DE19638076A1 - Purifying or preparing phase transfer chromatography column - Google Patents

Purifying or preparing phase transfer chromatography column

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Abstract

A method for purifying or preparing a moist phospholipid (PL) separation column for phase transfer chromatography (PTC), consisting of a silicon dioxide carrier, PL absorbed on the carrier and excess PL, involves eluting the excess PL with oligo-ethylene glycol (I) to obtain a column free of excess PL. An analogous method is claimed for purifying or preparing a moist PL-surfactant (ST) separation column (preferably for PTC), consisting of a silicon dioxide carrier, PL absorbed on the carrier, optionally excess PL and nonionic ST, involves eluting the ST with (I) to obtain a column free of ST and excess PL. Also claimed is a method for purifying aqueous PL/ST mixtures, involving (a) adding (I) to the mixture, (b) extracting PL from the obtained suspension with an ether (II) and separating the obtained aqueous and (II) phases, (c) concentrating the ether phase, treating with acetone, precipitating PL, separating PL from the solvent phase and purifying PL chromatographically and (d ) treating the aqueous phase from stage (b) with a hydrophobic solvent (III), isolating ST as a separate phase and purifying ST chromatographically.

Description

Zur Aufreinigung von biologischen Molekülen, wie beispielsweise Proteinen, bedient man sich verschiedener Methoden, unter an­ derem der Phasentransfer-Chromatographie (PTC) vergl. TransilR-Produktinformation der Nimbus GmbM (Leipzig) Bei dieser Methode werden verschiedene Phospholipide auf Silica-Träger aufgezogen. Derartige Träger stellen die statische Phase der Chromatographie dar. Das zu trennende und beispielsweise proteinhaltige Gemisch wird auf eine PTC-Säule aufgegeben und mit Hilfe eines Tempera­ turgradienten eluiert, wobei die Elution in Abhängigkeit von den Eigenschaften des zu trennenden Gemisches vor, während oder nach dem Phasenübergang (Lα./. Lβ) des Phospholipids erfolgt. Für einige spezielle Trennaufgaben ist eine Matrix aus nicht-ioni­ schen Phospholipiden und Tensiden der homologen Reihe CnEOm not­ wendig, beispielsweise eine Matrix aus 1,2-Dimyristoyl-sn­ glycero-phosphatidylcholin (DMPC) /Tetraethylenglykol­ monododecylether (C₁₂EM₄).Various methods are used to purify biological molecules, such as proteins, including phase transfer chromatography (PTC), see Transil R product information from Nimbus GmbH (Leipzig). In this method, various phospholipids are grown on silica supports. Such carriers represent the static phase of the chromatography. The mixture to be separated and, for example, protein-containing is applied to a PTC column and eluted with the aid of a temperature gradient, the elution depending on the properties of the mixture to be separated before, during or after the Phase transition (L α ./. L β ) of the phospholipid takes place. For some special separation tasks, a matrix of non-ionic phospholipids and surfactants of the homologous series C n EO m is necessary, for example a matrix of 1,2-dimyristoyl-sn glycerophosphatidylcholine (DMPC) / tetraethylene glycol monododecyl ether (C₁₂EM₄).

Für spezielle Trennungen sind exakt präparierte Trennsäulen er­ forderlich. Dafür muß überschüssiges Phospholipid aus der Säu­ lensubphase eluiert werden, wozu ein mehrmaliges Überfahren des Phasenüberganges Lβ-Lα bei gleichzeitiger Spülung mit Pufferlö­ sung vorgeschlagen worden ist.Precisely prepared separation columns are required for special separations. For this purpose, excess phospholipid must be eluted from the column subphase, for which purpose it has been proposed that the phase transition L β -Lα be run over several times while rinsing with buffer solution.

Eine der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe besteht darin, das bekannte Verfahren zur Aufreinigung bzw. Präparation einer feuchten Phospholipid-Trennsäule für die Phasentransfer-Chroma­ tographie (PTC) zur verbessern.One object of the invention is that known methods for the purification or preparation of a damp phospholipid separation column for phase transfer chroma Improve topography (PTC).

Dazu wird gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ein Verfah­ ren zur Aufreinigung bzw. Präparation einer feuchten Phospholipid-Trennsäule für die Phasentransfer-Chromatographie (PCT) mit Siliciumdioxid-Träger undAccording to an embodiment of the invention, a method is used for this Ren for cleaning or preparation of a damp Phospholipid separation column for phase transfer chromatography (PCT) with silica carrier and

  • (i) darauf aufgezogenem Phospholipid sowie(i) phospholipid grown thereon and
  • (ii) überschüssigem Phospholipid vorgeschlagen, das dadurch ge­ kennzeichnet ist, daß man das überschüssige Phospholipid mit Oligoethylenglykol eluiert und eine von überschüssigem Phospholipid befreite Phospholipid-Trennsäule erhält.(ii) proposed excess phospholipid, thereby ge is characterized in that the excess phospholipid with Oligoethylene glycol elutes and one of excess Phospholipid-free phospholipid separation column is obtained.

Diese Elution kann man oberhalb des Phasenüberganges Lα ./. Lβ des Phospholipids vornehmen.This elution can be found above the phase transition L α ./. Make L β of the phospholipid.

Das beanspruchte Verfahren eignet sich besonders gut für Phospholipide, bei denen es sich um nicht-ionische Phospholipide handelt. The claimed method is particularly suitable for Phospholipids, which are non-ionic phospholipids acts.  

Ein Beispiel für ein geeignetes Oligoethylenglykol ist Tetraethylenglykol.An example of a suitable oligoethylene glycol is Tetraethylene glycol.

Nach der Elution kann man ein nicht-ionisches Tensid auf die Trennsäule aufziehen, insbesondere ein Tensid der homologen Reihe der allgemeinen Formel CnEOm, wobei
C eine Alkylgruppe,
n die Anzahl der Kohlenstoffatome dieser Alkylgruppe,
EO eine Ethylenglykolgruppe und
m die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten dieser Ethylenglykolgruppe bedeuten. Ein Beispiel für ein derartiges Tensid ist Tetraethylenglykolmonododecylether (C₁₂EM₄). Durch die Zugabe eines nicht-ionischen Tensids wird die Temperatur des Hauptphasenüberganges deutlich abgesenkt.After the elution, a nonionic surfactant can be drawn onto the separation column, in particular a surfactant from the homologous series of the general formula C n EO m , where
C is an alkyl group,
n is the number of carbon atoms in this alkyl group,
EO is an ethylene glycol group and
m is the number of repeating units of this ethylene glycol group. An example of such a surfactant is tetraethylene glycol monododecyl ether (C₁₂EM₄). The temperature of the main phase transition is significantly reduced by adding a non-ionic surfactant.

Eine erfindungsgemäß behandelte Trennsäule kann zur Phasentrans­ fer-Chromatographie in vorteilhafter Weise eingesetzt werden.A separation column treated according to the invention can be used for phase trans fer chromatography can be used in an advantageous manner.

Nach Gawrisch, Habilitation Leipzig 1986, geht Oligoethylenglykol bei Wasserüberschuß mit dem Phospholipid keine Wechselwirkung ein, induziert jedoch nach Biochem. Bio­ phys. Acta, 728 (1983) 121-128 eine Fusion der Phospholipidvesi­ kel im Wasserüberschuß. Ausgehend von diesen Beobachtungen wird erfindungsgemäß ein Verfahren vorgeschlagen, bei dem sich in ei­ nem einzigen Spülzyklus oberhalb des Phasenüberganges alle Phospholipidvesikel aus der Subphase der Trennsäule ausspülen lassen.According to Gawrisch, Habilitation Leipzig 1986 , oligoethylene glycol does not interact with the phospholipid in excess water, but induces according to Biochem. Bio phys. Acta, 728 (1983) 121-128 a fusion of phospholipid vesicles in excess water. Based on these observations, a method is proposed according to the invention in which all phospholipid vesicles can be rinsed out of the subphase of the separation column in a single rinsing cycle above the phase transition.

Der Fachmann hat darauf zu achten, daß bei der Zumischung des Tensids nicht die kritische Konzentration erreicht bzw. über­ schritten wird, bei der das Tensid mit dem Phospholipid einen stabilen Komplex bildet; vergl. beispielsweise Mädler, Disserta­ tion Leipzig 1995. Für C₁₂EM₄ beträgt die kritische Konzentra­ tion etwa 1 Mol pro Mol Phospholipid. The person skilled in the art has to take care that the admixture of the surfactant does not reach or exceed the critical concentration at which the surfactant forms a stable complex with the phospholipid; see, for example, Mädler, dissertation Leipzig 1995 . For C₁₂EM₄ the critical concentration is about 1 mole per mole of phospholipid.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Ver­ fahren zur Aufreinigung bzw. Präparation einer feuchten Phospho­ lipid/Tensid-Trennsäule mit Siliciumdioxid-Träger, darauf aufge­ zogenem Phospholipid, fakultativem überschüssigen Phospholipid sowie nicht-ionischem Tensid vorgesehen, das dadurch gekenn­ zeichnet ist, daß man das Tensid und überschüssiges Phospholipid mit Oligoethylenglykol eluiert und eine von Tensid und über­ schüssigem Phospholipid befreite Phospholipid-Trennsäule erhält.According to a further embodiment of the invention, a Ver drive to the purification or preparation of a moist phospho Lipid / surfactant separation column with silicon dioxide carrier, applied to it drawn phospholipid, optional excess phospholipid as well as non-ionic surfactant provided, characterized thereby is that you have the surfactant and excess phospholipid eluted with oligoethylene glycol and one from surfactant and above receives phospholipid-free phospholipid separation column.

Das Eluieren kann man in Nachbarschaft und insbesondere oberhalb des Phasenübergangens Lα ./. Lb durchführen.Elution can be carried out in the vicinity and especially above the phase transition L α ./. Perform L b .

Als Oligoethylenglykol läßt sich Tetraethylenglykol verwenden. Dabei kann man bei einem Mol-Verhältnis von Tetraethylenglykol Lipid < 15 : 1 eluieren.Tetraethylene glycol can be used as the oligoethylene glycol. You can use a molar ratio of tetraethylene glycol Elute lipid <15: 1.

Selbstverständlich kann man in das erfindungsgemäße Verfahren eine Phospholipid/Tensid-Trennsäule einsetzten, die man gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung erhalten und für ein Reinigungsverfahren verwendet hat.Of course you can in the inventive method use a phospholipid / surfactant separation column, which according to obtained in the first embodiment of the invention and for a Has used cleaning methods.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Ver­ fahren zur Aufreinigung von wäßrigen Lipid/Tensid-Gemischen vorgesehen, wie sie unter anderem bei den vorstehend beschriebe­ nen Ausführungsformen der Erfindung anfallen. Das Verfahren die­ ser weiteren Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekenn­ zeichnet, daß manAccording to a further embodiment of the invention, a Ver drive to the purification of aqueous lipid / surfactant mixtures provided, as described, inter alia, in the above NEN embodiments of the invention are incurred. The procedure the This further embodiment of the invention is characterized records that one

  • (a) dem Lipid/Tensid-Gemisch ein Oligoethylenglykol zusetzt und eine Suspension bildet,(a) adding an oligoethylene glycol to the lipid / surfactant mixture and forms a suspension,
  • (b) das Phospholipid aus der gebildeten Suspension mit Ether ex­ trahiert und die beiden anfallenden Phasen (wäßrige Phase und etherische Phase) voneinander trennt,(b) the phospholipid from the suspension formed with ether ex trahed and the two resulting phases (aqueous phase and ethereal phase)
  • (c) die etherische Phase einengt, mit Aceton versetzt, das Phospholipid ausfällt, von der Lösungsmittelphase abtrennt und chromatographisch reinigt, (c) the ethereal phase is concentrated, mixed with acetone, the Phospholipid precipitates, separates from the solvent phase and chromatographically cleaned,  
  • (d) die bei Stufe (b) angefallene wäßrige Phase mit einem hy­ drophoben Lösungsmittel versetzt, das Tensid als separate Phase abschaltet und chromatographisch reinigt.(d) the aqueous phase obtained in step (b) with a hy drophobic solvent added, the surfactant as a separate Switch off phase and clean chromatographically.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist für deuterierte oder teil­ deuterierte Substanzen besonders vorteilhaft.The method according to the invention is for deuterated or partial deuterated substances are particularly advantageous.

Als Oligoethylenglykol kann man Tetraethylenglokol, als Ether Ethylether und/oder als hydrophobes Lösungsmittel n-Hexan ver­ wenden.As oligoethylene glycol, tetraethylene glycol can be used as ether Ethyl ether and / or ver as a hydrophobic solvent n-hexane turn.

Das bei Stufe (c) anfallende Lipid kann man mit Hilfe einer HP-Flüssig-Chromatographie (HPLC) an einer Umkehrphase reinigen, wobei man ein RP-8-Säule und ein Methanol/Chloroform-Wasserge­ misch als Chromatographiemittel verwenden kann.The lipid obtained in step (c) can be removed using a Clean HP liquid chromatography (HPLC) on a reverse phase, using an RP-8 column and a methanol / chloroform water column can be used as a chromatographic mixture.

Das bei Stufe (d) anfallende Tensid kann man mit Hilfe einer Säulenchromatographie reinigen, wobei man als Säulenmaterial Si­ licagel und/oder als Eluent ein Diethylether/Methylenchlorid-Ge­ misch verwenden kann.The surfactant obtained in step (d) can be removed using a Clean column chromatography, using Si licagel and / or as an eluent a diethyl ether / methylene chloride Ge can use mixed.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele und Figuren näher erläutert. Es zeigen:In the following, the invention is illustrated by examples and figures explained. Show it:

Fig. 1 Thermogramm (DSC-Diagramm) einer käuflichen Trennsäule mit zwei endothermen Hauptphasenübergängen bei 21,2°C für das auf der Silica-Oberfläche fixierte DMPC und bei 23,7°C für das DMPC in der Subphase mit endothermem Vorphasenübergang bei etwa 14,2°C; Fig. 1 thermogram (DSC diagram) of a commercially available separation column with two endothermic main phase transitions at 21.2 ° C for the DMPC fixed on the silica surface and at 23.7 ° C for the DMPC in the subphase with endothermic pre-phase transition at about 14 , 2 ° C;

Fig. 2 Hauptphasenübergangstemperatur des auf der Trennsäule (Silica-Träger) fixierten DMPC in Abhängigkeit vom Pseudomolenbruch bei Überschuß an wäßriger Pufferlösung xT = C₁₂EO₄/(C₁₂EO₄ + E4) mit C₁₂EO₄ als Tensid, wobei
Probe 1: Originalsäule, Phasenübergang des fixierten Lipides liegt bei 21,2°C, xT = 0
Probe 2: Zugabe von C₁₂EO₄, xT = 1; Phasenübergang liegt bei 16.6°C
Probe 3: Zugabe von E4 zu Probe 2, xT = 0,081
Probe 4: Zugabe von E4 zu Probe 2, xT = 0,039
Probe 5: Zugabe von E4 zu Probe 2; xT = 0,019
Probe 6: Zugabe von E4 zu Probe 2; xT = 0,007; Fig. 2 main phase transition temperature of the DMPC fixed on the separation column (silica support) depending on the pseudomole fraction with excess aqueous buffer solution x T = C₁₂EO₄ / (C₁₂EO₄ + E4) with C₁₂EO₄ as the surfactant, wherein
Sample 1 : original column, phase transition of the fixed lipid is 21.2 ° C, x T = 0
Sample 2 : addition of C₁₂EO₄, x T = 1; Phase transition is 16.6 ° C
Sample 3 : Add E4 to sample 2 , x T = 0.081
Sample 4 : Add E4 to Sample 2 , x T = 0.039
Sample 5 : Add E4 to Sample 2 ; x T = 0.019
Sample 6 : Add E4 to Sample 2 ; x T = 0.007;

Fig. 3 kritische Mizellkonzentration (CMC) von C₁₂EO₄ in Abhängigkeit des Pseudomolenbruches xE4 = E4/(C₁₂EO₄ + E4) bei Wasserüberschuß, Linie bei CMC = 78 mmol entspricht CMC des reinen C₁₂EO₄; und Fig. 3 critical micelle concentration (CMC) of C₁₂EO₄ depending on the pseudomole fraction x E4 = E4 / (C₁₂EO₄ + E4) with excess water, line at CMC = 78 mmol corresponds to CMC of pure C₁₂EO₄; and

Fig. 4 Hauptphasenübergangstemperatur des auf der Silica-Oberfläche der Trennsäule fixierten DMPC in Abhängigkeit des Stoffmengenverhältnisses RG/L = E4/C₂₁EO₄ Fig. 4 main phase transition temperature of the fixed on the silica surface of the separation column DMPC depending on the molar ratio R G / L = E4 / C₂₁EO₄

Beispiel 1example 1

Käufliches Säulenmaterial (Phospholipid auf Silica; Transil) wird in einer Pufferlösung (pH 7 für DMPC) bezogen und enthält als Fungicid 0,05 Mol-% NaN₃. Um eine Austrocknung zu verhin­ dern und die Aktivität der Trennsäule zu erhalten, muß die Säule ständig von Pufferlösung umspült werden.Commercial column material (phospholipid on silica; Transil) is obtained in a buffer solution (pH 7 for DMPC) and contains 0.05 mol% NaN₃ as fungicide. In order to prevent dehydration and to maintain the activity of the separation column, the column must be continuously flushed with buffer solution.

Frisch präpariertes Säulenmaterial wurde mit Hilfe einer Dünn­ schichtchromatographie (DSC) untersucht. Wie man Fig. 1 entneh­ men kann, wurde bei verschiedenen Hauptphasenübergangstemperatu­ ren detektiert. Die erste Temperatur entspricht der von 1,2-Di­ myristoyl-sn-glycero-phosphatidylcholin (DMPC) auf der Silica-Oberfläche (21,2°C) und die zweite Übergangstemperatur der von reinem DMPC im Wasserüberschuß (23,7°C). Freshly prepared column material was examined using thin layer chromatography (DSC). As can be seen in FIG. 1, it was detected at various main phase transition temperatures. The first temperature corresponds to that of 1,2-dimyristoyl-sn-glycerophosphatidylcholine (DMPC) on the silica surface (21.2 ° C) and the second transition temperature to that of pure DMPC in excess of water (23.7 ° C) .

Mit einem einzigen Spülzyklus oberhalb des Phasenüberganges war es möglich, alle Phospholipidvesikel aus der Subphase der Trenn­ säule auszuspülen.With a single rinse cycle was above the phase transition it is possible to separate all phospholipid vesicles from the subphase of separation rinse out the column.

Als letzten Präparationsschritt gab man Tetraethylenglykol­ monodocecylether (C₁₂EO₄) als nicht-ionisches Tensid auf die Trennsäule. Wie man Fig. 2 entnehmen kann, wurde dadurch die Temperatur des Hauptphasenüberganges erheblich abgesenkt. Die auf diese Weise behandelte Säule konnte zur PTC eingesetzt wer­ den.As the last preparation step, tetraethylene glycol monodocecyl ether (C₁₂EO₄) was added to the separation column as a non-ionic surfactant. As can be seen in FIG. 2, the temperature of the main phase transition was thereby considerably reduced. The column treated in this way could be used for the PTC.

Beispiel 2Example 2

Wie man Fig. 3 entnehmen kann, nimmt bei der Zugabe von Tetraethylenglykol (E4) zu einem Tensid/Wasser- bzw. C₁₂EO₄/Wasser-Gemisch die kritische Mizellkonzentration (CMC) erheblich ab.As can be seen in Fig. 3, the critical micelle concentration (CMC) decreases considerably when tetraethylene glycol (E4) is added to a surfactant / water or C₁₂EO₄ / water mixture.

Als man eine gemäß Beispiel 1 behandelte Trennsäule mit fixier­ tem Tensid untersuchte, konnte der angesprochene Effekt gleich­ falls beobachtet werden. Dazu wurde eine Trennsäule (Silica/DMPC/C₁₂EO₄) mit Tetraethylenglykol (E4) gespült und das Tensid in Nachbarschaft bzw. oberhalb des Hauptphasenüberganges (Lα ./. Lβ) praktisch vollständig ausgewaschen. Das auf den Silica-Träger gebundene Phospholipid blieb dabei unberührt. Infolgedessen beobachtete man gemäß Fig. 2 und Fig. 4 einen Anstieg der Temperatur des Hauptphasenüberganges des auf der Si­ lica-Oberfläche fixierten Phospholipids.When one examined a separation column treated according to Example 1 with fixed surfactant, the mentioned effect could also be observed. For this purpose, a separation column (silica / DMPC / C₁₂EO₄) was rinsed with tetraethylene glycol (E4) and the surfactant in the vicinity or above the main phase transition (L α ./. L β ) was almost completely washed out. The phospholipid bound to the silica support remained unaffected. As a result, it was observed as shown in FIG. 2 and FIG. 4, an increase in the temperature of the main phase transition of the fixed on the Si lica surface phospholipid.

Als man das DSC-Signal des auf dem Silica-Träger fixierten Phospholipids der Ausgangssäule integrierte und mit dem der mit E4 gewaschenen Trennsäule verglich, stimmte das Integral im Rah­ men der Fehler überein. So war das Flächenverhältnis der DSC-Sig­ nale der Ausgangssäule bei 21,2°C zu dem der Tensid-beladenen und mit E4 gespülten Trennsäule bei 21,0°C < als 0,99. Aus der graphischen Darstellung des Mol-Verhältnisses C₁₂EO₄-E4 über der Temperatur konnte ermittelt werden, daß mit 16 Mol E4 etwa ein Mol C₁₂EO₄ aus der Trennsäule ausgewaschen wurde. Die vom Tensid gereinigte Trennsäule konnte damit für weitere Trennaufgaben ge­ nutzt werden.When you fixed the DSC signal on the silica support Phospholipids of the starting column and integrated with that of E4 compared the washed column, the integral in the frame was correct the errors match. This was the area ratio of the DSC-Sig nals of the starting column at 21.2 ° C to that of the surfactant-laden and separation column rinsed with E4 at 21.0 ° C <than 0.99. From the  graphical representation of the molar ratio C₁₂EO₄-E4 over the Temperature could be determined that with 16 mol E4 about one Mol C₁₂EO₄ was washed out of the separation column. The surfactant cleaned separation column could thus be used for further separation tasks be used.

Beispiel 3Example 3

Es wurde ein wäßriges Medium verwendet, bei dem es sich um ein 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerophosphatityl-cholin (POPC)/C₁₂EO₄/Wasser-Gemisch handelt. Zu einer Probe dieses Gemischs wurde eine wäßrige E4-Lösung zugegeben, wonach man bis zur Bildung einer Suspension schüttelte und in Ether aufnahm. Das Phospholipid löste sich nicht in Wasser, aber sehr gut in Ether. Beide Phasen wurden voneinander abgetrennt, die etheri­ sche Phase eingedampft und in Aceton aufgenommen. POPC war in Aceton unlöslich und fiel als flockiger Niederschlag aus, der abgetrennt und separat chromatographisch aufgearbeitet wurde.An aqueous medium was used, which is a 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerophosphatityl-choline (POPC) / C₁₂EO₄ / water mixture. For a sample of this A mixture of an aqueous E4 solution was added, after which it was carried out until Shake to form a suspension and take up in ether. The phospholipid did not dissolve in water, but very well in Ether. Both phases were separated from each other, the etheri evaporated phase and taken up in acetone. POPC was in Acetone insoluble and precipitated as a flaky precipitate was separated and worked up separately by chromatography.

Das Tensid blieb in der wäßrigen als auch in der etherischen Phase und E4 in der wäßrigen Phase zurück. Beide Phasen wurden separat aufgearbeitet. Durch die Zugabe von n-Hexan zur wäßri­ gen Phase sammelte sich das Tensid an der Grenzfläche organi­ sche/wäßrige Phase, während E4 im Wasser verblieb. Die Aufrei­ nigung des Tensid/n-Hexan-Gemischs erfolgte wiederum chromato­ graphisch.The surfactant remained in both the aqueous and the etheric Phase and E4 back in the aqueous phase. Both phases were worked up separately. By adding n-hexane to the aq Towards the phase, the surfactant collected at the organic interface cal / aqueous phase, while E4 remained in the water. The outcry The surfactant / n-hexane mixture was again chromato graphically.

Die Reinigung des Phospholipids erfolgte mit Hilfe einer HP-Chromatographie (HPLC), wobei man eine Kromasil-Säule RP-8 und als Eluent ein Methanol/Chloroform/Wasser-Gemisch (80 : 15 : 5 auf Volumenbasis) einsetzte. The phospholipid was purified by means of HP chromatography (HPLC) using a Kromasil column RP-8 and a methanol / chloroform / water mixture ( 80 : 15: 5 on a volume basis) as eluent.

Die Reinigung des Tensids erfolgte mit Hilfe einer Säulenchroma­ tographie. Als stationäre Phase wurde dazu Silica-Gel und als Eluent ein Diethylether/Methylenchlorid-Gemisch (1 : 1 auf Volu­ menbasis) eingesetzt. Während das Tensid eluierte, blieb E4 auf der Säule zurück. Die tensidhaltigen Fraktionen wurden gesammelt und der Eluent (Diethylether/Methylenchlorid-Gemisch) mit Hilfe eines Rotationsverdampfers entfernt.The surfactant was cleaned using a column chromatography. For this purpose, silica gel was used as the stationary phase and a diethyl ether / methylene chloride mixture ( 1 : 1 on a volume basis) as the eluent. While the surfactant was eluting, E4 remained on the column. The surfactant-containing fractions were collected and the eluent (diethyl ether / methylene chloride mixture) was removed using a rotary evaporator.

Die gereinigten Substanzen konnten erneut verwendet werden.The cleaned substances could be used again.

Claims (19)

1. Verfahren zur Aufreinigung bzw. Präparation einer feuchten Phospholipid-Trennsäule für die Phasentransfer-Chroma­ tographie (PTC) mit Siliciumdioxid-Träger und
  • (i) darauf aufgezogenem Phospholipid sowie
  • (ii) überschüssigem Phospholipid, dadurch gekennzeichnet, daß man das überschüssige Phospholipid mit Oligoethylenglykol eluiert und eine von überschüssigem Phospholipid befreite Phospholipid-Trennsäule erhält.
1. Process for the purification or preparation of a moist phospholipid separation column for phase transfer chromatography (PTC) with silicon dioxide carrier and
  • (i) phospholipid grown thereon and
  • (ii) Excess phospholipid, characterized in that the excess phospholipid is eluted with oligoethylene glycol and a phospholipid separation column freed from excess phospholipid is obtained.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man oberhalb des Phasenüberganges Lα ./. Lβ des Phospholipids eluiert.2. The method according to claim 1, characterized in that above the phase transition L α ./. L β of the phospholipid eluted. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß es sich bei dem Phospholipid um ein nicht-ionisches Li­ pid handelt. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized net that the phospholipid is a non-ionic Li pid acts.   4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man mit Tetraethylenglykol eluiert.4. The method according to any one of the preceding claims characterized in that eluting with tetraethylene glycol. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man nach dem Eluieren ein nicht­ ionisches Tensid aufzieht, insbesondere ein Tensid der homologen Reihe der allgemeinen Formel CnEOm, worin
C eine Alkylgruppe,
n die Anzahl der Kohlenstoffatome der Alkylgruppe,
EO eine Ethylenglykolgruppe und m die Anzahl der wiederkehrenden Einheiten an Ethylenglykolgrup­ pen bedeuten,
vorzugsweise C₁₂EO₄.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that after the elution a nonionic surfactant is drawn up, in particular a surfactant of the homologous series of the general formula C n EO m , in which
C is an alkyl group,
n is the number of carbon atoms in the alkyl group,
EO is an ethylene glycol group and m is the number of repeating units of ethylene glycol groups,
preferably C₁₂EO₄. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß man das nicht-ionische Tensid in einer Menge aufzieht, die einer Komplexbildung Tensid-Phospholipid nicht entspricht.6. The method according to any one of the preceding claims, since characterized in that the non-ionic surfactant in a Amount that complexes surfactant-phospholipid does not match. 7. Verfahren zur Aufreinigung bzw. Präparation einer feuchten Phospholipid/Tensid-Trennsäule mit Siliciumdioxid-Trä­ ger, darauf aufgezogenem Phospholipid, fakultativem überschüssi­ gen Phospholipid sowie nicht-ionischem Tensid, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man das Tensid mit Oligoethylenglykol eluiert und eine von überschüssigem Phospholipid und von Tensid befreite Phospholipid-Trennsäule erhält.7. Process for the purification or preparation of a moist phospholipid / surfactant separation column with silica trä ger, phospholipid grown thereon, optional excess gene phospholipid and non-ionic surfactant, characterized records that the surfactant is eluted with oligoethylene glycol and one freed from excess phospholipid and surfactant Phospholipid separation column obtained. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man in Nachbarschaft und insbesondere oberhalb des Phasenüber­ gangens Lα ./. Lβ des Phospholipid eluiert.8. The method according to claim 7, characterized in that in the neighborhood and in particular above the phase transition L α ./. L β of the phospholipid eluted. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeich­ net, daß man mit Tetraethylenglykol eluiert. 9. The method according to claim 7 or 8, characterized net that one elutes with tetraethylene glycol.   10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem Mol-Verhältnis von Tetraethylenglykol : Phospholipid größer 15 : 1 eluiert.10. The method according to any one of claims 7 to 9, characterized characterized in that with a molar ratio of Tetraethylene glycol: phospholipid greater than 15: 1 eluted. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer gemäß Anspruch 5 oder Anspruch 6 erhaltenen und danach für eine Phasentransfer-Chromatographie (PTC) benutzten Trennsäule ausgeht.11. The method according to any one of claims 7 to 10, characterized characterized in that one of one according to claim 5 or claim 6 obtained and then for a phase transfer chromatography (PTC) used separation column. 12. Verfahren zur Aufreinigung von wäßrigen Phospholi­ pid/Tensid-Gemischen, dadurch gekennzeichnet, daß man
  • (a) dem Gemisch ein Oligoethylenglykol zusetzt und eine Suspen­ sion bildet,
  • (b) das Phospholipid aus der gebildeten Suspension mit Ether ex­ trahiert und die beiden anfallenden Phasen (wäßrige Phase und etherische Phase) voneinander trennt,
  • (c) die etherische Phase einengt, mit Aceton versetzt, das Phospholipid ausfällt, von der Lösungsmittelphase abtrennt und chromatographisch reinigt,
  • (e) die bei Stufe (b) angefallene wäßrige Phase mit einem hy­ drophoben Lösungsmittel versetzt, das Tensid als separate Phase abscheidet und chromatographisch reinigt.
12. Process for the purification of aqueous phospholipid / surfactant mixtures, characterized in that
  • (a) adding an oligoethylene glycol to the mixture and forming a suspension,
  • (b) the phospholipid is extracted from the suspension formed with ether and the two resulting phases (aqueous phase and ethereal phase) are separated from one another,
  • (c) the ethereal phase is concentrated, mixed with acetone, the phospholipid precipitates, separated from the solvent phase and purified by chromatography,
  • (e) the aqueous phase obtained in stage (b) is mixed with a hydrophobic solvent, which separates the surfactant as a separate phase and cleans it by chromatography.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem bei dem Verfahren gemäß Anspruch 7 anfallenden Eluat ausgeht.13. The method according to claim 12, characterized in that that one of those arising in the process according to claim 7 Eluate runs out. 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Oligoethylenglykol Tetraethylenglykol verwendet.14. The method according to claim 12 or 13, characterized characterized in that as oligoethylene glycol Tetraethylene glycol used. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ether Diethylether verwendet. 15. The method according to any one of claims 12 to 14, characterized characterized in that diethyl ether is used as ether.   16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Stufe (e) n-Hexan als hydrophiles Lösungsmittel verwendet.16. The method according to any one of claims 12 to 15, characterized characterized in that in stage (e) n-hexane as hydrophilic Solvent used. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man bei Stufe (c) anfallendes Phospholipid mit Hilfe einer HP-Flüssig-Chromatographie (HPLC) an einer Um­ kehrphase reinigt.17. The method according to any one of claims 12 to 16, characterized characterized in that one accumulates in step (c) phospholipid with the help of HP liquid chromatography (HPLC) on a Um sweeping phase cleans. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß man an einer RP-8-Säule mit einem Methanol/Chloroform/Was­ ser-Gemisch chromatographiert.18. The method according to claim 17, characterized in that that on a RP-8 column with a methanol / chloroform / What chromatographed ser mixture. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man das bei Stufe (e) anfallende Tensid mit Hilfe einer Säulenchromatographie reinigt, insbesondere an Silicagel, insbesondere mit einem Diethylether/Methylenchlorid-Gemisch als Eluent.19. The method according to any one of claims 12 to 18, characterized characterized in that the surfactant obtained in step (e) with Column chromatography cleans, especially on Silica gel, especially with a diethyl ether / methylene chloride mixture as an eluent.
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