DE19647697A1 - Process for the genetic control of seed ripening in plants - Google Patents
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur genetischen Kontrolle der Samenreifung in Pflanzen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Landwirtschaft.The invention relates to a method for genetic control seed ripening in plants. Field of application of the invention is agricultural.
Die Embryonalentwicklung bei höheren Landpflanzen endet im Normalfall mit der Reifung des Samens. Dieser Prozeß umfaßt die Produktion, Anreicherung und Einlagerung von Speicherstoffen, die Verhinderung des vorzeitigen Auskeimens und die Induktion der Samenruhe sowie die Ausprägung von Trocknungstoleranz.Embryonic development in higher land plants ends in Usually with the maturation of the seed. This process includes the Production, enrichment and storage of storage materials, the prevention of premature germination and induction the rest of the seeds and the expression of drying tolerance.
Ernteverluste durch vorzeitiges Auskeimen infolge von Störungen während der Samenreifung sind weltweit ein großes Problem. Insbesondere bei Weizen bedeutet das Auskeimen auf dem Halm nicht nur Ertragsverluste, sondern auch eine erhebliche Verminderung der Qualität. Durch den vorzeitig eingeleiteten Keimungsvorgang werden Umsetzungsvorgänge in der Stärkekomponente des Weizenkorns ausgelöst.Harvest losses due to premature germination due to disturbances are a major problem worldwide during seed ripening. In the case of wheat in particular, germination on the stalk means not only loss of earnings, but also a significant one Reduction in quality. By the prematurely initiated Germination process are implementation processes in the Starch component of the wheat grain triggered.
Die Erfindung hat das Ziel, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die die genannten Nachteile nicht aufweisen. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine genetische Kontrolle der Samenreifung und der Samenruhe durch den Transfer regulierender Gene in Pflanzen zu erreichen.The aim of the invention is to provide plants, that do not have the disadvantages mentioned. The task of Invention is a genetic control of the Semen maturation and semen rest through the transfer regulating Reach genes in plants.
Darüber hinaus soll die Erfindung eine Möglichkeit eröffnen, durch ein an die Samenreifung gekoppeltes Prinzip konditional letale Pflanzen herzustellen, die von sich aus nicht mehr vermehrungsfähig sind. Auf diese Weise kann die ungewollte oder unerlaubte Vermehrung z. B. patentrechtlich geschützter transgener Pflanzen drastisch eingeschränkt werden. In addition, the invention is intended to open up a possibility by a principle linked to seed ripening to produce lethal plants that no longer by themselves are able to multiply. This way the unwanted or unauthorized propagation z. B. patented transgenic plants can be drastically restricted.
Diese Aufgaben werden entsprechend den Ansprüchen 1, 7 und 11 gelöst, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.These tasks are in accordance with claims 1, 7 and 11th solved, the subclaims are preferred variants.
Ausgangspunkt der Erfindung ist eine Mutante von Arabidopsis thaliana, fus3, bei der die Samenreifung weitgehend ausfällt und der Embryo bereits im Samen zur Keimung übergeht. Getrocknete mutante Samen sind letal, normale Keimung und weiteres Wachstum können jedoch erfolgen, wenn mutante Samen vor Einsetzen der Trocknung geerntet und für kurze Zeit in eine feuchte Umgebung gebracht werden. Hingegen kann die Keimung von fus3 Samen mit Abscisinsäure verhindert werden. Molekulare Analysen brachten den überraschenden Befund, daß die Aminosäuresequenz von FUS3 einen 107 Aminosäuren umfassenden Konsensus-Bereich mit den Produkten der Gene Vp1 (Zea mays) und ABI3 (Arabidopsis thaliana) gemeinsam hat. Mutationen in VP1 und ABI3 führen im Gegensatz zur fus3 Mutante zu Insensitivität gegenüber Abscisinsäure während der Keimung, zeichnen sich aber ebenfalls durch einen weitgehenden Verlust der Samenreifung aus. Der bei den Genprodukten von FUS3, ABI3 und VP1 zu findende 07 Aminosäuren umfassende Konsensus-Bereich ist demnach nicht beschränkt auf Faktoren der Abscisinsäure-abhängigen Signaltransduktionskette. Vielmehr handelt es sich hierbei um ein Merkmal regulatorischer Proteine, die spezifisch für die Samenreifung essentiell sind. Diese Annahme wird gestützt durch Befunde, nach denen Orthologe zu VP1 aus Phaseolus vulgaris und Oryza sativa, die den genannten 107 Aminosäuren-Konsensus enthalten, aufgrund ihrer Eigenschaften in vitro ebenfalls Kandidaten für Regulatoren der Samenreifung sind. Mutanten der genannten Gene aus Phaseolus und Oryza liegen jedoch nicht vor, so daß auf die biologische Relevanz dieser Gene nur aus molekularbiologischen, nicht aus genetischen Experimenten geschlossen werden kann.The starting point of the invention is a mutant of Arabidopsis thaliana, fus3, in which seed ripening largely fails and the embryo already sprouts in the semen. Dried mutant seeds are lethal, normal germination and further growth can, however, be done if mutant seeds appear before the onset of Harvested drying and for a short time in a damp environment to be brought. In contrast, the germination of fus3 seeds with Abscisic acid can be prevented. Molecular analyzes brought the surprising finding that the amino acid sequence of FUS3 a 107 amino acid consensus area with the Products of the genes Vp1 (Zea mays) and ABI3 (Arabidopsis thaliana) has in common. Mutations in VP1 and ABI3 result in Contrary to the fus3 mutant compared to insensitivity Abscisic acid during germination, but also stand out due to extensive loss of seed ripening. The at the gene products from FUS3, ABI3 and VP1 There is therefore no consensus area covering amino acids limited to factors of abscisic acid dependent Signal transduction chain. Rather, it is about a feature of regulatory proteins that are specific for the Seed ripening are essential. This assumption is supported by Findings according to which orthologists for VP1 from Phaseolus vulgaris and Oryza sativa, which mentioned the 107 amino acid consensus included, due to their properties in vitro also Are candidates for regulators of seed maturation. Mutants of genes from Phaseolus and Oryza are not available, so that only on the biological relevance of these genes molecular biological, not from genetic experiments can be closed.
Ausgehend von diesem neuen Befund wird erfindungsgemäß ein
Verfahren vorgeschlagen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
Based on this new finding, a method is proposed according to the invention, which is characterized in that
- - in das Genom einer Pflanzenzelle eine DNA stabil integriert wird, die für ein Protein kodiert, das in einer Region von 107 Aminosäuren in mindestens 50% der Aminosäuren mit dem FUS3-Pro tein aus Arabidopsis thaliana (Abb. 1) übereinstimmt,- A DNA is stably integrated into the genome of a plant cell, which codes for a protein which in a region of 107 amino acids in at least 50% of the amino acids corresponds to the FUS3 protein from Arabidopsis thaliana ( Fig. 1),
- - diese DNA mit geeigneten, die Transkription steuernden Elementen konstitutiv oder induzierbar exprimiert wird und- This DNA with suitable, the transcription-controlling Elements is expressed constitutively or inducibly and
- - aus den transgenen Zellen Pflanzen regeneriert werden.- Plants are regenerated from the transgenic cells.
Die in die Pflanzenzelle integrierte DNA soll bevorzugt eine Region enthalten, die für das FUS3-Protein aus Arabidopsis thaliana kodiert. Zur Realisierung der Erfindung genügt jedoch, wenn das Protein mindestens an den markierten Stellen (Abb. 1) mit dem aus 107 Aminosäuren bestehenden Bereich des FUS3-Pro teins übereinstimmt.The DNA integrated into the plant cell should preferably contain a region which codes for the FUS3 protein from Arabidopsis thaliana. To implement the invention, however, it is sufficient if the protein at least at the marked locations ( FIG. 1) matches the region of the FUS3 protein consisting of 107 amino acids.
Die Kontrolle der Samenreifung in Pflanzen kann in bestimmten Fällen auch dadurch erfolgen, daß in das Genom der Pflanzenzelle DNA integriert wird, die komplementär zu der oben eingesetzten DNA ist. Damit wird genau der umgekehrte Effekt erreicht.The control of seed ripening in plants can be determined in certain Cases also occur in that in the genome of the plant cell DNA is integrated that is complementary to that used above DNA is. This has the exact opposite effect.
Gegenstand der Erfindung sind auch DNA-Sequenzen, die für ein Protein kodieren, das in einer Region von 107 Aminosäuren in mindestens 50% der Aminosäuren mit dem FUS3-Protein aus Arabidopsis thaliana übereinstimmt.The invention also relates to DNA sequences for a Encode protein that is in a region of 107 amino acids in at least 50% of the amino acids with the FUS3 protein Arabidopsis thaliana matches.
Beansprucht werden ferner die transgenen Pflanzen, welche die oben beschriebenen DNA-Sequenzen enthalten. Bevorzugt sind Nutzpflanzen, die vorteilhaft in der Landwirtschaft eingesetzt werden können.The transgenic plants, which the contain DNA sequences described above. Are preferred Crops used advantageously in agriculture can be.
Mit der Erfindung werden folgende Möglichkeiten eröffnet:
The following possibilities are opened up with the invention:
- 1. Die Kontrolle der Ruhe und des Keimungsverhaltens von Samen durch Expression/Überexpression der beanspruchten sense- oder antisense FUS3-cDNA oder ihrer Homologen (Paralogen oder Ortholgen) während der Embryogenese oder im frühen Keimungsstadium.1. The control of the rest and the germination behavior of seeds by expression / overexpression of the claimed sense or antisense FUS3 cDNA or its homologues (paralogues or Ortholgen) during embryogenesis or in the early Germination stage.
- 2. Verhinderung von vorzeitiger Keimung, Verbesserung der Lagerung des Ernteguts, Wiederherstellung der Samenruhe und der Trocknungstoleranz durch Expression von FUS3-Genen und/oder seiner Homologen (Paralogen oder Orthologen) in nicht trocknungstoleranten und vorzeitig auskeimenden, sogenannten recalzitranten Samen. Mit dieser transgenen Methode können die durch die Recalzitranz verursachten Mängel und technischen Probleme überwunden werden.2. Prevention of premature germination, improvement of Storage of the crop, restoration of seed rest and Drying tolerance through expression of FUS3 genes and / or of its homologues (paralogues or orthologists) in not drying-tolerant and early germinating, so-called recalcitrant seeds. With this transgenic method, the defects and technical problems caused by recalcitrance Problems are overcome.
- 3. Die künstliche Bildung von recalzitranten Samen durch Überexpression von Antisense-FUS3-cDNA oder seinen Homologen (Paralogen oder Orthologen) während der späten Embryogenese. Mit dieser Methode können unerwünschte oder unerlaubte Vermehrungen, Lagerungen und Verteilung von Samenmaterial (z. B. patentierter Linien) behindert werden, während gleichzeitig die postembryo nale Entwicklung ungestört erhalten bleibt, ebenso wie die sexuelle Vermehrungsfähigkeit.3. The artificial formation of recalcitrant seeds through Overexpression of antisense FUS3 cDNA or its homologues (Paralogues or orthologists) during late embryogenesis. With This method can prevent unwanted or illegal propagation, Storage and distribution of seed material (e.g. patented Lines) are hampered while maintaining the postembryo development remains undisturbed, as does that sexual reproductive ability.
- 4. Die Induktion der Herstellung samentypischer Speicherstoffe in anderen Organen, wie Blättern, Wurzeln usw. durch ektopische z. B. unter der Kontrolle des Blumenkohl-Mosaik-Virus-35S Promotors) oder organ- bzw. gewebespezifische Überexpression von FUS3 und/oder seiner Homologen (Paralogen oder Orthologen). Diese Möglichkeit kann zu einem vollkommen neuen Design von Nutzpflanzen führen.4. The induction of the production of seed materials typical of seeds in other organs such as leaves, roots etc. by ectopic e.g. B. under the control of Cauliflower Mosaic Virus 35S Promotors) or organ or tissue specific overexpression of FUS3 and / or its homologues (paralogues or orthologs). This possibility can lead to a completely new design by Lead crops.
- 5. Ektopische Bildung von trocknungstolerantem Pflanzengewebe in Blättern, Wurzeln usw. durch konstitutive oder organ- bzw. gewebespezifische Überexpression von FUS3 und/oder seinen Homologen (Paralogen oder Orthologen). Diese Möglichkeit kann einen völlig neuen Weg zur Beeinflussung der Trocknungstoleranz in Pflanzen eröffnen.5. Ectopic formation of drought-tolerant plant tissue in Leaves, roots etc. by constitutive or organ or tissue-specific overexpression of FUS3 and / or its Homologues (paralogues or orthologists). This possibility can a completely new way of influencing drying tolerance open in plants.
Die in dieser Beschreibung dargelegte Erfindung wurde auf der Grundlage folgender Untersuchungen gemacht.The invention set forth in this description was made on the Based on the following investigations.
Das FUSCA3-Gen von Arabidopsis thaliana ist definiert durch drei rezessive mutante Allele, fus3-1 bis -3, deren Phänotyp sich durch einen weitgehenden Ausfall der Samenreifung auszeichnet. Der fus3-2 Ort wurde durch Kartierung innerhalb des durch die molekularen Marker GAP-A (Konieczny und Ausubel, Plant J. 3: 403-410) und g2440 (Nam et al., Plant Cell 1: 699-705) gegebenen Intervalls auf dem linken Arm von Chromosom 3 lokalisiert.The FUSCA3 gene from Arabidopsis thaliana is defined by three recessive mutant alleles, fus3-1 to -3, whose phenotype changes characterized by extensive failure of seed ripening. The fus3-2 site was mapped within the by the molecular marker GAP-A (Konieczny and Ausubel, Plant J. 3: 403-410) and g2440 (Nam et al., Plant Cell 1: 699-705) Intervals located on the left arm of chromosome 3.
Für das Intervall wurden aus einer YAC-Bibliothek von genomischer Arabidopsis-DNA (Grill und Somerville, Mol. Gen. Genet. 226: 484 -490) sich gegenseitig überlagernde Klone isoliert. Die FUS3-Region ist danach durch die YAC-Klone EG17D10, EG8F10, EG3D2, EG14E3, EG4D12 auf einem Stück von etwa 330 kb physikalisch definiert.For the interval, a YAC library from Arabidopsis genomic DNA (Grill and Somerville, Mol. Gen. Genet. 226: 484-490) overlapping clones isolated. The FUS3 region is then through the YAC clones EG17D10, EG8F10, EG3D2, EG14E3, EG4D12 on a piece of about 330 kb physically defined.
Die Lage des FUS3 Gens wurde durch hochauflösende RFLP-Kar tierung von YAC-Enden genauer bestimmt. FUS3 liegt auf einem Abschnitt von etwa 90 kb der YACs EG8F10 und EG3D2 und wird in Richtung Telomer durch das linke Ende von EG17D10 begrenzt sowie in Richtung Zentromer durch das rechte Ende von EG14E3.The location of the FUS3 gene was determined by high-resolution RFLP card of YAC ends determined more precisely. FUS3 lies on one Section of about 90 kb of the YACs EG8F10 and EG3D2 and is in Directed towards Telomer by the left end of EG17D10 as well towards the centromere through the right end of EG14E3.
In dieses Intervall fallende Klone einer in pBIC20 klonierten Cosmid-Bibliothek von genomischer Arabidopsis DNA (Meyer et al. Science 264: 1452-1455) wurden mittels einer mehr als 2000 meiotische Ereignisse umfassenden F2-Kartierungspopulation in Bezug auf den fus3 Ort kartiert. Die Parentalkreuzung für die F2 war fus3/fus3 (Dijon-G) X FUS3/FUS3 (Columbia-0), F2 Individuen entstanden durch Selbstung der F1.Clones falling in this interval cloned in pBIC20 Cosmid library of Arabidopsis genomic DNA (Meyer et al. Science 264: 1452-1455) were measured using a more than 2000 F2 mapping population in meiotic events Mapped to the fus3 location. The parent crossing for the F2 was fus3 / fus3 (Dijon-G) X FUS3 / FUS3 (Columbia-0), F2 individuals originated from the self of the F1.
Das Cosmid FHL-C4/2 bestimmt einen Sty I RFLP (Restriktionsenzym Längenpolymorphismus), der innerhalb der Kartierungspopulation absolute Kopplung zu fus3 zeigte. Eine zu diesem Cosmid hybridisierende cDNA aus einer samenspezifischen Arabidopsis cDNA-Bibliothek (Giraudat et al. Plant Cell 4, 1251-1261), HL1, wies diesen Sty I Polymorphismus ebenfalls nach.The cosmid FHL-C4 / 2 determines a Sty I RFLP (restriction enzyme Length polymorphism) occurring within the mapping population showed absolute coupling to fus3. One on this cosmid hybridizing cDNA from a seed-specific Arabidopsis cDNA library (Giraudat et al. Plant Cell 4, 1251-1261), HL1, also demonstrated this Sty I polymorphism.
Die cDNA HL1 wurde sequenziert, ebenso ein genomisches EcoR I Fragment, das die gesamten kodierenden und nicht kodierenden Sequenzabschnitte des Gens umfaßt.The cDNA HL1 was sequenced, as was a genomic EcoR I Fragment that encodes the entire and non-coding Sequence sections of the gene included.
Die beobachtete absolute Kopplung des im Gen befindlichen Sty I Polymorphismus mit der fus3 Mutation ist ein Indiz, daß die cDNA HL1 die kodierende Sequenz des FUSCA3 Gens repräsentiert. Den Beweis hierfür erbrachten vergleichende Sequenzanalysen der HL1 enthaltenden EcoR I Fragmente der Wildtypen sowie der mutanten fus3 Allele. Bei fus3-1 und fus3-2 wurden Punktmutationen in zwei verschiedenen Exon/Intron-Grenzen, die zu Defekten bei der Reifung des primären Transkriptes (Splicing) führen, nachgewiesen.The observed absolute coupling of the Sty I located in the gene Polymorphism with the fus3 mutation is an indication that the cDNA HL1 represents the coding sequence of the FUSCA3 gene. The Evidence of this was provided by comparative sequence analyzes of HL1 containing EcoR I fragments of the wild types and of the mutants fus3 alleles. In fus3-1 and fus3-2, point mutations in two different exon / intron boundaries that cause defects in the Lead maturation of the primary transcript (splicing), proven.
Infolge dieser Defekte kommt es in beiden Fällen zu einem vorzeitigen Kettenabbruch während der Translation der mutanten mRNAs. Der Ort des Kettenabbruchs befindet sich sowohl bei fus3-1 als auch bei fus3-2 innerhalb der oben beschriebenen 107 Aminosäuren umfassenden Konsensusregion und führt damit zu einem weitgehenden Ausfall der Samenreifung in den Mutanten.As a result of these defects, one occurs in both cases premature chain termination during translation of the mutants mRNAs. The location of the chain termination is both at fus3-1 as well as fus3-2 within the 107 described above Consensus region comprising amino acids and thus leads to a extensive failure of seed maturation in the mutants.
Claims (13)
- - in das Genom einer Pflanzenzelle eine DNA stabil integriert wird, die für ein Protein kodiert, das in einer Region von 107 Aminosäuren in mindestens 50% der Aminosäuren mit dem FUS3-Pro tein aus Arabidopsis thaliana (Abb. 1) übereinstimmt,
- - diese DNA mit geeigneten, die Transkription steuernden Elementen konstitutiv oder induzierbar exprimiert wird und
- - aus den transgenen Zellen Pflanzen regeneriert werden.
- - A DNA is stably integrated into the genome of a plant cell, which codes for a protein which in a region of 107 amino acids in at least 50% of the amino acids corresponds to the FUS3 protein from Arabidopsis thaliana ( Fig. 1),
- - This DNA is expressed constitutively or inducibly with suitable elements which control the transcription and
- - Plants are regenerated from the transgenic cells.
- - in das Genom einer Pflanzenzelle eine DNA stabil integriert wird, die komplementär zu einem in der Zelle vorhandenen Gen ist, welches für ein Protein kodiert, das in einer Region von 107 Aminosäuren in mindestens 50% der Aminosäuren mit dem FUS3-Pro tein aus Arabidopsis thaliana übereinstimmt,
- - diese DNA mit geeigneten, die Transkription steuernden Elementen konstitutiv oder induzierbar exprimiert wird und
- - aus den transgenen Zellen Pflanzen regeneriert werden.
- - In the genome of a plant cell, a DNA is stably integrated, which is complementary to a gene present in the cell, which codes for a protein that in a region of 107 amino acids in at least 50% of the amino acids with the FUS3 protein from Arabidopsis thaliana matches,
- - This DNA is expressed constitutively or inducibly with suitable elements which control the transcription and
- - Plants are regenerated from the transgenic cells.
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