DE19715153A1

DE19715153A1 - Ferromagnetische Supporte für die Immobilisierung von Biomaterialien

Info

Publication number: DE19715153A1
Application number: DE1997115153
Authority: DE
Inventors: Peter-Juergen Dr Rer N Mueller; Joerg-Hermann Dr Rer Ozegowski; Wolfgang Dipl Ing Liebisch; Bernd Noack; Christel Dr Kummer
Original assignee: VTI THUERINGER VERFAHRENSTECHN; Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Vitrabio GmbH
Priority date: 1997-04-11
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 1998-10-15
Anticipated expiration: 2017-04-12
Also published as: DE19715153B4

Description

Der Einsatz der magnetischen partikelförmigen Supporte für die Immobilisierung von Biomaterialien wie Enzymen, bioaffinen Molekülen und Mikroorganismen bzw. Organellen (zusammengefaßt als Biomaterialien) gibt die Möglichkeit einer mechanischer Beeinflussung von an sich nicht magnetischen Biomaterialien über magnetische Felder. Die magnetischen Partikel dienen hierbei zur Übertragung magnetischer Kräfte auf die an ihnen immobilisierten Biomaterialien. Mit dem magnetischen Feld können die Partikel in einem Stoffstrom stabilisiert, transportiert und fluidisiert bzw. in Reaktoren ein- und ausgetragen werden (Magnetoprozesse). Die magnetischen Partikel können in folgenden Gebieten angewendet werden: Affinitätschromatografie, enzymatische Reaktionen und Reaktionen mit Zellen und Organellen, Reinigungs- und Konzentrierungsschritte, in situ-Gewinnung von Stoffen aus Fermentationen und Sortieren von Zellen. Die Möglichkeit der Übertragung der magnetischen Kräfte auf die nichtmagnetischen Biomaterialien ist eine entscheidende technische Voraussetzung für eine effektive und zukunftsträchtige Gestaltung von Bioprozessen und chemischen Prozessen.

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit magnetischen Partikeln, die bevorzugt in Magnetoprozessen der Stoffwandlung und Adsorption eingesetzt werden sollen. Die Erfindung kann in der chemischen, pharmazeutischen und biotechnischen Industrie genutzt werden. Bereits vorgeschlagen wurden technische Anwendungen beispiels weise bei der Lactosehydrolyse in Milch zu Glucose und Galactose, der Kasein hydrolyse, der enzymatischen Oxydation von Glucose zu Gluconsäure, der Ester hydrolyse und Esterbildung mit immobilisierter Lipase, bei der Herstellung von Invertzucker, bei der Stärkehydrolyse, bei der Ethanolproduktion mit immobilisierten Hefezellen und zum Abbau von Schadstoffen mit immobilisierten Bakterien. Die Anwendung zur Affinitätsadsorption betrifft beispielsweise die Enzymisolierung über immobilisierte Enzyminhibitoren z. B. unter Anwendung des Sojabohnentrypsininhibitors zur selektiven Enzymbindung. Concanavalin A-Magne tit wurde eingesetzt, um Hefen selektiv zu binden.

Zusammenfassende Darstellungen zu Magnetoprozessen geben G. Moffat, R. A. Williams, C. Webb, and R. Stirling, 1994. Selective separation in environmental and industrial processing using magnetic carrier technology. Minerals engineering, 7, 1039-1050; Halling, P.J. and Dunhill, P., 1979. Magnetic supports for immobilized enzymes & bioaffinity adsorption: trypsin binding by immobilized soyabean inhibitor. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 6, 195; I. Safarik, M. Safarikova, and S. J. Forsythe, 1995. The application of magnetic separations in applied microbiology. J. Appl. Bacteriol. 78, 575-585.

Bisher wurden magnetische partikuläre Supporte nur im Labor- und Pilotmaßstab erprobt. Ein Grund für das Nichtvorhandensein großvolumiger industrieller Magneto prozesse ist das Fehlen von kostengünstigen magnetischen Supporten.

Charakteristik des Standes der Technik

Da anorganische magnetischen Materialien praktisch keine aktiven funktionellen Gruppen für die Bindung der Biomaterialien aufweisen, müssen sie in der Regel durch Konditionierungsreaktionen mit entsprechend aktiven Gruppen versehen werden. Eine Ausnahme hiervon stellen Biomaterialien dar, die direkt von den Supporten adsorbiert werden.

Die Auswahl geeigneter magnetischer Partikel richtet sich nach dem jeweiligen technischen Prozeß. Es existieren einmal anorganische mikroporöse Partikel, an deren äußeren und inneren Oberflächen besonders viel Biomaterial gebunden werden können. Sie werden beispielsweise aus magnetischen Oxiden oder magnetischen Metallpulver zusammen mit Metalloxiden, die eine mikroporöse Matrix bilden, durch Calcinieren hergestellt und stellen einen Verbundwerkstoff dar (US 4,343,901). Die im Inneren liegenden Poren sind aber wegen der längeren Diffusionswege, besonders nach Beschichtung, weniger wirksam. Da sie zudem während des Prozesses durch Anlagerung quellbarer Materialien (Fouling) leicht verstopfen und auch die mechanische Stabilität wegen der porösen Struktur oft nicht ausreichend ist, sind Teilchen mit kompakter, nichtporöser Struktur für technische Prozesse interessant, obwohl ihre wirksame Oberfläche wesentlich geringer ist. Die hoch porösen als auch die nichtporösen Teilchen haben in der Regel Durchmesser von zwischen 1 und 1000 µm.

Andere Auswahlkriterien bevorzugen sehr kleine Teilchen mit Durchmessern im nm-Bereich, die eine, bezogen auf vergleichbare Gewichte, viel größere Oberflächen aufweisen und überraschend viel Biomaterial binden können. Der Einsatz der sehr kleinen Teilchen ist in technischen Prozessen aber nicht realisierbar, weil sie aus den oft viskose und kolloidale Substanzen enthaltenden Reaktionslösungen, besonders bei kontinuierlichen Verfahren, nur mit sehr starken Magnetfeldern separierbar sind.

Andere, bereits im Handel befindliche magnetische Partikel vom Typ eines Verbundwerkstoffes haben einen schalenförmigen Aufbau. Sie bestehen aus einem kompakten magnetischen Kern, z. B. aus Nickel oder aus Magnetit, der von einer porösen oder auch nicht porösen Matrix umgeben ist. Andere Partikel bestehen aus einer Matrix, die eine Vielzahl kleinerer magnetischer Partikel in aggregierter Form enthält. Wieder andere sind nur an der Oberfläche mit sehr kleinen magnetischen Teilchen bedeckt (U.S. 4,177,253).

Häufig wird die äußere Oberfläche der Aggregate zur Bindung der Biomaterialien genutzt. Durch eine poröse Matrix, beispielsweise aus porösen Kunststoffen wie Polyethylenglycol, Polymethylmethacrylat, Polyvinylalkohol oder mit Polyacrylamid und Alginat in Gelform können die Bindungseigenschaften erhöht werden (PCT 90/12773, Micro-particules for immobilising macromolecules). Sie sind aber auf Grund ihrer aufwendigen Herstellung nur in kleinvolumigen Umsetzungen einsetzbar, unterliegen leicht Fouling-Prozessen bzw. weisen eine eingeschränkte mechanische Stabilität auf.

Um die Nachteile der sehr kleinen Supporte als auch der größeren mikroporös und schalenförmig aufgebauten Supporte zu umgehen, werden für technische Anwendungen daher stabile, weitgehend nichtporöse oder wenig poröse Teilchen mit Durchmessern zwischen 1-500 µm empfohlen. Die aktiven Biomaterialien, z. B. Enzyme, sind hierbei vorwiegend an die Oberfläche gebunden. Auf Grund ihrer exponierten Lage werden sie bei kompakten glatten Oberflächen, wie sie beim Mahlen von mineralischem Magnetit gebildet werden, durch mechanische Einflüsse relativ leicht inaktiviert oder entfernt. Nicht zuletzt wegen des niedrigen Preises werden aber gemahlener mineralischer ferromagnetischer Magnetit für Immobilisierung vorgeschlagen (Sambamurthy, K. and Vijaya, M., Applied Microb. Biotech., 1987, 2, 15-21) oder auch synthetischer Magnetit (Matsunaga, T. And Kamiya, S. M., Appl. Microb. Biotech. 1987, 26, 328-332; Munro, P.A., Dunhill, P. and Lilly, M. D., 1977. Nonporous magnetic materials as enzyme supports: studies with immobilized chymotrypsin. Biotech. & Bioeng., XIX, 101). Biomagnetit aus Mikroorganismen, welches als Support ebenfalls vorgeschlagen wurde, ist zu klein dimensioniert und zu preisaufwendig (Matsunaga, T. and Kamiya, S., 1987. Use of magnetic particles isolated from magnetotatic bacteria for enzyme immobilisation. Appl. Microbiol. Biotechnol., 26, 328-332).

Ideal für technische Magnetoprozesse erscheinen ferromagnetische Partikel, die bei Teilchengrößen zwischen 1-500 µm einen möglichst hohen Anteil von nichtverstopfenden größeren Poren und somit eine ausreichende Oberfläche, eine hohe Magnetisierbarkeit, eine hohe mechanische Stabilität und Abrasionstestigkeit, eine gleiche Größenverteilung und Form und einen geringen Restmagnetismus nach Abschalten des Magnetfeldes aufweisen und chemisch inert sind. Für bestimmte Anwendungen, beispielsweise bei hohen Durchströmgeschwindigkeiten viskoser Flüssigkeiten entgegen der Schwerkraft, werden Partikel mit hoher Dichte bevorzugt. Für andere Anwendungen soll die Dichte geringer als die des Magnetits sein. Weiterhin sollten sie auf einfachem Weg kostengünstig in ausreichend großen Mengen herstellbar sein. Partikel mit solchen Eigenschaften sind zur Zeit nicht bekannt.

Zur Bindung der aktiven Biomaterialien und von Makromolekülen an das anorganische Magnetit wurden folgende Vorgehensweisen in der Literatur beschrieben:

1. Die Biomaterialien, insbesondere Glycoproteine wie Invertase, aber auch Polysaccharide wie Mannanderivate, Stärke oder Glycogen werden relativ fest durch Adsorption an poröse Magnetitpartikel gebunden und gegebenenfalls mit chemischen Vernetzern wie beispielsweise Glutaraldehyd vernetzt.
2. Auf den Partikeln werden nichtspezifische Proteine, wie Albumin, Hühnereiweiß oder auch polyanionische Verbindungen wie Carragenan, Agarose, Hyaluronsäure, Glycosaminoglycane, Chitinderivate oder Pektin adsorbiert oder aufgelagert und anschließend mit Vernetzern chemisch vernetzt. An die vernetzten Polymerschichten werden entweder über überschüssige, nicht abgesättigte sehr reaktiven Gruppen aus den Vernetzern und/oder durch Herstellen zusätzlicher Bindungen zu den Hydroxyl-, Carboxyl- und Aminogruppen der Polymerschichten unter Einsatz von aktivierenden Chemikalien (bzw. von Vernetzern) die aktiven Biomaterialien über kovalente Bindungen immobilisiert. Sulfatgruppen enthaltende polyanionische Verbindungen können auch durch Zugabe von Kationen, beispielsweise von Calciumionen, gehärtet werden.
3. Die anorganischen Partikel werden mit Chemikalien behandelt, durch die reaktive funktionelle Gruppen, insbesondere Aminogruppen auf den Partikeln aufgebracht werden. Beispielsweise wird durch Silanisierung mit speziellen Aminosilanen eine Bindung zwischen den OH-Gruppen der anorganischen Partikel (Silikate oder Magnetit) hergestellt, wobei eine erste Sphäre reaktiver Gruppen, hier Aminogruppen, entsteht. Diese werden beispielsweise mit einem Dialdehyd versetzt, von dem eine Aldehydgruppe mit den Aminogruppen reagiert und die zweite Aldehydgruppe eine zweite Sphäre einer besonders aktiven funktionellen Gruppe bildet, die mit Proteinen unter schonenden Bedingungen reagiert.
Wenn Glutaraldehyd bei alkalischen pH-Werten mit Aminosilanen behandeltem Magnetit versetzt wird, entsteht eine unlösliche Polyglutaraldehydschicht, in der noch freie, sehr reaktive Aldehydgruppen für die Proteinbindung vorhanden sind (Margel, S., Zisbalt, S. & Rembaum, A., 1979. Polyglutaraldehyde: a new reagent for coupling of proteins to microspheres and for labelling cell surface receptors (II). Immunol. Methods, 28, 341).
Häufig ist es günstig, wenn zwischen der Immobilisierungsmatrix und dem aktiven Biomaterial sich ein längerer, leicht beweglicher Kettenabschnitt (Spacer) befindet. Dies führt wegen der erhöhten Beweglichkeit des aktiven Biomaterials, beispielsweise eines Enzyms, häufig zu einer Aktivitätserhöhung. Wenn Glycidoxypropyltrimethoxysilan, welches die sehr reaktive Epoxygruppe enthält, anstelle der Aminosilane eingesetzt wird, kann die reaktive Gruppe beispielsweise mit dem langgestreckten Molekül Polyethylenglycol umgesetzt werden. Die freie endständige OH-Gruppe des Glycols wird dann mit Bromcyan aktiviert und die aktivierte Verbindung mit einem Enzym umgesetzt. Das Polyethylenglycol erhöht auf Grund seiner Länge die Beweglichkeit und damit der Aktivität der an ihm kovalent gebundenen Enzyme. Auch wird die Reaktivität in organischen Lösemitteln erhöht, wie beispielsweise bei Einsatz von Lipase als aktivem Biomaterial nachgewiesen wurde (Y. Inada, K. Takahashi, T. Yoshimoto, Y. Kodera, A. Matsushima and Y. Saito, 1988. Application of PEG-enzyme and magnetite-PEG-en zyme conjugates for biotechnological processes. TIBTECH 6, 131-134).
Besonders kostengünstig ist die Beschichtung des anorganischen Supports mit Polyethylenimin, Tetraethylenpentamin, Ethylendiamin, Diethylentriamin, Triethylen tetraamin, Pentaethylenhexamin, Hexamethylendiamin und Phenylendiamin bei alkalischen pH-Werten und anschließender Vernetzung mit Dialdehyden wie Glutaraldehyd, Succindialdehyd, Terephthaldehyd sowie Toluoldiisocyanat. Es bildet sich ein polymeres Netzwerk um den Support, welches noch aktive Aldehydgruppen enthält an die aktiven Biomaterialien gebunden werden können (Decker, B. R. 1989. Immobilization of a lactase onto a magnetic support by covalent attachment to polyethylenimine-glutaraldehyde-activated magnetite. Appl. Biochem. & Biotech., 22, 289-310; Pieters and G. Bardeletti, 1992. Enzyme immobilization on a low-cost magnetic support: Kinetic studies on immobilized and coimmobilized glucose oxydase and glucoamylase. Enzyme Microb. Technol., 14, 361-370).
Die freien Aldehydgruppen können weiterhin mit Hexamethylendiamin gegen Aminogruppen ausgetauscht werden. Die Doppelbindungen der entstehenden Schiff'schen Basen werden beispielsweise zur Stabilisierung mit Natriumborhydrid reduziert. Anschließend erfolgt eine Aktivierung mit Glutaraldehyd und Bindung des aktiven Biomaterials.
4. Durch die Bildung von Übergangsmetall-Brücken an den Partikeln, über welche die Enzyme bzw. Proteine durch Chelatbindung gebunden werden.
5. Durch Verkapseln magnetischer Partikel in einer Polymermatrix. An diese Matrix werden die aktiven Biomaterialien kovalent gekoppelt. Die Polymermatrix kann die magnetischen Partikel in größerer Anzahl enthalten. Die Bindung an eine Polymermatrix aus Polyacrylsäure kann beispielsweise über ein Hydrazidderivat erfolgen, welches durch Behandlung der Amidgruppe mit Hydroxylamin und salpetriger Säure hergestellt wird. Durch Umsetzung mit der Aminogruppe eines Biomaterials entsteht eine kovalenter Bindung.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, ein auf einfachem Weg in großen Mengen gewinnbares, kostengünstiges Partikelmaterial als Immobilisierungssupport für den Einsatz bei Magnetoprozessen in entsprechend technisch ausgerüsteten Reaktoren vorzuschlagen, mit dem die Nachteile bekannter mikroporöser, schalenförmig aufgebauter oder vollständig kompakter magnetischer Partikel umgangen werden. Weiterhin soll das Material durch Konditionierungsmethoden in eine zur Immobilisierung von bioaktiven Materialien geeignete Form umgewandelt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ferromagnetische, wenig poröse, chemisch inerte Partikel mit Durchmessern zwischen 1-1000 µm, bevorzugt 1-360 µm, zu gewinnen und diese durch adäquate chemische Behandlungen zur Immobilisierung von aktiven Biomaterialien wie Makromoleküle, Biokatalysatoren, Moleküle mit bioaffinen Eigenschaften, und/oder Mikroorganismen, tierische Zellen oder Organellen und/oder Makromoleküle nichtbiologischer Herkunft zu konditionieren und in Magnetoprozessen einzusetzen. Die magnetischen Partikel dienen zur Übertragung magnetischer Kräfte auf die an ihnen immobilisierten Biomaterialien. Mit dem magnetischen Feld können die Partikel in einem Stoffstrom stabilisiert, transportiert, bewegt und fluidisiert bzw. in Reaktoren ein- und ausgetragen werden (Magnetoprozesse). In solchen Magnetoprozessen werden in an sich bekannter Weise die ferromagnetischen, wenig porösen und chemisch inerten Partikel mit entsprechenden Reaktionslösungen in Kontakt gebracht und insbesondere chemische Umsetzungen bzw. adsorptive Vorgänge bewerkstelligt.

Erfindungsgemäß wurde gefunden, daß an ferromagnetischen, wenig porösen Partikeln, die in Aschen und Flugaschen, welche bei der Verbrennung von Kohle, wie Braunkohle, insbesondere von eisenreicher Braunkohle, in Verbrennungsanlagen auftreten (besonders bevorzugt sind Flugaschen aus Abscheidern in Kohleverbrennungsanlagen), nach Gewinnung, Reinigungsschritten, Behandlung mit verdünnten Säuren und chemischer Konditionierung durch Aufbringen von reaktiven funktionellen chemischen Gruppen aktive Biomaterialien sehr effektiv immobilisiert werden und diese Partikel in Magnetoprozessen eingesetzt werden können.

Die erfindungsgemäße Lösung besteht demnach in der Verwendung von ferro magnetischen, wenig porösen Partikeln als Supporte für die Immobilisierung von aktiven Biomaterialien und/oder aktiven Materialien nichtbiologischer Herkunft bei der Durchführung von Magnetoprozessen, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Partikeln um solche aus Aschen und Flugaschen handelt, die bei der Verbrennung von Kohle in Verbrennungsanlagen auftreten, die durch Anwendung von Magnetscheidung aus diesen gewonnen, mit verdünnter Säure, insbesondere Mineralsäure, behandelt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und gegebenenfalls nach der Größe klassifiziert und durch Aufbringen von reaktiven chemischen Gruppen konditioniert wurden.

Die für Immobilisierungzwecke besonders geeigneten ferromagnetischen Partikel sind in einem Mengenverhältnis von 2-12% je nach Herkunft der Kohle in den Aschen vorhanden. Die Partikel können beispielsweise mit Hilfe von Magnetscheidungsverfahren in Form eines ferromagnetisches schwarzen Pulver gewonnen werden. Vorteilhaft ist die Gewinnung direkt aus dem in den Abscheidern fließenden Aschestrom.

Die gewonnenen Partikel bestehen aus einem porösen, mehr oder weniger netzförmigen Aluminiumsilikatgrundgerüst mit annähernder Kugelform, auf welches fein verteiltes tröpfchenförmiges oder auch schollenförmiges Magnetit aufge schmolzen und eingelagert ist. Das Magnetitpulver hat einen hohen Gehalt an basisch reagierenden Substanzen wie z. B. Calciumoxid und enthält Eisensulfide. Durch Säurebehandlung mit verdünnten Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Salpetersäure, beispielsweise mit verdünnten 0,5 bis 2,0 N, insbesondere 1,2 N, Mineralsäuren, werden diese Bestandteile vollständig entfernt.

Mit einem Magneten werden die Partikel von der flüssigen Phase getrennt.

Die nachfolgend aufgeführte Auswahl von weiteren Reinigungs-, Klassifizierungs- und Konditionierungs- bzw. Immobilisierungsbeispielen dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen sie aber in keiner Weise beschränken.

Nach den in beliebiger Reihenfolge durchgeführten Schritten der weitgehenden mechanischen Reinigung von anhaftenden nichtmagnetischen Aschebestandteilen, einem oder mehrerer Waschprozesse, gefolgt von Säurebehandlungen zur Entfernung säurelöslicher Bestandteile und gegebenenfalls einer Korngrößen- Klassifizierung mit Sieben werden die gewonnenen ferromagnetischen Partikel mit chemischen Methoden konditioniert. Die Konditionierung hat das Ziel, reaktive Gruppen für die Immobilisierung auf dem Silikat bzw. Magnetit zu plazieren, an die mit an sich bekannten Methoden aktive Biomaterialien immobilisiert werden.

Die Partikel werden beispielsweise in eine Matrix eines Polymers oder Biopolymers eingeschlossen, welche zur Bindung der Biomoleküle dient. Als Polymer kann z. B. Polyacrylamid oder Acrylat/Ester Copolymere durch Polymerisation auf die Partikel aufgebracht werden oder ein Biopolymer eingesetzt werden. Das Biopolymer kann z. B. ein Polysaccharid wie Agar, Carrageenan oder Pektin oder auch ein Protein wie Kasein oder Albumin oder auch das Biomaterial selbst sein, welches auf die ferromagnetischen Partikel aufgebracht und durch vernetzende Chemikalien gehärtet wird. Vernetzende Chemikalien können Hydrazid-, Azido-, Amino-, Imino-, Epoxy-, Glycid-, Isocyano- oder Aldehydgruppen, beispielsweise Aldehyde und Dialdehyde oder Dihydrazide mit 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthaltenden Kettenabschnitten zwischen den Aldehydgruppen, wie Glutaraldehyd, oder Adipindihydrazid, enthalten. In einer anderen Ausführung werden Verbindungen vom Typ der Aminosilane, beispielsweise 3-Aminopropyltriethoxysilan oder p-Amino phenyltrimethoxysilan, eingesetzt, welche über die Silangruppe mit den OH-Grup pen der ferromagnetischen Partikel reagieren und zu einer Beladung der Partikeloberfläche mit reaktiven Aminogruppen führen. Diese können direkt mit Dialdehyden mit dem Biomaterial verbunden werden.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsvariante werden Verbindungen, die Aminogruppen enthalten, beispielsweise Polyethylenimin oder Hexamethylendiamin, auf die Partikeloberflächen aufgebracht und mit Dialdehyden, z. B. Glutardialdehyd, vernetzt.

Aktive Biomaterialien können Makromoleküle, Biokatalysatoren, Moleküle mit bioaffinen Eigenschaften, und/oder Mikroorganismen, tierische Zellen oder Organellen sein. Als Biokatalysatoren werden z. B. Enzyme vom Reaktionstyp einer Hyaluronidase, Glukoseoxydase, Peroxidase, Lipase, Glucoamylase, Glucoseisomerase, Lactase, Laccase, Cellulase, Urease, Histinase, Trypsin, Papain, Hexokinase, Chymotrypsin, Acylase, Esterase, Invertase, Lysozym, Pepsin, Rennin, Xylanase, β-Amylase, Asparaginase, Chosteroloxydase, Alkoholdehydrogenase, Aminosäureoxydase, Kollagenase, Arginase, Katalase und Nukleasen immobilisiert; immobilisierbare Mikroorganismen sind beispielsweise Bakterien und Hefen; weiterhin können tierische Zellen oder Zellorganellen und polyklonale und monoklonale Antikörper, Lectine, Agglutine an die Partikel immobilisiert werden. Materialien (Makromoleküle) nichtbiologischer Herkunft sind beispielsweise Polymere mit Ionenaustauscher-, Adsorptions- oder chemischen Bindungseigenschaften für die zu gewinnenden Substanzen.

Wenn bei der Säurebehandlung anstelle der verdünnten (z. B. 1,2 N) Salzsäure eine konzentriertere Salzsäure angewendet wird, löst sich ein steigender Anteil des Magnetits und die magnetische Suszeptibilität sinkt ab, während die Zahl und Volumina der Poren ansteigt. Eine Behandlung mit 65% Salpetersäure führt ebenfalls zu einem langsamen Auflösen des Magnetits.

Die Dichte der mit verdünnter Säure behandelten Partikel liegt mit 3,4 bis 4,3 g/cm³ unter der Dichte von reinem Magnetit mit 5,2 g/cm³. Sie besitzen Hohlräume mit einem Porendurchmesser im Bereich von etwa 0,1 bis 10 µm. Die mikroporöse spezifische Oberfläche der mit verdünnter Säure geätzter Proben beträgt etwa 0,5 bis 1,2 m²/g ("wenig porös"), das Porenvolumen 100 bis 240 µm³/g und der durchschnittliche Durchmesser der Poren liegt bei 1,2-1,4 µm. Partikel aus Braunkohlen unterscheiden sich in Form und Farbe nicht oder nur sehr wenig von denen aus Steinkohle. In der Größenverteilung der Partikel in Massenprozent sind zwei Maxima zu erkennen, eines befindet sich bei 130 µm, das andere bei 20-40 µm Durchmesser. Durch Sieben der trockenen Partikel werden zwei Haupt fraktionen gewonnenen, von denen eine Durchmesser zwischen 1 µm bis 80 µm aufweist und die andere Durchmesser zwischen 80 µm-360 µm.

Günstig erweist sich die wenig poröse Struktur der Partikel, die Fouling-Prozessen nur wenig unterworfen sind. Sie erhöhen die mechanische Stabilität der Bindung der Biomaterialien an die anorganische Oberfläche und verringern durch die Existenz geschützter Nischen die Abrasion der immobilisierten Biomaterialien durch mechanische Einflüsse. Der inhomogene, einem Verbundwerkstoff ähnliche Aufbau der Partikel erhöht die Möglichkeit, nicht nur über OH-Gruppen des Magnetits, sondern auch über die zahlreichen aluminosilikatischen OH-Gruppen chemische Bindungen einzugehen. Dieses führt zu einer etwa 10-20%igen höheren Bindung von Enzymen als bei vergleichbar großen kompakten mineralischen Magnetitpartikeln. Die vorteilhaften größeren Poren sind bei elektronenoptischer Betrachtung erkennbar. Teilweise liegen auch mehr oder weniger hohle Kugeln vor. Durch die Belegung der Makroporen mit immobilisiertem Biomaterial wird dieses vor dem mechanischen Abscheren im Reaktor geschützt.

Weiterhin vorteilhaft an den aus der Asche gewonnenen Partikeln ist, daß ihre Massensuszeptibilität, die ein Maß für die Separierbarkeit der Teilchen mit schwachen Magnetfeldern ist, etwa 10 bis 20% bei niedrigen Flußdichten (0,2 Tesla) und bei höheren Flußdichten (1,0 Tesla) bis zu 40% aber der des natürlichen Magnetiterzes liegt (Abb. 1).

Weiterhin ist der nach Entfernen des Magnetfeldes an den Partikeln verbleibende Restmagnetismus so gering, daß praktisch keine Partikelagglomerationen entstehen. Die Partikel haben superparamagnetische Eigenschaften und bilden bei Abwesenheit eines magnetischen Feldes im gerührten Reaktor eine homogene Suspension.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Durchführung von Magnetoprozessen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ferromagnetische, wenig poröse Partikel in einem Reaktionsraum mit einer entsprechender Reaktionslösung umgesetzt werden, wobei zur Stabilisierung, für den Transport, Ein- und Austragungsschritte bzw. zur Fluidisierung ein magnetisches Feld angelegt wird, und es sich bei den Partikeln um solche aus Aschen und Flugaschen handelt, die bei der Verbrennung von Kohle in Verbrennungsanlagen auftreten, die durch Anwendung von Magnetscheidung aus diesen gewonnen, mit verdünnter Säure behandelt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und gegebenenfalls nach der Größe klassifiziert und durch Aufbringen von reaktiven chemischen Gruppen konditioniert wurden und daran immobilisierte, aktive Biomaterialien und/oder aktive Materialien nichtbiologischer Herkunft tragen.

Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung erläutern, dienen aber in keiner Weise dazu, diese zu limitieren.

Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1

Mit einem Trockenmagnetscheider (SKET Magdeburg, Trommeldurchmesser 600 mm, Trommelbreite 400 mm, Permanentwechselpolen: Feldstärke ca. 850 Oe) wird Braunkohlenflugasche behandelt. Der Durchsatz beträgt 0,05 t/h, die Drehzahl 27 U/min. Es werden etwa 4% magnetische Partikel (20 kg) erhalten. Die Partikel werden in 50 l Wasser unter kräftigem Rühren suspendiert und mit Keramikpermanentmagneten aus der gerührten Suspension gesammelt. Die feuchten Partikel werden mit 30 l verdünnter Salzsäure in einem Plastefaß unter Rühren für die Dauer von drei Stunden suspendiert. Nach Dekantieren der Salzsäure wird die Behandlung mit Salzsäure wiederholt. Nach anschließenden mehrfachen Waschen mit Wasser wird an einer kleinen Probe, die noch einmal mit Salzsäure behandelt wird, keine Freisetzung von Schwefelwasserstoff bzw. von Eisenionen, erkennbar an dem Nichtvorhandensein einer auf Eisenionen zurückführbaren Gelbfärbung, nachgewiesen.

Die feuchten Partikel werden bei 150°C im Trockenofen 5 Stunden getrocknet.

Anschießend wird das rieselfähige schwarze Pulver mit Sieben in zwei Fraktionen aufgetrennt.

Eine Fraktion besitzt eine Korngrößenzusammensetzung kleiner als 80 µm, die andere größer als 80 µm.

Ausführungsbeispiel 2

10 g ferromagnetischer Partikel aus Braunkohlenflugasche mit einer Korngrößenzusammensetzung zwischen 1-80 µm, erhalten nach Ausführungs beispiel 1, werden mit 50 ml einer 10%igen Aminoethoxypropylsilanlösung, die mit 2 N Salzsäure auf pH 3,7 eingestellt worden ist, verrührt und in einem Trockenofen unter Verschluß für 5 h auf 100°C erhitzt. Danach wird der Magnetit mit 100 ml Wasser gewaschen und anschließend in einem Trockenofen bei 100°C getrocknet. Zur Aktivierung der silanisierten Oberfläche werden die 10 g Partikel für eine Stunde mit einer wäßrigen Glutaraldehydlösung bei Raumtemperatur behandelt. Nach dieser Behandlung werden die Partikel zweimal mit jeweils 50 ml 0,1 M NaHCO₃-Lösung gewaschen. Nach der letzten Waschung werden 50 mg Hyaluronidase in 15 ml 0,1 M NaHCO₃-Puffer von pH 8,3 gelöst. Diese Lösung wird zu den aktivierten Partikeln gegeben und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird die Hyaluronidaselösung abgetrennt und die Partikel werden für zwei Stunden mit 15 ml 0,1 M Ethanolaminlösung behandelt. Nach der Behandlung wird der Magnetit in Portionen mit 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer von pH 7,5 gewaschen. Nach der Waschung werden 1 g Partikel in 100 ml Azetatpuffer gegeben und nach gründlicher Durchmischung wieder abgetrennt. Danach werden die Partikel in eine Hyaluronsäurelösung gegeben, die 100 mg Hyaluronsäure/100 ml Azetatpuffer von pH 6,0 enthält und unter gutem Durchmischen für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird der Hyaluronsäuregehalt der Lösung bestimmt. Aus der Differenz wird die Menge an abgebauter Hyaluronsäure bestimmt. Sie dient als Maß für die pro Gramm Partikel gebundene Hyaluronsäureaktivität. Die partikelgebundene Hyaluronidase wird in 10%iger Glyzerinlösung aufbewahrt.

Ausführungsbeispiel 3

10 g Partikel, beschrieben in den Ausführungsbeispielen 1, werden wie im Beispiel 1 beschrieben mit Aminopropyltriethoxysilan silanisiert. Danach wird das silanisierte Material mit Azeton gewaschen und getrocknet. Von den getrockneten silanisierten Partikeln werden 1 g in 10 ml Wasser gegeben, das 50 mg des proteolytischen Enzyms MO/2 enthält. Danach wird zu der Lösung 40 mg 1 Cyclohexyl-3-(2-mor pholinoethyl)carbodiimid,methyl-p-toluolsulphonat gegeben und der pH-Wert der Lösung mit 1 N HCl auf pH 5,0 eingestellt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Danach wird das Gemisch für weitere 10 Stunden bei 4°C gehalten. Zur Aufbewahrung werden die Partikel mit der immobilisierten Metalloprotease MO/2 in 20 ml 40%ige Ammoniumsulfatlösung gegeben.

Ausführungsbeispiel 4

1 g Partikel, gereinigt entsprechend Beispiel 1, werden 10 Minuten in einer Polyethylenimin-Lösung (Molmasse 30 000-40 000 g/mol) von pH 8,5 bei Raumtemperatur 10 Minuten mit Ultraschall behandelt. Nach Entfernung des flüssigen Überstandes werden die polyethylenbeschichteten Partikel resuspendiert in 10 ml 0,2 M Borat-Puffer von pH 8,5, der 5% (w/v) Glutardialdehyd enthält. Die Suspension wird fünf Minuten mit Ultraschall behandelt, eine Stunde gerührt. Die Partikel werden anschließend zweimal mit Wasser gewaschen und bei 4°C in einem 50 mM Azetatpuffer von pH 5,5, der 0,5% Glutaraldehyd bei einer Endkonzentration von 100 mg/ml Partikel enthält, aufbewahrt.

Ausführungsbeispiel 5

Partikel (1-10 g), gereinigt entsprechend Beispiel 1, werden mit einer wäßrigen Lösung von 10% (w/v) Polyethylenimin (PEI) bei einem Verhältnis von 4 ml PEI Lösung per g Magnetit konditioniert. Die Suspension wird für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Überschüssige PEI-Lösung wird dekantiert und die Partikel werden luftgetrocknet. Das PEI-beschichtete Magnetit wird dann mit einer 25%igen (w/v) wäßrigen Glutaraldehyd-Lösung (1,5 ml/g PEI-Partikel) bei Raumtemperatur 1 Stunde belassen. Anschließend wird dekantiert und die aktivierten Partikel so lange mit Wasser gewaschen, bis das Glutaraldehyd vollständig entfernt ist. Die Partikel werden gewonnen und an der Luft getrocknet.

Ausführungsbeispiel 6

Die nach Beispiel 1 gewonnenen Partikel werden mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan unter Rückfluß in Toluol gekocht und anschließend durch dekantieren gewonnen. Die Partikel werden mit Polyethylenglycol bei pH 10 oder Polyvinylalkohol behandelt. Die erhaltenen aktivierten Partikel werden zuerst mit Bromcyan umgesetzt. Anschließend wird ein Enzym zugesetzt, welches immobilisiert werden soll.

Ausführungsbeispiel 7

Entsprechend Ausführungsbeispiel 1 behandelte Magnetitpartikel werden anschließend mit Glutaraldehyd bei alkalischen pH-Werten versetzt. Es entsteht ein Produkt mit freien Aldehydgruppen an die Proteine oder Enzyme gebunden werden.

Ausführungsbeispiel 8

10 g nach Beispiel 1 hergestellter ferromagnetischer Partikel werden bei 90°C in 100 ml einer Schmelze von 0,5 g k-Carragenan mit destilliertem Wasser gemischt. Nach 5 Minuten Rühren wird bei 80°C der flüssige Überstand dekantiert und die Partikel unter schnellem Rühren in 5°C kaltes Wasser, welches 0,3 M KCl enthält, gegeben. Die wäßrige Phase wird durch Dekantieren entfernt. Die mit einer dünnen Schicht k-Carragenan beschichteten Partikel werden anschließend durch Zugabe von 20 ml einer Pufferlösung von pH 7,0, die 0,05 M KCl und 0,3 M Phosphat und 1,6-Hexamethylendiamin bei 5°C versetzt. Anschließend werden 10 ml einer 10%igen (w/v) Glutaraldehydlösung in 0,05 Phosphatpuffer von pH 7,0 zugesetzt und 1 Stunde gerührt. Die flüssige Phase wird dann dekantiert und mit destilliertem Wasser mehrfach gewaschen. Anschließend wird ein 50 mM Azetatpuffer von pH 4,4 gewaschen. Nach Dekantieren werden 15 ml einer Glucoamylaselösung (10 000 U/ml) in 50 mM Azetatpuffer von pH 4.4 zugegeben. Die Suspension wird 2 Stunden bei 5°C gerührt. Die Partikel werden anschließend mit 50 mM Azetatpuffer von pH 4,4 gewaschen, lösliches k-Carragenan wird unter 5 minütigem Rühren mit einer 1 M Kochsalzlösung in 50 mM Azetatpuffer von pH 4,4 entfernt. Dann werden die Partikel mit 6 M Harnstofflösung versetzt und 30 Minuten in ihr belassen und anschließend erfolgt eine Waschung mit 50 mM Azetatpuffer von pH 4,5.

Die enzymbeladenen Partikel werden in einem Reaktor mit magnetisch stabilisiertem fluidisierten Bett für die Hydrolyse von Dextrin eingesetzt.

Ausführungsbeispiel 9

Jeweils 10 g Partikel aus Braunkohlenflugasche, gewonnen und gereinigt nach Beispiel 1 mit einem durchschnittlichen Durchmesser zwischen 1 und 80 µm (Partikel A) oder gemahlener mineralischer Magnetit mit einer durchschnittlichen Korngrößenzusammensetzung zwischen 1-100 µm (Partikel B) werden mit 4 M Salpetersäure kurz behandelt, anschließend mit Wasser säurefrei gewaschen und bei 400°C im Trockenofen getrocknet. Dann werden die Partikel mit 50 ml Gamma- Aminopropyltriethoxysilan 24 Stunden unter Rückfluß gekocht. Anschließend werden die Partikel A und B durch Versetzen mit einer Mischung von 50 ml einer wäßrigen 2,5%igen (v/v) Lösung von Glutaraldehyd bei Raumtemperatur zwei Stunden geschüttelt.

Jeweils 0,1 g der Partikel A und B werden in 1 ml 50 mM Natriumazetatpuffer von pH 5,2, der 60 U/ml einer Invertase enthält, 22 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wird die flüssige Phase entfernt und die Partikel dreimal mit jeweils 5 ml eines 20 mM Azetatpuffer von pH 4,5 gewaschen.

Die Invertaseaktivität der Partikel wird über die Bildung von Glukose aus einer Zuckerlösung (100 g/l) bei pH 4,5 und 55°C bestimmt. Die Messung erfolgt mit einem handelsüblichen Glukometer. 20 mg der getrockneten Partikel A und B immobilisiert mit Invertase, werden in 20 ml der Zuckerlösung suspendiert und mit einem Magnetrührwerk in der Probe ein Wirbelbett erzeugt. Nach 5, 10, 20 und 30 Minuten wird die Konzentration der entstandenen Glukose gemessen. Der Grad der Immobilisierung entspricht dem Verhältnis der immobilisierten Enzymaktivität zu der Aktivität des freien Enzyms. Es werden 12% der Invertase unter den angegebenen Bedingungen an die Partikel A und 4% an die Partikel B gebunden.

Abbildung

In Abb. 1 ist die Abhängigkeit der Massensuszeptibilität von der magnetischen Flußstärke bei Partikeln aus Braunkohlenflugasche im Vergleich zu mineralischem, kompaktem Magnetit dargestellt.

Claims

1. Verwendung von ferromagnetischen, wenig porösen Partikeln als Supporte für die Immobilisierung von aktiven Biomaterialien und/oder aktiven Materialien nichtbiologischer Herkunft bei der Durchführung von Magnetoprozessen, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Partikeln um solche aus Aschen und Flugaschen handelt, die bei der Verbrennung von Kohle in Verbrennungsanlagen auftreten, die durch Anwendung von Magnetscheidung aus diesen gewonnen, mit verdünnter Säure behandelt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und gegebenenfalls nach der Größe klassifiziert und durch Aufbringen von reaktiven chemischen Gruppen konditioniert wurden.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ferromagnetische, wenig poröse Partikel aus Aschen und Flugaschen der Braunkohlenverbrennung, insbesondere von eisenreichen Braunkohlen, eingesetzt werden.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ferromagnetische, wenig poröse Partikel aus Flugaschen, die im Abscheider für Flugasche in Kohleverbrennungsanlagen anfallen, eingesetzt werden.

4. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ferromagnetischen, wenig porösen, durch Magnetscheidung aus der Asche gewonnenen Partikel in Wasser suspendiert und anschließend durch Anwendung von magnetischen Feldern aus der Suspension separiert wurden.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die separierten, ferromagnetischen Partikel mit verdünnten Mineralsäuren, bevorzugt in einer Konzentration von 0,5-2 N, behandelt wurden und die Behandlung gegebenenfalls solange durchgeführt wurde, bis keine Eisenverbindungen mehr ausgewaschen und kein Schwefelwasserstoff mehr gebildet werden.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die ferromagnetischen, wenig porösen Partikel in getrockneter Form einer Größenklassifizierung mit Sieben unterworfen wurden.

7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die ferromagnetischen, wenig porösen Partikel Durchmesser zwischen 1 µm bis 360 µm aufweisen.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine Siebfraktion der ferromagnetischen, wenig porösen Partikel Durchmesser zwischen 1 µm und 80 µm und eine zweite Siebfraktion Durchmesser zwischen 80 µm und 360 µm aufweist.

9. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den aufgebrachten reaktiven chemischen Gruppen um Gruppen ausgewählt aus Hydrazid-, Azido-, Amino-, Imino-, Epoxy-, Isocyano- oder Aldehydgruppen handelt.

10. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ferromagnetischen, wenig porösen Partikel mit einer aus Polyethylenimin und Vernetzung mit Glutaraldehyd hergestellten Schicht bedeckt sind.

11. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ferromagnetischen, wenig porösen Partikel in einem Reaktorraum durch magnetische Felder stabilisiert, transportiert, bewegt, ein- und/oder ausgetragen oder fluidisiert werden.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die ferromagnetischen Partikeln, welche immobilisierte, aktive Biomaterialien und/oder aktive Materialien nichtbiologischer Herkunft tragen, mit einem Reaktionsmedium zusammengebracht werden.

13. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem aktiven Biomaterial um ein Enzym vom Reaktionstyp einer Hyaluronidase, Glukoseoxydase, Peroxidase, Lipase, Glucoamylase, Glucoseisomerase, Lactase, Laccase, Cellulase, Urease, Histinase, Trypsin, Papain, Hexokinase, Chymotrypsin, Acylase, Esterase, Invertase, Lysozym, Pepsin, Rennin, Xylanase, β-Amylase, Asparaginase, Chosteroloxydase, Alkoholdehydrogenase, Aminosäureoxydase, Kollagenase, Arginase, Katalase und Nukleasen handelt.

14. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem aktiven Biomaterial um einen Mikroorganismus, um tierische Zellen oder Zellorganellen handelt.

15. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem aktiven Biomaterial um polyklonale oder monoklonale Antikörper, Lectine oder Agglutine handelt.

16. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die ferromagnetischen Partikel aktive Materialien nichtbiologischer Herkunft, ausgewählt aus Polymeren mit Ionenaustauscher-, Adsorptions- oder chemischen Bindeeigenschaften handelt, tragen.