wurde in einem in-vitro-Translationssystem verglichen. RNA mit der Fähigkeit, die Haarnadelstruktur zu bilden, erzeugte zweimal soviel Protein wie die RNA, die mit Position -27 startete. Dieser Verstärkungseffekt war unabhängig von der Anwesenheit einer Cap-Struktur. Die Zugabe einer Cap-Struktur ergab eine effizientere Translation beider RNA-Typen, aber die zweifache Differenz zwischen den beiden RNAs blieb bestehen.

Die 5'-UTR von CETP plus die ersten 48 Nukleotide der kodierenden Region wurden an eine NarI-Restriktionsstelle an Position +33 der Luciferase-cDNA fusioniert. Das resultierende chimäre Protein ist hauptsächlich Luciferase mit einem Austausch der ersten 10 Aminosäuren gegen 16 aminoterminale Aminosäuren von CETP. RNA von diesem Konstrukt war in der Lage, die angenommene 5'-Haarnadelstruktur zu bilden.

Die Translationseffizienz der chimären RNA wurde mit der von unveränderter Lucife­ rase-RNA verglichen. Eine Verstärkung der translationalen Effizienz von etwa 50% wurde beobachtet, unabhängig ob eine Cap-Struktur vorhanden war oder nicht.

Beispiel 3 Enzymatische Sekundärstrukturuntersuchungen der funktionellen Domäne innerhalb der CETP-mRNA und künstlichen Modellsystemen

Die Gegenwart von wenigsten 30 Nukleotiden des 5'-UTR erlaubt die Bildung einer Haarnadelstruktur am extremen 5'-Ende der mRNA. Um die Haarnadelstruktur dieser Region zu bestätigen, wurden enzymatische Sekundärstrukturuntersuchungen ausgeführt.

Für die strukturelle Analyse der CETP-mRNA wurden in-vitro-Transkripte durch Inkubation mit zwei Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kalbsdünndarm (Stratagene, La Jolla/CA/USA) bei 50°C für 45 Minuten dephosphoryliert und wie beschrieben (Göringer et al. (1984) Eur. J. Biochem. 114, 25-34) 5'-endmarkiert. RNA-Oligonukleotide wurden direkt nach der Reinigung entweder 5'- oder 3'-endmarkiert. Ein partieller enzymatischer Abbau der gereinigten, markierten RNA wurde durchgeführt, wobei mit 1 bis 5 U der Nuklease S1 (Boehringer Mannheim, Mannheim/Deutschland), 0.1 bis 1 U der Nuklease T1 (USB, Cleveland/OH/USA), 0.15 bis 0.25 U der Nuklease CL3 (USB) oder 0.01 bis 0.1 mU des Kobragiftenzyms V1 (USB) in einem Gesamtvolumen von 25 µl für 10 Minuten bei 37°C inkubiert wurden. Die modifizierten Produkte wurden auf einem 10-15%igen Po­ lyacrylamid/7M-Harnstoff-Gel separiert und durch Autoradiographie detektiert.

Die Ergebnisse der enzymatischen Sekundärstrukturuntersuchung sind in guter Übereinstimmung mit der vorgeschlagenen Haarnadelstruktur (Abb. 3). Die gleiche Struktur wurde bestätigt für RNA-Fragmente, die aus den ersten 50, 36 und 23 Nukleotiden der CETP-mRNA bestehen.

Beispiel 4 Hochdurchsatzmusterungstest (High throughput screening) für in-vitro- Translation von CETP-mRNA und Inhibierung durch nukleinsäure-bindende Oligo­ nukleotide

Die cDNA von menschlichem CETP im Bereich von -30 bis +1657 wurde mit dem Promotor der T7-RNA-Polymerase fusioniert und in einen pUC18-abgeleiteten Plasmidvek­ tor (Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour 1989, S. 1.13) kloniert. Nach Linearisierung des Plasmides mit NotI wurde die CETP-mRNA durch Transkription in vitro mit T7-RNA-Polymerase und dem RiboMAX Large Scale RNA Production Sy­ stem-T7 (Promega) synthetisiert.

Die in-vitro-Translation wurde in Mikrotiterplatten im 96-Loch-Format ausgeführt. CETP-mRNA (0.5 µg) wurde für 15 Minuten bei 37°C mit Oligonukleotid, Testsubstanz oder Wasser präinkubiert. Dann wurde Retikulozytenlysat, Aminosäuremischung (1 mM minus Leucin) und 1 µCi L-[3,4,5-³H(N)]-Leucin zugegeben und die Mischung bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Für den Nachweis von radiomarkiertem CETP wurde jede Probe mit destilliertem H₂O zehnfach verdünnt und auf eine Anti-Maus-Flashplate Plus (NEN, Bad Homburg/Deutschland) transferiert. Ein muriner monoklonaler Antikörper, der für CETP spezifisch ist (TP2, Yen et al. [1989] J.Clin.Invest. 83, 2018-2024), wurde zugegeben, und die Platte für wenigsten 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde das Medium abgesaugt, jedes Loch mit PBS (80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na₂PO₄ × 2 H₂O add. 1 l H₂O, pH 7,4) gewaschen, und die Platte für wenigstens 1 Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend wurde die Platte in einem β-Zähler ausgewertet.

Beispiel 5 Inhibierung von CETP-Translation in Zellkultur

Die menschliche Hepatomazellinie HepG2 (ATCC HB-8065) dient als Modellsystem für die Untersuchung von Inhibitoren von CETP Expession in Zellkultur.

HepG2-Zellen wurden in 25 cm² Zellkulturflaschen ausgesät und in MEM mit 10% FKS bis zur Subkonfluenz gezüchtet. Oligonukleotide wurden mit einem gleichen Volumen einer kationischen Lipidmischung (LipofectAMINE Transfection Reagens, Life Technolo­ gies, Gaithersburg/MD/USA) gemischt. Der Oligonukleotid-Lipid-Komplex wurde 1 : 5 (v/v) mit Medium verdünnt, um die angegebene Konzentration von Oligonukleotid einzu­ stellen, und die Zellen wurden mit 625 µl dieser Mischung für 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Dann wurden 3 ml Medium zugegeben und die Zellen wurden für weitere 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Periode wurde die Konzentration von CETP im Medium mit Hilfe eines Radioimmuntests (RIA) mit dem Monoklonalen Antikörper TP2 bestimmt.

Beispiel 6 Testsystem zur Messung der Bindung von nukleinsäure-bindenden Oligo­ nukleotiden oder anderen Verbindungen an eine Ziel-RNA

Oberflächen-Plasmon-Resonanz ist das Grundprinzip der BIAcore-Technologie (Pharmacia Biosensor) zur Beobachtung molekularer Wechselwirkungen auf der Oberfläche eines Microchips. Mehrfach(multispot)-Messungen mit Hilfe eines BIAcore-2000 Instru­ ments (BIAcore AB, Uppsala/Schweden; Karlsson et al. 1995, Anal. Biochem. 228, 274-280) wurde hier durchgeführt, um Bindungsereignisse zwischen RNA und Oligonukleotiden zu messen.

Ein 5'-biotinyliertes RNA-Oligonukleotid, das das 5'-Ende der CETP-mRNA (Position -30 bis 6) repräsentiert, wurde über Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen auf ei­ nem kommerziell erhältlichen Mikrochip SA5 (Pharmacia Biosensor) immobilisiert. Der Chip enthält 4 verschiedene Flußzellen, die durch eine Probe entweder individuell oder seriell adressiert werden können. In verschiedenen Flußzellen wurden unterschiedliche Mengen von Oligonukleotid immobilisiert, um einen vierstufigen Gradienten zu erzeugen. Es ist zu erwarten, daß die Amplitude eines Bindungsereignisses von der Menge des im­ mobilisierten Oligonukleotides abhängt, während unspezifische Effekte unabhängig vom Immobilisierungsgrad auftreten sollten.

Um den Gradienten zu erzeugen, wurde jede individuelle Flußzelle mit einer Oligo­ nukleotidlösung einer jeweils anderen Konzentration (0, 6, 2.5 oder 1.3 µg/ml) für 5 Minuten mit einer Flußrate von 5 µl/min injiziert.

Um die Wechselwirkung der nukleinsäure-bindenden Oligonukleotide mit der immo­ bilisierten RNA zu messen, wurde das nukleinsäure-bindende Oligonukleotid in Laufpuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 20 mM MgCl₂, 0.05% Natrium-Azid) verdünnt, für 3 Minuten bei einer Flußrate von 5 µl/min. geladen, und dann das System bei der gleichen Flußrate mit Laufpuffer gewaschen. Die Bindung eines nukleinsäure-bindenden Oligonukleotides resultiert in einem Anstieg in Resonanzeinheiten gegenüber Hintergrund (keine RNA immobilisiert), die der Menge an immobiliserter RNA entspricht. Als Beispiel ist die Bindung eines 9 Basen langen nukleinsäure-bindenden RNA-Oligonukleotides (Sequenz ID NO 3) in Abb. 6 gezeigt.

Sequenzprotokoll

Claims (44)

1. Transkript des menschlichen Cholesterylester-Transferprotein(CETP)-Gens, dadurch charakterisiert, daß es eine 5'-nichttranslatierte Region mit einer regulatorischen Sequenz enthält.

2. Transkript nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die regulatorische Sequenz eine Haarnadelstruktur (hairpin) hat.

3. Transkript nach Anspruch 1 oder 2, dadurch charakterisiert, daß es eine 5'- nichttranslatierte Region von mindestens 30 Nukleotiden enthält.

4. Transkript nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß seine 5'-nichttranslatierte Region mit der Nukleotidsequenz GGGCCACUU beginnt.

5. Transkript nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß seine 5'-nichttranslatierte Region die Nukleotidsequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC enthält.

6. Transkript nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 80% der menschlichen CETP-mRNA repräsentiert.

7. Transkript nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es das Transkript einer DNA darstellt, die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14. oder eine allele Variante dieser Sequenz hat oder enthält.

8. Transkript nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ei­ ne CAP-Struktur hat.

9. Ribonukleinsäure, entsprechend einer DNA, die die Sequenz SEQ ID NO: 14 oder einer allelen Variante dieser Sequenz oder einen Teil dieser Sequenzen hat oder enthält, wobei diese Ribonukleinsäure mindestens die Sequenz GGGCCACUU enthält.

10. Ribonukleinsäure nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC enthält.

11. Ribonukleinsäure nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie wenigstens einen Teil der translatierten Region des menschlichen CETP-Gens enthält.

12. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens 90% der menschlichen CETP-mRNA repräsentiert.

13. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Transkript einer DNA darstellt, die die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 14. hat oder enthält.

14. Ribonukleinsäure nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine CAP-Struktur hat.

15. Verwendung eines Transkriptes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Ribonukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 zum Auffinden von Substanzen, die die CETP-Expression inhibieren können.

16. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die CETP-Expression inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß gemessen wird, ob eine Testsubstanz an die 5'- nichttranslatierte Region eines Transkriptes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 binden kann.

17. Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die CETP-Expression inhibieren können, dadurch gekennzeichnet, daß die Translationsrate eines Transkriptes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 in Anwesenheit einer Testsubstanz gemessen wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, daß es ein zellfreies oder ein zellbasiertes Verfahren ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des synthetisierten Proteins in einem zellfreien in-vitro-System gemessen wird, das Retikulo­ zyteniysat, Aminosäuren und ein Transkript gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem Hochdurchsatz-Musterungs- (High Throughput-Screening, IHS)-Format ausge­ führt wird.

21. Substanz, die die CETP-Expression inhibieren kann, erhältlich mit einem Verfah­ ren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20.

22. Substanz nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein nukleinsäure­ bindendes (antisense) Oligonukleotid oder eine nicht-nukleotidische Verbindung ist.

23. Substanz nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie an die 5'- nichttranslatierte Region eines Transkriptes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 binden kann.

24. Substanz nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie an die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCU binden kann.

25. Substanz nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur pharmazeutischen Verwen­ dung.

26. Verwendung einer Substanz gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24 zur prophy­ laktischen oder therapeutischen Behandlung von Gefäßkrankheiten, bei denen CETP eine pathogene Rolle spielt, insbesondere Atherosklerose.

27. Nukleinsäure-bindendes (antisense) Oligonukleotid, das an die 5'-nichttranslatier­ te Region eines Transkriptes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 binden kann.

28. Oligonukleotid nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es mit der 5'- nichttranslatierte Region eines Transkriptes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 oder einer Ribonukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 oder einem Abschnitt davon hybridi­ sert, insbesondere in einem physiologischen Milieu.

29. Oligonukleotid nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mindestens 7 und höchstens 50 Nukleotiden besteht.

30. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mindestens 10 und höchstens 35 Nukleotiden besteht.

31. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß es aus mindestens 7 Nukleotiden besteht und die Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 12 oder einen Teils einer dieser Se­ quenzen hat oder enthält.

32. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es an die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCUGAUAACC AUGC binden kann.

33. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß es an die Sequenz GGGCCACUUA CACACCACUG CCU binden kann.

34. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß es DNA oder RNA ist oder eine effektives Derivat davon ist.

35. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß es stabilisiert ist.

36. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 35, dadurch gekennzeichnet, daß es 3'-Didesoxynukleoside und/oder 3',3'-Inversionen, und/oder Phosphorthioat-, und/oder 2'-Methoxynucleoside- und/oder Methylphosphonat-Derivate enthält.

37. Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 27 bis 36 zur pharmazeutischen Verwendung.

38. Verwendung eines Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 27 bis 37 zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung von Gefäßkrankheiten, insbesondere Atherosklerose.

39. Verfahren zur Messung der Bindung einer Substanz an eine Nukleinsäure, da­ durch gekennzeichnet, daß es auf dem Effekt der Oberflächen-Plasmon-Resonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR) beruht.

40. Verfahren nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß dabei die Biomoleku­ lare Interaktions-Analyse (BIA) angewendet wird.

41. Verfahren nach Anspruch 39 oder 40, dadurch gekennzeichnet, daß dafür das BIAcore®-System verwendet wird.

42. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die getestete Substanz eine nukleotidische Verbindung ist.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41, dadurch gekennzeichnet, daß die getestete Substanz eine nicht-Nukleotid-Verbindung mit einem Molekulargewicht von mindestens 250 g/mol und weniger als 2000 g/mol ist.

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 42, dadurch gekennzeichnet, daß die getestete Substanz eine DNA, RNA oder ein Oligonukleotid mit 3'-Didesoxynukleoside und/oder 3',3'-Inversionen, und/oder Phosphorthioat-, und/oder 2'-Methoxynucleoside- und/oder Methylphosphonat-Derivate ist.