DE19708537A1 - Novel surface protein (SpsA protein) of Streptococcus pneumoniae etc. - Google Patents

Novel surface protein (SpsA protein) of Streptococcus pneumoniae etc.

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DE19708537A1 DE1997108537 DE19708537A DE19708537A1 DE 19708537 A1 DE19708537 A1 DE 19708537A1 DE 1997108537 DE1997108537 DE 1997108537 DE 19708537 A DE19708537 A DE 19708537A DE 19708537 A1 DE19708537 A1 DE 19708537A1
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Gursharan Singh Dr Chhatwal
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Abstract

The invention relates to a novel surface protein (SPsA protein) of streptococcus pneumoniae, deleted derivatives of the surface protein, an expression system for the surface protein and its derivatives as well as a vaccine that uses them.

Description

Streptococcus pneumoniae (Pneumokokken) sind gram-positive Bak terien, die von einem Kapselpolysaccharid umgeben sind und erstmals 1881 von einem gesunden Träger isoliert werden konnten (1). Streptococcus pneumoniae (pneumococcal) are gram-positive Bak criteria, which are surrounded by a capsular polysaccharide and for the first time in 1881 could be isolated from a healthy carrier (1). Pneumokokken gehören zur natürlichen Flora des oberen men schlichen Respirationstrakts und kolonisieren den Nasopharynx in bis zu 40% der gesunden Erwachsenen, wobei bis zu vier verschiedene Serotypen über mehrere Monate nachgewiesen werden konnten (2). Pneumococcal belong to the natural flora of the upper respiratory tract and men crept colonize the nasopharynx of up to 40% of healthy adults, where up to four different serotypes could be detected over several months (2). Streptococcus pneumoniae ist in den USA und vielen anderen Teilen der Welt ein häufiger Verursacher von Infektio nen. Streptococcus pneumoniae is a common cause of NEN Infektio in the US and many other parts of the world. Die Infektionen, die meist endogen erfolgen, und Todesfälle treten vor allem bei sehr jungen Kindern unter 2 Jahren, bei Per sonen über 60 Jahren sowie bei immungeschwächten Personen auf (3). The infections, which usually take place endogenously, and deaths mainly occur in very young children under 2 years, at Per sonen over 60 years and in immunocompromised persons (3).

Des weiteren sind Pneumokokken die zweithäufigsten Verursacher von bakterieller Meningitis (nach Haemophilus influenzae Typ b) (4) und Otitis Media (Mittelohrentzündung) bei Kindern (5). Furthermore, pneumococci are the second most common cause of bacterial meningitis (after Haemophilus influenzae type b) (4) and otitis media (middle ear infection) in children (5). So verursachten Pneumokokken allein in den USA innerhalb eines Jahres 500 000 Pneumonien, 7 Millionen Fälle von Otitis Media und 40 000 Todesfälle (6, 7). So caused pneumococci in the US alone within one year 500,000 pneumonia, 7 million cases of otitis media and 40,000 deaths (6, 7).

Auch die Sterblichkeitsrate bei den durch Streptococcus pneu moniae verursachten Erkrankungen liegt, trotz der zur Verfügung stehenden Antibiotika, auf einem konstant hohen Niveau. Also, the mortality rate for the damage caused by Streptococcus pneu moniae diseases is, in spite of the available antibiotics, at a constant high level. Zum Bei spiel betrug die Sterblichkeit bei Bakteriämien, die durch Pneu mokokken verursacht wurden, in den letzten vier Jahrzehnten zwi schen 25 und 29% (8). When playing for the mortality was at bacteremia caused by mokokken Pneu, Zvi rule in the last four decades 25 and 29% (8).

Aufgrund der Zusammensetzung der Kapselpolysaccharidstrukturen werden Pneumokokken in 90 Serotypen unterteilt (9). Due to the composition of the Kapselpolysaccharidstrukturen pneumococcal be divided into 90 serotypes (9). Das Kapsel polysaccharid schützt die Pneumokokken vor der Phagozytose durch polymorphkernige Leukozyten (PMN's), verhindert die Aktivierung des alternativen Weges des Komplements (10, 11, 12) und ist daher ein wichtiger Virulenzfaktor von Streptococcus pneumoniae (13, 14, 15). The capsule polysaccharide protects the pneumococci prior to phagocytosis by polymorphonuclear leukocytes (PMN's), prevents activation of the alternative pathway of complement (10, 11, 12) and is therefore an important virulence factor of Streptococcus pneumoniae (13, 14, 15).

Die Virulenz des Stammes ist in Bezug auf die Kapsel abhängig von der chemischen Zusammensetzung des Polysaccharids und nicht von der Größe des Kapselpolysaccharids (16). The virulence of the strain is dependent on the chemical composition of the polysaccharide and not by the size of the capsular polysaccharide (16) with respect to the capsule.

Der zur Zeit verwendete Impfstoff (Pneumokokken-Vakzin) zur ak tiven Immunisierung enthält die unkonjugierte Form von 23 Kap selpolysacchariden von Streptococcus pneumoniae. The vaccine (pneumococcal vaccine) currently used for ak tive immunizing contains the unconjugated form of Cape selpolysacchariden 23 of Streptococcus pneumoniae. Dieser Impf stoff enthält die Polysacccharide der Serotypen, die 85-90 Pro zent der bakteriämischen Infektionen verursachen. This vaccine contains the substance Polysacccharide of serotypes cent 85-90 per cause of bacteremic infections. Da bei Kindern und älteren Menschen keine Stimulation der T-Helferzellen durch ein Polysaccharidantigen erfolgt (17), ist die Anwendung dieses Impfstoffes ausschließlich auf Erwachsene beschränkt. As in children and the elderly no stimulation of T-helper cells by attaching a polysaccharide antigen takes place (17), the use of this vaccine is restricted to adults.

Ein weiteres Problem der Behandlung bei Pneumokokken-Infektionen ist das weltweit verstärkte Auftreten von antibiotikaresistenten Stämmen (Penicillin-Resistenz) (18). Another problem of the treatment of pneumococcal infections is the world increased occurrence of antibiotic-resistant strains (penicillin resistance) (18). Außerdem führt der Einsatz von β-Laktam-Antibiotika bei empfindlichen Stämmen von Strepto coccus pneumoniae in 30% der behandelten Kindern zum Tod oder es verbleiben permante, irreversible Gehirnschäden. In addition, the use of β-lactam antibiotics in susceptible strains of Strepto coccus pneumoniae in 30% of treated children leading to death or permante remain there, irreversible brain damage. Die Bakte rien werden durch β-Laktam-Antibiotika lysiert und die freiwer denden Zellwandbestandteile verursachen eine Anschwellung des Gehirns. The Bakte criteria are lysed by β-lactam antibiotics and the freiwer Denden cell wall components cause a swelling of the brain. Die Schwellung des Gehirns führt dann zu einem gefähr lich hohen interkranialen Druck, der einen irreversiblen Schaden auslöst (19). The swelling of the brain leads to a dangerous Lich high intracranial pressure, which causes irreversible damage (19).

Aufgrund der steigenden Antibiotikaresistenz und der einge schränkten Wirkung des Polysaccharid-Vakzins, besteht ein großes Interesse am Auffinden eines Pneumokokken-Proteins, das als Trä ger für die Kapselpolysaccharide fungieren kann oder das auf grund seiner eigenen starken Immunogenität und des ubiquitären Vorkommens bei Streptococcus pneumoniae Isolaten all präventiver Impfstoff Verwendung finden kann. Due to the increasing antibiotic resistance and is restricted effect of the polysaccharide vaccine, there is great interest in finding a pneumococcal protein can act as Trä ger for the capsular polysaccharides or on the basis of its own strong immunogenicity and the ubiquitous occurrence in Streptococcus pneumoniae isolates can be used all preventive vaccine.

Die zur Zeit als Vakzin-Kandidaten in Frage kommenden Proteine sind das Autolysin (20), die Neuraminidase (21), das pneumo coccal surface adhesin A (PsaA) (22), das pneumococcal surface protein A (PspA) (23) sowie das Pneumolysin (24). The currently as vaccine candidates candidate proteins are the autolysin (20), neuraminidase (21), the pneumo coccal surface adhesin A (PsaA) (22), the pneumococcal surface protein A (PspA) (23) and the pneumolysin (24).

Pneumolysin ist ein intrazelluläres Protein und gehört zu der Familie der Thiol-aktivierten Toxine (25). Pneumolysin is an intracellular protein and belongs to the family of thiol-activated toxins (25). Dieses cytoplasmati sche 53 kDa große Protein wird freigesetzt, wenn die Pneumokoc ken unter dem Einfluß des Autolysins spontan lysieren. This cytoplasmati specific 53 kDa protein is released when the Pneumokoc ken lyse spontaneously under the influence of autolysin. In hohen Konzentrationen bilden sich auf Säugetierzellen Oligomere des Pneumolysins und verursachen durch einen Anstieg der transmem branen Poren eine Zellyse. In high concentrations, form on mammalian cells oligomers of the pneumolysin and cause by an increase in pore membranes TRANSMEM cell lysis. In geringeren Konzentrationen stimu liert Pneumolysin die Produktion von inflammatorischen Cytokinen (26), zerstört in vitro Monolayer der Epithelzellen des oberen respiratorischen Trakts (27) und vermindert die bakterizide Ak tivität und Wanderung der Neutrophilen (28). stimu in lower concentrations lines pneumolysin the production of inflammatory cytokines (26) destroyed in vitro monolayer of epithelial cells upper respiratory tract (27) and reduces the bactericidal tivity Ak and migration of neutrophils (28). Des weiteren akti viert Pneumolysin bei Abwesenheit von anti-Toxin Antikörpern den klassischen Komplementweg (29). Furthermore akti fourth pneumolysin in the absence of anti-toxin antibodies the classical complement pathway (29).

Das pneumoccocal surface protein A (PspA) ist ein Oberflächen protein mit struktureller und antigenetischer Variabilität zwi schen den verschiedenen Pneumokokken-Stämmen, dessen Funktion bisher nicht aufgeklärt ist. The pneumoccocal surface protein A (PspA) is a surface protein with structural and anti-genetic variability interim rule different pneumococcal strains, whose function is not yet understood. PspA kommt in den meisten klini schen Isolaten vor (30) und ist auch wichtig für die Entwicklung der vollen Virulenz der Pneumokokken (31, 32). PspA is used in most Klini rule isolates front (30) and is also important for the development of the full virulence of pneumococci (31, 32).

Weitere bekannte Virulenzfaktoren sind eine IgA1-Protease ( 33 ), deren Gen kloniert und charakterisiert wurde (34, 35), ein Inhi bitor der Elastase (36) und Peptidpermeasen, die homolog zu Permeasen von anderen Streptokokken, die ebenfalls den Naso pharynx besiedeln, sind. Other known virulence factors are an IgA1 protease (33), whose gene was cloned and characterized (34, 35), a inhi bitor of elastase (36) and Peptidpermeasen homologous to permeases from other streptococci which also colonize the naso pharynx, are. Von besonderem Interesse sind dabei die Permeasen, bei denen der Verlust der Funktion eine verminderte Adhärenz der Pneumokokken an eukaryotische Zellen zur Folge hat (37). here are the Permeases in which the loss of function in a reduced adherence of the pneumococcus to eukaryotic cells results in (37) of particular interest. Der Nachweis für eine direkte Beteiligung dieser Permea sen, von denen die AmiA-Permease und das PlpA (permease-like protein A) zur Familie der Protein-abhängigen Permeasen gehören, die für den Transport von kleinen Peptiden verantwortlich sind (38, 39) an der Adhärenz an eukaryotische Zellen konnte bisher aber nicht erbracht werden. Evidence for a direct involvement of these permeation sen, of which the AmiA permease and PlpA (permease-like protein A) belong to the family of protein-dependent Permeases who are responsible for the transport of small peptides (38, 39) at adherence to eukaryotic cells could not be provided so far though. Als ein weiterer potentieller Regu lator der Pneumokokken-Adhärenz wird die Pyruvatoxidase, SpxB, angesehen, die die Konzentration des Acetylphosphats beeinflußt (40). As another potential regu lator of pneumococcal adherence, the pyruvate, SpxB considered that affects the concentration of Acetylphosphats (40).

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Oberflächenprotein von Streptococcus pneunomiae (SpsA-Protein) vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es an sekretorisches IgA (sIgA) bindet. According to one embodiment of the invention, a surface protein of Streptococcus pneunomiae (SpsA protein) is provided which is characterized in that it binds to secretory IgA (sIgA).

Das erfindungsgemäße Oberflächenprotein kann gekennzeichnet sein durch 523 Aminosäuren gemäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 523). The surface protein according to the invention may be characterized by 523 amino acids according to Fig. 2 (positions 1 to 523).

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein C-terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins gemäß der Erfindung vorgesehen, der gekennzeichnet ist durch 324 Aminosäuren gemäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 324) und According to another embodiment, a C-terminal is provided according to the invention of deleted derivative of the surface protein, which is characterized by 324 amino acids according to Fig. 2 (positions 1 to 324) and
Repeats 1 bis 6 (Positionen 325 bis 444) oder Repeats 1 to 6 (positions 325-444) or
Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder Repeats 1 to 7 (positions 325-464) or
Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485). Repeats 1 to 8 (positions 325 to 484 or to 485).

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein N-terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins gemäß der Erfindung vorgesehen, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er According to a further embodiment, an N-terminal-deleted derivative of the surface protein of the invention is provided, which is characterized in that it

  • (i) im Bereich der Positionen 1 bis 159 gemäß Fig. 2 um 1 bis maximal 159 Aminosäuren deletiert ist, (i) is deleted in the region of positions 1 to 159 of FIG. 2 to 1 to a maximum of 159 amino acids,
  • (ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 523 dele tiert ist. but (ii) does not dele in the region of positions 160-523 is advantage.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein N-terminal und C- terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins gemäß der Erfindung vorgesehen, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er According to a further embodiment, an N-terminal and C-terminal-deleted derivative of the surface protein is provided according to the invention, which is characterized in that it

  • (i) im Bereich der Positionen 1 bis 159 gemäß Fig. 2 um 1 bis maximal 159 Aminosäuren deletiert ist, (i) is deleted in the region of positions 1 to 159 of FIG. 2 to 1 to a maximum of 159 amino acids,
  • (ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 324 dele tiert ist und but (ii) does not dele in the region of positions 160-324 is advantage and
  • (iii) Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485) oder Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder Repeats 1 bis 6 (Positionen 325 bis 444) aufweist. (iii) has repeats of 1 to 8 (positions 325 to 484 or to 485) or repeats 1 to 7 (positions 325-464) repeats or 1 to 6 (positions 325-444).

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ferner ein Expressionssystem zur Expression eines Oberflächenproteins oder eines Abkömmlings gemäß der Erfindung vorgesehen, umfassend eine DNA-Sequenz, die das Oberflächenprotein oder den Abkömmling kodiert. In another embodiment, an expression system for expression of a surface protein or a descendant is further provided according to the invention comprising a DNA sequence encoding the surface protein, or progeny thereof.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird schließlich eine Vaccine zur Bekämpfung von Erkrankungen durch Streptococcus pneunomiae vorgesehen, herstellbar mit Hilfe eines Oberflächenproteins oder eines Abkömmlings gemäß der Erfindung. According to another embodiment a Vaccine for combating diseases caused by Streptococcus pneunomiae is finally provided, produced with the aid of a surface protein, or a descendant of the invention.

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Figuren, experimenteller Ergebnisse und Beispielenäher erläutert. The invention will be explained with reference to figures of experimental results and examples. Es zeigen: Show it:

Fig. 1 Western blot Analyse von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 [Serotyp 1] (Spur 1), NCTC 10319 [Serotyp 47, R36A] (Spur 2), ATCC 11733 [Serotyp 2, R36A] (Spur 3) und ATCC 12213 [Serotyp 1, I-192R) (Spur 4) mit sekretorischem Immunglobulin A. Zur Detektion der Bindung wurde ein peroxidase markierter anti-human IgA Antikörper eingesetzt. Fig. 1 Western blot analysis of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 [serotype 1] (lane 1), NCTC 10319 [serotype 47, R36A] (lane 2), ATCC 11733 [serotype 2, R36A] (lane 3) and ATCC 12213 [serotype 1, I-192R) (lane 4) with secretory immunoglobulin A. For the detection of binding of a peroxidase labeled anti-human IgA antibody was used.

Fig. 2 Nukleinsäuresequenz des Gens spsA und die Aminosäure sequenz des Proteins SpsA (Streptococcus pneumoniae secretory IgA binding protein) von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 Serotyp 1. RBS: Ribosomale Bindungsstelle; Fig. 2 nucleic acid sequence of the gene SPSA and the amino acid sequence of the protein SpsA (Streptococcus pneumoniae secretory IgA binding protein) of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 serotype 1. RBS: ribosome binding site; Leader: Signalsequenz von SpsA (Aminosäure 1-37); Leader: Signal sequence of SpsA (amino acid 1-37); mature Protein: SpsA nach der Pro zessierung; mature protein: SpsA zessierung after the Pro; Repeats: 9 jeweils 20 Aminosäuren lange, sich wie derholende Sequenzen. Repeats: 9 are each 20 amino acids long, as derholende sequences.

Fig. 3 Western blot Analyse mit sIgA nach Klonierung von spsA und spsA-Fragmenten in den Expressionsvektor pQE (Pharmacia) und Überexpression der Proteine in Escherichia coli M15 [pREP4). Fig. 3 Western blot analysis with sIgA after cloning of SPSA and the SPSA fragments into the expression vector pQE (Pharmacia) and overexpression of the proteins in Escherichia coli M15 [pREP4). Spur 1: SpsA (AS1-523; pQSHA12); Lane 1: SpsA (AS1-523; pQSHA12); Spur 2: N-Terminus von SpsA (AS1-324; pQSHA14); Lane 2: N-terminus of SpsA (AS1-324; pQSHA14); Spur 3: verkürzter N-Terminus von SpsA (AS1- 159; pSHA3); Lane 3: truncated N-terminus of SpsA (AS1 159; pSHA3); Spur 4: Repeats von SpsA (AS325-523; pQSHA30). Lane 4: repeats of SpsA (AS325-523; pQSHA30).

Fig. 4 Southern blot Analyse von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 [Serotyp 1] (Spur 1) und Streptococcus pneumoniae ATCC 11733 [Serotyp 2, R36A) (Spur 2) mit einer 32 Phosphor radioaktiv markierten DNA-Sonden von spsA (A), von einem 5'-spsA Fragment [nt1-nt476] (B) und pspA (C). Fig. 4 Southern blot analysis of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 [serotype 1] (lane 1) and Streptococcus pneumoniae ATCC 11733 [serotype 2, R36A) (lane 2) with a 32 phosphorus radiolabeled DNA probes of SPSA (A), from a 5'-fragment SPSA [nt1-nt476] (B) and pspA (C). nt: Nukleotid. nt: nucleotide.

Ergebnisse Results

In Bindungsstudien mit radioaktiv markiertem humanem sekretori schen Immunglobulin A (sIgA) und in Western-blots mit humanem sIgA konnte nachgewiesen werden, daß Streptococcus pneumoniae sekretorisches IgA bindet. In binding studies with radiolabeled human sekretori's immunoglobulin A (sIgA) and in Western blots with human sIgA could be shown that Streptococcus pneumoniae binds secretory IgA. Auf die Fähigkeit sIgA zu binden, wurden sowohl klinische Isolate als auch Stämme aus den Type Culture Collections (ATCC bzw. NCTC) der häufigsten Serotypen klinischer Isolate getestet. The ability to bind sIgA, both clinical isolates and strains from the Type Culture Collections (ATCC or NCTC) were tested the most common serotypes of clinical isolates. Von den untersuchten Pneumokokken- Stämmen konnten im Western-blot 73% sIgA binden ( Fig. 1). Of the studied pneumococcal strains in the Western blot 73% sIgA (Fig. 1) could bind. Des weiteren konnte in Bindungsstudien gezeigt werden, nach Verdau der Pneumokokken-Proteine mit Protease, daß die Bindung von se kretorischem IgA durch ein Protein von Streptococcus pneumoniae erfolgt. Further it could be shown in binding studies, after digestion of pneumococcal proteins with protease, that the binding of IgA se kretorischem done by a protein from Streptococcus pneumoniae.

Die Detektion des Gens, das für das sIgA-Bindungsprotein ko diert, erfolgte durch Screening einer LambdaZAP-Expressionsbank von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 (Serotyp 1) mit sekreto rischem IgA. The detection of the gene for the diert sIgA binding protein ko was carried out by screening a LambdaZAP expression library of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 (serotype 1) with sekreto rischem IgA. Der ausgewählte positive Klon, pSHA1, hat ein 5085 bp großes Insert von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 im Pha gemid pBK-CMV. The selected positive clone pSHA1, has a 5085 bp insert of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 in Pha gemid pBK-CMV. Durch die Konstruktion von Deletionsklonen von pSHA1 konnte das für das sIgA-Bindungsprotein kodierende Gen im Subklon pSHA2 nachgewiesen werden. By the construction of deletion clones of pSHA1 the gene coding for the subclone pSHA2 sIgA binding protein could be detected. Der Subklon pSHA2 zeigte im Gegensatz zu den beiden anderen Subklonen pSHA3 und pSHA4 eine Bindung des sekretorischen IgA im Western-blot. The subclone pSHA2 was in contrast to the other two subclones pSHA3 and pSHA4 binding of the secretory IgA in the Western blot. Die Sequenzie rung und anschließende Analyse der Sequenz des 2204 großen In serts zeigte ein offenes Leseraster von Nukleotid 282 bis 1853 in pSHA2 ( Fig. 2). The Sequenzie tion and subsequent analysis of the sequence of the large 2204 In Sert showed an open reading frame from nucleotide 282-1853 in pSHA2 (Fig. 2). Dieses 1572 bp große Leseraster kodiert für ein 523 Aminosäuren großes sIgA-Bindungsprotein von Pneumokokken des Serotyps 1. Das Molekulargewicht des SpsA (Btreptococcus pneumoniae secretory IgA binding-protein) genannten Proteins be trägt 59151 Da ( Fig. 2). This 1572 bp reading frame encoding large sIgA binding protein of pneumococci of serotype 1. The molecular weight of SpsA (Btreptococcus pneumoniae secretory IgA binding protein) said protein be bears 59151 Da (Fig. 2) for a 523 amino acids.

Der Vergleich der Nukleotidsäuresequenz von spsA mit den in der EMBL-Datenbank gespeicherten Sequenzen zeigte eine 78,8%-ige Identität zum pspA von Streptococcus pneumoniae. The comparison of the nucleotide acid sequence of SPSA with the data stored in the EMBL database sequences showed 78.8% identity to the pspA of Streptococcus pneumoniae. Auf Pro teinebene wurde eine 64,1%-ige Identität zum PspA nachgewiesen. On a pro teinebene a 64.1% identity to PspA has been demonstrated. Die Identität beschränkt sich dabei vor allem auf den C-Terminus der beiden Proteine. The identity is limited primarily to the C-terminus of the two proteins. Der C-Terminus des PspA besteht aus zehn Repeats, die jeweils 20 Aminosäuren lang sind (41). The C-terminus of PspA consists of ten repeats, which are each 20 amino acids in length (41). Die Identi tät zum C-Terminus von SpsA, der aus neun Repeats besteht, be trägt 92,5%. The identi ty to the C-terminus of SpsA, which consists of nine repeats, be carrying 92.5%.

Die Repeats von PspA sind an der Anheftung des Proteins an der Pneumokokken-Zellwand beteiligt. The repeats of PspA are involved in the attachment of the protein to the pneumococcal cell wall. Dieser Mechanismus erfordert eine Cholin vermittelte Interaktion zwischen der membranassozi ierten Lipoteichonsäure und der Repeatregion von PspsA (42). This mechanism requires a choline-mediated interaction between the membranassozi ierten lipoteichoic acid and the repeat region of PspsA (42). Zur Anheftung an die Zellwand müssen mindestens sechs der 20 Amino säuren langen Repeats exprimiert werden, ansonsten kommt es zu einer Sekretion des PspA (42, 43). For attachment to the cell wall must be at least six of the 20 amino acids long repeats are expressed, otherwise there is a secretion of PspA (42, 43).

Da der C-Terminus von SpsA, dh die Region der Repeats von SpsA, zu 92,5% identisch mit den Repeats von PspA ist, kann eine Beteiligung der SpsA-Repeats an der Anheftung an die Zell wand der Pneumokokken angenommen werden. Since the C-terminus of SpsA, ie the region of the repeats of SpsA is identical with the repeats of PspA to 92.5%, a contribution from the SpsA repeats at the attachment to the cell wall of pneumococcus are accepted. Dieser Mechanismus der Anheftung von SpsA wird unterstützt durch die Tatsache, daß eine Computeranalyse der Sekundärstruktur von SpsA keine helikale transmembranöse Struktur detektierte, die für eine Verankerung des Proteins in der gram-positiven Zellwand notwendig wäre. This mechanism of attachment of SpsA is supported by the fact that a computer analysis of the secondary structure of SpsA detected no helical transmembrane structure which would be necessary for anchoring the protein in the gram-positive cell wall.

Des weiteren deuteten frühere Ergebnisse darauf hin, daß das 3'- Ende von pspA eine konservierte Sequenz ist, die homolog zu an deren Sequenzen bei Streptococcus pneumoniae ist. Furthermore indicated earlier results indicate that the 3 'end of pspA is a conserved sequence that is homologous to at whose sequences in Streptococcus pneumoniae. Diese homolo gen Sequenzen könnten für Proteine kodieren, die einen ähnlichen Anheftungsmechanismus an die Zellwand haben wie das pneumococcal surface protein A (PspA) (44). This homologated gen sequences could encode proteins that have similar Anheftungsmechanismus to the cell wall as the pneumococcal surface protein A (PspA) (44).

Die Identität im N-Terminus der beiden Proteine SpsA und PspA beträgt nur von 34,5%. The identity of the N-terminus of the two proteins SpsA and PspA is only 34.5%. Die Signalsequenz (Leader) von SpsA ist 37 Aminosäuren lang und zeigt eine 75,7%-ige Identität zur Si gnalsequenz des IgA-Rezeptors von Streptococcus agalactiae (45, 46) The signal sequence (leader) of SpsA is 37 amino acids long and shows a 75.7% identity to the Si gnalsequenz the IgA receptor from Streptococcus agalactiae (45, 46)
Zur Aufklärung der Bindungsdomaine wurden i) spsA (pQSH12), ii) der N-Terminus (pQSH14) und iii) die Nukleinsäuresequenz, die für die neun Repeats von SpsA kodiert (pQSH30), in den Expres sionsvektor pQE30 kloniert und die sIgA-Bindung im Western-blot untersucht. To elucidate the binding domain i) SPSA (pQSH12) were ii) the N-terminus (pQSH14) and iii) the nucleic acid sequence encoding for the nine repeats of SpsA (pQSH30) cloned into the Expres sion vector pQE30 and sIgA bond examined by Western blot. Die Analyse im Western-blot zeigte eine Bindung des sekretorischen IgA im N-Terminus von SpsA. The analysis in the Western blot showed binding of the secretory IgA in the N-terminus of SpsA. Zusätzlich konnte die Bindungsdomaine von SpsA durch einen weiteren Subklon von pSHA1, der nur die Aminosäuren 1 bis 159 des N-Terminus von SpsA expri miert (pSHA3) und sIgA nicht bindet, auf die Aminosäuren 160 bis 324 eingeengt werden ( Fig. 3). In addition, the binding domain of SpsA could by another subclone of pSHA1, the mized only the amino acids 1 to 159 of the N-terminus of SpsA expri (pSHA3) and sIgA does not bind, are concentrated to the amino acids 160-324 (Fig. 3).

Durch Southern-blot Analyse von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 (Serotyp1) und S. pneumoniae ATCC 11733 (Serotyp 2, R36A) konnte mit einer pspA-, spsA und einer 5'-spsA spezifischen DNA- Sonde nachgewiesen werden, daß spsA nicht identisch mit pspA ist ( Fig. 4). By Southern blot analysis of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 (serotype 1) and S. pneumoniae ATCC 11733 (serotype 2, R36A) could be detected with a pspA, SpsA and a 5'-specific DNA probe SPSA that SPSA not identical to pspA (Fig. 4).

Mit diesen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß die C- terminale Sequenz von spsA eine der beschriebenen konservierten Sequenzen ist, die zu pspA homolog sind und bei Streptococcus pneumoniae an der Anheftung der Proteine an die Zellwand betei ligt ist. These studies have demonstrated that the C-terminal sequence of SPSA is one of the conserved sequences described, which are homologous to pspA and Streptococcus pneumoniae in the attachment of the proteins to the cell wall is BETEI ligt.

SpsA kodiert daher für ein neues Oberflächenprotein von Strepto coccus pneumoniae, dessen biologische Funktion die Bindung von sekretorischem Immunglobulin A im N-Terminus von SpsA ist. Therefore, SpsA encodes a novel surface protein of Strepto coccus pneumoniae, whose biological function is the binding of secretory immunoglobulin A in the N-terminus of SpsA.

Das sekretorische IgA, das aus einem IgA-J-IgA-SC (SC: sekreto rische Komponente) Komplex besteht, ist das wichtigste Immuno globulin im humanen respiratorischen und gastrointestinalen Trakt. The secretory IgA of an IgA-J-IgA-SC (SC: sekreto generic component) is complex, is the most important immuno globulin in the human respiratory and gastrointestinal tract. Die Vorstufe des sekretorischen IgA, ein IgA-Dimer ver bunden durch die 15,6 kDa große J-Kette, wird in B-Lymphozyten synthetisiert und bindet an einen auf der basolateralen Oberflä che der Epithelzellen lokalisierten poly-Immunglobulin Rezeptor. The precursor of the secretory IgA, an IgA dimer ver great connected by the 15.6 kDa J chain is synthesized in B lymphocytes and binds to a surface of the epithelial cells on the basolateral Oberflä localized poly-immunoglobulin receptor. Dieser poly-Ig-Rezeptor vermittelt die Transzytose durch die Zellen (47). This poly-Ig receptor mediated transcytosis through the cells (47). Dabei wird der c-terminale Teil des Rezeptors abge trennt und zur sekretorischen Komponente des (IgA) 2 -J-Ketten Komplex. Here, the c-terminal part of the receptor is abge separates and secretory component of (IgA) 2 -J-chain complex. Nach Transport an die apikale Membran der Zellen, fu sioniert der Komplex mit der Membran und wird als sekretorisches IgA freigesetzt (48). After transport to the apical membrane of the cells, fu the complex-dimensioned with the membrane and released as secretory IgA (48). Die sekretorische Komponente, die durch eine Disulfidbrücke kovalent an den Komplex gebunden ist, schützt das synthetisierte sIgA in externen Flüssigkeiten vor Denaturierung und Proteolyse. The secretory component, which is bonded by a disulfide bond covalently to the complex, the synthesized sIgA protects external liquids prior to denaturation and proteolysis.

Untersuchungen zur Adhärenz der Pneumokokken an humane Epithel zellen zeigten eine Adhärenz von größer als 100 Pneumokokken pro Epithelzelle für Stämme, die in den Bindungsstudien sIgA gebun den hatten, aber nur eine Adhärenz von ≦ 2 Pneumokokken für in Bindungsstudien negativ getestete Stämme. Investigations on the adherence of the pneumococcus to human epithelial cells showed adherence of greater than 100 per epithelial cell pneumococcal strains for which TIALLY in the binding studies sIgA had to, but only one adherence of ≦ 2 pneumococci tested negative for binding studies in tribes.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das SpsA an der Adhärenz der Pneumokokken an die Epithelzellen und an der Invasion in die Epithelzellen beteiligt ist. These results indicate that the SpsA on the adherence of pneumococci involved in the epithelial cells and in the invasion of the epithelial cells.

Das sekretorische IgA-Bindungsprotein, SpsA, von Streptococcus pneumoniae ist damit ein aussichtsreicher neuer Kandidat für die Impfstoffentwicklung. The secretory IgA binding protein SpsA, of Streptococcus pneumoniae is therefore a promising new candidate for vaccine development.

Beispiel 1 example 1

Dieses Beispiel beschreibt die sekretorische IgA-Bindung von Streptococcus pneumoniae Stämmen im Western-blot. This example describes the secretory IgA binding of Streptococcus pneumoniae strains in a Western blot.

Die Proteine der Streptococcus pneumoniae Lysate (OD 600 von 1,0 eingestellt und nach Aufnahme der Bakterien in 100 µl Aufschluß lösung (20% Glycerin, 3% SDS, 3% β-Mercaptoethanol, 0,05% Bromphenolblau) 10 Minuten bei 94°C gekocht) wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferriert. The proteins of Streptococcus pneumoniae lysates (OD 600 of 1.0 and adjusted to uptake of the bacteria in 100 ul digestion solution (20% glycerol, 3% SDS, 3% β-mercaptoethanol, 0.05% bromophenol blue) for 10 minutes at 94 ° C cooked) were separated in SDS-PAGE and then transferriert to a nitrocellulose membrane. Nach Absättigung mit 10%-iger Magermilch in 0,1 M PBS wurden die Filter mit sekretischem IgA [1 µg/ml] (Sigma, München, Germany) in 0,1 M PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. After saturation with 10% skimmed milk in 0.1 M PBS the filters with sekretischem IgA were [1 ug / ml] (Sigma, Munich, Germany) in 0.1 M PBS for 1 hour at room temperature with shaking. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 M PBS wurden die Filter 1 Stunde mit einem Goat-Anti Human IgA- HRP-Konjugat Antikörper (ICN, Eschwege, Germany) inkubiert. After washing three times with 0.1 M PBS the filters 1 hour with a Goat anti-human IgA-HRP conjugate antibody (ICN, Eschwege, Germany) were incubated. Die Farbentwicklung erfolgte nach dreimaligem Waschen mit 1 mg 4- Chloro-1-Naphthol und 0,1% H 2 O 2 pro 1 ml PBS. The color was developed after washing three times with 1 mg of 4- chloro-1-naphthol and 0.1% H 2 O 2 per 1 ml of PBS.

Beispiel 2 example 2

Dieses Beispiel beschreibt die Bindung von 125 Jod-markiertem se kretorischem IgA von Streptococcus pneumoniae Stämmen. This example describes the binding of 125 iodine-labeled IgA se kretorischem of Streptococcus pneumoniae strains.

100 ng sIgA in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,5 wurden nach Zugabe von 20 ug Chloramin T mit 350 µCi 125 Jod inkubiert und die Reaktion nach 5 Minuten durch Zugabe von 20 -g Na-Metabisul fit gestoppt. 100 ng sIgA in 1 ml of 0.05 M phosphate buffer pH 7.5 were incubated after addition of 20 ug chloramine T with 350 uCi 125 Iodine and the reaction after 5 minutes by addition of 20-g Na-Metabisul fit stopped. Die markierten Proteine wurden von den nicht mar kierten Proteinen mit einer PD10-Säule (Pharmacia, Freiburg, Germany) abgetrennt und bei -20 °C eingefroren. The labeled proteins were separated from the non-mar-labeled proteins with a PD10 column (Pharmacia, Freiburg, Germany) and frozen at -20 ° C. 250 µl einer Pneumokokkensuspension (Transmission 10% bei 600 nm) in PBST (PBS mit 0,05% Tween 20) wurden mit 0,023 µCi 125 Jod-markiertem sIgA 45 Minuten inkubiert und die Reaktion mit 1 ml PBST abge stoppt. 250 .mu.l of a pneumococcal suspension (10% transmittance at 600 nm) in PBST (PBS with 0.05% Tween 20) were incubated with 0.023 uCi 125-iodine labeled sIgA 45 minutes and the reaction with 1 ml PBST abge stops. Die Messung der sIgA-Bindung an die Streptococcus pneu moniae Stämme erfolgte durch Messung der Aktivität der Bakterien im Gamma-Counter (Packard, Dreieich, Germany). The measurement of sIgA binding to Streptococcus pneu moniae strains was determined by measuring the activity of the bacteria in a gamma counter (Packard, Dreieich, Germany).

Beispiel 3 example 3

Dieses Beispiel beschreibt die Klonierung der chromosomalen DNA von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 in den Vektor Lambda ZAP Express™ und das Screening der Genbank nach einem Streptococcus pneumoniae secretory IgA binding protein (SpsA). This example describes the cloning of the chromosomal DNA of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 in the vector Lambda ZAP Express ™ and the screening of the gene bank for a Streptococcus pneumoniae secretory IgA binding protein (SpsA).

Die chromosomale DNA von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 wurde isoliert, mit Sau3A partiell verdaut und in einem Natrium chloridgradienten, der durch Einfrieren und Auftauen einer 20% igen Natriumchloridlösung gebildet wurde, nach Größe der DNA- Fragmente fraktioniert. The chromosomal DNA of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 was isolated, partially digested with Sau3A and chloridgradienten in sodium, which was formed by freezing and thawing of a 20% sodium chloride solution, fractionated by size fragments of DNA. Die Ligation der 2,0 kb bis 6,0 kb großen DNA-Fragmente der chromosomalen DNA in den BamHI-ge schnittenen Lambda ZAP Express™ und die in vitro Verpackung er folgte mit einem komerziellen Kit nach Angaben des Herstellers (Stratagene, Heidelberg, Germany). The ligation of the 2.0 kb to 6.0 kb DNA fragments of the chromosomal DNA into the Bam HI cut ge Lambda ZAP Express ™ and the in vitro packaging, he followed with a comercial kit according to the manufacturer's instructions (Stratagene, Heidelberg, Germany ). Die Phagengenbank wurde ohne weitere Amplifikation ausplattiert und die rekombinanten Plaques auf die Expression eines sekretorischen IgA-Bindungsprotein un tersucht. The phage library was plated without further amplification and tersucht the recombinant plaques on the expression of a secretory IgA-binding protein un. Der Transfer der Proteine erfolgte auf Nitrozellulose filter, und nach Absättigung mit 10%-iger Magermilch in 0,1 M PBS wurde mit sekretorischem IgA [1 µg/ml] (Sigma, München, Germany) in 0,1 M PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. The transfer of proteins to nitrocellulose filter was carried out, and after saturation with 10% skimmed milk in 0.1 M PBS with secretory IgA [1 ug / ml] (Sigma, Munich, Germany) in 0.1 M PBS for 1 hour incubated at room temperature with shaking. Nach dreimaligem Waschen mit 0,1 M PBS wur den die Filter 1 Stunde mit einem Goat-Anti Human IgA-HRP-Konju gat Antikörper inkubiert. After washing three times with 0.1 M PBS to the filters 1 hour with a Goat anti-human IgA-HRP antibody Konju gat WUR incubated. Die Farbentwicklung erfolgte nach dreimaligem Waschen mit 1 mg 4-Chloro-1-Naphthol und 0,1% H 2 O 2 in 1 ml PBS. The color was developed after washing three times with 1 mg 4-chloro-1-naphthol and 0.1% H 2 O 2 in 1 ml PBS. Positive Plaques wurden isoliert und nach Amplifi kation die in vivo Excision des pBK-CMV Phagmids mit Hilfe des Exassist He1ferphagen und XLOLR System nach den Angaben des Her stellers (Stratagene, Heidelberg, Germany) durchgeführt. Positive plaques were isolated, and after the actuator amplifi in vivo excision of the pBK-CMV phagmid using the ExAssist He1ferphagen and XLOLR system according to the specifications of the Her (Stratagene, Heidelberg, Germany) cation performed.

Beispiel 4 example 4

Dieses Beispiel beschreibt die DNA-Sequenzierung und die Ablei tung der Aminosäuresequenz. This example describes the DNA sequencing and the Ablei tung the amino acid sequence. Die Sequenzierung des 5,085 kb In serts von Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 im Phagemid pBK- CMV, pSHAI genannt, erfolgte durch das ABI PRISM™ Dye Termina tor Cycle Sequencing nach Angaben des Herstellers (Perkin-Elmer, Germany) mit den Vektorprimern T3X (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3') und T7X (5'-TAATACGACTCACTATCGGG-3') sowie den von der erhalte nen Sequenz abgeleiteten Primern (siehe Tabelle). The sequencing of the kb called 5,085 in Sert of Streptococcus pneumoniae ATCC 33400 in phagemid pBK- CMV, PshAI was done by the ABI PRISM ™ Dye Termina tor cycle sequencing according to the manufacturer (Perkin-Elmer, Germany) with the vector primers T3X (5 ' -AATTAACCCTCACTAAAGGG-3 ') and T7X (5'-TAATACGACTCACTATCGGG-3'), and primers derived from the receive NEN sequence (see table). Die Transla tion der Nukleinsäuresequenz in die Aminosäuresequenz erfolgte mit Hilfe des Programms GeneWorks, Version 2.45 (Intelligene tics, Montain View, CA). The Transla tion of the nucleic acid sequence in the amino acid sequence was performed using the Gene Works program, version 2.45 (Intel Ligene tics, Montain View, CA).

Tabelle 1 Table 1

Beispiel 5 example 5

Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der Subklone von pSHA1 und deren Charakterisierung im Western-blot. This example describes the construction of subclones of pSHA1 and their characterization by Western blot. Subklon pSHA2 (nt1-nt2203 von pSHA1) wurde durch Deletion eines 2882 bp großen EcoRI-Fragments erhalten und Subklon pSHA3 (nt1- nt757) durch Deletion eines 4328 bp großen HindIII-Fragments von pSHA1. Subclone pSHA2 (nt1-nt2203 of pSHA1) was obtained by deletion of a 2882 bp EcoRI fragment and subclone pSHA3 (nt1- nt757) by deletion of a 4328 bp HindIII fragment of pSHA1. Ein weiterer Subklon, genannt pSHA4 (nt2952-nt5085 von pSHA1), wurde durch Deletion eines 2133 bp großen SacI-Fragments erhalten. Another subclone, called pSHA4 (nt2952-nt5085 of pSHA1) was obtained by deletion of a 2133 bp SacI fragment.

Die Charakterisierung der Klone erfolgte nach Auftrennung der Proteine des Zellysats [OD 600 von 1,0 eingestellt und nach Auf nahme der Bakterien in 100 µl Aufschlußlösung (20% Glycerin, 3 % SDS, 3% β-Mercaptoethanol, 0,05% Bromphenolblau) 10 Minuten bei 94°C gekocht] der rekombinanten E.coli Zellen im SDS-PAGE und Transfer der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran im Western-blot mit sekretorischem IgA. The characterization of the clones was carried out after separation of the proteins of the cell lysate [OD 600 of 1.0 and set according to the bacteria acceptance in 100 ul lysis solution (20% glycerol, 3% SDS, 3% β-mercaptoethanol, 0.05% bromophenol blue) boiled for 10 minutes at 94 ° C] of the recombinant E. coli cells in SDS-PAGE and transfer of proteins to a nitrocellulose membrane by Western blotting with secretory IgA. Nach Absättigung mit 10% iger Magermilch in 0,1 M PBS wurden die Filter mit sekretori schem 1gA [1 µg/ml] (Sigma, München, Germany) in 0,1 M PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. After saturation with 10% skimmed milk in 0.1 M PBS, the filters were sekretori with schem 1GA [1 ug / ml] (Sigma, Munich, Germany) in 0.1 M PBS for 1 hour at room temperature with shaking. Nach drei maligem Waschen mit 0,1 M PBS wurden die Filter 1 Stunde mit einem Goat-Anti Human IgA-MRP-Konjugat Antikörper inkubiert. After three washes with 0.1 M PBS, the filters were incubated for 1 hour with a Goat anti-human IgA-MRP-conjugate antibodies. Die Farbentwicklung erfolgte nach dreimaligem Waschen mit 1 mg 4- Chloro-1-Naphthol und 0,1% H 2 O 2 pro 1 ml PBS. The color was developed after washing three times with 1 mg of 4- chloro-1-naphthol and 0.1% H 2 O 2 per 1 ml of PBS.

Beispiel 6 example 6

Dieses Beispiel beschreibt die PCR-Amplifikation und Klonierung von spsA, des 5'-Bereichs von spsA (nt1-nt972) und des 3'-Be reichs (nt973-nt1572) von spsA in den Expressionsvektor pQE30 (Pharmacia). This example describes the PCR amplification and cloning of SPSA, the 5 'region of SPSA (nt1-nt972) and the 3'-Be Reich (nt973-nt1572) of SPSA into the expression vector pQE30 (Pharmacia).

Die PCR Primer für spsA und der spsA-Fragmente wurden abgeleitet von der in pSHA1 erhaltenen spsA-Sequenz von Streptococcus pneu moniae ATCC 33400 Serotyp 1. Der 5'-Primer SH22 (5'-GCGCGCG CGCGGATCCTTGTTTGCATCAAAAAGCGAAAG-3') ist 39 bp lang und beginnt mit einem veränderten Startkodon des spsA-Gens (TTG statt ATG). The PCR primers for SPSA and the SPSA fragments were derived from the compound obtained in pSHA1 SPSA sequence of Streptococcus pneu moniae ATCC 33400 serotype 1. The 5 'primer SH22 (5'-GCGCGCG CGCGGATCCTTGTTTGCATCAAAAAGCGAAAG-3') is 39 bp long and begins with an altered start codon of the SPSA gene (TTG ATG instead). Der 5'-Primer für die Repeats, SH24 (5'-GCGCGCGGGCGGATCCACAGGCT GGAAACAAGAAAAC-3'), beginnt mit der Anfangssequenz des ersten Repeats bei Nukleotid 973 des spsA-Gens. The 5 'primer for the repeats, SH24 (5'-GCGCGCGGGCGGATCCACAGGCT GGAAACAAGAAAAC-3'), begins with the beginning of the first sequence repeats at nucleotide 973 of the SPSA gene. Der 3'-Primer von spsASH23 (CTCAGCTAATTAAGCTTGTTTAGTTTACCCATTCACCATTGGC-3'), be ginnt mit dem Stopkodon und der 3'-Primer des N-Terminus, SH25 (5'- CTCAGCTAATTAAGCTTTTTTGGAGTAGATGGTTGTGCTGG-3'), beginnt bei Nukleotid 972 des spsA-Gens. The 3 'primer of spsASH23 (CTCAGCTAATTAAGCTTGTTTAGTTTACCCATTCACCATTGGC-3') be, starts with the stop codon and the 3 'primer of the N-terminus, SH25 (5'CTCAGCTAATTAAGCTTTTTTGGAGTAGATGGTTGTGCTGG-3'), beginning at nucleotide 972 of the SPSA gene. Die Primer SH22-SH23 wurden zur Konstruktion von pQSH12, die Primer SH22-SH25 zur Konstruktion von pQSH14 und die Primer SH24-SH23 zur Konstruktion von pQSH30 genutzt. The primers SH22-SH23 were to construct pQSH12, used the primer SH22-SH25 to construct pQSH14 and primers SH24-SH23 to construct pQSH30. Die 5'-Primer enthielten zur Klonierung eine BamHI Re striktionsschnittstelle, die 3'-Primer eine HindIII Restrik tionsschnittstelle. The 5 'primer contained a BamHI for cloning Re striktionsschnittstelle, the 3' primers tion interface a HindIII restrictive.

Die Amplifikation der genomischen Pneumokokken-DNA mit den 5'- und 3'-Primern (20 pmol jeweils) erfolgte in einem Thermocycler (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany) in einem 100 µl Volumen mit 2,5 Units der Goldstar Taq-Polymerase nach den Angaben des Her stellers (Eurogentec, Seraing, Belgien) und 50 ng chromosomaler DNA. The amplification of the genomic pneumococcal DNA with the 5'- and 3'-primers (20 pmol each) was performed in a thermocycler (MWG-Biotech, Ebersberg, Germany) in a 100 .mu.l volume with 2.5 units Goldstar Taq polymerase according to the information of the Her actuator (Eurogentec, Seraing, Belgium) and 50 ng chromosomal DNA. Die Proben wurden bei 94°C zwei Minuten denaturiert und die Amplifikation erfolgte in 35 Zyklen bestehend aus 1 Minute Denaturierung der DNA bei 94°C, 1 Minute Annealing des Primers bei 55°C und 2 Minuten Extension bei 72°C. The samples were denatured for two minutes at 94 ° C, and the amplification was performed in 35 cycles consisting of 1 minute denaturation of DNA at 94 ° C, 1 minute annealing of the primer at 55 ° C and 2 minutes extension at 72 ° C.

Die Primer SH22 bis SH23 konnten auch für die Amplifikation und Klonierung der spsA-Gene von Streptococcus pneumoniae Serotyp 2 (R36A smooth, ATCC 11733 und D39, NCTC 7466) und Serotyp 47 (R36A rough, NCTC 10319) verwendet werden. The primers SH22 to SH23 were also for the amplification and cloning of the SPSA genes of Streptococcus pneumoniae serotype 2 (R36A smooth, ATCC 11733 and D39, NCTC 7466) and serotype 47 (R36A rough, NCTC 10319) may be used.

Die Primer SH22 bis SH25 konnten auch für die Amplifikation und Klonierung des 5'-Bereichs von Streptococcus pneumoniae Serotyp 47 (R36A rough, NCTC 10319) verwendet werden. The primers SH22 to SH25 could also be used for the amplification and cloning of the 5 'region of Streptococcus pneumoniae serotype 47 (R36A rough, NCTC 10319).

Beispiel 7 example 7

Dieses Beispiel beschreibt die Untersuchung der Adhärenz von Streptococcus pneumoniae Stämmen an humane Epithelzellen. This example describes the study of adherence of Streptococcus pneumoniae strains to human epithelial cells.

Konfluente HEp-2 Larynxkarzinom Zellen oder A549 alveolare Lun genzellen (2×10 5 ), die in DMEM/5% fetales Kälberserum (FCS) wuchsen, wurden nach Waschen der Zellen mit DMEM/1mM HEPES mit 10 7 Pneumokokken in DMEM/1 mM HEPES für 1 Stunde bei 37°C infi ziert. Confluent HEp-2 laryngeal carcinoma cells or A549 alveolar Lun genzellen (2 x 10 5), the fetal in DMEM / 5% calf serum (FCS) grew after washing the cells with DMEM / 1 mM HEPES with 10 7 pneumococcal in DMEM / 1 mM HEPES for 1 hour at 37 ° C infi sheet. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit Methanol fixiert (-20°C, 30 Minuten). The cells were then washed three times with PBS and fixed with methanol (-20 ° C, 30 minutes). Die extrazellulä ren Pneumokokken wurden zur mikroskopischen Auszählung mit Giemsa nach den Angaben des Herstellers (Sigma Diagnostic, Mün chen, Germany) angefärbt. The extrazellulä ren pneumococci were stained for microscopic count with Giemsa according to the manufacturer (Sigma Diagnostics, Munich chen, Germany). Die Anzahl der adhärenten Pneumokokken wurde durch Auszählen von mindestens 100 Epithelzellen bestimmt. The number of adherent pneumococci was determined by counting at least 100 epithelial cells.
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Claims (7)

1. Oberflächenprotein von Streptococcus pneunomiae (SpsA- Protein), dadurch gekennzeichnet , daß es an sekretorisches IgA (sIgA) bindet. 1. Surface protein of Streptococcus pneunomiae (SPSA protein), characterized in that it (sIgA) binds to secretory IgA.
2. Oberflächenprotein nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch 523 Aminosäuren gemäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 523). 2. Surface protein according to claim 1, characterized by 523 amino acids according to Fig. 2 (positions 1 to 523).
3. C-terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins ge mäß Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch 324 Aminosäuren ge mäß Fig. 2 (Positionen 1 bis 324) und 3. C-terminal-deleted derivative of the surface protein accelerator as in claim 1 or 2, characterized by 324 amino acids accelerator as Fig. 2 (positions 1 to 324) and
Repeats 1 bis 6 (Positionen 325 bis 444) oder Repeats 1 to 6 (positions 325-444) or
Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder Repeats 1 to 7 (positions 325-464) or
Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485). Repeats 1 to 8 (positions 325 to 484 or to 485).
4. N-terminal deletierter Abkömmling des Oberflächenproteins ge mäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er 4. N-terminal-deleted derivative of the surface protein accelerator as in claim 1 or 2, characterized in that it
  • (i) im Bereich der Positionen 1 bis 159 gemäß Fig. 2 um 1 bis maximal 159 Aminosäuren deletiert ist, (i) is deleted in the region of positions 1 to 159 of FIG. 2 to 1 to a maximum of 159 amino acids,
  • (ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 523 dele tiert ist. but (ii) does not dele in the region of positions 160-523 is advantage.
5. N-terminal und C-terminal deletierter Abkömmling des Oberflä chenproteins gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er 5. N-terminal and C-terminal-deleted derivative of Oberflä chenproteins according to claim 1 or 2, characterized in that it
  • (i) im Bereich der Positionen 1 bis 159 gemäß Fig. 2 um 1 bis maximal 159 Aminosäuren deletiert ist, (i) is deleted in the region of positions 1 to 159 of FIG. 2 to 1 to a maximum of 159 amino acids,
  • (ii) nicht jedoch im Bereich der Positionen 160 bis 324 dele tiert ist und but (ii) does not dele in the region of positions 160-324 is advantage and
  • (iii) Repeats 1 bis 8 (Positionen 325 bis 484 oder bis 485) oder (Iii) repeats 1 to 8 (positions 325 to 484 or to 485) or
    Repeats 1 bis 7 (Positionen 325 bis 464) oder Repeats 1 to 7 (positions 325-464) or
    Repeats 1 bis 6 (Positionen 325 bis 444) aufweist. Repeats comprising 1 to 6 (positions 325-444).
6. Expressionssystem zur Expression eines Oberflächenproteins oder eines Abkömmlings gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine DNA-Sequenz, die das Oberflächenprotein oder den Abkömmling kodiert. 6. An expression system for expression of a surface protein, or a descendant of any one of the preceding claims, comprising a DNA sequence encoding the surface protein, or the progeny thereof.
7. Vaccine zur Bekämpfung von Erkrankungen durch Streptococcus pneunomiae, herstellbar mit Hilfe eines Oberflächenproteins oder eines Abkömmlings gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5. 7. Vaccine for combating diseases caused by Streptococcus pneunomiae, produced with the aid of a surface protein, or a descendant of any one of claims 1 to. 5
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