DE19646324A1 - Verwendung biogener Wirkstoffe aus dem Cyanobacterium Scytonema hofmanni und dem Gemeinen Seestern Asterias rubens als natürliche Antifouling-Wirkstoffe - Google Patents

Verwendung biogener Wirkstoffe aus dem Cyanobacterium Scytonema hofmanni und dem Gemeinen Seestern Asterias rubens als natürliche Antifouling-Wirkstoffe

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Description

Die Erfindung mit der Bezeichnung "Verwendung biogener Wirkstoffe aus dem Cyanobacterium Scytonema hofmanni und dem Gemeinen Seestern Asterias rubens als natürliche Antifouling-Wirkstoffe" betrifft den Einsatz o.g. Wirkstoffe als Antifouling- Wirkstoffe zum Schutz von Oberflächen gegen den Bewuchs durch Foulingorganismen.
Unterwasserstrukturen wie z. B. Schiffsrümpfe, Seezeichen, Hafen- und off-shore-Anlagen müssen aus ökonomischen und ökologischen Gründen gegen den Bewuchs (Fouling), der aus einer komplexen Schicht von Foulingorganismen wie Bakterien, Mikroalgen, Makroalgen, Seepocken und Muscheln besteht, geschützt werden. Insbesondere bei Schiffen erhöht sich durch den Bewuchs des Schiffsrumpfes der Reibungswiderstand im Wasser, was zu einem größeren Treibstoffverbrauch, erhöhter Korrosionsanfälligkeit und erhöhter CO₂-Emission führt. Die Dockungsintervalle verkürzen sich; die Unterhaltungs- und Wartungskosten erhöhen sich.
Das auf diesem Gebiet weltweit vorwiegend praktizierte und effektivste Verfahren besteht deshalb in einer Beschichtung der entsprechenden Oberflächen mit hochgiftigen Antifoulinganstrichen. Der Antifoulinganstrich besteht in der Regel aus einem Bindemittel, einem oder mehreren hochgiftigen Bioziden und Pigmenten.
Als Bindemittel werden z. B. Kolophonium, Fettsäurederivate, Poly(meth)acrylate, Polyester, Polyurethane, Epoxidverbindungen, Chlorkautschuk, Harze oder andere, filmbildende Systeme eingesetzt. Innerhalb der Biozide werden wegen der biologischen Vielfalt der als Bewuchs­ organismen in Frage kommenden Tier-, Pflanzen- und Mikroorganismengruppen Breitband­ gifte (vorwiegend Schwermetalle und in jüngster Zeit vor allem Kupfer (I) salze wie z. B. Kupfer (I)-oxid oder organische Zinnverbindungen wie z. B. Tributylzinnoxid) verwendet. Als Pigmente werden entweder schwer wasserlösliche Pigmente wie z. B. Zinkoxid oder wasser­ unlösliche Pigmente wie z. B. Titandioxid oder Eisenoxid verwendet. Die wasserunlöslichen Pigmente verzögern hierbei aufgrund ihrer Eigenschaften die schnelle Auflösung des Farbsystems.
Die Entwicklung von Antifouling-Anstrichstoffen führte zu nachfolgenden verschiedenen Typen (Holzapfel & Rother 1988):
  • 1. Antifoulings mit löslicher Matrix (Bindemittel : Kolophonium, Fettsäurederivate):
    Gleichzeitiges Herauslösen von Biozid und Bindemittel, Bewuchsschutzvermögen durch kontinuierliche Biozidabgabe bis zur Grenze der Lebensdauer der Schicht, relative kurze Lebensdauer der Schicht, weiche Antifoulingschicht, Rauhigkeitsanstieg.
  • 2. Antifoulings mit unlöslicher Matrix (Bindemittel: Chlorkautschuk, Vinylharze):
    Biozid diffundiert aus Bindemittelmatrix heraus, keine gleichmäßige Biozidabgabe durch unterschiedliches Konzentrationsgefälle, verbrauchte Antifoulingschicht muß entfernt werden, Rauhigkeitsanstieg.
  • 3. Selbstpolierende Antifoulings (Bindemittel: zinnhaltige Acrylatcopolymere):
    Biozid wird durch Hydrolyse des Bindemittels kontinuierlich freigesetzt, die verbleibende Polymermatrix ist wasserlöslich und wird "abpoliert".
Der Einsatz von Bioziden in den beiden erstgenannten Typen ist in hoher Konzentration erforderlich, in selbstpolierenden Antifoulings in deutlich geringerer Konzentration zweckmäßig.
Die o. g. Breitbandgifte bewirken jedoch neben der Verhinderung der Ansiedlung von Foulingorganismen auch gravierende Schäden an "Nichtzielorganismen" (z. B. Immun­ schwäche und verminderte Fortpflanzungsfähigkeit bei Fischen, Sterilität bei Schnecken und Muscheln) und belasten damit unsere Gewässer erheblich. Somit zeichnet sich die Notwendig­ keit des Einsatzes alternativer Methoden zur Foulingbekämpfung ab.
Die außerordentlich vielfältigen Versuche, alternative Strategien zum Einsatz von kupfer- und zinnfreien Antifoulings zu entwickeln, haben zu einer Vielzahl von verschiedenen physikalisch/mechanischen, physikalisch/chemischen und biologisch/biochemischen Ansätzen der Bewuchsverhinderung geführt, die in der Praxis jedoch noch nicht voll einsetzbar sind (Von Oertzen et al. 1989, Abarzua & Jakubowski 1995).
Innerhalb der biologisch/biochemischen Methoden zur Foulingbekämpfung scheint die Substitution der für Antifoulinganstriche verwendeten giftigen Biozide durch biogene, nicht toxische Wirkstoffe die aussichtsreichste und umweltschonendste Methode der Bewuchsverhinderung zu sein (Abarzua & Jakubowski 1995).
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, biogene Wirkstoffe aus Süßwasser- und Meeresorganismen zu isolieren und in bestimmte Beschichtungen von Oberflächen einzubetten, um eine Besiedlung dieser durch Bewuchsorganismen zu verhindern, ohne toxische Effekte hervorzurufen. Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß die biogenen Wirkstoffe aus benthischen Cyanobacterien (Blaualgen) und marinen Invertebraten (Wirbellose) isoliert werden, von denen bekannt ist, daß sie eine Reihe von Sekundärmetaboliten produzieren, die sie gegen Bewuchsdruck schützen können. Als Ergebnis des Screenings von 30 benthischen Cyanobacterien- und marinen Invertebratenspecies kristallisierten sich das benthische Cyanobacterium Scytonema hofmanni und der marine Gemeine Seestern Asterias rubens als effektive Produzenten von spezifischen Wirkstoffen zum Schutz gegen Bewuchsdruck heraus. Als Modellbewuchsorganismus im Labor wird die Kieselalge Nitzschia pusilla verwendet.
Nach Aufkonzentrierung und chromatographischer Reinigung der Extrakte können Sekundärmetabolite isoliert werden, für die in der Literatur bislang folgende Strukturen vorgeschlagen werden:
Erfindungsgemäß sind organische Lösungsmittel wie Ether, Hexan, Benzen, Ethanol, Chloroform, Xylol oder Naphtha geeignete Lösungsmittel für Cyanobacterin; Essigsäurebutylester und Essigsäurepropylester für Saponine.
Die Isolierung (Extraktion) der spezifischen Sekundärmetabolite aus dem benthischen Cyanobacterium Scytonema hofmanni und dem Gemeinen Seestern Asterias rubens und deren biologische Testung auf die Kieselalge Nitzschia pusilla (Agardiffusionstest, Adhäsionstest, Toxizitätstest) soll an folgenden Ausführungsbeispielen erläutert werden.
Beispiel 1 Kultivierung von Scytonema hofmanni
Scytonema hofmanni Ag. UTEX B 1581 wird von der Austin Collection der Universität Texas (USA) bezogen. S. hofmanni wird in einem Cyanobacterienmedium nach Jüttner et al. (1983) (pH = 7,7) bei 25°C und Dauerlicht (15 µE m-2 ·s-1) in Batchkultur kultiviert. Die Belüftung erfolgt durch ein Luft/CO₂-Gemisch (0,3 Vol.-%). Die die biogenen Wirkstoffe produzierenden Cyanobacterien werden nach 21 Tagen Kultivierung geerntet.
Beispiel 2 Isolierung von Rohcyanobacterin (Extraktion von S. hofmanni)
Die Zellen von S. hofmanni werden filtriert, das dabei entstehende Pellet in kleine Teile zerschnitten. Die Frischmasse wird in Tris-HCl-Puffer (pH = 7,5) resuspendiert, im Ultraschallbad homogenisiert, zentrifugiert und erneut filtriert, anschließend lyophilisiert und gemahlen. 1 g lyophilisierte und gemahlene Trockenmasse von S. hofmanni wird mit 50 ml TBE, Chloroform, Benzen oder Hexan für 30 min im Ultraschallbad extrahiert und 2 × bei Raumtemperatur reextrahiert. Nach Zentrifugation werden die Rohextrakte vereinigt, filtriert und die zurückbleibende Rohcyanobacterinlösung bis zur Trockne eingeengt.
Beispiel 3 Sammeln von Asterias rubens
Mehrere Kilogramm des Gemeinen Seesterns Asterias rubens (Größe 3-15 cm) werden in der Ostsee (Dänische Ostseeküste, Kleiner Belt, Fredericia) in ca. 20 m Tiefe gesammelt.
Beispiel 4 Isolierung von Rohsaponin (Extraktion von A. rubens)
Die frischen Seesterne werden gesäubert, mit Ethanol (Endkonzentration 80%) übergossen und über Nacht stehengelassen. Der Rohextrakt wird nach Filtration über Papierfilter auf 1/3 des Gesamtvolumens im Vakuum eingeengt und anschließend mit Chloroform ausgeschüttelt. Die Chloroformphase wird abgetrennt und die Rohsaponine durch Ausfällen mit Aceton aus der zur Trockne eingeengten wäßrig-ethanolischen Extraktlösung als kompakter weißer Niederschlag gewonnen. Im Anschluß erfolgt eine Reinigung der Rohsaponine durch Ausfällen von störenden Begleitstoffen (Makromoleküle, Salze) aus der wäßrigen Rohsaponinlösung mit Ethanol. Die störenden Stoffe werden als kristalliner Niederschlag abfiltriert und die zurückbleibende wäßrige aufgereinigte Rohsaponinlösung wird im Vakuum zur Trockne eingeengt.
Beispiel 5 Kultivierung von Nitzschia pusilla
Mit Nitzschia pusilla wird eine typische Art der im Mikrofoulingbewuchs vorkommenden Kieselalge gewählt. N pusilla wird in Batchkultur bei 15°C und Dauerlicht (20 µE · m-2 · s-1) (Lichtkühlkammer) in einem ASW-Medium (artificial seawater medium) (Van Baalen 1962) (pH = 7,8) axenisch kultiviert. Da N. pusilla durch Probenahmen aus Schlickwatten des Jadebusens, Teilbereich Dangast und Vareler Außenhafen (Nordsee) gewonnen und anschließend isoliert wird, ist neben einer sterilen Anzucht die kontinuierliche Behandlung mit einer Antibiotika-Lösung (Streptomycin: Penicillin: Amphotericin = 40 : 20 : 0,25; bei Einsatz von 4 mg · ml-1 Streptomycin) notwendig (Round et al. 1990). Belüftet wird mit einem Luftgemisch (0,03 Vol.-% CO₂).
Beispiel 6 Agardiffusionstest mit N. pusilla
Der Agardiffusionstest mit der Kieselalge N. pusilla wird zum Screening verschiedener Extrakte von S. hofmanni und A. rubens auf Wachstumsinhibierungseffekte genutzt. Die Agar­ platten werden wie folgt vorbereitet: 10 ml Nährmedium, bestehend aus ASW-Medium (Van Baalen 1962) unter Zusatz von 1,5% Agar werden steril in Petrischalen (⌀ 50 mm) gegossen. Nach dem Abkühlen der Agarplatten werden 0,2 ml einer Suspension von N. pusilla aus der logarithmischen Phase (4-5 · 10⁶ Zellen · ml-1) (siehe Beispiel 5) gleichmäßig auf die Agar­ platten ausgespatelt. Nach dem Trocknen der Algensuspension erfolgt das Ausstanzen eines Loches (⌀ = 7 mm) aus der Agarschicht mit einem abgeflammten Korkbohrer im Zentrum der Agarplatte. Das durch verschiedene Extraktionsmittel gewonnene Rohcyanobacterin aus S. hofmanni (siehe Beispiel 2) wird in tert-Butylmethylether (TBE), das Rohsaponin aus A . . rubens in Aqua dest. (siehe Beispiel 4) in einer Konzentration von 100 mg · ml-1 gelöst. Zur Ermittlung der minimalen Hemmkonzentration werden aus diesen Lösungen entsprechende Verdünnungen hergestellt. Die Menge der applizierte Extraktlösung pro Petrischale beträgt in allen Fällen 50 µl. Die Wachstumshemmung wird vom Rand des Loches bis zum Rand der Hemmzone (in mm) nach 8 Tagen Inkubation (3 Parallelen) in der Lichtkühlkammer für Kieselalgen (15°C, 20 µE · m-2 · s-1) gemessen. Die Wachstumshemmung der entsprechenden Lösungsmittelkontrolle wird subtrahiert.
Tabelle 1 zeigt den Einfluß unterschiedlicher Konzentrationen des durch verschiedene Extraktionsmittel gewonnenen Rohcyanobacterins aus S. hofmanni auf das Wachstum von N. pusilla.
Tabelle 1
Aus Tabelle 1 ist deutlich zu erkennen, daß das Rohcyanobacterin aus S. hofmanni, unabhängig vom verwendeten Extraktionsmittel, eine starke Wachstumshemmung auf N. pusilla ausübt. Mit steigender Konzentration nimmt die Wachstumsinhibierung zu, wobei 0,002 mg · ml-1 (= 0,1 µg pro Agarplatte) in allen Fällen die minimale Hemmkonzentration ausmacht.
Die nachfolgende Tabelle (Tabelle 2) zeigt den Effekt unterschiedlicher Konzentrationen des Rohsaponins von A. rubens auf das Wachstum von N pusilla.
Tabelle 2
Die minimale Hemmkonzentration beträgt bei dieser Applikation 2 mg · ml-1 (=100 µg pro Agarplatte).
Beispiel 7 Adhäsionstest mit N. pusilla
Zum Testen der Antifoulingaktivität im Labormaßstab wird der Adhäsionstest mit einer 1- Algen-Kultur der Kieselalge N. pusilla durchgeführt. N. pusilla wird nach 5-6tägiger Kultivierung im Batchverfahren (siehe Beispiel 5) geerntet, in 6 l sterilem ASW-Medium (Van Baalen 1962) aufgenommen und auf eine Zellzahl von ∼ 2 · 10⁶ Zellen · ml-1 eingestellt. Danach wird diese Algensuspension auf sterile Erlenmeyerkolben (200 ml) mit Weithals (5 cm) verteilt. Vorbereitung der PVC-Plättchen: PVC-Plättchen (20 × 40 mm), die an den Seiten mit 2 kleinen Löchern versehen sind, werden mit 2 Schichten einer Mischung aus Bindemittel + Extrakt (Rohcyanobacterin bzw. Rohsaponin) bzw. Bindemittel + Lösungsmittel im Verhältnis 40 : 1 (1 g Bindemittel + 25 mg Extrakt/0,25 ml Lösungsmittel) bzw. Bindemittel pur gestrichen, an den Seiten festes Garn durchgezogen und 24 Std. hängend getrocknet. Der Extrakt wird, wenn nicht anders gekennzeichnet, in einer Konzentration von 100 mg · ml-1 appliziert, d. h. für ein Verhältnis von Bindemittel : Lösungsmittel = 40:1 wird der Extrakt in 2,5% Gewichtsprozenten appliziert. Die PVC-Plättchen werden in o. g. Algensuspension von N. pusilla getaucht (Plättchen müssen vollständig bedeckt und aufrecht sein). Danach werden die mit der Algensuspension von N. pusilla und den PVC-Plättchen versehenen Erlenmeyerkolben für 5-90 Tage bei 15°C und Dauerlicht (20 µE · m-2 · s-1) (Lichtkühlkammer) inkubiert. Dabei werden die Suspensionen von N. pusilla mit den entsprechenden PVC-Plättchen im Kreisschüttler bei 180 U · min-1 geschüttelt.
Nach 5-90tägiger Inkubation der PVC-Testplättchen erfolgt die Auswertung des Adhäsionstestes in Form einer visuellen Einschätzung (Bewuchs in %; Hemmung des Bewuchses in %) und durch exakte Ermittlung der Zellzahl im Bewuchs. Dazu wird der Bewuchs mit Gummiwischern sanft abgeschabt, in 5 ml sterilem Aqua dest. aufgenommen und mit 0,5 ml Lugolscher Lösung fixiert. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt mittels der Zählkammer nach THOMA unter dem Lichtmikroskop (Olympus CH-2).
Beispiel 8 Adhäsionstest mit N pusilla unter Einsatz verschiedener Bindemittel-/Lösungsmitteln kombinationen
Die Auswahl eines geeigneten Trägers für den Wirkstoff d. h. eines Bindemittels, spielt eine ganz entscheidende Rolle für dessen Erfolg als Antifoulingsystem. Weiterhin ist auch die Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels zum Lösen des Wirkstoffes und zum Einbinden in den Anstrich von großer Bedeutung. Es müssen die nachfolgend zusammengestellten Kriterien für die Verwendung der entsprechenden Binde- und Lösungsmittel im Adhäsionstest beachtet werden:
Hinsichtlich dieser Kriterien werden zahlreiche Versuchsserien mit unterschiedlichen Kombinationen von Binde- und Lösungsmitteln durchgeführt und ausgewertet.
Als Bindemittel werden in diesen Versuchen eingesetzt:
  • - die Farbmuster B und E der Firma BÜFA-BAEUERLE, Vinylharz rot, Vinylharz weiß, Acrylharz rot und Acrylharz weiß der Firma BROHL CHEMIE.
Zum Vergleich wird der spezielle Antifoulinganstrich Clean-Snip 200, 522-4039 als repräsentativer kommerzieller Antifoulinganstrich mitgeführt.
Als Lösungsmittel kommen zum Einsatz:
  • - Ethanol, Naphtha, Glycolether, Xylol.
Folgende Tabellen (Tabelle 3 und 4) zeigen einen Ausschnitt aus den Versuchsserien. Als beste Kombination von Bindemittel/Lösungsmittel hinsichtlich der o. g. Kriterien kristallisiert sich dabei die Mischung aus Vinylharz weiß und Naphtha heraus (vgl. Tabelle 3 und 4), da:
  • 1. eine gute Löslichkeit und Vermischung von Vinylharz weiß und Naphtha sowie eine gute Filmbildung gewährleistet sind (Tabelle 4)
  • 2. ein starker Bewuchs induziert wird, der auf weißem Untergrund gut sichtbar ist und der nach 90 Tagen noch stabil ist (Tabelle 4)
  • 3. Vinylharz weiß als Bindemittel mechanisch stabil ist (gehört zu den Antifoulings mit unlöslicher Matrix) (Tabelle 4)
  • 4. keine toxischen Effekte festgestellt werden (Tabelle 4)
  • - kein Anheftungshemmung
  • - keine Wachstumshemmung (vgl. Beispiel 10a))
  • 5. sich fast alle Extrakte gut in Naphtha lösen (Ausnahme: wäßriger Extrakt von A. rubens, hier Lösungsmittel Essigsäurebutylester)
Mit dieser Mischung aus Vinylharz weiß und Naphtha wird daraufhin der Adhäsionstest mit N. pusilla unter Einbettung des im Beispiel 9 aufgeführten Rohcyanobacterins aus S. hofmanni und des Rohsaponins aus A. rubens durchgeführt.
Beispiel 9 Adhäsionstest mit N. pusilla unter Einbettung von Rohcyanobacterin aus S. hofmanni und Rohsaponin aus A. rubens
Durch Extraktion mit TBE gewonnenes Rohcyanobacterin aus S. hofmanni wird in einer Konzentration von 10, 50 und 100 mg · ml-1 in Naphtha gelöst, durch Extraktion mit Ethanol gewonnenes Rohsaponin aus A. rubens in einer Konzentration von 100 mg · ml-1 in Essigsäurebutylester. Da sich das Rohsaponin aus A. rubens am besten in Aqua dest. löst, muß zum Einbinden in den Anstrich Essigsäurebutylester als Lösungsvermittler eingesetzt werden. Die gelösten Extrakte werden anschließend in das Bindemittel Vinylharz weiß im Verhältnis 40 : 1 (1 g Bindemittel + 25 mg Extrakt/0,25 ml Lösungsmittel) eingebettet (vgl. Beispiel 7) und der Bewuchs ausgewertet (vgl. Beispiel 7). Tabelle 5 zeigt die Wirkung von Rohcyanobacterin (100 mg · ml-1) und Rohsaponin (100 mg · ml-1) auf den Bewuchs durch N. pusilla.
Bei Einsatz von 100 mg · ml-1 Rohcyanobacterin aus S. hofmanni wird eine ca. 98%ige Hemmung des Bewuchses erreicht (siehe Tabelle 5). Die geringe Hemmwirkung des Rohsaponins aus A. rubens (100 mg · ml-1) (ca. 55%ige Hemmung des Bewuchses) ist darauf zurückzuführen, daß mit dieser Methode nur 20% der Rohsaponine in den Anstrich eingebunden werden (siehe Tabelle 5).
Bei Einsatz von Rohcyanobacterin unterschiedlicher Konzentrationen aus S. hofmanni zeigt sich, daß eine Einbettung einer Konzentration von 10 mg · ml-1 (0,25% Gewichtsprozent) ausreicht, um eine signifikante Inhibierung des Bewuchses zu erreichen (siehe Tabelle 6).
Beispiel 10 Wachstums- und Vitalitätstests mit N. pusilla
Um zu klären, ob der Testanstrich im Adhäsionstest nur die Adhäsion der Kieselalge N pusilla verhindert oder aber, ob abgegebene Stoffe durch den Auslaugungseffekt insgesamt die Vitalität der Algen in der Suspension beeinträchtigen, wird zusätzlich das Wachstum und die Vitalität (Prozentsatz an lebenden Zellen) von N. pusilla vor, während und nach Inkubation der entsprechenden PVC-Plättchen im Adhäsionstest untersucht. Folgende spezifische Tests werden durchgeführt:
a) Messen der Absorption der Algensuspension
Zur Ermittlung des Wachstums der die PVC-Plättchen umgebenden N. pusilla-Suspensionen wird die Absorption am Spektralphotometer bei 750 (Trübung), 680 (Chlorophyll a-Gehalt in vivo) und 490 nm (Carotin-Gehalt in vivo) gemessen.
b) Plattentest
Durch die Anwendung des Plattentests wird die Rekultivierung ("das Wiederanwachsen") der jeweiligen N pusilla-Suspensionen, in die die entsprechenden PVC-Plättchen mit Bindemittel und Extrakt bzw. Lösungsmittel gehängt werden, auf Agarplatten verfolgt. Die Agarplatten werden, wie unter Beispiel 6 beschrieben, vorbereitet.
c) Vitalfärbungen mit Trypanblau
Der Prozentsatz an lebenden Zellen wird anhand von Vitalfärbungen mit Trypanblau ermittelt (Lindl & Bauer 1994). 50 µl Algensuspension von N. pusilla werden mit 50 µl 0,4% Trypanblaulösung versetzt, 5 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend die Zellzahl nicht angefärbter und angefärbter Zellen mittels der Zählkammer nach THOMA unter dem Lichtmikroskop (Olympus CH-2) bestimmt: Lebende Zellen sind nicht angefärbt. Tote Zellen sind durchgängig blau angefärbt. Der Prozentsatz an lebenden Zellen errechnet sich nach folgendem Schema:
Tabellen 7 und 8 zeigen die Ergebnisse der Wachstumstests, die zur Toxizitätsbestimmung neben den Untersuchungen zur Verhinderung von Bewuchs durch Applikation von Rohcyanobacterin aus S. hofmanni und Rohsaponin aus A. rubens mitgeführt werden.
Die Einbettung von Rohcyanobacterin aus S. hofmanni führt bei Verwendung einer Konzentration von 100 mg · ml-1 zur Vitalitätsbeeinträchtigung, die sich im Laufe des Untersuchungszeitraumes verstärkt, was dafür spricht, daß das Rohcyanobacterin allmählich aus dem Bindemittel Vinylharz weiß freigesetzt wird (Auslaugungseffekt) (siehe Tabelle 7).
Bei Applikation von 10 mg · ml-1 ist eine sehr geringe Toxizität zu verzeichnen (siehe Tabelle 8), obwohl die Bewuchshemmung genauso stark ist (Tabelle 6). Durch Vitalfärbungen (Anfärbung mit Trypanblau) wird gezeigt, daß bei Einsatz von 10 mg · ml-1 Rohcyanobacterin keine Toxizität vorliegt (97% der Zellen sind lebensfähig). Im Falle der Einbettung des Rohsaponins aus A. rubens (100 mg · ml-1) wird nur eine geringe Toxizität (25%) nachgewiesen (siehe Tabelle 7).
Literatur
  • - Abarzua, S.; Jakubowski, S. (1995): Biotechnological investigation for the prevention of biofouling. I. Biological and biochemical principles for the prevention of biofouling. Mar. Ecol. Prog. Ser. 123: 301-312
  • - Holzapfel, H.; Rother, J. (1988): Antifouling-Anstrichsysteme für den Schiffbau. Farbe und Raum 4: 120-123
  • - Jüttner, F.; Leonhardt, J.; Möhren, S. (1983): Environmental factors affecting the formation of metisyl oxide, demethylalylic alcohol and other volatile compounds excreted by Anabaena cylindrica. J. Gen. Microbiol. 129: 407-412
  • - Lindl, T.; Bauer, J. (1994): Zell- und Gewebekultur, Einführung in die Gründlagen sowie ausgewählte Methoden und Anwendungen. Gustav Fischer Verlag, ISBN 3-437-30736-3, pp. 189-190
  • - Round, F.E.; Crawford, R.M.; Mann, D.G. (1990): The diatoms. Biology and Morphology of the genera. Cambridge University Press, ISBN 0-521-36318-7, pp. 13
  • - Van Baalen, C. (1962): Studies on marine blue-green algae. Bot. Mar. 4: 129-139

Claims (8)

1. Verwendung von Sekundärmetaboliten aus Süßwasser- und Meeresorganismen als natürliche Antifouling-Wirkstoffe.
2. Verwendung von Sekundärmetaboliten aus Süßwasser- und Meeresorganismen gemäß Anspruch 1, wobei die Sekundärmetabolite durch Extraktion von Cyanobacterien (Blaualgen) gewonnen werden.
3. Verwendung von Sekundärmetaboliten aus Süßwasser- und Meeresorganismen gemäß Anspruch 1, wobei die Sekundärmetabolite durch Extraktion von marinen Invertebraten (Wirbellosen) gewonnen werden.
4. Verwendung von Sekundärmetaboliten aus Süßwasser- und Meeresorganismen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, wobei es sich bei den Süßwasserorganismen um das Cyanobacterium Scytonema hofmanni handelt.
5. Verwendung von Sekundärmetaboliten aus Süßwasser- und Meeresorganismen gemäß den Ansprüchen 1 und 3, wobei es sich bei den Meeresorganismen um den Gemeinen Seestern Asterias rubens handelt.
6. Verwendung einer Mischung aus dem Bindemittel Vinylharz weiß und den Lösungsmitteln Naphtha und Essigsäurebutylester zur Einbettung der Antifouling-Wirkstoffe gemäß Anspruch 1.
7. Zubereitung einer Mischung von Rohcyanobacterin aus Scytonema hofmanni und Naphtha in Form einer Lösung, Vermischung mit dem Bindemittel Vinylharz weiß zu 0,25% Gewichtsprozenten gemäß den Ansprüchen 1, 2 und 4.
8. Zubereitung einer Mischung von Rohsaponin aus Asterias rubens und Essigsäurebutylester in Form einer Lösung, Vermischung mit dem Bindemittel Vinylharz weiß zu 2,5% Gewichtsprozenten gemäß den Ansprüchen 1, 3 und 5.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000075183A1 (en) * 1999-06-08 2000-12-14 King's College London Product from starfish
US6464997B1 (en) 1996-12-09 2002-10-15 Kelvin Winston Duncan Method of biological control
WO2003092382A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Danish Institute For Fisheries Research Composition and method for controlling microbial adhesion and biofilm formation of surfaces

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB172523A (en) * 1920-12-08 1921-12-15 Seiji Asakawa Improvements in paints for ships'-bottoms
JPH06345611A (ja) * 1993-06-04 1994-12-20 Yokohama Rubber Co Ltd:The 防汚エラストマー組成物
WO1995016000A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-15 The Research Foundation Of State University Of New York Aquatic antifouling compositions and methods

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB172523A (en) * 1920-12-08 1921-12-15 Seiji Asakawa Improvements in paints for ships'-bottoms
JPH06345611A (ja) * 1993-06-04 1994-12-20 Yokohama Rubber Co Ltd:The 防汚エラストマー組成物
WO1995016000A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-15 The Research Foundation Of State University Of New York Aquatic antifouling compositions and methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
farbe + lack, 98.Jg., 8/1992, S.657 *
Lexikon der Biologie, HERDER, Freiburg, Basel, Wien, 5.Bd., 1985, S.437,438 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6464997B1 (en) 1996-12-09 2002-10-15 Kelvin Winston Duncan Method of biological control
US6537570B1 (en) 1996-12-09 2003-03-25 Kelvin Winston Duncan Method of biological control
WO2000075183A1 (en) * 1999-06-08 2000-12-14 King's College London Product from starfish
US6991810B1 (en) 1999-06-08 2006-01-31 King's College London Product from starfish
WO2003092382A1 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Danish Institute For Fisheries Research Composition and method for controlling microbial adhesion and biofilm formation of surfaces

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