DE19712702A1

DE19712702A1 - Recovery of polyhydroxyalkanoates produced by microbial fermentation

Info

Publication number: DE19712702A1
Application number: DE1997112702
Authority: DE
Inventors: Thorsten Sembritzki; Marion Sela; Klaus Dr Metzner
Original assignee: Buna Sow Leuna Olefinverbund GmbH
Current assignee: Dow Olefinverbund GmbH
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1998-10-01

Abstract

A method for recovering polyhydroxyalkanoate (PHA) compounds produced by fermentation of microorganisms comprises mechanical breakdown of the cells, followed by removal of the cell fragments and dissolved components, then drying of the PHA-containing biomass and extraction of the PHAs with acetic acid. The novelty is that after drying, the biomass is treated for five minutes to two hours with the acetic acid at a temperature below the extraction temperature, before raising the temperature to allow extraction to take place.

Description

Das Verfahren findet Anwendung zur Gewinnung von Polyhydroxyalkanoaten (PHA) in Form von Polyhydroxybuttersäure (PHB), Polyhydroxyvaleriansäure oder Copolymeren dieser Polyhydroxyalkansäuren, welche in der Zellmasse von Mikroorganismen oder pflanzlicher Biomasse, die diese Polyhydroxyalkansäuren als innerzellulären Reservestoff akkumulieren, enthalten sind.The process is used to obtain polyhydroxyalkanoates (PHA) in the form of polyhydroxybutyric acid (PHB), polyhydroxyvaleric acid or Copolymers of these polyhydroxyalkanoic acids, which in the cell mass of Microorganisms or vegetable biomass that these polyhydroxyalkanoic acids as accumulate within the cellular reserve.

Zur Gewinnung von PHA aus der Zellmasse eines Mikroorganismus sind Lösungs- und Fällverfahren bekannt, bei denen die PHA in gelöster Form aus der Zellstruktur entfernt und von der Restbiomasse abgetrennt wird. So werden nach US 3044942 1.2-Dichlorethan im Gemisch mit Ethanol, nach EP 024810 Dichlormethan und nach US 3275610 Chloroform als Lösungsmittel für das PHA angewendet. Aus der von der Zellmasse abgetrennten PHA-haltigen Lösung wird durch geeignete Fällmittel das PHA in einer festen Form gewonnen. Nach DD 229428 erfolgt das Herauslösen von Polyhydroxybuttersäure aus der Biomasse mit Essigsäureanhydrid bei erhöhten Temperaturen, hier bei 100 bis 140°C. Aus der Polymerlösung fällt die Polyhydroxy buttersäure durch Herabsetzen der Temperatur in pulverförmigem Zustand aus. Nachteilig wirkt sich beim Umgang mit chlorierten Kohlenwasserstoffen als Lösungs mittel jedoch der damit verbundene Recycling- bzw. Entsorgungsaufwand des ver schmutzten Solvents aus. Des weiteren bedingen diese Stoffe erhöhte Anforderun gen an die Anlagengestaltung und -sicherheit. Für die Gewinnung eines farbstofffreien Polyhydroxyalkanoats wird in WO 93/23554 als gängiges Extraktionsmittel Essigsäure genannt, welche in Kombination mit Es sigsäureanhydrid bzw. unter Zusatz von 1-10% eines aliphatischen Carbonsäure anhydrids oder eines Lactons einer β-Hydroxycarbonsäure verwendet wird. Mit die sem Verfahren werden in der Praxis sehr gute Ergebnisse erzielt, jedoch sind diese abhängig von der Art der verwendeten Mikroorganismen sowie vom späteren Ein satzzweck. Das beschriebene Verfahren wurde speziell für Bakterien entwickelt, die der Gruppe PPFM (pink pigmented facultatively methylotrophic) zugeordnet werden. Neben dem Extraktionsschritt zur Gewinnung des Polymeren mußte demnach zu sätzlich eine Lösung zur Eliminierung des roten Farbstoffes gefunden werden. Dies ist bei anderen Mikroorganismen nicht unbedingt nötig.To obtain PHA from the cell mass of a microorganism, and precipitation processes are known in which the PHA in dissolved form from the cell structure is removed and separated from the residual biomass. So according to US 3044942 1,2-dichloroethane in a mixture with ethanol, according to EP 024810 dichloromethane and after US 3275610 chloroform applied as a solvent for the PHA. From that of the cell mass separated PHA-containing solution is by suitable precipitants the PHA obtained in a solid form. Removal takes place according to DD 229428 of polyhydroxybutyric acid from the biomass with acetic anhydride at elevated Temperatures, here at 100 to 140 ° C. The polyhydroxy falls out of the polymer solution butyric acid by lowering the temperature in powdered state. A disadvantageous effect when handling chlorinated hydrocarbons is as a solution medium, however, the associated recycling and disposal costs of the ver polluted solvents. Furthermore, these substances impose increased requirements system design and safety. WO 93/23554 describes the production of a dye-free polyhydroxyalkanoate Acetic acid, which is used in combination with Es acetic anhydride or with the addition of 1-10% of an aliphatic carboxylic acid anhydrides or a lactone of a β-hydroxycarboxylic acid is used. With the This method gives very good results in practice, but they are depending on the type of microorganisms used as well as the later on purpose of record. The method described was specially developed for bacteria that assigned to the group PPFM (pink pigmented facultatively methylotrophic). In addition to the extraction step to obtain the polymer, it was necessary to a solution to eliminate the red dye can also be found. This is not absolutely necessary for other microorganisms.

Um den Reinheitsgrad des extrahierten Polymers zu erhöhen sind unterschiedliche Behandlungsweisen bekannt, die in unterschiedlicher Form auf Restbiomassebe standteile wirken. So wird in der Patentanmeldung WO 94/24302 ein Verfahren dar gestellt, welches mit Hilfe eines oxidierenden Mediums in Gegenwart eines Kom plexbildners die Zellhüllen der Mikroorganismen auflöst. Beispielsweise wird zur Gewinnung von Polyhydroxybuttersäure ein Wasserstoffperoxid bei einer Behand lungstemperatur zwischen 60 und 1 80°C als oxidierendes Mittel eingesetzt. Als Vorstufe zur oxidativen Behandlung ist eine physikalische Vorbereitung des Zellmaterials möglich, insbesondere durch eine Temperaturbehandlung im Bereich zwischen 100 und 200°C. Ein weiterer Effekt von Peroxiden, beispielsweise Was serstoffperoxid, kommt in der Patentanmeldung WO 94/10289 für einen Prozeß zur Gewinnung von Produkten aus einer wäßrigen Zusammensetzung zur Zersetzung von Nucleinsäuren zur Anwendung, wenn die Menge an Nucleinsäure ausreicht, die Viskosität derartig zu erhöhen, daß nachfolgende Prozeßschritte beeinträchtigt wer den. Die Konzentration der in Wasser gelösten Nucleinsäuren wird mit < 0,1 g/l an gegeben, beispielsweise 0,5-20 g/l.In order to increase the degree of purity of the extracted polymer, there are different ones Treatments known in different forms based on residual biomass components work. For example, a method is described in patent application WO 94/24302 provided which with the help of an oxidizing medium in the presence of a com plexbildners dissolves the cell shells of the microorganisms. For example, Obtaining polyhydroxybutyric acid a hydrogen peroxide in a treatment used between 60 and 1 80 ° C as an oxidizing agent. A physical preparation of the Cell material possible, in particular by a thermal treatment in the area between 100 and 200 ° C. Another effect of peroxides, such as what Serstoffperoxid, comes in the patent application WO 94/10289 for a process Obtaining products from an aqueous decomposition composition of nucleic acids for use when the amount of nucleic acid sufficient to To increase viscosity in such a way that subsequent process steps are impaired the. The concentration of the nucleic acids dissolved in water becomes <0.1 g / l given, for example 0.5-20 g / l.

Biologische Verfahren sind durch den Einsatz kostenintensiver Enzyme und auf wendigerer Verfahrensbedingungen in der Regel sehr teuer. Zudem stellt sich, ebenso wie beim Einsatz chemischer Substanzen und Detergenzien, das Problem der späteren Abtrennung, da neben der Reinigung des Polymeren von Biomassebe standteilen eine "Verschmutzung" durch neue Materialien auftritt. Ein weiterer Nach teil chemischer Behandlungsmethoden ist die zumeist damit verbundene Schädi gung des zu reinigenden Polymers, welche sich in Form von Molekulargewichtsab bau äußert.Biological processes are based on the use of costly enzymes more agile process conditions are usually very expensive. In addition, just as with the use of chemical substances and detergents, the problem the later separation, since in addition to purifying the polymer from biomass a "pollution" from new materials occurs. Another after Part of chemical treatment methods is the usually associated pest supply of the polymer to be purified, which differs in the form of molecular weight construction expresses.

Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines kostengünstigen und effektiven Verfahrens zur Gewinnung von in einer bakteriellen Biomasse enthaltenen PHA, wobei der Restgehalt an Biomasse, ausgedrückt durch den Stickstoffgehalt in der PHA, sehr gering zu halten ist. Das Verfahren soll die Molekularmasse der fermen tativ erzeugten Polyhydroxyalkanoate nicht negativ beeinflussen.The object of the invention is to develop an inexpensive and effective Process for obtaining PHA contained in a bacterial biomass, the residual biomass expressed by the nitrogen content in the PHA, is to be kept very low. The process is said to be the molecular mass of the fermen Do not negatively affect generated polyhydroxyalkanoates.

Die Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen dargestellte Erfindung gelöst. Die sich in der Fermentationsbrühe befindliche bakterielle Biomasse kann zunächst einem mechanischen Zellaufschluß, beispielsweise in einer Rührwerkskugelmühle oder einem Hochdruckhomogenisator unterzogen werden. Der Aufschluß dient zur Zerstörung der festen Zellhülle und Freisetzung wasserlöslicher bzw. mit Wasser ausspülbarer Zellkomponenten. Weiterhin wird eine vergrößerte Oberfläche für den Angriff biologischer oder chemischer Substanzen geschaffen. Die Abtrennung der in der Fermentationsbrühe gelösten Substanzen bzw. leichter Schwebeteilchen und Zellbruchstücke erfolgt in bekannter Weise durch Filtration, Separation oder Dekan tieren. Im Anschluß daran wird die Biomasse als Ausgangspunkt der Wasch- und Extraktionsschritte getrocknet.The object is achieved by the invention presented in the claims. The bacterial biomass in the fermentation broth can initially a mechanical cell disruption, for example in an agitator ball mill or subjected to a high pressure homogenizer. The digestion serves Destruction of the solid cell envelope and release of water-soluble or water rinsable cell components. Furthermore, an enlarged surface for the Attack of biological or chemical substances created. The separation of the in substances dissolved in the fermentation broth or light suspended particles and Cell fragments are made in a known manner by filtration, separation or dean animals. Subsequently, the biomass is the starting point for washing and Extraction steps dried.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß bei Behandlung der getrockneten Bio masse aus Zellbruchstücken und PHA mit dem Extraktionsmittel Essigsäure bei ei ner Temperatur unterhalb der bekannten Extraktionstemperatur zur Gewinnung von PHA aus einer Biomasse ein Reinigungseffekt erreicht werden kann, das heißt, eine PHA mit hoher Reinheit gewonnen werden kann. Da die üblichen Extraktionstemperaturen bei der Verwendung von Essigsäure als Extraktionsmittel im Bereich von 85-105°C, zur Lösung des Polymeren jedoch in jedem Fall über 70°C liegen, wird die Vorreinigung der Biomasse unter Rühren in einem Temperaturbereich zwischen Raumtemperatur und 50°C durchgeführt. Der Vorteil der Verwendung von Essigsäure liegt in der Vermeidung eines aufwendigen Trenn- bzw. Trocknungsschrittes vor der Polymerextraktion. Nach der Abtrennung des Reinigungsmittels Essigsäure von der Biomasse wird die Biomasse ohne noch maliges Trocknen mit dem Extraktionsmittel Essigsäure in der bereits aus dem Stand der Technik bekannten Weise bei Extraktionstemperatur extrahiert. Die Aufarbeitung des Extraktes aus Extraktionsmittel und gereinigter PHA durch Fällung ist hinrei chend bekannt. It has now surprisingly been found that when the dried organic mass from cell fragments and PHA with the extracting agent acetic acid at egg ner temperature below the known extraction temperature to obtain PHA can be achieved from a biomass, that is, a cleaning effect PHA can be obtained with high purity. Since the usual extraction temperatures when using acetic acid as Extractant in the range of 85-105 ° C, but for dissolving the polymer in in any case above 70 ° C, the pre-cleaning of the biomass is stirred in a temperature range between room temperature and 50 ° C. Of the The advantage of using acetic acid lies in the avoidance of a complex one Separation or drying step before polymer extraction. After the separation of the cleaning agent acetic acid from the biomass, the biomass becomes without drying once with the extracting agent acetic acid in the already from the stand the manner known in the art extracted at extraction temperature. The workup the extract from the extractant and purified PHA by precipitation is sufficient known.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für solche PHAs wie Poly hydroxybuttersäure, Polyhydroxyvaleriansäure oder deren Copolymere anwendbar. Gleichfalls ist das Verfahren aber auch für Gemische aus den genannten PHAs an wendbar.The method according to the invention is particularly suitable for PHAs such as poly hydroxybutyric acid, polyhydroxyvaleric acid or their copolymers applicable. The method is also suitable for mixtures of the aforementioned PHAs reversible.

Der Reinigungsprozeß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann in seiner Ef fektivität dadurch unterstützt werden, daß dem Extraktionsmittel Essigsäure in der Verfahrensstufe der Behandlung der Biomasse unterhalb der Extraktionstemperatur Essigsäureanhydrid in einer Menge bis zu 10% bezogen auf Essigsäure zugesetzt wird.The cleaning process according to the inventive method can in its Ef effectiveness are supported by the fact that the extractant acetic acid in the Process stage of the treatment of the biomass below the extraction temperature Acetic anhydride added in an amount up to 10% based on acetic acid becomes.

Eine weitere Bedingung für den Reinigungseffekt ergab sich aus anwendungstech nischen Versuchen. Da viele Verarbeitungstechnologien die Produkte über den Schmelzzustand des Ausgangsmaterials erzeugen, wurden in einer Laborpresse bei 150°C, 150 bar und einer Verweilzeit von drei Minuten Prüfkörper hergestellt. Nach dem Preßvorgang zeigte sich bei den mit Essigsäure extrahierten, ursprünglich wei ßen Polymerproben eine Verfärbung, die je nach Mikroorganismus und Vorbehand lung zwischen einem Karamel- und dunklem Braunton variierte. Die Verfärbung trat interessanter Weise auch bei Proben auf, deren Stickstoffgehalt, einem Maß für den Restbiomasseanteil, weit unter 0,1% lag.Another condition for the cleaning effect resulted from application technology African attempts. Since many processing technologies use products over the To produce the melt state of the starting material were used in a laboratory press 150 ° C, 150 bar and a dwell time of three minutes test specimen. After the pressing process was shown in those originally extracted with acetic acid polymer samples have a discoloration that depends on the microorganism and pretreatment between a caramel and a dark brown tone. The discoloration occurred interesting also for samples whose nitrogen content is a measure of the Residual biomass content was well below 0.1%.

Um den bloßen Temperatureinfluß auszuschließen, wurden bei identischen Bedin gungen mit Chloroform extrahierte PHB-Proben verpreßt, die jedoch reinweiße bzw., milchig trübe Prüfkörper ergaben. Da eine Adsorption von in Essigsäure gelösten oder ausgeschwemmten Biomassepartikel an die PHB vermutet wurde, wurde als Gegenprobe mit Chloroform extrahierte PHB im Filtrat des Essigsäure Fällbades eingeweicht, gewaschen und getrocknet. Nach dem Verpressen zeigte sich auch hier eine karamelbraune Verfärbung der Prüfkörper, so daß eine besondere Anfor derung an die Reinigung in der Vermeidung dieses Effektes lag.To exclude the mere influence of temperature, identical conditions were used PHB samples extracted with chloroform, which, however, are pure white or milky cloudy test specimens resulted. Because an adsorption of dissolved in acetic acid or washed out biomass particles suspected of being PHB was considered Cross-test with chloroform extracted PHB in the filtrate of the acetic acid precipitation bath soaked, washed and dried. After pressing also showed up here a caramel-brown discoloration of the test specimens, so that a special requirement cleaning was to avoid this effect.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an folgenden Beispielen näher erläutert:
Durch einen Fermentationsprozeß im batch-Verfahren werden Mikroorganismen durch eine entsprechende Wachstumsphase mit anschließend initiierter Akkumula tion zur Einlagerung von Polyhydroxybuttersäure in der Zelle kultiviert. Die erziel bare Polymerkonzentration hängt sehr stark von der Art des Mikroorganismus und den Fermentationsbedingungen ab. Für technisch relevante Prozesse wird von ei nem Polymeranteil größer 50% der Zelltrockenmasse ausgegangen. Durch Kultivierung des Mikroorganismus Methylobacterium rhodesianum wurde nach Beendigung des Fermentationsprozesses ein PHB-Gehalt von 52% erzielt. Die Ausgangsbiomassekonzentration, bezogen auf die Trockensubstanz, betrug 50 g/l. Bei Methylocystis spez. wurden vergleichbare Werte erreicht, diese lagen bei 48% PHB sowie einer Zelldichte von 50 g/l.The process according to the invention is explained in more detail using the following examples:
Through a fermentation process in a batch process, microorganisms are cultivated through a corresponding growth phase with subsequently initiated accumulation for the storage of polyhydroxybutyric acid in the cell. The polymer concentration that can be achieved depends very much on the type of microorganism and the fermentation conditions. For technically relevant processes, a polymer content of more than 50% of the dry cell mass is assumed. By cultivating the microorganism Methylobacterium rhodesianum, a PHB content of 52% was achieved after the fermentation process had ended. The starting biomass concentration, based on the dry matter, was 50 g / l. With Methylocystis spec. comparable values were achieved, these were 48% PHB and a cell density of 50 g / l.

Zum Vergleich wurden beide Mikroorganismen, ausgehend von sprühgetrockneter Biomasse, einer reinen Säureextraktion, einer Kaltwäsche sowie einer Kombination aus Kaltwäsche und Extraktion unterzogen. Zum Vergleich wurden beide Biomassen mit Chloroform extrahiert. Einen Überblick über die verwendeten Rezepturen gibt folgende Aufstellung:For comparison, both microorganisms were spray-dried Biomass, a pure acid extraction, a cold wash and a combination subjected to cold washing and extraction. Both biomasses were used for comparison extracted with chloroform. The following list provides an overview of the recipes used:

A: Acetic acid extraction

1. Extract 10 g of biomass with 200 ml of acetic acid at 100 ° C for 15 minutes
2. Then filter the suspension immediately using a suction filter with filter paper.
3. 1 l of water are introduced as the precipitant and the filtrate is stirred in.
4. Aspirate the precipitated PHB.
5. The PHB is washed twice with water.
6. The PHB is dried at 60 ° C.

B: Cold wash of acetic acid followed by extraction of acetic acid

1. stir 25 g of biomass with 500 ml of acetic acid at room temperature for 10 minutes, then aspirate the suspension and mixed again with 500 ml of acetic acid Zen.
2. Extract the batch at 100 ° C for 15 minutes.
3. Then filter immediately, if the filtrate fuses, the Saugerlenmeyer be tempered to 70 ° C.
4. Put 2 l of water for the precipitation and the acetic acid solution in a thin stream pour in
5. Aspirate the precipitated PHB.
6. The PHB is washed twice with water.
7. The PHB is dried at 60 ° C.

Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle dargestellt:
The results are shown in the following table:

Bei der Biomasse Methylocystis spez. liegt die Ausbeute an PHB bei der Essigsäure- Extraktion deutlich höher (ca. 95%), als bei der Extraktion mit Chloroform (ca. 65-80%). Die nach der Chloroform-Extraktion im Filterkuchen noch vorhandene PHB kann durch Essigsäure fast vollständig extrahiert werden. Dabei beträgt die Mol masse der extrahierten PHB 740.000. Es zeigt sich, daß, speziell bei der Verwen dung von Methylocystis spez., eine deutliche Verringerung des Stickstoffgehaltes festzustellen ist. Interessant ist der geringe Abfall des Stickstoffwertes nach der Kaltwäsche. Dieser weist darauf hin, daß durch die Wäsche nicht nur stickstoffhal tige Verbindungen entfernt werden. Der positive Effekt der Reinigung durch die Vor wäsche ist jedoch bei der thermischen Beanspruchung des Produktes deutlich zu bemerken.For the biomass Methylocystis spec. is the yield of PHB in acetic acid Extraction significantly higher (approx. 95%) than with extraction with chloroform (approx. 65-80%). The PHB still present in the filter cake after the chloroform extraction can be extracted almost completely by acetic acid. The mole is mass of the extracted PHB 740,000. It turns out that, especially when used of Methylocystis spec., a significant reduction in the nitrogen content can be determined. What is interesting is the slight drop in the nitrogen value after the Machine wash cold. This indicates that the laundry not only nitrogen connections are removed. The positive effect of cleaning through the pre however, laundry is clearly too hot when the product is thermally stressed to notice.

Claims

1. A process for the production of polyhydroxyalkanoates which are accumulated in the cells by fermentation of a microorganism, by mechanical cell disruption, subsequent separation of the cell fragments and dissolved substances, and drying of the polyhydroxyalkanoate-containing biomass and extraction of the polyhydroxyalkanoates by the extraction agent acetic acid, characterized by that the biomass after drying is treated for 5 minutes to 2 hours with the extractant at temperatures below the extraction temperature, the extractant is separated from the biomass and this is extracted in the usual manner with the extractant at the extraction temperature and the polyhydroxyalkanoate is precipitated.

2. The method according to claim 1, characterized in that the polyhydroxyalka noat a polyhydroxybutyric acid, a polyhydroxyvaleric acid or a Co polymer this is.

3. The method according to claim 1, characterized in that the extractant Acetic anhydride is added.