DE19716346C1 - Oligonucleotide primers for amplifying cytokeratin 18 cDNA - Google Patents
Oligonucleotide primers for amplifying cytokeratin 18 cDNAInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Cytokeratin 18 (CK18) mittels Polymerasekettenreaktion und hierzu verwendbare Primer sowie einen Nachweis- Kit.The invention relates to a method for the detection of cytokeratin 18 (CK18) by means of Polymerase chain reaction and primers that can be used for this, as well as a detection Kit.
Cytokeratine sind eine Gruppe von Keratin-ähnlichen Filamenten. Unter ihnen hat insbesondere Cytokeratin 18 (nachstehend mit CK18 bezeichnet) eine große Bedeutung erlangt, da es zum Nachweis von aus Epithelzellen hervorgegangenen Tumoren verwendet werden kann. Zu diesem Nachweis werden z. B. immunolo gische Verfahren durchgeführt, in denen Antikörper gegen CK18 eingesetzt werden. Solche Verfahren sind jedoch wenig sensitiv. Andererseits wird CK18 auch auf Nukleinsäureebene nachgewiesen. Hierzu wird CK18-mRNA mittels reverser Transkription in cDNA übersetzt und diese in einer Polymerasekettenre aktion (PCR) amplifiziert und dann nachgewiesen. Ein solches mit RT-PCR bezeichnetes Verfahren führt allerdings oft zu falsch positiven Ergebnissen. Seine Spezifität ist daher unbefriedigend.Cytokeratins are a group of keratin-like filaments. Among them especially cytokeratin 18 (hereinafter referred to as CK18) a large one Gained importance because it is used to detect epithelial cells Tumors can be used. For this proof z. B. immunolo genetic procedures carried out in which antibodies against CK18 are used will. However, such methods are not very sensitive. On the other hand, CK18 also detected at the nucleic acid level. For this purpose, CK18 mRNA is used Reverse transcription translated into cDNA and this in a polymerase chain action (PCR) amplified and then detected. One with RT-PCR However, the designated method often leads to false positive results. Its specificity is therefore unsatisfactory.
Neumaier et al., Gene 159 (1995), S. 43-47 beschreiben die Diagnose von Mikro metastasen durch die Amplifikation von gewebe-spezifischen Genen. Dies erfolgt beispielsweise durch Amplifikation von CK-18 bzw. CEA in einer Polymerase- Ketten-Reaktion.Neumaier et al., Gene 159 (1995), pp. 43-47 describe the diagnosis of micro metastases through the amplification of tissue-specific genes. this happens for example by amplification of CK-18 or CEA in a polymerase Chain reaction.
WO 96/17080 betrifft den Nachweis von Tumoren über die Expression von Cytoke ratin 20.WO 96/17080 relates to the detection of tumors via the expression of cytoke ratin 20
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem CK18, sensitiv und spezi fisch nachgewiesen werden kann.The present invention is therefore based on the object of a method to provide, with the CK18, sensitive and spec fish can be detected.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.According to the invention, this is the subject of the claims reached.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zum Nachweis von CK18 das die folgenden Schritte umfaßt:The present invention thus relates to a method for detection of CK18 which includes the following steps:
- a) Entnahme und Aufbereitung einer Körperprobe,a) taking and preparing a body sample,
- b) Isolierung von mRNA aus der Körperprobe, b) isolation of mRNA from the body sample,
- c) Übersetzung der mRNA in cDNA durch eine reverse Transkription,c) translation of the mRNA into cDNA by reverse transcription,
- d) Amplifikation der cDNA durch eine PCR mit speziellen nachfolgend genannten Primern, die eine größere Affinität zur cDNA von CK18 zu prozessierten CK18- Pseudogenen aufweisen, undd) amplification of the cDNA by a PCR with special primers mentioned below, which are larger Affinity for the cDNA from CK18 to processed CK18 Have pseudogenes, and
- e) Nachweis der amplifizierten cDNA.e) Detection of the amplified cDNA.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis des Anmelders, daß die falsch positiven Ergebnisse in einer herkömmlichen RT-PCR für CK18 durch prozessierte CK18-Pseudogene verursacht werden. Diese liegen als Verunreini gung der präparierten mRNA einer Körperprobe vor. Die prozessierten CK18- Pseudogene haben eine große Homologie zur cDNA von CK18 und werden daher in einem herkömmlichen RT-PCR-Verfahren mitamplifiziert.The present invention is based on the knowledge of the applicant that the false positive results in a conventional RT-PCR for CK18 processed CK18 pseudogenes are caused. These lie as Verunreini preparation of the prepared mRNA of a body sample. The processed CK18 Pseudogenes have great homology to the cDNA of CK18 and are therefore co-amplified in a conventional RT-PCR method.
Der Anmelder hat prozessierte CK18-Pseudogene isoliert. Hierzu hat er genom ische DNA des Menschen isoliert und einer PCR unterzogen, in der Primer verwendet wurden, die sich auch zur Amplifikation von CK18-cDNA eignen. Die amplifizierte Pseudogen-DNA wurde kloniert und sequenziert. Drei der amplifi zierten Pseudogen-DNAs sind in Fig. 1 im Vergleich zur CK18-cDNA dargestellt. Die amplifizierten Pseudogen-DNAs wurden bei der DSM am 07. März 1997 als Klon 6, Klon 5 bzw. Klon 1 unter DSM 11448, DSM 11447 bzw. DSM 11446 hinterlegt. Sie stellen auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.The applicant has isolated processed CK18 pseudogenes. To this end, he isolated human genomic DNA and subjected to a PCR in which primers were used which are also suitable for the amplification of CK18 cDNA. The amplified pseudogen DNA was cloned and sequenced. Three of the amplified pseudogen DNAs are shown in Fig. 1 compared to the CK18 cDNA. The amplified pseudogen DNAs were deposited with the DSM on March 7, 1997 as clone 6, clone 5 or clone 1 under DSM 11448, DSM 11447 or DSM 11446. They also form an object of the present invention.
In einem erfindungsgemäßen Verfahren wird der Unterschied zwischen der cDNA von CK18 und ihren prozessierten Pseudo genen zur Konstruktion von Primern für eine PCR genutzt, durch die eine selekti ve Amplifikation der cDNA von Cytokeratinen gegenüber prozessierten Cytoke ratin-Pseudogenen erhalten wird.In a method according to the invention, the difference between the cDNA of CK18 and its processed pseudo genes used for the construction of primers for a PCR, by which a selective ve amplification of cDNA from cytokeratins against processed cytokines ratin pseudogenes is obtained.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren umfaßt die Entnahme einer Körperprobe und deren Aufbereitung. Als Körperprobe sind z. B. ein Abstrich, das Punktat bzw. die Biopsie eines Organs, z. B. von Knochenmark, aber auch Blut, Sputum, Urin, Stuhl, Liquor, Galle, Lymphflüssigkeit oder ein gastrointestinales Sekret, ge eignet, wobei eine Knochenmarks-Biopsie oder Blut bevorzugt ist.A method according to the invention comprises taking a body sample and their preparation. As a body sample z. B. a smear, the Punktat or the biopsy of an organ, e.g. B. of bone marrow, but also blood, sputum, urine, Stool, cerebrospinal fluid, bile, lymph fluid or a gastrointestinal secretion, ge is suitable, with a bone marrow biopsy or blood being preferred.
Die Entnahme und Aufbereitung der Körperprobe erfolgt in üblicher Weise. Ebenso wird die mRNA aus der Körperprobe nach üblichen Verfahren isoliert. Günstig ist es, das Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren zu verwenden (vgl. Chomczynski, P und Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, (1987), 156-1691.The body sample is taken and prepared in the usual way. The mRNA is also isolated from the body sample using customary methods. It is beneficial to use the guanidinium thiocyanate phenol chloroform process use (cf. Chomczynski, P and Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, (1987), 156-1691.
Die erhaltene mRNA wird einer reversen Transkription unterzogen, wobei übliche Primer, z. B. "random hexamer" von Pharmacia, verwendet werden. Ebenso kann eine übliche reverse Transkriptase, vorzugsweise eine MMLV reverse Trans kriptase (z. B. Superskript II, Gibco BRL), verwendet werden. Die Bedingungen und die Puffer der reversen Transkription erfolgen wie vom Hersteller em pfohlen.The mRNA obtained is subjected to reverse transcription, using conventional Primers, e.g. B. "random hexamer" from Pharmacia can be used. Likewise can a conventional reverse transcriptase, preferably an MMLV reverse trans scriptase (e.g. Superscript II, Gibco BRL) can be used. The conditions and the reverse transcription buffers are made as by the manufacturer em paw.
Die erhaltene cDNA wird einer PCR unterzogen, wobei es günstig ist, eine käufliche Taq-Polymerase (z. B. Gibco BRL) zu verwenden. Als Primer werden solche verwendet, die eine größere Affinität zur cDNA von Cytokeratinen als zu prozessierten Cytokeratin-Pseudogenen aufweisen. Solche Primer können durch übliche Verfahren erhalten werden. Günstig ist es wie folgt vorzugehen: Es werden Primer zu Bereichen der cDNA von Cytokeratinen, insbesondere CK18, konstruiert, in denen die prozessierten Cytokeratin-Pseudogene Unterschiede aufweisen (vgl. Fig. 2). Die Bereitstellung von prozessierten Cytokeratin-Pseudo genen bzw. deren Sequenzen erfolgt durch übliche Verfahren. Beispielhaft wird auf die vorstehend beschriebene Bereitstellung von prozessierten CK18-Pseudo genen verwiesen. Die erhaltenen Primer werden auf ihre Affinität zur cDNA von Cytokeratinen bzw. zu prozessierten Cytokeratin-Pseudogenen getestet. Dies kann in üblichen Tests erfolgen. Beispielsweise werden die Primer in eine PCR eingesetzt, in der die cDNA von Cytokeratinen oder prozessierte Cytokeratin- Pseudogene in Form genomischer DNA enthalten sind. Die PCR kann unter üblichen Bedingungen durchgeführt werden. Es werden Primer erhalten, die eine größere Affinität zur cDNA von Cytokeratinen als zu prozessierten Cytokeratin- Pseudogenen aufweisen. Auch können die Bedingungen der PCR, wie Zeit, Temperatur, pH, Puffer, variiert werden, wodurch für jedes Primerpaar die optimalen Bedingungen ermittelt werden, unter denen es die größte Affinität zur cDNA von Cytokeratinen bzw. die kleinste Affinität zu prozessierten Cytokeratin- Pseudogenen aufweist.The cDNA obtained is subjected to a PCR, it being advantageous to use a commercially available Taq polymerase (e.g. Gibco BRL). The primers used are those which have a greater affinity for the cDNA of cytokeratins than for processed cytokeratin pseudogens. Such primers can be obtained by conventional methods. It is advantageous to proceed as follows: Primers are constructed for areas of the cDNA of cytokeratins, in particular CK18, in which the processed cytokeratin pseudogenes have differences (cf. FIG. 2). Processed cytokeratin pseudo genes or their sequences are provided by conventional methods. As an example, reference is made to the provision of processed CK18 pseudo genes described above. The primers obtained are tested for their affinity for cDNA from cytokeratins or for processed cytokeratin pseudogenes. This can be done in normal tests. For example, the primers are used in a PCR in which the cDNA of cytokeratins or processed cytokeratin pseudogens are contained in the form of genomic DNA. The PCR can be carried out under normal conditions. Primers are obtained which have a greater affinity for the cDNA of cytokeratins than for processed cytokeratin pseudogenes. The conditions of the PCR, such as time, temperature, pH, buffer, can also be varied, as a result of which the optimal conditions are determined for each pair of primers, under which it has the greatest affinity for cDNA of cytokeratins or the lowest affinity for processed cytokeratin pseudogenes .
Primer, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, stellen auch einen Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.Primers which can be used in a method according to the invention, also represent an object of the present invention.
Erfindungsgemäße Primer hinsichtlich der cDNA von CK18 sind folgende: 5'-TGCTCACCACACAGTCTGAT-3' (X), 5'-CACTTTGCCATCCAC TAGCC-3' (Y), 5'-TGGAGGACCGCTACGCCCTA-3'(X') und 5'-CCAAGGCAT CACCAAGACTA-3' (Y'). Die Position der Primer ist in Fig. 1 angegeben. Die Primer X und X' können als "upper" Primer und Y und Y' als "lower" Primer eingesetzt werden. Besonders bevorzugt sind die Primerpaare X und Y sowie X' und Y'.Primers according to the invention with regard to the CK18 cDNA are the following: 5'-TGCTCACCACACAGTCTGAT-3 '(X), 5'-CACTTTGCCATCCAC TAGCC-3' (Y), 5'-TGGAGGACCGCTACGCCCTA-3 '(X') and 5'-CCAAGGCAT CACCAAGACCAT -3 '(Y'). The position of the primers is given in Fig. 1. The primers X and X 'can be used as "upper" primers and Y and Y' as "lower" primers. The primer pairs X and Y and X 'and Y' are particularly preferred.
Zur Durchführung der PCR in einem erfindungsgemäßen Verfahren können übliche Bedingungen eingehalten werden. Vorzugsweise umfaßt der PCR-Reak tionsansatz 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2, 0,01% Gelatine, 0,25 mM jedes dNTP, 0,4-0,8 µM Primer und 5 Einheiten Taq-Poly merase pro 100 µl.Conventional conditions can be observed for carrying out the PCR in a method according to the invention. Preferably, the PCR reaction mixture comprises 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2 , 0.01% gelatin, 0.25 mM each dNTP, 0.4-0.8 µM primer and 5 units of Taq polymerase per 100 µl.
Die PCR umfaßt pro Zyklus vorzugsweise folgendes: Eine Denaturierung der DNA bei 90 bis 100°C, während 40 bis 60 Sekunden, insbesondere bei 95°C, während 50 Sekunden. Ferner eine Hybridisierung der Primer bei 40 bis 60°C, während 20 bis 40 Sekunden, insbesondere bei 54°C, während 30 Sekunden. The PCR preferably comprises the following per cycle: denaturation of the DNA at 90 to 100 ° C, for 40 to 60 seconds, especially at 95 ° C, for 50 seconds. Furthermore, a hybridization of the primers at 40 to 60 ° C, for 20 to 40 seconds, especially at 54 ° C, for 30 seconds.
Desweiteren kann die PCR-Reaktion eine initiale Denaturierung bei 90 bis 100°C, während 1 bis 2 Minuten, insbesondere bei 95°C, während 80 Sekun den und eine abschließende Extension bei 65 bis 75°C, während 30 bis 90 Sekunden, insbesonders bei 72°C, während 1 Minute umfassen.Furthermore, the PCR reaction can cause an initial denaturation at 90 to 100 ° C, for 1 to 2 minutes, especially at 95 ° C, for 80 seconds den and a final extension at 65 to 75 ° C, during 30 to 90 Seconds, especially at 72 ° C, for 1 minute.
Die Anzahl der Zyklen in der PCR kann von einem Fachmann leicht ermittelt werden. Sie kann vom Gewebe abhängig sein, aus dem die mRNA stammt. Vorzugsweise beträgt die Anzahl der Zyklen 20 bis 100, wobei ca. 30 bis 70 Zyklen für mRNA aus Blut und 40 bis 80 Zyklen für mRNA aus Knochenmark besonders bevorzugt sind.The number of cycles in the PCR can easily be determined by a person skilled in the art will. It can depend on the tissue from which the mRNA originates. The number of cycles is preferably 20 to 100, with approximately 30 to 70 Cycles for blood mRNA and 40 to 80 cycles for bone marrow mRNA are particularly preferred.
Günstig kann es sein, wenn in der PCR zwei unterschiedliche Primerpaare
verwendet werden, wobei das zweite Primerpaar "nested" Primer sind, so daß
hiermit ein kleineres DNA-Stück innerhalb des amplifizierten DNA-Stücks der
ersten PCR amplifiziert wird. Vorzugsweise umfaßt eine solche PCR-Reaktion
folgendes:
erste PCR: Primer X und Y, ca. 40 Zyklen bei 90 bis
100°C, während 40 bis 60 Sekunden, insbesondere 95°C,
während 50 Sekunden, und 40 bis 60°C, während 20 bis
40 Sekunden, insbesondere 54°C, während 30 Sekunden.
Ein Aliquot der ersten PCR wird mit dem Ansatz für die zweite PCR verdünnt,
z. B. 1 : 10-1 : 20.
zweite PCR: Primer X' und Y', 25 bis 40 Zyklen unter den Bedingungen
der ersten PCR.It can be advantageous if two different primer pairs are used in the PCR, the second primer pair being "nested" primers, so that a smaller piece of DNA is thereby amplified within the amplified DNA piece of the first PCR. Such a PCR reaction preferably comprises the following:
first PCR: primers X and Y, approx. 40 cycles at 90 to 100 ° C, for 40 to 60 seconds, in particular 95 ° C, for 50 seconds, and 40 to 60 ° C, for 20 to 40 seconds, in particular 54 ° C, for 30 seconds.
An aliquot of the first PCR is diluted with the batch for the second PCR, e.g. B. 1: 10-1: 20.
second PCR: primers X 'and Y', 25 to 40 cycles under the conditions of the first PCR.
Jede PCR kann mit einer initialen Denaturierung gestartet und mit einer ab schließenden Extension unter jeweils vorstehenden Bedingungen beendet wer den. Each PCR can be started with an initial denaturation and with an ab closing extension under the above conditions the.
Der Nachweis der amplifizierten Cytokeratin-cDNA erfolgt in üblicher Weise, z. B. durch Agarosegel-Elektrophorese mit Ethidiumbromid unter UV-Licht oder durch Southern-Blot-Hybridisierung mit für die Cytokeratin-cDNA spezifischen Sonden.The detection of the amplified cytokeratin cDNA is carried out in a conventional manner, e.g. B. by agarose gel electrophoresis with ethidium bromide under UV light or by Southern blot hybridization with probes specific for the cytokeratin cDNA.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zum Nachweis von CK18 in einer Körperprobe. Dieser Kit umfaßt Mittel zur Überset zung von mRNA in cDNA, Primer für eine PCR, Reagenzien, Lösungen, Puffer und Enzyme sowie Mittel zum Nachweis von amplifizierter DNA.Another object of the present invention is a kit for detection of CK18 in a body sample. This kit includes translation means generation of mRNA in cDNA, primer for a PCR, reagents, solutions, buffers and enzymes and means for the detection of amplified DNA.
Er umfaßt als Primer die vorstehenden Primer X, Y und/oder X', Y'.It comprises as a primer the above primers X, Y and / or X ', Y'.
Die vorliegende Erfindung weist eine Reihe von Vorteilen auf. Mit dem erfin dungsgemäßen Verfahren können geringste Mengen von CK18-RNA nachgewiesen werden. Beispielsweise ist es bei CK18-RNA möglich, Mengen nachzuweisen, die auf das Vorliegen von 1-10 Epithelzellen pro Milliliter Blut schließen lassen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist somit sehr sensitiv. Ferner werden bei ihm keine falsch positiven Ergebnisse erhalten. Es ist somit auch sehr spezifisch. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich daher bestens zum Nachweis von CK18.The present invention has a number of advantages. With the invent Methods according to the invention can use the smallest amounts of CK18-RNA be detected. For example, it is with CK18 RNA possible to detect amounts based on the presence of 1-10 epithelial cells close blood per milliliter. The method according to the invention is thus very sensitive. Furthermore, no false positive results are obtained from him. It is also very specific. The method according to the invention is suitable therefore ideal for the detection of CK18.
Fig. 1: zeigt die cDNA von CK18 und die DNA von drei prozessierten CK18-Pseudogenen. Unterschiede in den einzelnen DNAs sind angegeben. Ferner sind in der CK18-cDNA die Positionen der Pri mer X, Y, X' und Y' angegeben. Fig. 1: shows the cDNA of CK18 and the DNA of three processed CK18 pseudogenes. Differences in the individual DNAs are indicated. The positions of the primers X, Y, X 'and Y' are also given in the CK18 cDNA.
Fig. 2: zeigt einen Teilbereich der cDNA von CK18 und die entsprechen den Teilbereiche von drei prozessierten CK18-Pseudogenen sowie die Konstruktion von "upper" und "lower" Primer, wobei Nukleotid- Substitutionen in Boxen dargestellt sind. FIG. 2 shows a portion of the cDNA of CK18 and which correspond to portions of three processed CK18 pseudogenes and the construction of "upper" and "lower" primer, wherein nucleotide substitutions are shown in boxes.
Fig. 3: zeigt amplifizierte cDNAs einer PCR-Reaktion (erwartete Größe der amplifizierten cDNA: 210 bp) in einer Gelelektrophorese mit Ethidi umbromid-Färbung (0-5 : 100 bis 105 HT29-Karzinomzellen pro Milliliter peripherem Blut, N: negative Kontrolle (Wasser anstelle von Blut bei der RNA-Isolierung, H: negative Kontrolle (Wasser anstelle von RNA bei der cDNA-Synthese, B: peripheres Blut ohne Karzinomzellen). Figure 3 shows amplified cDNAs of a PCR reaction (expected size of the amplified cDNA: 210 bp). In a gel electrophoresis with ethidium bromide staining (0-5: 10 0 to 10 5 HT29 carcinoma cells per milliliter of peripheral blood, N: negative Control (water instead of blood in RNA isolation, H: negative control (water instead of RNA in cDNA synthesis, B: peripheral blood without carcinoma cells).
Fig. 4: zeigt die Untersuchung von Knochenmarksproben mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens (Ethidiumbromid-gefärbtes Gel, H: negative Kontrolle (Wasser anstelle von RNA in der cDNA-Syn these), P: positive Kontrolle (RNA von Karzinomzellen in peripherem Blut); 1: Knochenmarksprobe eines Patienten mit nicht-maligner Erkrankung (chronische Pankreatitis); 2-6: Knochenmarksproben von Patienten mit gastrointestinalem Krebs. FIG. 4 shows the analysis of bone marrow samples by means of an inventive method (ethidium bromide-stained gel H: negative control (water instead of RNA in the cDNA Syn thesis), P: positive control (RNA of carcinoma cells in peripheral blood); 1 : Bone marrow specimen from a patient with non-malignant disease (chronic pancreatitis); 2-6: Bone marrow specimen from patients with gastrointestinal cancer.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
Genomische DNA wurde gemäß einem üblichen Verfahren aus Leukozyten des peripheren Bluts isoliert und mit 30 µg/ml RNase während einer Stunde bei 37 °C behandelt. Es wurde eine PCR durchgeführt, in der zur Amplifikation von CK18-Pseudogenen folgende Primer verwendet wurden: L: 5'-ATGAGATTCAC CACTCGCTCCACCT-3' und R: 5'-ATGCCTCAGAACTTTGGTGTCATTGG- 3'. Die PCR-Reaktionsbedingungen umfaßten 32 Zyklen bei 97°C (1 Minute), eine Hybridisierungstemperatur von 62°C (2 Minuten) und einen abschließenden Extensionsschritt bei 72°C (2 Minuten), gefolgt von einer Extension bei 72°C (10 Minuten). Der PCR-Ansatz erfolgte in 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl2 0,01% Gelatine, 0,25 mM jedes dNTP's, 0,4 µM Primer und 5 Einheiten Taq-Polymerase pro 100 µl. Die amplifizierte cDNA wurde in die Klonierungsstelle des Vektors pCRII integriert. Erhaltene Klone wurden einer Restriktionsanalyse unterzogen. Es wurden drei Klone gefunden, welche die in Fig. 1 dargestellten CK18-Pseudogene enthielten.Genomic DNA was isolated from peripheral blood leukocytes according to a conventional method and treated with 30 µg / ml RNase for one hour at 37 ° C. A PCR was carried out in which the following primers were used to amplify CK18 pseudogenes: L: 5'-ATGAGATTCAC CACTCGCTCCACCT-3 'and R: 5'-ATGCCTCAGAACTTTGGTGTCATTGG-3'. The PCR reaction conditions included 32 cycles at 97 ° C (1 minute), a hybridization temperature of 62 ° C (2 minutes) and a final extension step at 72 ° C (2 minutes), followed by an extension at 72 ° C (10 minutes) ). The PCR was carried out in 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2 0.01% gelatin, 0.25 mM each dNTP, 0.4 uM primer and 5 units Taq Polymerase per 100 µl. The amplified cDNA was integrated into the cloning site of the vector pCRII. Clones obtained were subjected to restriction analysis. Three clones were found which contained the CK18 pseudogenes shown in FIG. 1.
Zellkulturen der menschlichen Kolon-Karzinom-Zellinie HT29 wurden trypsiniert, pelletiert, gewaschen, in PBS resuspendiert, gezählt und in peripherem Blut von Gesunden, enthaltend 153 mg Hämoglobin und 6 × 106 Leukozyten pro Milliliter Blut, seriell verdünnt (105 bis 100). Bei der Blutentnahme wurde darauf geachtet, keine Kontamination durch Epithelzellen der Haut zu verursachen, indem die ersten Milliliter entnommenen Blutes verworfen wurden. RNA wurde aus dem Blut bzw. den Blut-HT29-Verdünnungen in üblicher Weise mit dem Guanidinium- Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren extrahiert. Ferner wurde die RNA- Präparation mit DNAse inkubiert (40 Einheiten pro 400 µl mit 10 Einheiten RNAse-Inhibitor in 5 mM MgSO4 bei 25°C). Das Enzym wurde danach bei 90°C während 5 Minuten inaktiviert. Getrocknete RNA von 0,5 ml Blut bzw. Blut- HT29-Verdünnungen wurde in 80 µl TE resuspendiert. Diese RNA wurde einer reversen Transkription unterzogen, in der "random hexamer" Primer verwendet wurden. Es wurde cDNA erhalten. Diese wurde einer "nested" PCR unterzogen, in der "nested" Primer als zweites Primerpaar verwendet wurden. Der erste PCR- Ansatz (100 µl) umfaßte 10 µl cDNA und jeweils 0,8 µM der Primer 5'- TGC TCACCACACAGTCTGAT-3' (X) und 5'-CACTTTGCCATCCACTAGCC-3' (Y). 40 Zyklen wurden bei 95°C (50 Sekunden) und 54°C (30 Sekunden)) durchge führt. 7 µl dieses Ansatzes wurden in einen zweiten PCR-Ansatz (100 µl) gege ben, der jeweils 0,8 µM der Primer 5'-TGGAGGACCGCTACGCCCTA-3' (X') und 5'-CCAAGGCATCACCAAGACTA-3' (Y') enthielt. Ferner wurde jede PCR mit einer initialen Denaturierung von 80 Sekunden bei 95°C gestartet und mit einer abschließenden Extension während 1 Minute bei 72°C beendet. Amplifizierte cDNA wurde einer Gelelektrophorese unterzogen, um Größe und Menge der amplifizierten cDNA abzuschätzen. Cell cultures of the human colon carcinoma cell line HT29 were trypsinized, pelleted, washed, resuspended in PBS, counted and serially diluted in healthy blood containing 153 mg hemoglobin and 6 × 10 6 leukocytes per milliliter of blood (10 5 to 10 0 ). When taking blood, care was taken not to cause contamination by skin epithelial cells by discarding the first milliliters of blood drawn. RNA was extracted from the blood or the blood HT29 dilutions in a conventional manner using the guanidinium-thiocyanate-phenol-chloroform method. The RNA preparation was also incubated with DNAse (40 units per 400 μl with 10 units of RNAse inhibitor in 5 mM MgSO 4 at 25 ° C.). The enzyme was then inactivated at 90 ° C for 5 minutes. Dried RNA from 0.5 ml blood or blood HT29 dilutions was resuspended in 80 μl TE. This RNA was subjected to reverse transcription using "random hexamer" primers. CDNA was obtained. This was subjected to a "nested" PCR, in which "nested" primers were used as the second pair of primers. The first PCR approach (100 µl) comprised 10 µl cDNA and 0.8 µM each of the primers 5'-TGC TCACCACACAGTCTGAT-3 '(X) and 5'-CACTTTGCCATCCACTAGCC-3' (Y). 40 cycles were performed at 95 ° C (50 seconds) and 54 ° C (30 seconds)). 7 µl of this mixture were added to a second PCR mixture (100 µl), each containing 0.8 µM of the primers 5'-TGGAGGACCGCTACGCCCTA-3 '(X') and 5'-CCAAGGCATCACCAAGACTA-3 '(Y') . Furthermore, each PCR was started with an initial denaturation of 80 seconds at 95 ° C. and ended with a final extension for 1 minute at 72 ° C. Amplified cDNA was subjected to gel electrophoresis to estimate the size and amount of the amplified cDNA.
Aus Fig. 3 geht hervor, daß in peripherem Blut CK18 in einer Menge nachgewie sen werden konnte, die auf 1 bis 10 Zellen der Kolonkarzinom-Zellinie HT 29 pro Milliliter Blut schließen läßt. Ferner geht aus Fig. 3 hervor, daß im Blut von Gesunden ohne Zusatz von Epithelzellen kein CK18 nachgewiesen werden konnte.From Fig. 3 it can be seen that CK18 could be detected in peripheral blood in an amount which suggests 1 to 10 cells of the colon carcinoma cell line HT 29 per milliliter of blood. It is also apparent from FIG. 3 that could be detected in the blood of healthy persons without the addition of epithelial cells not CK18.
Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren spezifisch und sensitiv für Cytokerati ne, z. B. CK18.The method according to the invention is thus specific and sensitive to cytokerati no, e.g. B. CK18.
Knochenmarksproben von fünf Patienten, die an einem Tumor der Speiseröhre, des Magens oder der Lunge litten, und eines Patienten mit einer gutartigen Er krankung (chronische Pankreatitis) wurden entnommen. Es wurde ein erfin dungsgemäßes Verfahren (vgl. Beispiel 2) durchgeführt.Bone marrow samples from five patients suffering from an esophageal tumor, of the stomach or lungs, and a patient with a benign er disease (chronic pancreatitis) were removed. It was invented process according to the invention (cf. Example 2).
Aus Fig. 4 geht hervor, daß drei der fünf Tumorpatientenproben positiv für CK18 waren. Die Probe von dem an einer chronischen Pankreatitis leidenden Patienten war negativ für CK18. Figure 4 shows that three of the five tumor patient samples were positive for CK18. The sample from the patient suffering from chronic pancreatitis was negative for CK18.
Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um in Patien tenproben spezifisch, d. h. ohne durch genomische DNA verursachte falsch positive Ergebnisse, und sensitiv Cytokeratin, z. B. CK18, nachzuweisen.Thus, the method according to the invention can be used to treat patients specific samples, d. H. without being wrong caused by genomic DNA positive results, and sensitive cytokeratin, e.g. B. CK18.
Claims (6)
- a) Entnahme und Aufbereitung einer Körperprobe,
- b) Isolierung von mRNA aus der Körperprobe,
- c) Übersetzung der mRNA in cDNA durch eine reverse Transkription,
- d) Amplifikation der cDNA durch eine PCR mit Primern, die eine größere Affinität zur cDNA von CK18 als zu prozessierten CK18-Pseudogenen aufweisen, und
- e) Nachweis der amplifizierten cDNA,
- a) taking and preparing a body sample,
- b) isolation of mRNA from the body sample,
- c) translation of the mRNA into cDNA by reverse transcription,
- d) amplification of the cDNA by a PCR with primers which have a greater affinity for the cDNA of CK18 than for processed CK18 pseudogenes, and
- e) detection of the amplified cDNA,
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