DE19722815A1

DE19722815A1 - Device for determination of analytes comprising two elements

Info

Publication number: DE19722815A1
Application number: DE1997122815
Authority: DE
Inventors: Michael Gismann; Elene Dr Kasten; Olaf Mueller; Stephan Dr Huewel; Elmar Dr Michels
Original assignee: Cell Diagnostica Ges fur GmbH
Current assignee: BIOCHECK GESELLSCHAFT FUER BIOLOGISCH-IMMUNOLOGISCH
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 1998-12-03

Abstract

Device for the quantitative and/or qualitative determination of analytes in a test solution, comprises a first element (4) with a recess (6) and a depression (7), where the depression (7) can receive a support onto which various biomolecules can be applied, each spatially separated from one another, and a second element (5) with a recess (8) adapted to the configuration of the recess (6) and a breakthrough(9), where the second element (5) is or can be disposed with respect to the first element (4) in such a way that the support positioned in the depression (7) is fixable or fixed, and that a defined reaction chamber for a process is formed.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum gleichzeitigen Nachweis verschiedener Antigene und/oder Antikörper in Lösung, insbesondere Körperflüssigkeiten, oder anderen komplexen Analysegemischen. Darüber hinaus betrifft die Erfindung hierfür verwendbare Teststreifen und eine Vorrichtung zur Aufnahme der Test streifen und zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es insbesondere möglich, die nachzuweisenden Antikörper und/oder Antigene zu quantifizieren und zu differenzieren.The invention relates to a method for the simultaneous detection of different Antigens and / or antibodies in solution, especially body fluids, or other complex analytical mixtures. The invention also relates to test strips that can be used for this purpose and a device for recording the test strip and to carry out the method according to the invention. By the According to the method of the invention, it is in particular possible to detect those To quantify and differentiate antibodies and / or antigens.

Das Aufbringen von Biomolekülen auf feste Träger ist ein im Stand der Technik ausführlich beschriebenes und vielseitig anwendbares Verfahren. Renart [1] und Towbin [2] beschrieben erstmals 1979 den Transfer elektrophoretisch aufge trennter Proteine auf eine feste Matrix als "Protein blotting". Hierzu werden bevorzugt Nitrocellulose (NC), Celluloseacetat oder synthetische Polymere wie Nylonmembranen als feste Träger verwendet. Das Dot-blotting-Verfahren stellt eine weitere Methode zur Immobilisierung von Biomolekülen auf feste Träger dar [3, 4]. Hierbei werden die Analyte durch direktes Auftragen auf der Membran immobilisiert. Das Auftragen kann entweder automatisch, z. B. durch einen Drop-, Line- oder Pattern-Printer, oder auch manuell mit einer Pipette erfolgen. Auch in diesen Fällen werden bevorzugt die oben bereits erwähnten, festen Träger als Immobilisierungsmatrices verwendet. Eine spezielle Anwendung dieser Techniken ist der Dot-ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay), der z. B. bei der Detektion geringer Konzentrationen bestimmter Antikörper im Plasma [4] oder dem selektiven Nachweis spezifischer mikrobieller Antigene [5, 6] eingesetzt wird. Ein ELISA ist im allgemeinen eine Technik, bei der z. B. ein Antikörper A gegen ein bestimmtes Protein auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert wird. Dieser bindet das Antigen, welches dann mit einem zweiten Antikörper B, der ebenfalls das Antigen erkennt und eine Markierung trägt, nachgewiesen werden kann. Im speziellen Fall des Dot-ELISAs wird der Antikörper A oder ein Antigen als Punkt auf einer Trägermembran immobilisiert und durch eine nachgeschaltete immuno logische Reaktion nachgewiesen.The application of biomolecules to solid supports is one of the prior art well-described and versatile process. Renart [1] and Towbin [2] first described the transfer electrophoretically in 1979 separated proteins onto a solid matrix as "protein blotting". To do this preferably nitrocellulose (NC), cellulose acetate or synthetic polymers such as Nylon membranes used as solid supports. The dot blotting process provides is another method of immobilizing biomolecules on solid supports [3, 4]. Here, the analytes are applied directly to the membrane immobilized. The application can either be automatic, e.g. B. by a Drop, line or pattern printer, or manually with a pipette. In these cases too, the solid ones already mentioned are preferred Carrier used as immobilization matrices. A special application of this Techniques is the dot ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), which, for. B. at the detection of low concentrations of certain antibodies in plasma [4] or the selective detection of specific microbial antigens [5, 6] becomes. An ELISA is generally a technique in which e.g. B. an antibody A is immobilized against a specific protein on a microtiter plate. This binds the antigen, which then with a second antibody B, which also recognizes the antigen and carries a label that can be detected. in the Special case of the dot ELISA is the antibody A or an antigen as a point immobilized on a support membrane and by a downstream immuno logical response demonstrated.

Durch den Einsatz solcher Verfahren werden größere Mengen an teuren Anti körperlösungen und Nachweisreagenzien sowie Analytlösung (wie z. B. Patien tenserum oder -plasma) benötigt, um die gesamte Filtermembran zu überschich ten. Stehen nur geringe Mengen an Analytlösung zur Verfügung, müssen die Dot-ELISA-Membranen in kleine Stücke geschnitten werden, die in je eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte passen [3]. Dies Verfahren ist arbeitstechnisch aufwendig und für größere Testreihen nur bedingt geeignet. Ein großer Nachteil dieser Verfahren besteht darin, daß die Ergebnisse nur qualitativ ausgewertet werden können (abgesehen vom ELISA), so daß die Interpretation der Aus wertung zu Fehleinschätzungen führen kann. Eine quantitative Auswertung von Dot-ELISA-Membranen ist bisher nur in Form eines Radioimmunoassays be schrieben worden [7]. Dies bedeutet ein erhöhtes Sicherheitsrisiko und damit eine eingeschränkte Verwendbarkeit in der klinischen Diagnostik.By using such methods, larger amounts of expensive anti body solutions and detection reagents as well as analyte solution (such as patients serum or plasma) is required to cover the entire filter membrane If only small amounts of analyte solution are available, the Dot ELISA membranes are cut into small pieces, each in one Well of a microtiter plate fit [3]. This process is work engineering complex and only partially suitable for larger test series. A great disadvantage This method is that the results are only evaluated qualitatively (apart from the ELISA), so that the interpretation of the Aus evaluation can lead to misjudgments. A quantitative evaluation of Dot ELISA membranes have so far only been in the form of a radioimmunoassay have been written [7]. This means an increased security risk and therefore limited usability in clinical diagnostics.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die dargelegten Nachteile zu beseitigen und ein Verfahren bereitzustellen, welches verschiedene Biomoleküle auf einer Trägermatrix immobilisiert, die dann daran bindenden Antigene oder Antikörper in einem einzigen Analyseprozeß nachweist und eine Differenzierung und Quantifizierung erlaubt.The present invention is therefore based on the object set forth Eliminate disadvantages and provide a method which different Biomolecules immobilized on a carrier matrix, which then bind to them Detects antigens or antibodies in a single analysis process and one Differentiation and quantification allowed.

Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung gelöst.This object is achieved by the features characterized in the claims the inventive method and the inventive device solved.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Anmeldung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung von unterschiedlichen Analyten in einer zu untersuchenden Lösung, umfassend die Schritte
A first subject of the present application relates to a method for the qualitative and / or quantitative determination of different analytes in a solution to be examined, comprising the steps

(a) the application and immobilization of at least two different Chen biomolecules on a support, the different biomoles coolers are applied separately from each other,
(b) incubating the biomolecules applied to the support with the investigating solution, and
(c) performing a biomolecule / analyte detection reaction plexe.

Im ersten Schritt (a) werden spezielle Antigene und/oder Antikörper ("Biomolekü le") auf eine feste Matrix als Träger immobilisiert. Im zweiten Schritt (b) werden Antikörper oder Antigene ("Analyte") aus Körperflüssigkeiten oder anderen komplexen Analysegemischen ("Analytlösung") an die immobilisierten Biomole küle gebunden und durch eine anschließende Nachweisreaktion gemäß Schritt (c) in Form einer Farbreaktion sichtbar gemacht. Diese Nachweisreaktion beruht auf einer visuellen und/oder computergestützten Bildauswertung, bei welcher die entstandene Färbung auf der Trägermatrix mit Hilfe eines Scanners digitalisiert wird. Ein entsprechendes Computerprogramm wertet dann das digitalisierte Färbemuster so aus, daß die im Schritt (b) gebundenen Analyte quantifiziert und, wenn verschiedene Analyte nachgewiesen werden sollen, auch differenziert werden können.In the first step (a), special antigens and / or antibodies ("biomolecule le ") immobilized on a solid matrix as a carrier. In the second step (b) Antibodies or antigens ("analytes") from body fluids or others complex analysis mixtures ("analyte solution") to the immobilized biomole cool bound and by a subsequent detection reaction according to step (c) visualized in the form of a color reaction. This detection reaction is based on a visual and / or computer-assisted image evaluation, in which the The resulting color on the carrier matrix is digitized using a scanner becomes. A corresponding computer program then evaluates the digitized Staining pattern so that the analytes bound in step (b) are quantified and, if different analytes are to be detected, also differentiated can be.

Erfindungsgemäß werden die verwendeten Biomoleküle so auf einen festen Träger aufgebracht, daß sie irreversibel an den Träger bzw. Trägermatrix gebun den werden. Dies wird dadurch erreicht, daß als Immobilisierungsmatrix ein Trägermaterial verwendet wird, an welches die Biomoleküle zum einen kovalent binden, zum anderen aber auch durch verschiedenartige nicht-kovalente Bindun gen (z. B. ionische Wechselwirkungen, van der Waals-Kräft, hydrophobe Wech selwirkungen) adsorptiv gebunden werden. Das Aufbringen der Biomoleküle ge schieht durch im Stand der Technik bekanntes Verfahren, bevorzugt mit Hilfe dazu geeigneter Geräte. Zu diesem Zweck eignen sich besonders ein Micro-Drop-System oder ein Line-Printing-System. Es können aber auch andere entsprechen de Geräte verwendet werden. Ebenso ist ein manuelles Aufbringen der Biomole küle mit Hilfe üblicher Pipettierhilfen möglich. According to the invention, the biomolecules used are thus fixed Carrier applied that they irreversibly bound to the carrier or carrier matrix that will. This is achieved by using an immobilization matrix Support material is used to which the biomolecules are covalently attached bind, but also through different types of non-covalent binding gene (e.g. ionic interactions, van der Waals-Kraft, hydrophobic interactions interactions) are bound by adsorption. The application of the biomolecules ge occurs by means of a method known in the prior art, preferably with the aid of suitable devices. A micro-drop system is particularly suitable for this purpose or a line printing system. But others can also correspond de devices are used. There is also a manual application of the biomole cool with the help of usual pipetting aids.

Die Bezeichnung "Biomoleküle" umfaßt zum einen spezifische Antikörper, die distinkte Antigene erkennen, welche dann durch eine Nachweisreaktion detek tiert werden, zum anderen aber auch beliebige Antigene, die durch spezifische Antikörper erkannt und die dann ihrerseits nachgewiesen werden.The term "biomolecules" includes specific antibodies that Detect distinct antigens, which are then detected by a detection reaction be on the other hand, but also any antigens by specific Antibodies are recognized and then in turn detected.

Die zu detektierenden Antigene oder Antikörper ("Analyte") werden typischer weise aus Körperflüssigkeiten oder anderen komplexen Analysegemischen durch immunologische Verfahren nachgewiesen. Unter Körperflüssigkeiten werden erfindungsgemäß sämtliche Flüssigkeiten verstanden, die aus einem tierischen Körper, insbesondere einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, erhalten werden können. Solche Flüssigkeiten umfassen vorzugsweise Serum, Plasma, Vollblut, Lymphe, Speichel, Ascitis und Urin. Weiterhin sind auch solche Flüssig keiten umfaßt, die aus festen Geweben gewonnen werden können. Unter den "anderen komplexen Analysegemischen" werden insbesondere Fermentations überstände, Zellkulturüberstände, Gewebeextrakte sowie Proben aus dem Bereich der Umweltanalytik (Boden und Wasserproben), der Lebensmittelanalytik und der Rückstandsanalytik. Alle dargelegten Analysegemische können sowohl unverdünnt als auch in verdünnter Form eingesetzt werden. Zur Verdünnung können zu diesem Zweck übliche, im Stand der Technik bekannte Lösungen verwendet werden.The antigens or antibodies ("analytes") to be detected are becoming more typical show from body fluids or other complex analytical mixtures demonstrated immunological procedures. Being under body fluids according to the invention understood all liquids that come from an animal Body, especially a mammal, preferably a human can be. Such liquids preferably include serum, plasma, Whole blood, lymph, saliva, ascitis and urine. Such liquids are also liquid keiten includes that can be obtained from solid tissues. Among the "Other complex analysis mixtures" are especially fermentations supernatants, cell culture supernatants, tissue extracts and samples from the Area of environmental analysis (soil and water samples), food analysis and residue analysis. All of the analytical mixtures presented can be both can be used undiluted as well as in diluted form. For dilution can for this purpose usual solutions known in the art be used.

Die zu detektierenden Analyte werden erfindungsgemäß derart nachgewiesen, daß die Trägermatrix mit den aufgebrachten Biomolekülen mit Körperflüssigkei ten oder anderen komplexen Analysegemischen (im folgenden zusammengefaßt und als "Analytlösung" bezeichnet) inkubiert wird, so daß die darin enthaltenen Analyte an die trägerfixierten Biomoleküle binden. Die gebundenen Analyte werden entweder mit spezifischen, markierten Detektorantikörpern, die gegen die Analyte gerichtet sind, oder mit unmarkierten Detektorantikörpern und diese dann mit markierten, gegen die Detektorantikörper gerichteten Nachweisantikör per nachgewiesen, wobei die Markierung in beiden Fällen nicht-radioaktiv ist.According to the invention, the analytes to be detected are detected in such a way that that the carrier matrix with the applied biomolecules with body fluids ten or other complex analysis mixtures (summarized below and referred to as "analyte solution") so that the contained therein Bind analytes to the fixed biomolecules. The bound analytes either with specific, labeled detector antibodies against the analytes are directed, or with unlabelled detector antibodies and these then with labeled detection antibody directed against the detector antibody per detected, the label being non-radioactive in both cases.

Die Markierung der Antikörper ergibt am Ende der Nachweisreaktion eine Farb reaktion, die in ihrer Intensität direkt proportional zur Konzentration der gebunde nen, nachzuweisenden Analyte ist.The labeling of the antibodies gives a color at the end of the detection reaction reaction that is directly proportional in intensity to the concentration of the bound an analyte to be detected.

Die Markierung der Antikörper erfolgt typischerweise so, daß sie entweder direkt sichtbar werden, wie z. B. bei Kopplung mit kolloidalem Gold, oder die Markie rung ist ein Enzym, welches nach Zugabe eines Substrats eine Farbreaktion katalysiert, die dann sichtbar wird. Zu diesem Zweck können Enzyme wie z. B. alkalische Phosphatase, Meerrettich-Peroxidase, Glucose-Oxidase oder sonstige bekannte Markerenzyme verwendet werden. Die Nachweisreaktion kann auch das bekannte Biotin-Streptavidin- bzw. Biotin-Avidin-Verstärkungssystem um fassen.The antibodies are typically labeled so that they are either direct become visible, such as B. when coupled with colloidal gold, or the Markie tion is an enzyme which, after adding a substrate, undergoes a color reaction catalyzed, which then becomes visible. For this purpose, enzymes such as e.g. B. alkaline phosphatase, horseradish peroxidase, glucose oxidase or others known marker enzymes are used. The detection reaction can also the known biotin-streptavidin or biotin-avidin amplification system grasp.

Aufgrund der Markierung und in Abhängigkeit der Analyte in der Analytlösung entsteht am Ende der Nachweisreaktion ein Färbemuster auf dem Träger, wel ches entweder visuell oder mit Hilfe einer computergestützten Bildauswertung ausgewertet wird. In beiden Fällen ist sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Auswertung möglich, weil die Farbintensität proportional zur Kon zentration der gebundenen Analyte ist. Je höher die Analytkonzentration ist, desto intensiver ist auch die Färbung.Due to the labeling and depending on the analytes in the analyte solution at the end of the detection reaction there is a color pattern on the support, which ches either visually or with the help of a computer-assisted image evaluation is evaluated. In both cases there is both a qualitative and a quantitative evaluation possible because the color intensity is proportional to the con concentration of the bound analyte is. The higher the analyte concentration, the more intense the coloring.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine quantitative Auswertung dadurch ermöglicht, daß auf einen Träger sowohl ein spezifischer Antikörper gegen ein nachzuweisendes Antigen als auch das Antigen selbst als Standard in unterschiedlichen Konzentrationen aufgebracht wird. Selbstverständlich kann auch umgekehrt ein spezifischer Antikörper als Standard und das Antigen für diesen spezifischen Antikörper auf einen Träger aufgebracht werden. Nach der Inkubation mit der Analytlösung und der folgenden Nachweisreaktion werden die Standards entsprechend ihrer Konzentration unterschiedlich stark angefärbt. Ebenso wird der Analyt entsprechend seiner Konzentration angefärbt, so daß ein direkter Vergleich mit dem Standard möglich ist.In a preferred embodiment, a quantitative evaluation thereby allowing both a specific antibody to be carried on a support against an antigen to be detected as well as the antigen itself as the standard in different concentrations is applied. Of course you can vice versa a specific antibody as standard and the antigen for apply this specific antibody to a support. After Incubation with the analyte solution and the following detection reaction are the Standards colored differently according to their concentration. The analyte is also stained according to its concentration, so that a direct comparison with the standard is possible.

In solchen Fällen, in denen nur eine qualitative Aussage getroffen werden soll, ist das Aufbringen von Standards auf den Träger nicht erforderlich. In cases where only a qualitative statement should be made, it is not necessary to apply standards to the carrier.

Ein Färbemuster entsteht dann, wenn erfindungsgemäß verschiedene Biomolekü le an distinkten (d. h. örtlich voneinander getrennten) Stellen auf den Träger aufgebracht werden. Das Muster kann in verschiedenen Formen angelegt sein, so z. B. in Linien oder Punkten. Entscheidend ist hierbei nur, daß an definierten Stellen des Trägers auch nur eine Sorte bzw. Art von Biomolekülen aufgebracht ist.A color pattern occurs when different biomolecules according to the invention le at distinct (i.e., spatially separated) locations on the wearer be applied. The pattern can be created in different forms, so z. B. in lines or dots. The only important thing here is that at defined Places only one type or type of biomolecules applied to the carrier is.

Bei der rein visuellen Auswertung des Färbemusters kann durch einen Vergleich mit einer externen Schablone eine Zuordnung von angefärbten Bereichen auf dem Träger mit bestimmten Analyten erfolgen. Auf diese Weise ist eine qualitati ve Aussage möglich. Anhand der Farbintensität des nachgewiesenen Analyten ist darüber hinaus eine Quantifizierung möglich, wenn Standards mit auf den Träger aufgebracht waren, oder wenn auf einer externen Schablone eine Farb skala angegeben ist, so daß über die Farbintensität eine Konzentrationszuord nung erfolgen kann.In the case of a purely visual evaluation of the color pattern, a comparison can be made an assignment of stained areas with an external template the carrier with certain analytes. In this way a qualitati ve statement possible. Based on the color intensity of the detected analyte quantification is also possible if standards are included in the Carrier were applied, or if a color on an external stencil scale is given, so that a concentration assignment via the color intensity can be done.

Erfindungsgemäß wird bei Verwendung einer computergestützten Bildauswer tung in einem ersten Schritt das Färbemuster mittels eines Scanners digitalisiert. Danach wird das digitalisierte Färbemuster mit Hilfe eines speziellen Computer programms in 256 Graustufen aufgeschlüsselt, so daß aus jedem angefärbten Bereich des Trägers ein Grauwert errechnet wird. Aufgrund der Standards auf dem Träger wird eine Korrelation zwischen Konzentration und Grauwert (also Farbintensität) ermittelt. Anhand dieser Korrelation kann über den ermittelten Grauwert eines angefärbten Analyten deren Konzentration berechnet werden. Mit diesem Verfahren ist es darüber hinaus möglich, zwischen verschiedenen Analyten in einem Gemisch zu unterscheiden, wenn an verschiedenen Stellen des Trägers solche Biomoleküle aufgetragen sind, die spezifisch mit nur einem Analyten aus diesem Gemisch reagieren.According to the invention, when using a computer-assisted image evaluator In a first step, the coloring pattern is digitized using a scanner. After that, the digitized coloring pattern is made using a special computer programs broken down into 256 shades of gray so that each stained Area of the carrier a gray value is calculated. Because of the standards the wearer is shown a correlation between concentration and gray value (i.e. Color intensity) determined. Based on this correlation, the determined Gray value of a stained analyte whose concentration is calculated. With this method it is also possible to choose between different Differentiate analytes in a mixture when at different locations the carrier, such biomolecules are plotted that are specific with only one React analytes from this mixture.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt somit eine Differenzierung und Quantifizie rung von verschiedenen Analyten in einem einzigen Testansatz zu.The method according to the invention thus allows differentiation and quantification different analytes in a single test.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Analyten in einer zu unter suchenden Lösung, umfassend ein erstes Element mit einer Aussparung und einer Vertiefung, wobei die Vertiefung den vorstehend definierten Träger auf nehmen kann, und ein zweites Element mit einer Konfiguration, die der Aus sparung des ersten Elements angepaßt ist, und durch eine Aussparung eine Vertiefung ausbildet, die am Boden einen Durchbruch aufweist, wobei das zweite Element in die Aussparung des ersten Elements derart eingefügt werden kann, daß es den in der Vertiefung des ersten Elements angeordneten Träger fixiert und einen definierten Reaktionsraum für das erfindungsgemäße Verfahren ausbildet.Another object of the present invention is a device for quantitative and / or qualitative determination of analytes in one to under seeking solution, comprising a first element with a recess and a depression, the depression having the carrier defined above can take, and a second element with a configuration that the off saving of the first element is adapted, and a through a recess Forms recess that has an opening at the bottom, the second element can be inserted into the recess of the first element in this way may be that the carrier arranged in the recess of the first element fixed and a defined reaction space for the inventive method trains.

Diese zweiteilige Vorrichtung zur Fixierung des Trägers zeichnet sich besonders dadurch aus, daß in einem von zwei Gehäuseelementen eine Vertiefung angeord net ist, in welche der feste Träger eingelegt werden kann. Mit dem zweiten Gehäuseelement dieser erfindungsgemäßen Vorrichtung wird der Träger so mit dem ersten Gehäuseelement verbunden, daß er fest, beispielsweise durch Einklemmen oder Kleben, zwischen diesen beiden Elementen angeordnet bzw. fixiert wird. Das zweite Element der Vorrichtung ist mit einer, der Konfiguration der Aussparung des ersten Elements angepaßten Aussparung und einer Durch brechung ausgestattet. Diese Durchbrechung ist so ausgebildet, daß sie den reaktiven Teil des in der Vertiefung der Aussparung des erstens Elements an geordneten Trägers freiläßt. Die durch Einfügen des zweiten Elements in die Aussparung des ersten Elements ausgebildete Vertiefung stellt einen Reaktions raum über dem Träger dar, welcher die Analytlösung und die Nachweislösungen vollständig aufnimmt.This two-part device for fixing the carrier is particularly distinguished characterized in that a recess is arranged in one of two housing elements net in which the solid support can be inserted. With the second Housing element of this device according to the invention is the carrier with connected to the first housing element that it is fixed, for example by Pinching or gluing, arranged between these two elements or is fixed. The second element of the device is one, the configuration the recess of the first element adapted recess and a through refraction equipped. This opening is designed so that the reactive part of the in the recess of the recess of the first element orderly carrier releases. By inserting the second element into the Recess of the first element formed recess provides a reaction space above the support which contains the analyte solution and the detection solutions completely absorbs.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine einstückige Vor richtung zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von Analyten in einer zu untersuchenden Lösung, umfassend ein erstes Element bzw. einen ersten Abschnitt mit einer Aussparung und einer Vertiefung, wobei die Vertie fung den vorstehend definierten Träger aufnehmen kann, und ein zweites Ele ment bzw. einen zweiten Abschnitt mit einer Konfiguration und/oder Abmessun gen, die der Konfiguration und/oder den Abmessungen der Aussparung und/oder der Vertiefung und/oder des Teststreifens angepaßt ist/sind, und durch eine Aussparung eine Vertiefung ausbildet, die am Boden einen Durchbruch aufweist, wobei die ersten und zweiten Elemente bzw. Abschnitte derart angeordnet sind, daß der in der Vertiefung des ersten Elementes bzw. Abschnittes angeordnete Träger fixierbar ist bzw. fixiert ist und daß ein definierter Reaktionsraum für das erfindungsgemäße Verfahren ausgebildet ist.Another object of the present invention is a one-piece front Direction for the quantitative and / or qualitative determination of analytes in a solution to be examined, comprising a first element or a first section with a recess and a recess, the Vertie fung can take the carrier defined above, and a second Ele ment or a second section with a configuration and / or dimensions conditions of the configuration and / or the dimensions of the recess and / or the depression and / or the test strip is / are adapted, and by a Recess forms a depression which has an opening at the bottom, the first and second elements or sections being arranged in such a way that the arranged in the recess of the first element or section Carrier is fixable or is fixed and that a defined reaction space for the the inventive method is formed.

Bei sowohl der einteiligen als auch der zweiteiligen Ausführungsform ist der Durchbruch in dem zweiten Abschnitt oder Element bevorzugt in zumindest einer Richtung kleiner als der Teststreifen, so daß der Teststreifen durch eine Art Vorsprung in der Vertiefung gehalten wird. Bei der zweiteiligen Ausführungsform kann somit z. B. erst der Teststreifen angeordnet werden, und nachfolgend durch das Einfügen des zweiten Elementes festgelegt werden. Bei der einstückigen Ausgestaltung kann der Streifen z. B. über einen gebildeten Vorsprung in die Vertiefung gepreßt werden, so daß der Teststreifen entsprechend einrastet.In both the one-piece and the two-piece embodiment is the Breakthrough in the second section or element preferably in at least one Direction smaller than the test strip, so that the test strip is separated by a kind Projection is held in the recess. In the two-part embodiment can thus z. B. only the test strips are arranged, and then by insert the second element. With the one-piece Design can the strip z. B. over a formed projection in the Depression are pressed so that the test strip engages accordingly.

Alternativ ist es bevorzugt, daß der Durchbruch im wesentlichen den Abmessun gen des Teststreifens und/oder der Aussparung entspricht, so daß der Test streifen zur Anordnung in der Vorrichtung einfach von oben eingesetzt wird, wobei insbesondere bevorzugt ein Klebstoff zwischengelagert wird, um den Teststreifen bezüglich der Vorrichtung zu fixieren.Alternatively, it is preferred that the breakthrough be substantially the same size gene of the test strip and / or the recess, so that the test strips for arrangement in the device is simply inserted from above, wherein an adhesive is particularly preferably stored temporarily around the Fix test strips in relation to the device.

Die Aussparung in dem oberen Element oder Abschnitt verjüngt sich bevorzugt zumindest teilweise konisch oder trichterartig nach unten hin zu der Vertiefung, welche den Teststreifen aufnehmen soll, so daß zum einen beim Einsetzen eine automatische Justier- und/oder Positioniereinrichtung bereitgestellt ist und daß zum anderen sich der Reaktionsraum nach oben aufweitet, um das Befüllen mit Reagens zu vereinfachen.The recess in the upper element or section preferably tapers at least partially conical or funnel-like down towards the depression, which should take up the test strip, so that on the one hand a automatic adjustment and / or positioning device is provided and that on the other hand, the reaction space widens upwards in order to be filled with Simplify reagent.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der folgenden beispielhaften Beschreibung einiger derzeit bevorzugter Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen. Further advantages and features of the invention result from the following exemplary description of some currently preferred embodiments below Reference to the drawings.

Die Figuren zeigen:The figures show:

Fig. 1 ist eine bevorzugte Ausführungsform des Trägers und zeigt ein Allergen-Panel. Auf einer verstärkten Nitrocellulosemembran (1) sind verschiedene Al lergene (2) als Biomoleküle sowie Standards (3) in Form von Linien aufgebracht. Fig. 1 is a preferred embodiment of the carrier, showing an allergen panel. On a reinforced nitrocellulose membrane (1) are different Al lergene (2) applied as biomolecules and standards (3) in the form of lines.

Fig. 2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vor richtung, bestehend aus zwei Gehäuseelementen, von denen das eine als Grund element (4) und das andere als Einlegerahmen (5) ausgebildet ist. Fig. 2 shows a preferred embodiment of the device according to the invention, consisting of two housing elements, one of which is designed as a basic element ( 4 ) and the other as an insert frame ( 5 ).

Fig. 3, 4 und 5 sind Schnittansichten einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, im wesentlichen der Vorrichtung von Fig. 2 entsprechend. Fig. 3, 4 and 5 are sectional views of a preferred embodiment of the device according to the invention, essentially the device of Fig. 2 accordingly.

Fig. 6, 7 und 8 zeigen Querschnittsansichten von bevorzugten erfindungs gemäßen Vorrichtungen des einstückigen Typs. Fig. 6, 7 and 8 show cross-sectional views of preferred fiction, modern devices of the integral type.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand eines Beispiels unter Her anziehung der Figuren näher erläutert. Als beispielhafte Anwendung der vor liegenden Erfindung wird die Herstellung, Anwendung und Auswertung eines in vitro-Allergietests beschrieben.The present invention is described below using an example under Her attraction of the figures explained in more detail. As an exemplary application of the above lying invention is the manufacture, application and evaluation of a in vitro allergy tests described.

example

Zunächst wird die Immobilisierung der Biomoleküle an den festen Träger be schrieben werden. Eine Aufsicht ist in Fig. 1 dargestellt.First, the immobilization of the biomolecules on the solid support will be described. A top view is shown in FIG. 1.

Als Trägermaterial zur Immobilisierung der Biomoleküle wird eine Nitrocellulose membran (1) mit einer Porenweite von 0,1 µm, die vom Hersteller auf ein festes Trägermaterial aufgebracht worden ist, verwendet. Die Biomoleküle in diesem Anwendungsbeispiel sind Allergene (2) (wie z. B. Milben, Pollen von Gräsern oder Bäumen, Bestandteile aus Nahrungsmittel oder Hausstaub), die in einer Lösung aus PBS und Glycerin suspendiert vorliegen. Als Standard (3) wird IgE (Immuno globulin E) in verschiedenen Konzentrationen verwendet. Die Konzentrationen der Standards sind so eingestellt, daß sie den international bekannten 6 RAST-Klassen entsprechen. Die so vorliegenden verschiedenen Allergen-Lösungen bzw. Standard-Lösungen werden nun mit Hilfe eines Line-Printers (Bio.Dot Limited, Diddington, England) in Form von Linien auf die Nitrocellulosemembran so aufgetragen, daß ein leiterartiges Muster entsteht (vgl. Fig. 1). Nachdem alle Allergene und Standards aufgebracht worden sind, wird die Membran für 1 Stunde in einer 1%igen BSA-Lösung (Rinderserumalbumin) inkubiert, um die nicht mit Allergenen beschichteten Stellen abzusättigen. Die beschichtete Mem bran wird im folgenden als Allergen-Panel bezeichnet. Die in der Fig. 1 dar gestellten Banden repräsentieren die auf der Membran aufgetragenen Biomo leküle. Sie sind auf der Membran natürlich transparent und damit nicht sichtbar.A nitrocellulose membrane ( 1 ) with a pore size of 0.1 μm, which the manufacturer has applied to a solid support material, is used as the support material for immobilizing the biomolecules. The biomolecules in this application example are allergens ( 2 ) (such as mites, pollen from grass or trees, constituents from food or house dust), which are suspended in a solution of PBS and glycerin. IgE (immunoglobulin E) in various concentrations is used as standard ( 3 ). The concentrations of the standards are set so that they correspond to the internationally known 6 RAST classes. The thus present different allergen solutions or standard solutions are then applied with the aid of a line printer (Bio.Dot Limited, Diddington, England) in the form of lines onto the nitrocellulose membrane so that a ladder-like pattern is created (cf. Fig. 1). After all allergens and standards have been applied, the membrane is incubated for 1 hour in a 1% BSA solution (bovine serum albumin) in order to saturate the areas not coated with allergens. The coated membrane is referred to below as the allergen panel. The bands shown in FIG. 1 represent the biomolecules applied to the membrane. They are of course transparent on the membrane and therefore not visible.

Nachfolgend wird die Herstellung einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung (vgl. Fig. 2) und der Zusammenbau von Vor richtung und Allergen-Panel zum fertigen Allergietest beschrieben.The production of a preferred embodiment of the device according to the invention (cf. FIG. 2) and the assembly of the device and allergen panel for the finished allergy test are described below.

Die zweiteilige Vorrichtung wird durch ein industrielles Spritzgußverfahren aus einem handelsüblichen Kunststoffmaterial in zwei Teilen hergestellt. Die beiden Teile sind in Form eines größeren Grundelements (4) und eines kleineren Ele ments als Einlegerahmen (5) ausgebildet. In dem größeren Grundelement (4) ist eine Aussparung (6) eingearbeitet, in die der Einlegerahmen (5) fest eingefügt, beispielsweise geklemmet werden kann. Am Boden dieser Aussparung ist eine Vertiefung (7) eingefügt, die so ausgestaltet ist, daß sie das Allergen-Panel vorzugsweise vollständig aufnimmt. Der Einlegerahmen (5) enthält ebenfalls eine Vertiefung (8), die konisch zuläuft und vorzugsweise der Konfiguration der Aussparung (6) des ersten Elements angepaßt ist, und die eine Durchbrechung (9) aufweist. Der Zusammenbau erfolgt nun so, daß zuerst das Allergen-Panel in die dafür vorgesehene Vertiefung (7) am Boden des größeren Gehäuseele ments (4) eingelegt wird, und das Allergen-Panel dann mit dem Einlegerah men (5), also dem zweiten Gehäuseelement, beispielsweise fest eingeklemmt wird. Der reaktive Teil des Allergen-Panels bleibt durch die Durchbrechung (9) in dem Einlegerahmen (5) frei. Die Vertiefung (8) im Einlegerahmen (5) definiert über dem Allergen-Panel einen Reaktionsraum mit festgelegtem Volumen in den die Analytlösung und die nachfolgend zu verwendenden Lösungen eingefüllt werden können.The two-part device is manufactured in two parts by an industrial injection molding process from a commercially available plastic material. The two parts are in the form of a larger base element ( 4 ) and a smaller element as an insert frame ( 5 ). A recess ( 6 ) is incorporated in the larger base element ( 4 ), into which the insert frame ( 5 ) can be firmly inserted, for example clamped. At the bottom of this recess, a recess ( 7 ) is inserted, which is designed such that it preferably completely receives the allergen panel. The insertion frame ( 5 ) also contains a recess ( 8 ) which tapers and is preferably adapted to the configuration of the recess ( 6 ) of the first element and which has an opening ( 9 ). The assembly is now carried out so that the allergen panel is first inserted into the recess ( 7 ) provided on the bottom of the larger housing element ( 4 ), and the allergen panel is then inserted with the insert frame ( 5 ), that is to say the second housing element , for example, is firmly clamped. The reactive part of the allergen panel remains free through the opening ( 9 ) in the insert frame ( 5 ). The recess ( 8 ) in the insertion frame ( 5 ) defines a reaction space with a fixed volume above the allergen panel, into which the analyte solution and the solutions to be used subsequently can be filled.

Auf dem größeren Gehäuseelement (4) kann ferner eine definierte Fläche (10) vorliegen, die beispielsweise dazu geeignet ist, Etiketten oder Aufkleber auf zunehmen. Insbesondere können solche Etiketten, wie sie aus der klinischen Praxis als Patientenetiketten mit patientenspezifischen Daten und Barcode bekannt sind, verwendet werden. Darüber hinaus kann dieses Gehäuseelement eine weitere Fläche (11) aufweisen, die dazu geeignet ist, produktspezifische Daten, wie Produktbezeichnung, Lot-Nr. oder Haltbarkeitsdatum aufzunehmen.On the larger housing element ( 4 ) there can also be a defined area ( 10 ) which is suitable, for example, for receiving labels or stickers. In particular, such labels as are known from clinical practice as patient labels with patient-specific data and barcode can be used. In addition, this housing element can have a further surface ( 11 ) which is suitable for storing product-specific data, such as product name, lot no. or expiration date.

Aus der in Fig. 3 gezeigten Schnittansicht läßt sich besonders einfach entneh men, wie das zweite Element (5) in die Aussparung (6) des ersten Elements eingesetzt ist, und dabei die Trägerplatte (1) in der Vertiefung (7) fixiert. Eine zu Fig. 3 senkrecht verlaufende Schnittansicht könnte eine im wesentliche ent sprechende Gestalt aufweisen, könnte jedoch auch so vorliegen, wie sie in Fig. 4 gezeigt ist, das heißt, daß der von dem Element (5) vorragende Teil, welcher die Trägerplatte (1) fixiert, nicht über den gesamten Perimeter des Durchbruches (9) vorliegen muß, sondern daß vielmehr z. B. lediglich zwei gegenüberliegende Abschnitte derart ausgestaltet sein müssen. Alternativ wäre es auch denkbar, daß lediglich vereinzelte Vorsprünge zur Fixierung der Trägerplatte (1) dienen. Aus den Fig. 3 und 4 ist ersichtlich, daß der Reaktionsraum gebildet ist durch das von dem Durchbruch (9) gebildete Volumen, sowie durch den sich nach oben verbreiterten Raum, welcher durch die Wandungen der Aussparung (8) definiert ist.From the sectional view shown in Fig. 3 can be removed particularly easily men, how the second element ( 5 ) is inserted into the recess ( 6 ) of the first element, and thereby the carrier plate ( 1 ) fixed in the recess ( 7 ). A sectional view perpendicular to FIG. 3 could have a substantially corresponding shape, but could also be as shown in FIG. 4, that is to say that the part protruding from the element ( 5 ), which the carrier plate ( 1 ) fixed, need not be present over the entire perimeter of the opening ( 9 ), but rather that z. B. only two opposite sections must be designed in this way. Alternatively, it would also be conceivable that only isolated projections serve to fix the carrier plate ( 1 ). From Figs. 3 and 4 it can be seen that the reaction chamber is formed, which is defined by the walls of the recess (8) through the formed of the opening (9) volume, and by the upward widened space.

Wie es in Fig. 5 gezeigt ist, kann der Reaktionsraum auch ausschließlich durch die Wandungen der Aussparung (8) gebildet sein. Bei den Ausführungsvarianten gemäß den Fig. 4 und 5, bei welchen das zweite Element nicht über die Trägerplatte ragt, kann zur Fixierung der Trägerplatte (1) am Boden der Vertie fung (7) ein Klebstoff vorgesehen sein. Alternativ ist es auch denkbar, daß die Trägerplatte (1) in der Vertiefung (7) mittels Preßpassung oder dergleichen gepaßt ist.As shown in Fig. 5, the reaction space can also be formed exclusively by the walls of the recess ( 8 ). In the embodiments according to FIGS. 4 and 5, in which the second element does not extend beyond the carrier plate, can be used for fixing the support plate (1) at the bottom of the evaporation Vertie (7), an adhesive may be provided. Alternatively, it is also conceivable that the carrier plate ( 1 ) is fitted in the recess ( 7 ) by means of an interference fit or the like.

Aus den Schnittansichten der Fig. 3 bis 5 ist es ersichtlich, daß die zwei Elemente (4) und (5) in sehr einfacher Weise ebenfalls als eine einzelne Einheit oder einstückig ausgebildet werden können, wobei insbesondere bevorzugt ein herkömmliches Kunststoff-Spritzgußverfahren zur Herstellung desselben verwen det werden kann. Das Ergebnis einer einstückigen Ausgestaltung der in den Fig. 3 bis 5 gezeigten Ausführungsformen ist in den Fig. 6 bis 8 gezeigt. Hierbei besteht insbesondere folgender Zusammenhang zwischen den einzelnen Figuren, mit der Ausnahme, daß jeweils die Elemente als getrennt oder als einstückig dargestellt sind; Fig. 6 entspricht im wesentlichen Fig. 5; Fig. 7 entspricht im wesentlichen Fig. 4; Fig. 8 entspricht im wesentlichen Fig. 3. Neben der Einstückigkeit ist noch als Unterschied zu erwähnen, daß die Aus sparung (6) in den in den Fig. 6 bis 8 gezeigten Ausführungsformen als Seitenwand oder seitliche Aussparung bezüglich der Vertiefung (7) vorgesehen ist.From the sectional views of FIGS . 3 to 5 it can be seen that the two elements ( 4 ) and ( 5 ) can also be formed in a very simple manner as a single unit or in one piece, with particular preference being given to a conventional plastic injection molding process for producing the same can be used. The result of a one-piece design of the embodiments shown in FIGS . 3 to 5 is shown in FIGS. 6 to 8. Here there is in particular the following connection between the individual figures, with the exception that the elements are each shown as separate or as one piece; Fig. 6 essentially corresponds to Fig. 5; Fig. 7 essentially corresponds to Fig. 4; Fig. 8 corresponds essentially to Fig. 3. In addition to the one-piece, it should also be mentioned as a difference that the savings ( 6 ) in the embodiments shown in FIGS . 6 to 8 are provided as a side wall or side recess with respect to the recess ( 7 ) is.

Die Anordnung des Teststreifens (1) in der Vertiefung (7) erfolgt bei den in den Fig. 6 und 7 gezeigten Ausführungsformen in dem in einem ersten Schritt entweder an der Unterseite des Teststreifens oder auf dem Boden der Vertiefung (7) eine geringe Menge an Klebstoff angebracht wird. Nachfolgend wird der Teststreifen (1) einfach in die Aussparung (8) gelegt, wodurch er automatisch und einfach hin zu der Vertiefung (7) geführt wird. Alternativ zu dem Klebstoff kann auch die Vertiefung (7) entsprechend zu dem Teststreifen ausgebildet sein, so daß eine Passung oder Preßpassung gebildet ist, so daß ein zusätzlicher Klebstoff nicht erforderlich ist.The arrangement of the test strip ( 1 ) in the recess ( 7 ) takes place in the embodiments shown in FIGS. 6 and 7 in a small amount in a first step either on the underside of the test strip or on the bottom of the recess ( 7 ) Glue is attached. The test strip ( 1 ) is then simply placed in the recess ( 8 ), as a result of which it is automatically and easily guided to the recess ( 7 ). As an alternative to the adhesive, the recess ( 7 ) can also be designed corresponding to the test strip, so that a fit or press fit is formed, so that an additional adhesive is not required.

Bei der in Fig. 8 gezeigten Ausführungsform ist die die Vertiefung (7) begren zende Aussparung (6) seitlich breiter als der Durchbruch (9), so daß der Test streifen oder die Vorrichtung selbst leicht verformt werden müssen, um den Teststreifen in der Vertiefung (7) anzuordnen.In the embodiment shown in Fig. 8, the recess ( 7 ) limiting recess ( 6 ) is laterally wider than the opening ( 9 ), so that the test strip or the device itself must be slightly deformed to the test strip in the recess ( 7 ) to be arranged.

In jedem Fall ist bei allen gezeigten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Anordnung geschaffen, bei welcher der Teststreifen (1) an einer definierten Position gehalten wird, sei es nun mittels Klebstoff, Eingriff, Wechsel wirkung etc. Über dem Teststreifen ist in jedem Fall ein definierter Reaktions raum ausgebildet, welcher sich bevorzugt nach oben hin verbreitert, um das Einfügen von Reagenzen zu vereinfachen. Der Reaktionsraum kann begrenzt sein durch Wandungen der Aussparung (8) und/oder des Durchbruches (9).In any case, in all of the embodiments of the device according to the invention shown, an arrangement is created in which the test strip ( 1 ) is held at a defined position, be it by means of adhesive, engagement, interaction etc. In any case, a defined one is above the test strip Reaction space formed, which preferably widens towards the top to simplify the insertion of reagents. The reaction space can be limited by walls of the recess ( 8 ) and / or the opening ( 9 ).

Der so vollständig zusammengebaute "Allergietest-Chip" wird zur Bestimmung von allergenspezifischem IgE in Serum eingesetzt.The "allergy test chip" completely assembled in this way is used for determination of allergen-specific IgE used in serum.

Zu diesem Zweck wird ein definiertes Volumen (in diesem Beispiel 400 µl) unverdünntes oder verdünntes Patientenserum in den Reaktionsraum über der aktiven Fläche der Membran (gebildet durch die Vertiefung (8)) gegeben und für eine bestimmte Zeit, beispielsweise zwischen 45 und 60 Minuten, inkubiert. Sind im Serum allergenspezifische IgE Moleküle vorhanden, so binden diese spezifisch an die auf der Membran aufgebrachten Allergene. Nach der Inkubation wird das Serum von der Membran durch Absaugen oder Abwaschen entfernt und die Membran mit Puffer gewaschen. Zu diesem Zweck wird beispielsweise PBS + 0,5% Tween verwendet. Es kann aber auch jede andere, zu diesem Zweck geeignete Lösung oder Wasser verwendet werden. Im Anschluß an diesen Waschvorgang wird eine Nachweislösung in den Reaktionsraum pipettiert. Diese Nachweislösung enthält typischerweise Antikörper, die gegen IgE Moleküle gerichtet sind. Der Nachweisantikörper ist entweder mit einem Markerenzym oder mit kolloidalem Gold oder mit Biotin gekoppelt. Als Markerenzyme können typischerweise Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Glucose-Oxidase oder andere zu diesem Zweck übliche Enzyme verwendet werden. In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel wird bevorzugt ein mit Biotin gekoppelter Nachweisantikörper eingesetzt. Die Nachweislösung wird ebenfalls 45 bis 60 Minuten inkubiert und danach entfernt. Die Membran wird danach wieder gründ lich gewaschen und anschließend mit einer Lösung inkubiert, die ein Konjugat aus Streptavidin und alkalischer Phosphatase oder Avidin und alkalischer Phos phatase enthält. Streptavidin bzw. Avidin bindet mit hoher Affinität an das Biotin des Nachweisantikörpers. Nach einer Inkubationszeit von etwa 5 Minuten wird die Membran nochmals gewaschen und danach mit einer Lösung überschichtet, die ein Substrat für das Markerenzym enthält. Als Substrat für die alkalische Phosphatase wird bevorzugt NBT/BCIP (NBT: Nirto-blue Tetrazoliumchlorid, BCIP: 5-Brom-4-chlorindolylphosphat) verwendet, welches durch das Marke renzym in eine farbige Verbindung umgesetzt wird.For this purpose, a defined volume (in this example 400 μl) of undiluted or diluted patient serum is added to the reaction space above the active surface of the membrane (formed by the depression ( 8 )) and for a certain time, for example between 45 and 60 minutes, incubated. If allergen-specific IgE molecules are present in the serum, they bind specifically to the allergens applied to the membrane. After the incubation, the serum is removed from the membrane by suction or washing and the membrane is washed with buffer. For this purpose, for example, PBS + 0.5% Tween is used. However, any other solution or water suitable for this purpose can also be used. Following this washing process, a detection solution is pipetted into the reaction space. This detection solution typically contains antibodies that are directed against IgE molecules. The detection antibody is coupled either with a marker enzyme or with colloidal gold or with biotin. Horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase or other enzymes customary for this purpose can typically be used as marker enzymes. In the present exemplary embodiment, a detection antibody coupled with biotin is preferably used. The detection solution is also incubated for 45 to 60 minutes and then removed. The membrane is then washed again thoroughly and then incubated with a solution containing a conjugate of streptavidin and alkaline phosphatase or avidin and alkaline phosphatase. Streptavidin and avidin bind with high affinity to the biotin of the detection antibody. After an incubation period of about 5 minutes, the membrane is washed again and then covered with a solution which contains a substrate for the marker enzyme. NBT / BCIP (NBT: Nirto-blue tetrazolium chloride, BCIP: 5-bromo-4-chloroindolyl phosphate) is preferably used as the substrate for the alkaline phosphatase, which is converted into a colored compound by the renzym brand.

Die Intensität der Färbung ist direkt proportional zum gebundenen allergenspezifi schen IgE.The intensity of the coloring is directly proportional to the bound allergen-specific IgE.

Die Standards auf der Membran sind ebenfalls IgE Moleküle, die in 6 unter schiedlichen Konzentrationen aufgetragen sind. Es ist aber auch möglich, weni ger als 6 Standardkonzentrationen aufzubringen. Die Standards werden von den Nachweisantikörpern erkannt und im Zuge der weiteren Reaktionen ebenfalls angefärbt. Die Intensität der Färbung ist proportional zur Konzentration des aufgetragenen Standards, so daß eine Eichgerade ermittelt werden kann, an der dann über die Intensität der Färbung der gebundenen allergenspezifischen IgE Moleküle deren Konzentration im Serum bestimmt wird.The standards on the membrane are also IgE molecules, which are shown in 6 below different concentrations are applied. But it is also possible if to apply less than 6 standard concentrations. The standards are set by the Detection antibodies recognized and also in the course of further reactions stained. The intensity of the coloring is proportional to the concentration of the applied standards so that a calibration line can be determined on the then the intensity of the coloring of the bound allergen-specific IgE Molecules whose concentration in the serum is determined.

Die Färbung auf dem Allergietest-Chip kann sowohl visuell als auch mit elek tronischen/optischen Hilfsmitteln ausgewertet werden. Im ersten Fall ist eine qualitative bzw. eine semiquantitative Auswertung möglich. Anhand der Farb intensität kann mit Hilfe der Standards die Konzentration von allergenspezifi schen IgE Molekülen abgeschätzt werden.The coloring on the allergy test chip can be done both visually and with elec tronic / optical aids are evaluated. In the first case there is one Qualitative or semi-quantitative evaluation possible. Based on the color With the help of the standards, the concentration of allergen-specific IgE molecules can be estimated.

Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird der gefärbte Allergietest-Chip mit Hilfe eines computergestützten Verfahrens ausgewertet. Hierzu wird das Färbemuster auf dem Allergietest-Chip mit einem Scanner digitalisiert und mit einem Compu terprogramm in 256 Graustufen aufgeschlüsselt. Dieses Computerprogramm ordnet dann jedem Balken auf dem Allergen-Panel einen bestimmten Grauwert zu. Anhand der Standards wird eine Eichgerade errechnet (Grauwert gegen IgE Konzentration), mit deren Hilfe dann die Konzentration der allergenspezifischen IgE Moleküle jedes einzelnen Balkens berechnet und einer bestimmten RAST-Kla sse zugeordnet wird. Der Begriff RAST-Klasse bezeichnet international festge legte Konzentrationsbereiche für allergenspezifische IgE Moleküle in Serum.In the present embodiment, the colored allergy test chip is made with the help evaluated by a computer-aided procedure. For this, the coloring pattern digitized on the allergy test chip with a scanner and with a compu The program is broken down into 256 shades of gray. This computer program then assigns each bar on the allergen panel a specific gray value to. A calibration line is calculated based on the standards (gray value against IgE Concentration), with the help of which the concentration of the allergen-specific IgE molecules of each individual bar calculated and a specific RAST class sse is assigned. The term RAST class refers internationally set concentration ranges for allergen-specific IgE molecules in serum.

Im folgenden werden weitere Anwendungsbeispiele aufgeführt, die ebenfalls mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können:
The following are further application examples which can also be carried out with the present invention:

- Cytokine composition in body and tissue fluids or in Tissue extracts
- Immunoglobulin subclass determination
- acute complex hormone pattern determination
- Checking a range of tumor markers
- blood group determination (including rhesus antigen pattern)
- autoimmune response
- All conceivable immunologically detectable antigens that are in the Diffe potential diagnostics are in demand
- Detection and differentiation of complex enzyme activity patterns
- Detection and differentiation of different inhibitors
- Detection and differentiation of immunologically detectable order world toxins

literature

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Claims

1. A method for the qualitative and / or quantitative determination of different analytes in a solution to be examined, comprising the steps

(a) the application and immobilization of at least two different biomolecules on a support, the different biomolecules being applied separately from each other,
(b) incubating the biomolecules on the support with the solution to be examined, and
(c) performing a detection reaction for biomolecule / analyte complexes.

2. The method according to claim 1, wherein the detection reaction in step (c) Incubate the biomolecules and / or the biomolecule / analyte complexes the carrier with at least one specific, labeled detector anti body against the respective biomolecule / analyte complex or analy ten is directed.

3. The method according to claim 1, wherein the detection reaction in step (c) Incubate the biomolecules and / or the biomolecule / analyte complexes the carrier with at least one specific, unlabeled detector antibody against the respective biomolecule / analyte complexes or analyte and the incubation of the biomolecule / analyte / detectoranti Body complexes with labeled, directed against the detector antibodies Detection antibody includes.

4. The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the detection reaction in step (c) gives a color pattern on the support which is visual and / or evaluated with the aid of a computer-assisted image evaluation becomes.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the to be examined Solution from mammals, fermentation and culture supernatants, tissue ex tracts, soil, water, food or residues.

6. Device for the quantitative and / or qualitative determination of analytes in a solution to be examined, comprising a first element ( 4 ) with a recess ( 6 ) and a recess ( 7 ), the recess ( 7 ) being able to receive a carrier, to which different biomolecules can each be attached separately from one another, and a second element ( 5 ) with a recess ( 8 ) which is essentially adapted to the configuration of the recess ( 6 ) and an opening ( 9 ), the second element ( 5 ) with respect to the first element ( 4 ) is or can be arranged in such a way that the carrier positioned in the recess ( 7 ) can be fixed or defined, and that a defined reaction space forms for the method defined in claims 1 to 5.

7. The device according to claim 6, wherein the opening ( 9 ) in at least one direction is smaller than the test strip ( 1 ).

8. The device according to claim 6, wherein the dimensions and / or the configuration of the opening ( 9 ) substantially corresponds to the configuration or the dimensions of the test strip ( 1 ) and / or the recess ( 7 ).

9. Device according to one of claims 6 to 8, wherein the test strip ( 1 ) by means of an adhesive ( 15 ) on the bottom of the recess ( 7 ) can be fixed / fixed.

10. The device according to one of claims 6 to 9, wherein the recess ( 8 ) tapers at least partially conically or funnel-like.

11. The device according to one of claims 6 to 17, in which the ele te ( 4 ) and ( 5 ) are integrally formed, in particular as a one-piece injection molding.

12. Device according to one of claims 6 to 10, wherein the two elements ( 4 , 5 ) as separate units, preferably as ge separate injection molded parts, are formed, wherein the second element ( 5 ) in the recess ( 6 ) of the first Elements ( 4 ) can be inserted.