DE19649266A1 - The new peptide lipohexin - Google Patents

The new peptide lipohexin

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DE19649266A1
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lipohexin
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Udo Prof Dr Graefe
Werner Prof Dr Fleck
Brigitte Dr Schlegel
Stefan Dr Heinze
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Abstract

The peptide antibiotic lipohexin, which has the chemical structure (I), is new: Me(CH2)9-CO-CHMe-CO-L-Pro-Aib-Aib-Aib-Aib- beta -Ala (I); Aib = alpha -aminoisobutyric acid.

Description

Peptide verschiedenster Strukturen werden bekanntermaßen durch Mikroorganismen pro­ duziert und zeichnen sich durch interessante biologische Wirkungen aus (z. B. diverse anti­ mikrobielle Aktivitäten, kanzerostatische, kardiotone, immunmodulatorische Wirkungen, Wachstumsförderung von Nutztieren, Wirkungen als Insektizide usw.; siehe z. B. Gräfe, U., Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg, 1992; Takeuchi et al., J. Antibiot. 44, 263-272, 1991; Kaneda, M., J. Antibiot. 44, 792-796, 1991).Peptides of various structures are known to be pro by microorganisms induced and are characterized by interesting biological effects (e.g. various anti microbial activities, cancerostatic, cardiotonic, immunomodulatory effects, Promotion of growth of farm animals, effects as insecticides, etc .; see e.g. B. Graefe, U., Biochemistry of Antibiotics, Spectrum Heidelberg, 1992; Takeuchi et al., J. Antibiot. 44, 263-272, 1991; Kaneda, M., J. Antibiot. 44, 792-796, 1991).

Darüber hinaus wurde für eine Reihe von Peptidwirkstoffen gezeigt, daß sie mit Rezeptoren von Zellen oder mit Enzymen zellulärer Signalketten interagieren und somit antagonistische, agoristische, inhibitorische und stimulatorische Wirkungen hervorrufen (Miyata, S. et al., J. Antibiot. 45, 74-82, 1992; Kamiyama et al., J. Antibiot. 45, 424-427, 1992; Weber et al., J. Antibiot. 44, 164-171, 1991).In addition, a number of peptide drugs have been shown to work with receptors of cells or interact with enzymes in cellular signal chains and thus antagonistic, cause agoristic, inhibitory and stimulatory effects (Miyata, S. et al., J. Antibiotic. 45, 74-82, 1992; Kamiyama et al., J. Antibiot. 45, 424-427, 1992; Weber et al., J. Antibiotic. 44, 164-171, 1991).

Die biologische Funktion der Prolyl-Oligopeptidase (hPOP) [EC 3.4.21.26] besteht im Pro­ cessing prolinhaltiger Peptidhormone wie z. B. Angiotensin, Vasopressin, Oxytocin, Neuro­ tensin oder Bradykinin. Über die Regulation der Aktivität der involvierten Proteine und Peptide ist die hPOP an vielen lebensnotwendigen Funktionen beteiligt und stellt ein poten­ tielles Target zur Therapie von Morbus Alzheimer, Depressionen, Amnesie oder Entzün­ dungsprozessen dar. Bekannte Inhibitoren der hPOP sind synthetische substratanaloge Ver­ bindungen wie z. B. Cbz-Pro-Prolinal (A. Yaron & F. Naider, Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 28, 31-81, 1993) oder die mikrobiellen Cyclopeptide Eurystatin A und B (S. Toda et al., J. Antibiot. 45, 1573-1579 und 1580-1586, 1992).The biological function of prolyl oligopeptidase (hPOP) [EC 3.4.21.26] is in the Pro cessing proline-containing peptide hormones such. B. angiotensin, vasopressin, oxytocin, neuro tensin or bradykinin. Regulating the activity of the involved proteins and Peptide, the hPOP is involved in many vital functions and represents a poten tial target for the therapy of Alzheimer's disease, depression, amnesia or inflammation Known inhibitors of hPOP are synthetic substrate-analogous Ver ties such as B. Cbz-Pro-Prolinal (A. Yaron & F. Naider, Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 28, 31-81, 1993) or the microbial cyclopeptides Eurystatin A and B (S. Toda et al., J. Antibiot. 45, 1573-1579 and 1580-1586, 1992).

Die für verschiedene Anwendungen vorgesehenen und eingesetzten Wirkstoffe weisen häu­ fig Mängel auf, dadurch gekennzeichnet, daß unbefriedigende Wirkungen gegenüber patho­ genen Zellen und Rezeptoren vorhanden sind, daß die Entwicklung resistenter Zelltypen be­ obachtet wird, und daß eine zu hohe Toxizität oder unerwünschte Nebenwirkungen auftre­ ten.The active ingredients intended and used for various applications often show fig defects, characterized in that unsatisfactory effects against patho gene cells and receptors are present that the development of resistant cell types be is observed, and that there is too high a toxicity or undesirable side effects ten.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen neuen mikrobiellen Peptidwirkstoff als Antibiotikum und Inhibitor der humanen Prolyl-Oligopeptidase zur Verfügung zu stellen. The object of the invention is a new microbial peptide active ingredient as an antibiotic and to provide an inhibitor of human prolyl oligopeptidase.  

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß der Pilzstamm Moeszia lindtneri DSM 11119 in einem Nährmedium mit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie üblichen anorganischen Salzen fermentiert wird, bis sich der neue Wirkstoff, nachfolgend Lipohexin (I) genannt, in der Kulturbrühe anhäuft, anschließend Lipohexin (I) aus der Kulturbrühe isoliert und in reiner Form gewonnen wird.The object is achieved in that the mushroom strain Moeszia lindtneri DSM 11119 in a nutrient medium with a carbon and nitrogen source and usual inorganic salts is fermented until the new active ingredient, subsequently called lipohexin (I) called, in which culture broth accumulates, then lipohexin (I) from the culture broth isolated and obtained in pure form.

Der Peptidwirkstoff Lipohexin, der inhibitorische Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien und der humanen Prolyl-Oligopeptidase besitzt, kann insbesondere als Heilmittel für neurologische Erkrankungen des Menschen und in der Therapie von Entzündungen ein­ gesetzt werden.The peptide drug lipohexin, the inhibitory activity against gram-positive Bacteria and the human prolyl oligopeptidase possesses, in particular, as a remedy for human neurological diseases and in the treatment of inflammation be set.

Die Erfindung betrifft somit:
The invention thus relates to:

  • 1. Eine Verbindung der Summenformel C39H68N6O9 (Lipohexin, I) mit der aufgeführ­ ten chemischen Konstitution
    CH3(CH2)9CO-CH(CH3)CO-L-Pro-Aib-Aib-Aib-Aib-β-Ala
    und den in Tab. 1 aufgeführten physikalisch-chemischen Eigenschaften.    1. A compound of the empirical formula C 39 H 68 N 6 O 9 (lipohexin, I) with the listed chemical constitution
    CH 3 (CH 2 ) 9 CO-CH (CH 3 ) CO-L-Pro-Aib-Aib-Aib-Aib-β-Ala
    and the physico-chemical properties listed in Table 1.
  • 2. Ein Verfahren zur Herstellung von Lipohexin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Moeszia lindtneri DSM 11119 in einem flüssigen Nährmedium kultiviert, bis sich Lipohexin in der Kulturbrühe anhäuft und man es nachfolgend daraus isoliert.2. A process for the preparation of lipohexin, which is characterized in that Moeszia Lindtneri DSM 11119 is cultivated in a liquid nutrient medium until lipohexin accumulates in the culture broth and it is subsequently isolated therefrom.
  • 3. Eine Verwendung von Lipohexin laut Punkt 1 als pharmakologischer Wirkstoff zur Bekämpfung von Erkrankungen, die auf eine Inhibition der humanen Prolyl- Oligopeptidase ansprechen, insbesondere zur Bekämpfung von Morbus Alzheimer, Amnesie, Depressionen und als entzündungshemmender Wirkstoff.3. A use of lipohexin according to point 1 as a pharmacological agent for Combating diseases based on inhibition of human prolyl Address oligopeptidase, especially for combating Alzheimer's disease, Amnesia, depression and as an anti-inflammatory agent.

Die Erfindung wird im folgenden detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird sie durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.The invention is described in detail below, particularly in its preferred ones Embodiments. Furthermore, it is determined by the content of the claims.

Definitionen:
Definitions:

  • - Die erfindungsgemäße Verbindung wird Lipohexin genannt. In der angegebenen Konsti­ tutionsformel bedeutet Aib α-Aminoisobuttersäure.- The compound of the invention is called lipohexin. In the given consti tution formula means Aib α-aminoisobutyric acid.
  • - Als Kulturbrühe wird das Nährmedium, welches das darin gewachsene Pilzmyzel enthält, bezeichnet.- The culture medium which contains the fungal mycelium grown therein is used as culture broth, designated.

Das erfindungsgemäße Antibiotikum Lipohexin wird durch einen Moeszia lindtneri-Stamm produziert. Dieser Stamm ist durch spezifische morphologische Merkmale charakterisiert (siehe unten).The antibiotic lipohexin according to the invention is produced by a Moeszia lindtneri strain produced. This strain is characterized by specific morphological features (see below).

Aufgrund von aufeinanderfolgenden Isolierungsschritten wurde von Moeszia lindtneri HKI 0054 eine Pilzkolorie isoliert, die das Peptidantibiotikum Lipohexin (1) besonders effizient in der Kulturbrühe anhäuft. Ein Isolat von Moeszia lindtneri HKI 0054 wurde bei der Deut­ schen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH in Braunschweig, Masche­ roder Weg 1B , 38124 Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 11119 am 20.08.1996 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.Due to successive isolation steps, Moeszia lindtneri HKI 0054 isolated a mushroom colony that the peptide antibiotic lipohexin (1) particularly efficiently in the culture broth. An isolate from Moeszia lindtneri HKI 0054 was obtained from Deut Collection of microorganisms and cell cultures GmbH in Braunschweig, Masche roder Weg 1B, 38124 Braunschweig, Germany, under the deposit number DSM 11119 on August 20, 1996 according to the terms of the Budapest Treaty.

Moeszia lindtneri DSM 11119 ist mit der Gattung Cylindrocarpon verwandt, die weltweit verbreitet ist und in Acker-, Wald-, Moor- und Heideböden vor allem der gemäßigten Kli­ mazonen aufgefunden wird (K.H. Domsch, W. Gams: Pilze aus Agrarböden, G. Fischer- Verlag Jena, 1970)). Variationsbreite und genaue Beschreibung der Gattung findet man bei W. Gerlach (W. Gerlach: Beiträge zur Kenntnis der Gattung Cylindrocarpon I. Phytopa­ thol.Z. 26, 161-170 und II. Phytopathol. Z. 35, 333-346 (1956)).Moeszia lindtneri DSM 11119 is related to the genus Cylindrocarpon, which is used worldwide is widespread and in arable, forest, moor and heather soils, especially in the temperate climate mazons (K.H. Domsch, W. Gams: Mushrooms from Agricultural Soils, G. Fischer- Verlag Jena, 1970)). Variation and precise description of the genus can be found at W. Gerlach (W. Gerlach: Contributions to the knowledge of the genus Cylindrocarpon I. Phytopa thol.Z. 26, 161-170 and II. Phytopathol. Z. 35, 333-346 (1956)).

In einem flüssigen Medium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und den übli­ chen Mineralsalzen produziert Moeszia lindtneri DSM 11119 die erfindungsgemäße Ver­ bindung Lipohexin. Anstelle des Stammes Moeszia lindtneri DSM 11119 können auch des­ sen Mutanten und Varianten eingesetzt werden. Als Mutanten und Varianten gelten alle jene Mikroorgarismen der Spezies, die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Verbindungen zu synthetisieren.In a liquid medium with a carbon source, a nitrogen source and the usual Chen mineral salts Moeszia lindtneri DSM 11119 produces the ver binding lipohexin. Instead of the Moeszia lindtneri DSM 11119 strain, the mutants and variants can be used. All those are considered mutants and variants Microorganisms of the species capable of the compounds of the invention to synthesize.

Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispiels­ weise Bestrahlung mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene er­ zeugt werden.Such mutants can in a manner known per se by physical means, for example wise exposure to ultraviolet or X-rays, or chemical mutagens be fathered.

Das Screening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemäße Verbindung syn­ thetisieren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der in der Kulturbrühe ange­ häuften Wirkstoffe, beispielsweise durch Austesten der antibiotischen Wirkung auf bekannte Testkeime anhand der dem Fachmann bekannten Methoden und durch chromatographischen Nachweis durchgeführt werden.The screening for mutants and variants that syn the compound of the invention thetize can be determined by determining the biological activity in the culture broth increased active substances, for example by testing the antibiotic effect on known ones Test germs using the methods known to those skilled in the art and by chromatographic Proof will be carried out.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie z. B. Glucose, Lactose, Maltose, Glycerol, Manni­ tol oder deren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt. Assimilable ones are suitable as preferred carbon sources for aerobic fermentation Carbohydrates and sugar alcohols, such as. B. glucose, lactose, maltose, glycerol, manni tol or their mixtures as well as carbohydrate-containing natural products, such as malt extract.  

Als Stickstoffquelle eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbaupro­ dukte, wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate.Amino acids, peptides and proteins and their degradation pro are suitable as nitrogen sources products such as tryptones or peptones, also meat extracts, ground seeds, for example of corn, wheat, beans, soybeans or the cotton plant, distillation residues of Alcohol production, fish meal or yeast extracts, but also ammonium salts and nitrates.

Die Bildung des Lipohexins der Strukturformel C39H68N6O9 erfolgt besonders gut in Nähr­ medien, die 0,2-6% Glycerol, bevorzugt 2-4% Glycerol, 1% Glucose, 0,01-1% Pepton, bevorzugt 0,1-0,6% Pepton, enthalten.The formation of the lipohexin of the structural formula C 39 H 68 N 6 O 9 takes place particularly well in nutrient media which preferably 0.2-6% glycerol, preferably 2-4% glycerol, 1% glucose, 0.01-1% peptone 0.1-0.6% peptone.

Die Kultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentoren, gegebenenfalls unter Einleiten von Luft oder Sauerstoff oder unter Verwendung von Standkulturen in Glasflaschen.The cultivation is carried out aerobically, for example submerged with shaking or stirring Shake flasks or fermenters, if necessary with the introduction of air or oxygen or using stand cultures in glass bottles.

Die Fermentation kann beispielsweise in Steilbrustflaschen, Erlenmeyer- oder Rundkolben verschiedener Volumina, in Glasfermentoren oder V2A-Stahltanks durchgeführt werden.The fermentation can be carried out, for example, in steep breast bottles, Erlenmeyer or round-bottom flasks of different volumes, in glass fermenters or V 2 A steel tanks.

Sie wird in einem Temperaturbereich zwischen 15-37°C, besonders bevorzugt zwischen 25-33°C, durchgeführt.It is in a temperature range between 15-37 ° C, particularly preferably between 25-33 ° C.

Der pH-Wert liegt zwischen 4 und 8, bevorzugt zwischen 5 und 7.The pH is between 4 and 8, preferably between 5 and 7.

Der Mikroorganismus wird unter diesen Bedingungen 5-28 Tage, bevorzugt 12 Tage, kul­ tiviert.The microorganism is cultivated under these conditions for 5-28 days, preferably 12 days activated.

Die Fermentation kann im Labormaßstab (Kulturvolumina zwischen 100 ml und 200 ml), aber auch im Produktionsmaßstab (Volumina bis mehrere m3) durchgeführt werden.The fermentation can be carried out on a laboratory scale (culture volumes between 100 ml and 200 ml), but also on a production scale (volumes up to several m 3 ).

Vorteilhafterweise kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. zunächst werden eine oder meh­ rere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium hergestellt, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1 : 15-1 : 20, überimpft werden.It is advantageously cultivated in several stages, i. H. first one or more More precultures are prepared in a liquid nutrient medium, which is then put into the actual Production medium, the main culture, for example in the ratio 1:15-1: 20, inoculated will.

Die Vorkultur erhält man, indem man ein versportes Myzel von z. B. Malzagar-Nährböden in eine Nährlösung überführt, beispielsweise durch Einimpfen von Myzel-bewachsenen Ag­ arstücken, und diese 5-28 Tage, vorzugsweise 7 Tage, inkubiert.The preculture is obtained by using a mycelium from z. B. Malt agar media transferred into a nutrient solution, for example by inoculating mycelium-covered Ag pieces and incubated for 5-28 days, preferably 7 days.

Das Pilzmyzel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm etwa 7-28 Ta­ ge, bevorzugt 15 Tage, auf einem Nährboden, wie z. B. Malz-Agar oder Sojamehl-Glucose- Agar, wachsen läßt. The fungal mycelium can be obtained, for example, by strain about 7-28 Ta ge, preferably 15 days, on a nutrient medium, such as. B. malt agar or soy flour glucose Agar, growing.  

Das Peptidantibiotikum Lipohexin ist in wechselnden Anteilen in der Kulturbrühe, sowie vorzugsweise im Myzel, enthalten.The peptide antibiotic lipohexin is in varying proportions in the culture broth, as well preferably contained in the mycelium.

Zum Testen der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolie­ rungsstufen können die üblichen dem Fachmann vertrauten Methoden der biologischen Ak­ tivitätsbestimmung, z. B. der Agardiffusions-Lochplattentest oder die Hochleistungsflüssig­ keitschromatographie, beispielsweise an Kieselgel RP18 mit Acetoritril/Wasser-Mischungen als Laufmittel, verwendet werden.To test the concentration of active substance in the culture medium or in the individual isolation stages, the usual methods familiar to those skilled in the art can be used to determine the activity, for. B. the agar diffusion perforated plate test or high-performance liquid chromatography, for example on silica gel RP 18 with acetoritrile / water mixtures as the eluent, can be used.

Die Detektion bei der dünnschichtchromatografischen Auftrennung kann durch Ninhydrin- Reagens und durch andere Färbeagentien erfolgen.Detection in thin-layer chromatography separation can be performed using ninhydrin Reagent and other staining agents.

Die Isolierung des Lipohexins aus der Kulturbrühe und dem Myzel erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigen­ schaften der Produkte.The lipohexyne is isolated from the culture broth and the mycelium according to known methods Methods taking into account the chemical, physical and biological properties products.

Zur Isolierung des Lipohexins wird am Ende einer emersen Fermentation im Labormaßstab wasserunlösliches organisches Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäureethylester, zur Kulturlö­ sung zugesetzt und somit die Kulturbrühe vollständig extrahiert. Zur Isolierung des Lipo­ hexins aus submersen Kulturansätzen werden am Ende der Fermentation Kulturmedium und Myzel getrennt und das Myzel mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol oder Aceton, vorzugsweise Methanol, extrahiert.To isolate the lipohexyne, at the end of an emersed fermentation on a laboratory scale water-insoluble organic solvent, such as. B. ethyl acetate, for culture sol Solution added and thus the culture broth completely extracted. To isolate the lipo Hexins from submerged culture batches become culture medium and at the end of the fermentation Separated mycelium and the mycelium with organic solvents such as methanol or acetone, preferably methanol, extracted.

Weitere Mengen an Lipohexin werden durch Extraktion der vom Myzel abgetrennten Kul­ turlösung mit wasserunlöslichen organischen Lösemitteln, wie z. B. Essigsäureethylester, gewonnen.Additional amounts of lipohexin are obtained by extracting the kul turlösung with water-insoluble organic solvents, such as. B. ethyl acetate, won.

Nach Einengen der Extrakte und gegebenenfalls Reextraktion des eingeengten Methanolex­ traktes des Myzels mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Essigsäu­ reethylester oder Dichlormethan, erfolgt die Isolierung des Peptidwirkstoffes Lipohexin unter Einsatz üblicher chromatografischer Adsorbentien bzw. Trägermaterialien, wie z. B. Kieselgel oder organophile Dextrangele.After concentrating the extracts and, if necessary, re-extracting the concentrated methanolex tract of the mycelium with water-insoluble organic solvents, such as. B. acetic acid reethylester or dichloromethane, the peptide active ingredient lipohexin is isolated using conventional chromatographic adsorbents or carrier materials, such as. B. Silica gel or organophilic dextran gels.

Durch sequentielle Anwendung der Säulenchromatografie an Kieselgel, der Gelpermeations- Chromatografie an organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Methanol, der Mitteldruckchromatografie an Kieselgel RP18 unter Verwendung von Acetonitril/Wasser-Gemischen sowie der Hochleistungsflüssigkeitschro­ matografie unter Verwendung von Methanol/Wasser- und Acetonitril/Wasser-Gemischen wird schließlich reines Lipohexin erhalten. By sequential application of column chromatography on silica gel, the gel permeation chromatography on organophilic dextran gel using polar organic solvents, such as. B. methanol, medium pressure chromatography on silica gel RP 18 using acetonitrile / water mixtures and high-performance liquid chromatography using methanol / water and acetonitrile / water mixtures finally pure lipohexin is obtained.

Die chemische Identität des Peptidwirkstoffes Lipohexin wird durch die Ergebnisse der hochauflösenden Massenspektrometrie (FAB-MS, Quadropol-Electrospray-MS, CID- MS/MS) sowie durch hochauflösende 600 MHz-Protonen- und 150 MHz-13C-NMR Korre­ lations-Spektroskopie, bewiesen (siehe Zuordnung des NMR-Spektrums von Lipohexin in Tabelle 2).The chemical identity of the peptide drug lipohexin is determined by the results of high-resolution mass spectrometry (FAB-MS, Quadropol-Electrospray-MS, CID-MS / MS) as well as by high-resolution 600 MHz proton and 150 MHz 13 C NMR correlation spectroscopy , proved (see assignment of the NMR spectrum of lipohexin in Table 2).

Lipohexin ist antibakteriell gegen grampositive Mikroorgarismen wie Bacillus subtilis ATCC6633 und Staphylococcus aureus SG511 wirksam (100 µg/Diffusionszone im Agar­ lochplatten-Diffusionstest ergeben 17 mm bzw. 18 mm Hemmzonendurchmesser; Deutsches Arzneibuch, 9. Auflage, S. 47-48 und 424-430, Deutscher Apothekerverlag Stuttgart, 1986).Lipohexin is antibacterial against gram-positive microorganisms such as Bacillus subtilis ATCC6633 and Staphylococcus aureus SG511 effective (100 µg / diffusion zone in agar perforated plate diffusion test result in 17 mm or 18 mm zone diameter; German Pharmacopoeia, 9th edition, pp. 47-48 and 424-430, Deutscher Apothekerverlag Stuttgart, 1986).

Insbesondere zeigt Lipohexin eine inhibitorische Wirkung auf die humane Prolyl- Oligopeptidase (z. B. isoliert aus humaner Plazenta) und kann daher zur Therapie von Mor­ bus Alzheimer, Amnesie, Depressionen und als entzündungshemmender Wirkstoff einge­ setzt werden.In particular, lipohexin shows an inhibitory effect on the human prolyl Oligopeptidase (e.g. isolated from human placenta) and can therefore be used to treat Mor bus Alzheimer's, amnesia, depression and as an anti-inflammatory agent be set.

Sowohl zur Prophylaxe als auch zur Behandlung entsprechender Erkrankungen kann Lipo­ hexin entweder allein oder mit physiologisch verträglichen Hilfs- oder Trägerstoffen ange­ wandt werden. Als Trägermaterial können beim Menschen alle pharmakologisch verträgli­ chen Trägermaterialien und/oder Hilfsstoffe verwendet werden.Lipo can be used both for the prophylaxis and for the treatment of corresponding diseases hexin either alone or with physiologically compatible auxiliaries or carriers be turned. As a carrier material, all pharmacologically acceptable in humans Chen carrier materials and / or auxiliaries are used.

Die erfindungsgemäße Verbindung wird im allgemeinen oral oder parenteral verabreicht, aber auch eine rektale Anwendung ist prinzipiell möglich. Geeignete feste oder flüssige ga­ lenische Zubereitsformen sind beispielweise Granulate, Pulver, Tabletten, Dragees, (Mikro­ )Kapseln, Zäpfchen, Sirupe, Emulsionen, Aerosole, Tropfen oder injizierbare Lösungen in Ampullenform sowie Präparate und Zusätze und/oder Hilfsmittel wie Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel oder Lösungsvermittler. Als häufig verwendete Träger oder Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbo­ nat, Titandioxid, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stär­ ke, Vitamine, Cellulose und ihre Derivate, tierische oder pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser, ein- und mehrwertige Alkohole und Glycerin genannt. Gegebenenfalls können die Dosierungseinheiten für die orale Verabreichung mi­ kroverkapselt werden, um die Abgabe zu verzögern oder über einen längeren Zeitraum aus­ zudehnen, wie beispielsweise durch Überziehen oder Einbetten des Wirkstoffes in Teilchen­ form in geeignete Polymere, Wachse und dergleichen. The compound according to the invention is generally administered orally or parenterally, in principle, rectal application is also possible. Suitable solid or liquid ga Lenic forms of preparation are, for example, granules, powders, tablets, coated tablets, (micro ) Capsules, suppositories, syrups, emulsions, aerosols, drops or injectable solutions in Ampoule shape as well as preparations and additives and / or aids such as explosives, binders, Coating, swelling, lubricating or lubricating agents, flavoring agents, sweeteners or Solution broker. Magnesium carbo is a frequently used carrier or auxiliary nat, titanium dioxide, lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, gelatin, starch ke, vitamins, cellulose and their derivatives, animal or vegetable oils, polyethylene glycols and solvents such as sterile water, mono- and polyhydric alcohols and glycerin called. Optionally, the dosage units for oral administration mi to be microencapsulated to delay delivery or for a longer period stretch, such as by coating or embedding the active ingredient in particles form into suitable polymers, waxes and the like.  

Die erfindungsgemäßen Arzneien werden dadurch hergestellt, daß man Lipohexin mit übli­ chen Träger- sowie gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffen in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.The medicaments according to the invention are prepared by lipohexin with übli Chen carrier and optionally additives and / or auxiliaries in the or a suitable Dosage form brings.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.The invention is explained in more detail by the following exemplary embodiments.

AusführungsbeispieleEmbodiments 1. Kultivierung von Moeszia lindtneri DSM 11119 unter submersen Bedingungen1. Cultivation of Moeszia lindtneri DSM 11119 under submerged conditions 1a. Herstellung von Vorkulturen des Stammes Moeszia lindtneri. DSM 111191a. Production of pre-cultures of the Moeszia lindtneri tribe. DSM 11119

Zur Gewinnung eines versporten Myzels wird Moeszia lindtneri. DSM 11119 15 Tage bei 25°C auf Nährböden folgender Zusammensetzung (g/l) kultiviert: Malzex­ trakt 40, Hefeextrakt 4, Agar 15, destilliertes Wasser pH 6.0 (Sterilisation 25 min bei 110°C).Moeszia lindtneri is used to obtain a spelled mycelium. DSM 11119 15 Cultivated for days at 25 ° C on nutrient media of the following composition (g / l): Malzex tract 40, yeast extract 4, agar 15, distilled water pH 6.0 (sterilization 25 min at 110 ° C).

1b. Herstellung einer emersen Standkultur bzw. einer Vorkultur von Moeszia lindtneri1b. Production of an emersed stand culture or a pre-culture of Moeszia lindtneri

DSM 11119. Dazu wird Moeszia lindtneri. DSM 11119 in sterilen Plastikboxen mit 400 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung (g/l): Glycerol 30, Glucose 10, Pepton 5, NaCl 2, Zeolith 10 (0,5 nm, Merck), Agar 1, pH 7.0 kultiviert. Die Beimpfung erfolgt mit 2 cm2-Arealen von Oberflächenkulturen von Moeszia lindt­ neri DSM 11119, die auf Agarmedium entsprechend Beispiel 1a angezogen wurden.DSM 11119. For this Moeszia lindtneri. DSM 11119 in sterile plastic boxes with 400 ml nutrient medium of the following composition (g / l): glycerol 30, glucose 10, peptone 5, NaCl 2, zeolite 10 (0.5 nm, Merck), agar 1, pH 7.0. The inoculation is carried out with 2 cm 2 areas of surface cultures from Moeszia Lindt neri DSM 11119, which were grown on agar medium in accordance with Example 1a.

1c. Anlage von Fermenterkulturen des Stammes Moeszia lindtneri DSM 11119 : 150 l1c. Creation of fermenter cultures of the Moeszia lindtneri strain DSM 11119: 150 l

Fermenter werden mit 20 l Vorkulturen angeimpft. Für die Vorkultur und die Fer­ menterkulturen wird ein Medium mit folgender Zusammensetzung verwendet (g/l):
Glycerol 30; Glucose 10; Pepton 5; NaCl 2; Zeolith 10; Agar 10; destilliertes Was­ ser; pH 7.0 (Sterilisation 25 Min. bei 110 °C).Fermenters are inoculated with 20 l precultures. A medium with the following composition (g / l) is used for the preculture and the fermenter cultures:
Glycerol 30; Glucose 10; Peptone 5; NaCl 2; Zeolite 10; Agar 10; distilled water; pH 7.0 (sterilization 25 min. at 110 ° C).

Die Fermentation wird in 150 l-Tankfermentoren für 12 Tage bei 28 °C durchge­ führt.The fermentation is carried out in 150 l tank fermenters for 12 days at 28 ° C leads.

2. Gewinnung von Lipohexin aus der Kulturbrühe2. Obtaining lipohexin from the culture broth

Die gesamte Kulturlösung gemäß Beispiel 1, bestehend aus dem Mycel und dem Medium, wird im Verhältnis 2 : 1 (Kulturbrühe/Lösemittel) mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wurde nach Trocknen über Natriumsulfat bis zum Rückstand im Vakuum eingeengt.The entire culture solution according to Example 1, consisting of the mycelium and the Medium, is extracted in a 2: 1 ratio (culture broth / solvent) with ethyl acetate,  and the extract was after drying over sodium sulfate to the residue in Vacuum concentrated.

3. Chromatografische Aufreinigung des Lipohexins3. Chromatographic purification of the lipohexin

Lipohexin wird aus dem eingeengten Ethylacetatextrakt von 20 l Fermentations­ brühe durch die nachfolgenden chromatografischen Aufarbeitungsschritte erhalten:
Zunächst wird der Rückstand des eingeengten Extraktes auf eine Chromatografie­ säule, gefüllt mit Sephadex LH-20, in Methanol gegeben. Mit dem gleichen Lö­ sungsmittel werden zunächst ölige Begleitkomponenten eluiert, danach eluiert man die Hauptmenge an Lipohexin sowie nachfolgend niedermolekulare Verunreinigun­ gen. Ausbeute: 0,8 g. In einer zweiten säulenchromatografischen Reinigungsstufe erfolgt die Chromatografie an Kieselgel 60 unter Verwendung von Chloro­ form/Methanol (9 : 1; 0.1; v/v) als Eluent. Ausbeute: 0,4 g. Eine weitere Anreiche­ rung des Lipohexins kann durch nochmalige Säulenchromatografie an Sephadex LH- 20 in Methanol erfolgen. Das auf diese Weise erhaltene Lipohexin kann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung von Reversphasen- Kieselgelen (z. B. RP18) und eines binären Gradienten Wasser-Acetonitril (95 : 5 zu 5 : 95, 30 min) hochgereinigt werden. Beispielsweise beträgt die Ausbeute der Aufar­ beitung eines 20 l-Fermentationsansatzes (Umkristallisation aus Acetonitril oder Chloroform/Hexan-Mischungen) 180 mg.Lipohexin is obtained from the concentrated ethyl acetate extract from 20 l fermentation broth through the following chromatographic work-up steps:
First, the residue of the concentrated extract is placed on a chromatography column, filled with Sephadex LH-20, in methanol. With the same solvent, oily accompanying components are first eluted, then the main amount of lipohexin and then low-molecular impurities are eluted. Yield: 0.8 g. In a second column chromatography purification stage, the chromatography on silica gel 60 is carried out using chloroform / methanol (9: 1; 0.1; v / v) as the eluent. Yield: 0.4 g. A further enrichment of the lipohexin can be carried out by repeated column chromatography on Sephadex LH-20 in methanol. The lipohexin thus obtained can be highly purified by high performance liquid chromatography using reverse phase silica gels (e.g. RP 18 ) and a binary gradient water-acetonitrile (95: 5 to 5: 95, 30 min). For example, the yield of the processing of a 20 l fermentation batch (recrystallization from acetonitrile or chloroform / hexane mixtures) is 180 mg.

4. Inhibitorische Wirkung von Lipohexin auf die Prolyl-Oligopeptidase aus humaner Plazenta (hPOP)4. Inhibitory effect of lipohexin on the prolyl oligopeptidase from human Placenta (hPOP)

Die Enzymaktivität wird spektrophotometrisch an Hand der Spaltung des chromo­ genen Substrates Suc-Ala-Pro-NHNp und der Freisetzung von 4-Nitroanilin gemes­ sen (390 nm). Die Testung der Verbindung der Formel I erfolgt bei 30°C in einem Reaktionsansatz von 9.8 U/ml hPOP aus humaner Plazenta, 2.33 nM Substrat, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 150 mM KCl und 0.5 mM DTT, pH 7.8.The enzyme activity is measured spectrophotometrically using the cleavage of the chromogenic substrate Suc-Ala-Pro-NHNp and the release of 4-nitroaniline (390 nm). The compound of formula I is tested at 30 ° C. in a reaction mixture of 9.8 U / ml hPOP from human placenta, 2.33 nM substrate, 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl 2 , 150 mM KCl and 0.5 mM DTT, pH 7.8.

Ein Unit der Enzymaktivität wird definiert durch die Freisetzung von 1 µmol 4- Nitroanilin pro Minute. Der Ki-Wert von 3,6 µM für Lipohexin wurde anhand des Lineweaver-Burk-Plots ermittelt. One unit of enzyme activity is defined by the release of 1 µmol of 4-nitroaniline per minute. The K i value of 3.6 µM for lipohexin was determined using the Lineweaver-Burk plot.

Tabelle 1Table 1 Physikalisch-chemische Eigenschaften des LipohexinsPhysico-chemical properties of lipohexin

Aussehen: farblose kristalline Substanz
Schmelzpunkt: < 220°C (Zersetzung)
Massenspektrum: Quadrupol-MS: m/z 765 [Lipohexin+H]⁺
Bruttoformel: C39 Appearance: colorless crystalline substance
Melting point: <220 ° C (decomposition)
Mass spectrum: quadrupole MS: m / z 765 [lipohexin + H] ⁺
Gross formula: C 39

H58 H 58

N6 N 6

O9
O 9

Aminosäureanalyse: Aib (α-Aminoisobuttersäure), α-Alanin, L-Prolin
Chromatografische Eigenschaften des Lipohexins:
Dünnschichtchromatografie an Kieselgel 60-Folien (Merck, Darmstadt, CHCl3 Amino acid analysis: Aib (α-aminoisobutyric acid), α-alanine, L-proline
Chromatographic properties of lipohexin:
Thin layer chromatography on silica gel 60 films (Merck, Darmstadt, CHCl 3

/MeOH 9 : 1), Rf / MeOH 9: 1), R f

Wert 0,5, Anfärbung Ninhy­ drin-Reagens)
Retentionszeit in der analytischen Hochleistungs-Flüssigkeits­ chromatografie (Spherisorb RP18 Value 0.5, staining Ninhy in reagent)
Retention time in analytical high-performance liquid chromatography (Spherisorb RP 18

ODS2, 4,2 mm × 25 mm;
Acetonitril/Wasser 87 : 13; v/v); 1 ml/min, 210 nm): 3,8 min ODS2, 4.2 mm x 25 mm;
Acetonitrile / water 87: 13; v / v); 1 ml / min, 210 nm): 3.8 min

1H und 13C NMR-Daten des Lipohexins in CDCl3 (MOTDA: 2-Methyl-3- oxo-tridecansäure; Pro: L-Prolin; Aib: α-Aminoisobuttersäure; β-Ala: β-Alanin) Chemische Verschiebung (δ) in ppm; Kopplungskonstanten in Hz; s: Singulett; d: Dublett; t: Triplett; br: breit; m: Multiplett) 1 H and 13 C NMR data of lipohexyne in CDCl 3 (MOTDA: 2-methyl-3-oxo-tridecanoic acid; Pro: L-proline; Aib: α-aminoisobutyric acid; β-Ala: β-alanine) Chemical shift (δ ) in ppm; Coupling constants in Hz; s: singlet; d: doublet; t: triplet; br: broad; m: multiplet)

1H und 13C NMR-Daten des Lipohexins in CDCl3 (MOTDA: 2-Methyl-3- oxo-tridecansäure; Pro: L-Prolin; Aib: α-Aminoisobuttersäure; β-Ala: β-Alanin) Chemische Verschiebung (δ) in ppm; Kopplungskonstanten in Hz; s: Singulett; d: Dublett; t: Triplett; br: breit; m: Multiplett) 1 H and 13 C NMR data of lipohexyne in CDCl 3 (MOTDA: 2-methyl-3-oxo-tridecanoic acid; Pro: L-proline; Aib: α-aminoisobutyric acid; β-Ala: β-alanine) Chemical shift (δ ) in ppm; Coupling constants in Hz; s: singlet; d: doublet; t: triplet; br: broad; m: multiplet)

Claims (5)

1. Peptidantibiotikum mit der Bezeichnung Lipohexin und der chemischen Struktur
CH3(CH2)9CO-CH(CH3)CO-L-Pro-Aib-Aib-Aib-Aib-β-Ala.1. Peptide antibiotic called lipohexin and its chemical structure
CH 3 (CH 2 ) 9 CO-CH (CH 3 ) CO-L-Pro-Aib-Aib-Aib-Aib-β-Ala. 2. Verfahren zur Herstellung von Lipohexin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Moeszia lindtneri DSM 11119 in einem flüssigen Nährmedium kultiviert und Lipohexin aus der Kulturbrühe isoliert.2. A process for the preparation of lipohexin according to claim 1, characterized in that that one cultivates Moeszia lindtneri DSM 11119 in a liquid nutrient medium and lipohexin isolated from the culture broth. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Varianten oder Mu­ tanten des Stammes Moeszia lindtneri DSM 11119 verwendet.3. The method according to claim 2, characterized in that variants or Mu aunts of the Moeszia lindtneri tribe DSM 11119 used. 4. Arzneimittel enthaltend Lipohexin nach Anspruch 1 nebst einem oder mehreren Trä­ gerstoffen.4. Medicament containing lipohexin according to claim 1 together with one or more Trä materials. 5. Verwendung von Lipohexin gemäß Anspruch 1 als pharmakologisch wirksames Mittel.5. Use of lipohexin according to claim 1 as a pharmacologically active Medium.
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