DE19711879A1 - Stable biosensor, e.g. for glucose determination - Google Patents

Stable biosensor, e.g. for glucose determination

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Michael Dipl Chem Wittkampf
Gabriele Christine Chemnitius
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Abstract

Biosensor consists of a membrane-covered transducer and a immobilised biological component (BC). The novel features are that: (i) preparation of the gas-permeable membrane (GPM) on the transducer and its modification by incorporation of functional groups are carried out in a single stage; and (ii) immobilisation between the GPM of the transducer and BC is carried out by covalent bonds via the functional groups incorporated in the membrane.

Description

Die Erfindung betrifft einen Biosensor, der aus einem Chemosensor zur Detektion von Gasen und einer immobilisierten biologischen Komponente aufgebaut ist, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.The invention relates to a biosensor consisting of a chemical sensor for detection of gases and an immobilized biological component, and a process for its manufacture.

Das Prinzip eines Biosensors beruht auf der Kopplung einer biologischen Komponente mit einem physikalischen Signalwandler (Transducer) und einer elektronischen Signalverarbeitung. Als biologische Komponenten können Enzyme, Multienzymsysteme, Organellen, Komponenten der Zellmembran, ganze Zellen Antikörper oder Antigene eingesetzt werden. Sie werden in einer dünnen Schicht vor der Oberfläche des Transducers fixiert. Die Wechselwirkung des zu charakterisierenden gasförmigen oder flüssigen Stoffes mit der biologischen Komponente bewirkt eine physikalische Veränderung, die z. B. elektrisch, optisch, mechanisch, akustisch oder kalorimetrisch vom Transducer erfaßt werden kann. Durch elektronische Datenerfassung und -verarbeitung kann diese Veränderung in ein quantifizierbares und amplifizierbares elektronisches Signal umgewandelt werden.The principle of a biosensor is based on the coupling of a biological one Component with a physical signal converter (transducer) and one electronic signal processing. As biological components, enzymes, Multi enzyme systems, organelles, components of the cell membrane, whole cells Antibodies or antigens can be used. You will be in a thin layer before fixed on the surface of the transducer. The interaction of the characterizing gaseous or liquid substance with the biological Component causes a physical change that z. B. electrical, optical, can be detected mechanically, acoustically or calorimetrically by the transducer. By electronic data acquisition and processing this change in converted a quantifiable and amplifiable electronic signal will.

Schwierigkeiten stellt bis heute die reproduzierbare, einfach zu handhabende und stabile Immobilisierung der biologischen Komponenten dar. Zur Erzielung einer schnellen Ansprechzeit ist eine dünne Immobilisatschicht und zur Erzielung einer hohen Lager- und Funktionsstabilität eine hohe immobilisierte Enzymaktivität anzustreben.To date, the reproducible, easy-to-use and presents difficulties stable immobilization of the biological components. To achieve a fast response time is a thin layer of immobilisate and to achieve a high storage and functional stability, high immobilized enzyme activity to strive for.

Als Möglichkeiten zur Immobilisierung der biologischen Komponenten auf dem Transducer bieten sich an:
The following options are available for immobilizing the biological components on the transducer:

  • - die Adsorption durch physikalische Wechselwirkungen wie z. B. ionische Wechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen,- The adsorption through physical interactions such. B. ionic Interactions and hydrogen bonds,
  • - die Quervernetzung der biologischen Komponenten durch multifunktionelle Reagenzien, z. B. Glutardialdehyd,- the cross-linking of the biological components through multifunctional Reagents, e.g. B. glutardialdehyde,
  • - der Einschluß der biologischen Komponenten in Polymermatrices zur Mikro- und Makroverkapselung und- The inclusion of the biological components in polymer matrices for micro and Macroencapsulation and
  • - die kovalente Bindung an Trägermaterialien wie z. B. Glas oder Polymeroberflächen.- The covalent bond to carrier materials such. B. glass or Polymer surfaces.

Durch Adsorption an Trägeroberflächen werden relativ instabile Systeme erhalten, Änderungen des Lösungsmittels, der Ionenstärke und des pH-Wertes können zur Beeinträchtigung der Aktivität und zum Verlust des Enzyms von der Oberfläche führen. Bei der Quervernetzung der biologischen Komponente ist zwar ein starker Zusammenhalt der z. B. Enzyme untereinander gegeben, die Verbindung zur Transduceroberfläche jedoch kann labil sein. Bei der Einschlußimmobilisierung kann die Diffusion der Enzyme aus dem Polymer heraus zu einer ständigen Aktivitätsabnahme und damit zu einer begrenzten Lebensdauer des Sensors führen ("Protein Immobilization: Fundamentals and Applications", Dekker, New York, Basel, Hongkong, 1991). Die kovalente Immobilisierung erlaubt dagegen eine dauerhafte Kopplung von Transduceroberfläche bzw. Trägermaterial mit der biologischen Komponente. Biologische Komponenten, z. B. Enzyme, enthalten freie Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und Mercaptogruppen, die für die Bildung kovalenter Bindungen und zur Quervernetzung zur Verfügung stehen. Materialien, wie z. B. organische Polymere lassen sich direkt zur Immobilisierung verwenden, soweit sie bestimmte funktionelle Gruppen wie Isocyanat-, Isothiocyanat-, Säurechlorid- und Epoxidreste, aber auch weniger reaktive Gruppen, wie z. B. Amino-, Hydroxyl-, Aldehyd- und Carboxylgruppen zur Verfügung stellen, ansonsten kann ihre vorherige Modifizierung bzw. Aktivierung erforderlich sein.Adsorption on carrier surfaces results in relatively unstable systems Changes in the solvent, ionic strength and pH can lead to Impairment of activity and loss of the enzyme from the surface to lead. The cross-linking of the biological component is a strong one Cohesion of z. B. Enzymes given to each other, the connection to However, the transducer surface can be unstable. When immobilization can be included the diffusion of the enzymes out of the polymer to a constant Decrease in activity and thus lead to a limited service life of the sensor ("Protein Immobilization: Fundamentals and Applications", Dekker, New York, Basel, Hong Kong, 1991). Covalent immobilization, on the other hand, allows permanent Coupling the transducer surface or carrier material with the biological one Component. Biological components, e.g. B. enzymes, contain free amino, Carboxyl, hydroxyl and mercapto groups, which are responsible for the formation of covalent bonds and are available for cross-linking. Materials such as B. organic Polymers can be used directly for immobilization insofar as they are specific functional groups such as isocyanate, isothiocyanate, acid chloride and epoxy residues, but also less reactive groups, such as. B. amino, hydroxyl, aldehyde and Provide carboxyl groups, otherwise their prior modification or activation may be required.

Bei der Herstellung von Biosensoren ist somit die Funktionalisierung von Immobilisierungsmatrices wie Glas-, Polymer- und Metalloberflächen geeignet, eine feste Bindung zwischen diesen und dem Immobilisat zu ermöglichen. Solche Sensoren sind jedoch anfällig für Störungen der Sensorsignale durch sogenannte Störstoffe, die - wie der durch die biochemische Reaktion erkannte Analyt - ebenfalls Signale am Transducer hervorrufen. Biosensoren mit gasdurchlässiger Membran zur Detektion von entstehendem oder verbrauchten Gas bieten, durch Abtrennung von Analyt- und Detektionsraum, die Möglichkeit Störstoffe von der Transduceroberfläche fernzuhalten und so nur das durch die biochemische Reaktion hervorgerufene Sensorsignal aufzuzeichnen. Ebenso läßt sich ein für manche Transducertypen notwendiger Reaktionsraum vom Meßmedium abtrennen und darin eine für den Betrieb unerläßliche konstante Zusammensetzung gewährleisten. Ein Problem bei dieser Herstellung der Biosensoren stellt die begrenzte Haftung der Immobilisatschicht auf der gasdurchlässigen Membran dar und ihre dadurch verursachte Ablösung. Diese Problem wurde bei Makrosensoren bisher durch einen Sandwichaufbau gelöst, bei dem über die Immobilisatschicht eine weitere Membran, meist mit einem O-Ring, als mechanischer Schutz gespannt wird. Es ist aber auch schon eine nachträgliche Modifizierung von FEP gasdurchlässigen Membranen zur Anbindung der biologischen Komponente beschrieben worden (Japanisches Patent 63230078 und "Analytical Chemistry Vol. 67 (1995) Seiten 1546 bis 1552).In the manufacture of biosensors, the functionalization of Immobilization matrices such as glass, polymer and metal surfaces suitable, a to allow a firm bond between these and the immobilizate. Such However, sensors are susceptible to interference in the sensor signals by so-called Contaminants, like the analyte recognized by the biochemical reaction, also Generate signals at the transducer. Biosensors with gas permeable membrane for Provide detection of emerging or used gas by separating Analyte and detection room, the possibility of contaminants from the Keep transducer surface away and only that through the biochemical reaction evoked sensor signal record. You can also do one for some Separate the necessary reaction space of the transducer types from the measuring medium and in it ensure a constant composition that is essential for operation. A The problem with this production of the biosensors is the limited liability of Immobilisatschicht on the gas permeable membrane and thereby caused detachment. This problem has so far been caused by a macro sensor Sandwich construction solved, in which a further membrane over the immobilized layer,  usually with an O-ring as mechanical protection. It is also already a subsequent modification of FEP gas permeable membranes Binding of the biological component has been described (Japanese patent 63230078 and "Analytical Chemistry Vol. 67 (1995) pages 1546 to 1552).

Das Problem der Haftung der Immobilisatschicht auf dem Transducer oder Trägermaterial tritt noch krasser bei planaren Strukturen auf, bei denen ein mechanischer Sandwichaufbau zur Sensorherstellung nicht mehr eingesetzt werden kann. Bei miniaturisierten Dünnschicht- und Dickschichtsensoren werden als gaspermeable Schicht auf dem Innenelektrolyten erfolgreich u. a. Photolacke ("Analytical Letters" Vol. 2 (1989) Seiten 2915 bis 2927) und Silicongummi ("Proceedings of Eurosensors X the 10th European Conference on Solid-State Transducers" (1996) Seiten 805-808) eingesetzt. Auf solchen gaspermeablen Membranen war jedoch bisher die Haftung einer Immobilisatschicht begrenzt, da keine direkte Verknüpfung der beiden Schichten beschrieben worden ist. M. Suzuki äußerte sogar die Meinung, daß eine kovalente Immobilisierung auf solchen gasdurchlässigen Membranen nicht möglich ist, betonte aber auch die Notwendigkeit einer guten Adhäsion der beiden Membranen ("Analytical Letters" Vol. 2 (1989) Seiten 2915 bis 2927). H. Suzuki brachte eine Art Haftvermittlerschicht aus γ-Amino­ propyltriethoxysilan und BSA zwischen beide Membranen ("Biosensors & Bio­ electronics" Vol. 6 (1991), Seiten 395 bis 400). Jedoch erfolgte auch hier nach einiger Zeit eine Ablösung der Immobilisatschicht.The problem of the adhesion of the immobilized layer on the transducer or Backing material appears even more blatantly in planar structures where mechanical sandwich structure for sensor production can no longer be used can. With miniaturized thin-film and thick-film sensors are considered gas permeable layer on the inner electrolyte successfully u. a. Photoresists ("Analytical Letters" Vol. 2 (1989) pages 2915 to 2927) and silicone rubber ("Proceedings of Eurosensors X the 10th European Conference on Solid-State Transducers "(1996) pages 805-808). On such gas permeable However, the adhesion of an immobilized layer was previously limited to membranes because no direct link between the two layers has been described. M. Suzuki even expressed the opinion that covalent immobilization on such gas permeable membranes is not possible, but also emphasized the need good adhesion of the two membranes ("Analytical Letters" Vol. 2 (1989) Pages 2915 to 2927). H. Suzuki brought a kind of adhesion promoter layer made of γ-amino propyltriethoxysilane and BSA between both membranes ("Biosensors & Bio electronics "Vol. 6 (1991), pages 395 to 400). However, here too some time a detachment of the immobilized layer.

Aufgabe der Erfindung ist es, zum Aufbau eines stabilen Biosensors aus einem Chemosensor, der zur Messung von Gasen wie Sauerstoff, Ammoniak oder Kohlendioxid in Flüssigkeiten geeignet ist, eine kovalente Kopplung einer modifizierten gasdurchlässigen Polymerschicht mit einer biologischen Komponente anzugeben. Das Aufbringen der Schichten soll möglichst einfach und in einer geringen Anzahl von Verfahrensschritten erfolgen. Das Herstellungsverfahren soll auch für die Anwendung bei planaren Sensoren in eine automatisierte z. B. eine full- wafer kompatible Fertigung integrierbar sein.The object of the invention is to build a stable biosensor from one Chemosensor used to measure gases such as oxygen, ammonia or Carbon dioxide in liquids is suitable for covalent coupling modified gas-permeable polymer layer with a biological component specify. The application of the layers should be as simple as possible and in one small number of procedural steps take place. The manufacturing process is said to also for use with planar sensors in an automated z. B. a full Wafer compatible manufacturing can be integrated.

Die Erfindung zeigt einen Lösungsweg auf, eine kovalente Immobilisierung der biologischen Komponenten auf einer gasdurchlässigen Membran vorzunehmen, die direkt auf dem Innenelektrolyten des Sensors erzeugt werden kann. Für die Immobilisierung ist prinzipiell kein Trägermaterial notwendig und auch keine zweite Membran, die die Immobilisatschicht auf der gasdurchlässigen Membran festhält. Bei der gasdurchlässigen Membran handelt es sich nicht um eine vorkonfektionierte, feste Membran, zu deren Befestigung Hilfsmittel wie z. B. O-Ringe benötigt werden, sondern um eine elastische in-situ herstellbare Membran. Die Herstellung der Membran und das Einbringen von funktionellen Gruppen, die anschließend zur kovalenten Immobilisierung der biologischen Komponente benutzt werden können, geschieht erfindungsgemäß in einem einzigen Arbeitsschritt. Dazu wird ein Mehrkomponenten-Silicongummi verwendet, das Polydimethylsiloxan (PDMS), ein Vernetzer/Katalysator-Gemisch und ein funktionalisiertes Triethoxysilan enthält und bei Raumtemperatur vulkanisiert. Dazu ist keine zusätzliche Behandlung wie UV-An­ regung oder Auswaschen von nichtvernetzten Komponenten notwendig. Die Viskosität des Membrancocktails und die Schichtdicke läßt sich durch Verdünnen mit n-Hexan einstellen. Dieses Silicongummi zeigt im Gegensatz zur europäischen Patentanmeldung 0 562 372 keine Porosität, so daß der Stofftransport nur durch aktive Diffusion im Material erfolgt. Wegen dieser Eigenschaft und des unpolaren Charakters im Inneren der Membran sind nur kleine Gasmoleküle in der Lage hindurchzutreten. Es ist auch möglich, diese Membran zur mechanischen Stabilisierung auf ein Trägermaterial aufzubringen und dieses dann vor einem Transducer zu fixieren.The invention shows a solution, a covalent immobilization of make biological components on a gas permeable membrane, the can be generated directly on the internal electrolyte of the sensor. For the In principle, immobilization does not require a carrier material, nor does it require a second one Membrane that holds the immobilized layer on the gas-permeable membrane. At the gas permeable membrane is not a pre-assembled,  solid membrane, for attaching aids such. B. O-rings are required but an elastic membrane that can be manufactured in situ. The manufacture of the Membrane and the introduction of functional groups, which subsequently to covalent immobilization of the biological component can be used, happens according to the invention in a single step. To do this, a Multi-component silicone rubber used, the polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker / catalyst mixture and a functionalized triethoxysilane contains and vulcanized at room temperature. There is no additional treatment like UV-An Excitation or washing out of non-crosslinked components necessary. The Viscosity of the membrane cocktail and the layer thickness can be diluted with Set n-hexane. This silicone rubber shows in contrast to the European one Patent application 0 562 372 no porosity, so that the mass transfer only through active diffusion takes place in the material. Because of this property and the non-polar In the interior of the membrane, only small gas molecules are able to step through. It is also possible to use this membrane for mechanical Apply stabilization to a substrate and then in front of it Fix transducer.

Die ausvulkanisierte Schicht wird mit einer wäßrigen Lösung der biologischen Komponente behandelt, die durch Reaktion mit den funktionellen Gruppen des Polymers kovalent immobilisiert wird. Enzyme lassen sich so aus einer wäßrigen Lösung auf einem gasdurchlässigen Polymer unter milden Bedingungen immobilisieren. Die Herstellung und Anwendung der Polymerschicht ist durch ihre Einfachheit gekennzeichnet, da die Herstellung der Polymerschicht und die Immobilisierung der biochemischen Substanz jeweils nur einen Arbeitsschritt darstellt und somit nur einen geringen technischen Aufwand erfordert.The vulcanized layer is covered with an aqueous solution of the biological Component treated by reaction with the functional groups of the Polymer is covalently immobilized. Enzymes can thus be extracted from an aqueous Solution on a gas permeable polymer under mild conditions immobilize. The production and application of the polymer layer is through its Marked simplicity because of the production of the polymer layer and the Immobilization of the biochemical substance is only one step at a time and therefore requires only a small technical effort.

Durch diese neuartige Immobilisierung wird eine feste Verbindung der beiden Membranen erhalten. Die biochemische und die detektierende Reaktion des Sensorsystems laufen auf verschiedenen Seiten der gaspermeablen Membran ab und können sich daher nicht gegenseitig stören. Nur das Gas, das bei der biochemischen Reaktion verbraucht oder gebildet wird, kann über die Membran von einem Reaktionsraum in den anderen übertreten.This new immobilization creates a firm bond between the two Preserved membranes. The biochemical and the detecting reaction of the Sensor systems run on different sides of the gas-permeable membrane and therefore cannot interfere with each other. Only the gas that comes from the biochemical reaction can be consumed or formed via the membrane of to move from one reaction space to another.

Die Erzeugung des Erkennungssystems des erfindungsgemäßen Biosensors beinhaltet im allgemeinen folgende Schritte:The generation of the detection system of the biosensor according to the invention generally includes the following steps:

1. Schichtpräparation1. Layer preparation

Es wird eine Lösung aus PDMS mit endständigen Hydroxylgruppen, einem geeigneten Vernetzer/Katalysator-Gemisch und einem funktionalisierten Alkoxysilan in n-Hexan hergestellt. Diese wird auf ein Trägermaterial oder auf einen Elektrolyten durch Dispensieren, spin/dip-coating oder einem anderen in der Technik üblichen Prozeß aufgebracht. Die Vulkanisation erfolgt bei Raumtemperatur ohne weitere Behandlung.It becomes a solution of PDMS with terminal hydroxyl groups, one suitable crosslinker / catalyst mixture and a functionalized alkoxysilane made in n-hexane. This is placed on a carrier material or on an electrolyte by dispensing, spin / dip-coating or another technique customary in the art Process applied. The vulcanization takes place at room temperature without further Treatment.

2. Immobilisierung der biochemischen Schicht2. Immobilization of the biochemical layer

Durch den Kontakt der vulkanisierten Schicht mit einer wäßrigen Lösung der biologischen Komponente wird diese kovalent durch die Reaktion mit den funktionellen Gruppen angebunden. Die Immobilisierung ist nicht auf eine biochemische Substanz begrenzt, sondern es kann auch ein Gemisch von mehreren Substanzen gleichzeitig aufgebracht werden.By contacting the vulcanized layer with an aqueous solution of the biological component becomes covalent through the reaction with the linked functional groups. The immobilization is not on one limited biochemical substance, but it can also be a mixture of several Substances are applied simultaneously.

Für den erfindungsgemäßen Biosensor eignen sich funktionalisierte Triethoxysilane folgender Struktur:
Functionalized triethoxysilanes of the following structure are suitable for the biosensor according to the invention:

(C2H5O)3Si-(CH2)n-R(C 2 H 5 O) 3 Si- (CH 2 ) n -R

Dabei gilt folgendes:
n = 3 - ?
R = funktionelle Gruppe (z. B. -Amino, -Epoxy, -Aldehyd, -Carboxyl, Mercapto, Isocyanat).The following applies:
n = 3 -?
R = functional group (e.g. -amino, -epoxy, -aldehyde, -carboxyl, mercapto, isocyanate).

Die beim Beispiel 2 verwendeten Epoxysilane sind Gegenstand der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 485 985 "Organosilicon compounds and methods of manufacturing thereof".The epoxysilanes used in Example 2 are the subject of European ones Patent Application No. 0 485 985 "Organosilicon compounds and methods of manufacturing thereof ".

Es können prinzipiell auch funktionalisierte Polydiorganosiloxan für eine kovalente Immobilisierung benutzt werden.In principle, functionalized polydiorganosiloxane can also be used for a covalent Immobilization can be used.

Die Erfindung bietet folgende Vorteile:
The invention offers the following advantages:

  • - Die kovalente Immobilisierung von biologischen Komponenten, die über reaktive NH-, OH-, SH- oder COOH-Gruppen verfügen, wird ermöglicht.- The covalent immobilization of biological components via reactive NH, OH, SH or COOH groups are enabled.
  • - Biochemische und detektierende Reaktion laufen auf verschiedenen Seiten der gaspermeablen Membran ab und können sich daher nicht gegenseitig stören.- Biochemical and detection reactions run on different sides of the gas permeable membrane and can therefore not interfere with each other.
  • - Die fertiggestellten Membranen können trocken sowie auch feucht gelagert werden.- The finished membranes can be stored dry as well as moist will.
  • - Die Immobilisierung wird unter sehr milden Bedingungen in wäßriger Lösung durchgeführt. - The immobilization is carried out under very mild conditions in aqueous solution carried out.  
  • - Die Membrandicke kann relativ einfach durch Verdünnung des Siliconcocktails eingestellt werden.- The membrane thickness can be relatively easily by diluting the silicone cocktail can be set.
  • - Das Verfahren ist geeignet zur Herstellung von Makro-Biosensoren und von miniaturisierten Biosensoren in Planartechnologie. Es ist automatisierbar und kann in Produktionsabläufe von massenproduzierbaren Sensoren integriert werden. Bei der Siliciumtechnologie kann eine Immobilisierung auf dem full-wafer Level stattfinden.- The method is suitable for the production of macro biosensors and miniaturized biosensors in planar technology. It can be automated and can be integrated into the production processes of mass-produced sensors will. In silicon technology, immobilization on the full wafer Level take place.
  • - Durch die Erfindung kann die Nutzung von Biosensoren, bei denen eine gasförmige Komponente beteiligt ist, beträchtlich erweitert werden.- The invention allows the use of biosensors in which a gaseous component is involved, will be expanded considerably.
  • - Eine große Zahl von biologischen Komponenten kann verwendet werden.- A large number of biological components can be used.

Beispiele sind:
Examples are:

  • - Oxidasen z. B. Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Alkoholoxidase,- Oxidases e.g. B. glucose oxidase, lactate oxidase, alcohol oxidase,
  • - Oxygenasen, die kein H2O2 produzieren und deren Analytumsetzung daher über den O2 Verbrauch oder die Bildung eines anderen detektierbaren Produktes nachgewiesen werden muß. z. B.: Tyrosinase, Ascorbatoxidase- Oxygenases that do not produce H 2 O 2 and whose analyte conversion must therefore be demonstrated by the O 2 consumption or the formation of another detectable product. e.g. For example: tyrosinase, ascorbate oxidase
  • - Hydrolasen, die gasförmige Komponenten verbrauchen oder produzieren z. B. Urease- Hydrolases that consume or produce gaseous components e.g. B. Urease
  • - Decarboxylasen, die CO2 freisetzen, z. B. Aminosäuredecarboxylase- Decarboxylases that release CO 2 , e.g. B. Amino Acid Decarboxylase
  • - Mikroorganismen zur Detektion der Atmungsaktivität- Microorganisms for detection of breathability
  • - Enzymgekoppelte Antikörperreaktionen- Enzyme-linked antibody reactions
  • - Auch im Bezug auf die Transducer gibt die Erfindung ein breites Anwendungsgebiet. Es bieten sich elektrochemische (amperometrische, potentiometrische, impediometrische) und optische Transducer zur Detektion von O2, NH3, CO2 produzierenden oder verbrauchenden biochemischen Reaktionen an.- The invention also has a wide field of application with regard to the transducers. There are electrochemical (amperometric, potentiometric, impediometric) and optical transducers for the detection of O 2 , NH 3 , CO 2 producing or consuming biochemical reactions.
  • - Die Membran läßt sich den speziellen Anforderungen der Analyse durch Variation und Mischung der Alkoxysilane und der immobilisierten biologischen Komponente anpassen.- The membrane can meet the special requirements of the analysis by variation and mixing the alkoxysilanes and the immobilized biological component to adjust.

Anhand von Ausführungsbeispielen soll die Erfindung noch näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail using exemplary embodiments.

Beispiel 1example 1 Biosensor mit gaspermeabler aminofunktionalisierter Silicongummi/Enzymschicht mit immobilisierter GOD auf einem Trägermaterial zur Verwendung mit einer Sauerstoff­ elektrodeBiosensor with gas permeable amino functionalized silicone rubber / enzyme layer with immobilized GOD on a support material for use with an oxygen electrode

150 Massenanteile Polydimethylsiloxan (z. B. K-1000, FLUKA) werden in 500 Massenanteilen n-Hexan gelöst. 20 Massenanteile 3-Aminopropyl-1-triethoxysilan werden dazu gegeben und vermischt. Zu dieser Lösung werden 10 Massenanteile K-11 (FLUKA) als Vernetzer gegeben und vermischt. Durch die Variation der Menge an n-Hexan kann die resultierende Dicke auf dem Trägermaterial/Biosensor eingestellt werden. Eine Cuprophan® Dialysierfolie wird in Wasser eingeweicht und über ein Rollrandglas aufgezogen. Beim Trocknen spannt sich diese Membran über das Gefäß und bildet eine glatte Oberfläche. Von der beschriebenen Lösung wird dann 10 µl durch Auftropfen, dip-coating oder andere Verfahren auf das Trägermaterial aufgebracht. Die entstandene Silicongummi/Cuprophan® Dialysierfolie-Membran wird bei Raumtemperatur 12 Stunden getrocknet, wobei das Silicongummi vulkanisiert.150 parts by mass of polydimethylsiloxane (e.g. K-1000, FLUKA) are in 500 Mass fractions of n-hexane dissolved. 20 parts by mass of 3-aminopropyl-1-triethoxysilane are added and mixed. 10 mass fractions of K-11 are added to this solution (FLUKA) as crosslinker and mixed. By varying the amount of n-Hexane can adjust the resulting thickness on the substrate / biosensor will. A Cuprophan® dialysis film is soaked in water and over a Rolled edge glass pulled up. When drying, this membrane stretches over the Vessel and forms a smooth surface. Then from the solution described 10 µl by dripping, dip-coating or other processes on the carrier material upset. The resulting silicone rubber / Cuprophan® dialysing membrane is dried at room temperature for 12 hours, the silicone rubber vulcanizing.

Zur Immobilisierung werden 5 U/µl GOD in 0,1 M Phosphat-Puffer (KH2PO4/Na2HPO4.2 H2O) gelöst und die Enzymlösung mit einem gleichen Massenanteil 5-10%iger Glutardialdehyd-Lösung versetzt. Auf die gasdurchlässige Membran werden 10 µl dieser Immobilisierungslösung vorsichtig aufgebracht. Nach dem Aufbringen der Enzymlösung wird die Membran ca. 16 h bei 4°C aufbewahrt, danach wird diese Schicht mit 10 µl deionisiertem Wasser benetzt, wieder eingetrocknet und anschließend wird die Oberfläche der Membran mit deionisiertem Wasser oder Pufferlösung gespült. Diese Membran wird zur Glucosebestimmung über einer Sauerstoffelektrode mit einem O-Ring angebracht.For immobilization, 5 U / µl GOD are dissolved in 0.1 M phosphate buffer (KH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 .2 H 2 O) and an equal mass fraction of 5-10% glutardialdehyde solution is added to the enzyme solution. 10 µl of this immobilization solution are carefully applied to the gas-permeable membrane. After the enzyme solution has been applied, the membrane is stored for about 16 hours at 4 ° C., then this layer is wetted with 10 μl of deionized water, dried again and the surface of the membrane is then rinsed with deionized water or buffer solution. This membrane is attached to an oxygen electrode with an O-ring for glucose determination.

Die Glucosemessung ergab eine Empfindlichkeit von 0,36 nA µM⁻1.The glucose measurement showed a sensitivity of 0.36 nA µM⁻ 1 .

Beispiel 2Example 2 Biosensor mit gaspermeabler epoxyfunktionalisierter Silicongummi/Enzym-Schicht mit immobilisierter GOD auf einem Trägermaterial zur Verwendung mit einer SauerstoffelektrodeBiosensor with gas permeable epoxy functionalized silicone rubber / enzyme layer with immobilized GOD on a substrate for use with a Oxygen electrode

150 Massenanteile Polydimethylsiloxan (z. B. K-1000, FLUKA) werden in 500 Massenanteilen n-Hexan gelöst. 20 Massenanteile 9,10 Epoxydecyl-1-triethoxysilan werden dazu gegeben und vermischt. Diese Lösung wird mit 10 Massenanteile K-11 (FLUKA) als Vernetzer versetzt und vermischt. Durch die Variation der Menge an n-Hexan kann die resultierende Dicke auf dem Trägermaterial/Biosensor eingestellt werden. Eine Cuprophan® Dialysierfolie wird in Wasser eingeweicht und über ein Rollrandglas aufgezogen. Beim Trocknen spannt sich diese Membran über das Gefäß und bildet eine glatte Oberfläche. Von der beschriebenen Lösung wird dann 10 µl durch Auftropfen, dip-coating oder andere Verfahren auf die Cuprophan® Dialysierfolie aufgebracht. Die entstandene Silicongummi/Cuprophan® Dialysierfolie- Membran wird über 12 Stunden getrocknet, wobei das Silicongummi vulkanisiert.150 parts by mass of polydimethylsiloxane (e.g. K-1000, FLUKA) are in 500 Mass fractions of n-hexane dissolved. 20 parts by mass 9.10 epoxydecyl-1-triethoxysilane are added and mixed. This solution comes with 10 parts by mass of K-11 (FLUKA) added as a crosslinker and mixed. By varying the amount of n-hexane  the resulting thickness can be set on the substrate / biosensor will. A Cuprophan® dialysis film is soaked in water and over a Rolled edge glass pulled up. When drying, this membrane stretches over the Vessel and forms a smooth surface. Then from the solution described 10 µl by dripping, dip-coating or other processes on the Cuprophan® Dialysis foil applied. The resulting silicone rubber / Cuprophan® dialysis film The membrane is dried over 12 hours, during which the silicone rubber is vulcanized.

Zur Immobilisierung werden 5 U/µl Glucoseoxidase in 0,1 M Phosphat-Puffer (KH2PO4/Na2HPO4.2 H2O) gelöst. 10 µl dieser Immobilisierungslösung werden vorsichtig auf die gasdurchlässige Membran aufgebracht und die Immobilisierungsanordnung ca. 16 h bei 4°C stehen gelassen. Danach wird diese Schicht mit 10 µl deionisiertem Wasser benetzt, wieder eingetrocknet und anschließend wird die Oberfläche der Membran mit deionisiertem Wasser oder Pufferlösung gespült. Diese Membran wird über eine Sauerstoffelektrode mit einem O-Ring gespannt.For immobilization, 5 U / µl glucose oxidase are dissolved in 0.1 M phosphate buffer (KH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 .2 H 2 O). 10 μl of this immobilization solution are carefully applied to the gas-permeable membrane and the immobilization arrangement is left to stand at 4 ° C. for about 16 h. Then this layer is wetted with 10 μl of deionized water, dried again and then the surface of the membrane is rinsed with deionized water or buffer solution. This membrane is stretched over an oxygen electrode with an O-ring.

Eine Glucosemessung ergab eine Empfindlichkeit von 1,33 nA µM⁻1.A glucose measurement showed a sensitivity of 1.33 nA µM⁻ 1 .

Claims (12)

1. Biosensor bestehend aus einem membranbedeckten Transducer und einer immobilisierten biologischen Komponente, dadurch gekennzeichnet, daß
  • - die Herstellung der gasdurchlässigen Membran auf dem Transducer und ihre Modifikation durch Einbringen von funktionellen Gruppen in einem einzigen Arbeitsschritt geschieht und
  • - sich bei der Immobilisierung zwischen der gasdurchlässigen Membran des Transducers und der biologischen Komponente über die in die Membran eingebrachten funktionellen Gruppen kovalente Bindungen ausbilden.
1. Biosensor consisting of a membrane-covered transducer and an immobilized biological component, characterized in that
  • - The production of the gas-permeable membrane on the transducer and its modification by introducing functional groups in a single step and
  • - During immobilization, covalent bonds form between the gas-permeable membrane of the transducer and the biological component via the functional groups introduced into the membrane.
2. Biosensor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der gasdurchlässigen Membran um ein Mehrkomponentensilicongummi handelt, dessen eine Komponente, zumindestens teilweise, durch eine, für die Kondensationsreaktion äquivalente, aber zusätzlich funktionalisierte Komponente ersetzt wurde.2. Biosensor according to claim 1, characterized in that it is in the gas permeable membrane is a multi-component silicone rubber, one component, at least in part, by one for which Condensation reaction equivalent, but additionally functionalized component was replaced. 3. Biosensor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der funktionalisierten Komponente um das Alkoxysilan handelt.3. Biosensor according to claim 2, characterized in that it is in the functionalized component is the alkoxysilane. 4. Biosensor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem funktionalisierten Alkoxysilan um ein amino- oder epoxy- oder aldehyd- oder carboxyl- oder thiol- oder cyanat- oder isocyanat-funktionalisiertes Alkoxysilan oder eine Kombination der funktionalisierten Alkoxysilane handelt.4. Biosensor according to claim 3, characterized in that it is in the functionalized alkoxysilane by an amino or epoxy or aldehyde or carboxyl- or thiol- or cyanate- or isocyanate-functionalized alkoxysilane or a combination of the functionalized alkoxysilanes. 5. Biosensor nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Komponente um ein Enzym handelt.5. Biosensor according to claim 1 to 4, characterized in that it is in the biological component is an enzyme. 6. Biosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um eine Oxidase handelt.6. Biosensor according to claim 5, characterized in that it is the enzyme is an oxidase. 7. Biosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um eine Oxygenase handelt. 7. Biosensor according to claim 5, characterized in that it is the enzyme is an oxygenase.   8. Biosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um eine Hydrolase handelt.8. Biosensor according to claim 5, characterized in that it is the enzyme is a hydrolase. 9. Biosensor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um eine Decarboxylase handelt.9. Biosensor according to claim 5, characterized in that it is in the Enzyme is a decarboxylase. 10. Biosensor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Komponente um Mikroorganismen handelt.10. Biosensor according to claim 4, characterized in that it is in the biological component is microorganisms. 11. Biosensor nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen elektrochemischen Transducer handelt.11. Biosensor according to claim 1 to 4, characterized in that it is a electrochemical transducer. 12. Biosensor nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um einen optischen Transducer handelt.12. Biosensor according to claim 1 to 4, characterized in that it is a optical transducer.
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