DE19626830A1 - Conditional immortalization method for human tumor cells for the production of a vaccine - Google Patents
Conditional immortalization method for human tumor cells for the production of a vaccineInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein konditionales Immortalisierungs verfahren für humane Tumorzellen zur Herstellung einer Vakzine. Es betrifft ferner ein generelles Verfahren zur Herstellung von Zellinien aus primären Zellkulturen, z. B. von T-Zellen oder von dendritischen Zellen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a conditional immortalization Method for human tumor cells for the production of a vaccine. It further relates to a general process for the preparation of Cell lines from primary cell cultures, e.g. B. T cells or of dendritic cells. Areas of application of the invention are the Medicine and the pharmaceutical industry.
Internationaler Stand der Wissenschaft und Technik. Es gibt bereits einige Vorschläge für gentechnisch hergestellte Tumorzellvakzine (OS DE 44 31 401), ihre Entwicklung basiert auf der Annahme, daß das Immunsystem gegen Tumorzellen aktiviert werden kann. Die Etablierung tumorspezifischer T-Zellen, die Klonierung erster tumorassoziierter Antigene und der Befund, daß die Sekretion eines einzelnen Zytokins durch Tumorzellen ausreicht, deren selektive Zerstörung zu induzieren, sprechen für die Möglichkeit einer tumorspezifischen Immunaktivierung. Da die molekulare Struktur der meisten Tumorantigene noch unbekannt ist und "gemeinsame" Tumorantigene bislang eher eine Seltenheit sind, muß eine spezifische Vakzine auf autologen Tumorzellen basieren. Für die Durchführung klinischer Vakzinierungsstudien ist die Transfektion autologer Tumorzellen daher ein kritischer Parameter. In den USA sind bereits mehrere klinische Studien angelaufen, die genetisch modifizierte autologe Tumorzellen als Vakzine überprüfen. Jaffee et al. (Cancer Res. 1993, 53: 2221-2226) und Yannelli et al. (J. Immunother. 1993, 161: 77-90) haben gezeigt, daß es bei ca. 30% der Patienten möglich war, Zellkulturen aus operativ gewonnenem Tumormaterial für einen ausreichenden Zeitraum zu etablieren, um in diesen Zellen Zytokine (GM-CSF, TNF bzw. IL2) zu exprimieren. Dies wurde für Nierenzell-, Ovarial-, Pankreas-, Kolon-, Mamma- und Bronchial karzinome und für Melanome gezeigt.International state of science and technology. There are already some proposals for genetically engineered Tumor cell vaccine (OS DE 44 31 401), their development is based on the assumption that the immune system activates against tumor cells can be. The establishment of tumor-specific T cells, the Cloning of first tumor-associated antigens and the finding that the secretion of a single cytokine by tumor cells sufficient to induce their selective destruction for the possibility of tumor-specific immune activation. There the molecular structure of most tumor antigens still unknown and "common" tumor antigens so far rather a rarity are, must have a specific vaccine on autologous tumor cells based. For conducting clinical vaccination studies the transfection of autologous tumor cells is therefore a critical one Parameter. There are already several clinical trials in the US tarnished the genetically modified autologous tumor cells as Check vaccine. Jaffee et al. (Cancer Res. 1993, 53: 2221-2226) and Yannelli et al. (J. Immunother. 1993, 161: 77-90) have shown that it was possible in about 30% of patients Cell cultures from surgically obtained tumor material for a sufficient time to establish in these cells Cytokines (GM-CSF, TNF or IL2) to express. This was for Renal cell, ovarian, pancreatic, colon, mammary and bronchial carcinomas and shown for melanoma.
Einschränkend ist hierzu zu sagen, daß 30% Erfolgsrate immer noch unbefriedigend ist. Das "Nadelöhr" bei dem Versuch, eine autologe Tumorzellvakzine gentechnisch zu konstruieren, besteht also nach wie vor in der geringen Reproduzierbarkeit, Zellkulturen aus Tumorbiopsaten anzulegen.Restrictive is to say that 30% success rate always still unsatisfactory. The "bottleneck" while trying to get a genetically engineering autologous tumor cell vaccines So still in the low reproducibility, Create cell cultures from tumor biopsies.
Die Erfindung hat das Ziel, die Herstellung von Zellinien aus primären Zellkulturen, z. B. von T-Zellen, von dendritischen Zellen oder von Tumorzellen, zu ermöglichen. Die spezielle Aufgabe besteht darin, gentechnisch eine autologe Tumorzellvakzine zu konstruieren und dazu reproduzierbare Zellkulturen aus Tumorbiopsaten herzustellen.The invention has the goal of producing cell lines primary cell cultures, e.g. B. T cells, dendritic Cells or from tumor cells. The special one The task is to genetically engineer an autologous To construct tumor cell vaccines and reproducible Produce cell cultures from tumor biopsies.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Das konditionale Immortalisationsverfahren für Zellinien aus primären Zellkulturen ist dadurch gekennzeichnet, daß T-Zellen, dendritische Zellen oder Tumorzellen mit einem Retrovirus konstrukt, das die Immortalisierung der Zellen bewirkt, behandelt werden, danach eine Kultivierung erfolgt und die erhaltenen Zellen vor ihrer Verwendung mit einem zweiten Retroviruskonstrukt, mit dem das inserierte erste Retroviruskonstrukt herausgeschnitten wird, behandelt werden.The invention is realized according to the claims. The conditional immortalization techniques for cell lines primary cell cultures is characterized in that T cells, dendritic cells or tumor cells with a retrovirus construct that causes immortalization of the cells, treated, followed by cultivation and the obtained cells before use with a second Retrovirus construct with which the inserted first Retrovirus construct is excised, treated.
Eine wichtige Ausführungsform der Erfindung liegt darin, daß Tumorzellen aus Patientenmaterial mit einem Retroviruskonstrukt, das die Immortalisierung der Tumorzellen bewirkt, behandelt werden, danach eine Kultivierung erfolgt und die erhaltenen Zellen vor ihrer Verwendung zur Herstellung einer Vakzine mit einem zweiten Retroviruskonstrukt, mit dem das inserierte erste Retroviruskonstrukt herausgeschnitten wird, behandelt werden.An important embodiment of the invention is that Tumor cells from patient material with a retrovirus construct, which causes the immortalization of the tumor cells treated then cultivated and the obtained Cells before use for the preparation of a vaccine with a second retroviral construct with which the first inserted Retrovirus construct is excised, treated.
Das erste Retroviruskonstrukt besteht aus den Genen für die 004Herpes Simplex-Thymidinkinase, dem large T-Gen aus SV 40 als immortalisierendem Agens, dem CMV-Promotor, Gancyclovir als negativem Selektionsmarker und dem Hygromycin-Gen als positivem Selektionsmarker, flankiert von Signal-Sequenzen (LOX) für die Rekombinase CRE.The first retrovirus construct consists of the genes for the 004 Herpes simplex thymidine kinase, the SV40 large T gene immortalizing agent, the CMV promoter, gancyclovir as negative selection marker and the hygromycin gene as positive Selection marker flanked by signal sequences (LOX) for the Recombinase CRE.
Das zweite Retroviruskonstrukt zum Herausschneiden des inserierten Konstrukts enthält die Bakteriophagen-Rekombinase CRE unter LTR-Kontrolle und das Puromycingen unter SV 40-Promotor-Kontrolle.The second retrovirus construct for excision of the inserted construct contains the bacteriophage recombinase CRE under LTR control and puromycin under SV 40 promoter control.
Beide Konstrukte sind in Abb. 1 dargestellt.Both constructs are shown in Fig. 1.
Beide Vektoren tragen unterschiedliche Selektionsmarker. Durch Infektion mit dem large T-Virus werden die Tumorzellen durch die "Krise" der Adaptation an Zellkulturbedingungen geführt. Mit dem zweiten Viruskonstrukt können diese Zellen zwecks Entfernung des ersten Konstrukts zu jedem beliebigen Zeitpunkt infiziert werden. Gegen Zellen, die keine erfolgreiche Entfernung des 1. Konstrukts gelingt (bei der TK- und und large T-Gene deletiert werden), kann mit Gancyclovir selektioniert werden. Damit werden alle Zellen abgetötet, die noch das Hygromycin-Gen in sich tragen.Both vectors carry different selection markers. By Infection with the large T virus, the tumor cells through the "Crisis" of adaptation to cell culture conditions. With the second virus construct, these cells can for the purpose of removing the infected first construct at any time become. Against cells that do not successfully remove the 1. Constructs succeed (at the TK and and large T genes deleted can be selected with Gancyclovir. With that killing all the cells that still have the hygromycin gene in them carry.
Mit der Erfindung wird erreicht, daß reproduzierbar Zellkulturen aus Tumorbiopsaten angelegt werden können und daß die "Krise" humaner Tumorzellen in Kultur überwunden werden kann. Man erreicht damit, in ihrer Antigenität unveränderte Tumorzellen als Basis für die Konstruktion genmodifizierter autologer Tumorzellen in die Hand zu bekommen. Als Zelltypen sind u. a. geeignet: das Oesophagus- und Bronchialkarzinom, Magen- und Kolonkarzinom sowie Weichgewebstumoren.With the invention it is achieved that reproducible cell cultures can be created from tumor biopsies and that the "crisis" of human tumor cells in culture can be overcome. you achieves unaltered tumor cells in their antigenicity as a basis for the construction of genetically modified autologous To get tumor cells in the hand. As cell types u. a. suitable: esophageal and bronchial carcinoma, gastric and Colon carcinoma and soft tissue tumors.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below by exemplary embodiments be explained.
Die beiden aufzubauenden Retroviruskonstrukte sind in Abb. 1 dargestellt. Das erste basiert auf dem Vektor HyTK-CMV. Der Vektor enthält ein Fusionsgen aus Hygromycin- und Herpes- Simplex-Thymidinkinase (HyTK)-Gen unter "long terminal repeat" (LTR)-Promotorkontrolle. Mit dem Virus infizierte Zellen haben daher einen positiven (Hygromycin) und einen negativen (Gancyclovir) Selektionsmarker. 3 vom HyTK-Gen liegt ein vergleichsweise starker Promotor aus dem Cytomegalovirus. Hinter diesen wird das large T-Gen aus SV40 kloniert. Das large T-Gen wird durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert, wobei der 3′Primer und eine 34-Basenpaar-lange Sequenz verlängert ist, die der LOX-Erkennungssequenz für die CRE-Rekombinase entspricht und während der PCR-Reaktion aufgefüllt wird. In einem zweiten Schritt wird eine zweite LOX-Sequenz als doppelsträngiges Primerpaar 5′ vom HyTK-Gen aus gesehen kloniert. Das Ergebnis ist ein Vektor, der links und rechts vom HyTK- und large T-Gen je eine LOX-Sequenz als Substrat für die CRE-Rekombinase aufweist. Das zweite Retroviruskonstrukt basiert auf der pBABE-Puro. In diesen Vektor wird in eine Klonierungsschnittstelle das Gen für Bakteriophagen-Rekombinase CRE hinter das 5 LTR kloniert. Die CRE-Rekombinase kann in einer LOX-Sequenz-spezifischen Weise die Deletion der Sequenz zwischen zwei LOX-Erkennungssequenzen durchführen. Der Vektor enthält zusätzlich das Puromycin-Gen unter SV40-Promotorkontrolle als Selektionsmarker. Beide Vektoren werden durch Transfektion in geeignete Verpackungszellinien in Viruspartikel konvertiert. Die Sequenzen des large T-Bereichs und der LOX-Regionen werden durch Sequenzanalyse verifiziert.The two retrovirus constructs to be constructed are shown in FIG . The first is based on the vector HyTK-CMV. The vector contains a fusion gene of hygromycin and herpes simplex thymidine kinase (HyTK) gene under long terminal repeat (LTR) promoter control. Cells infected with the virus therefore have a positive (hygromycin) and a negative (gancyclovir) selection marker. 3 of the HyTK gene is a comparatively strong promoter from the cytomegalovirus. Behind these, the large T gene from SV40 is cloned. The large T gene is amplified by the polymerase chain reaction (PCR) to extend the 3 'primer and a 34 base pair sequence that corresponds to the LOX recognition sequence for the CRE recombinase and replenished during the PCR reaction. In a second step, a second LOX sequence is cloned as a double-stranded primer pair 5 'from the HyTK gene. The result is a vector that has one LOX sequence as substrate for the CRE recombinase to the left and right of the HyTK and large T gene. The second retrovirus construct is based on the pBABE-Puro. In this vector, the gene for bacteriophage recombinase CRE is cloned into a cloning site behind the 5 LTR. The CRE recombinase may perform deletion of the sequence between two LOX recognition sequences in a LOX sequence-specific manner. The vector additionally contains the puromycin gene under SV40 promoter control as a selection marker. Both vectors are converted to virus particles by transfection into suitable packaging cell lines. The sequences of the large T-region and the LOX regions are verified by sequence analysis.
Unterschiedliches Tumormaterial wird operativ gewonnen, mechanisch/enzymatisch zu Einzelzell-suspensionen aufgearbeitet, mit dem HyTK-LOX-CMV-IT-Virus bzw. Kontrollvirus infiziert, plus und minus Selektionsmarker (Hygromycin) kultiviert und die Wachstumskinetik bestimmt. Ggf. wird der Infektion eine Anreicherung der Tumorzellen, z. B. durch Separation mit Antikörpern, die spezifisch für tumorassoziierte Antigene sind, vorangestellt, um zu verhindern, daß virusinfizierte Zellen (z. B. Fibroblasten), die das Tumor-material kontaminieren, die Tumorzellen überwachsen. Der Nachweis, daß wirklich Tumorzellen immortalisiert wurden, kann durch Färbung mit Antikörpern, die tumorassoziierte Antigene erkennen, und durch PCR für bestimmte Onkogene geführt werden. Außerdem wird die Frequenz, mit der in large T-abhängiger Weise Langzeitkulturen gewonnen werden, in Abhängigkeit vom Tumorzelltyp bestimmt. Nach unterschiedlich vielen Passagen werden die Zellinien mit dem Virus BABE-CRE-Puro infiziert und auf Puromycinresistenz selektioniert. In den mit beiden Viren infizierten Zellen führt die CRE-Rekombinase eine LOX-spezifische Rekombination des HyTK-LOX-CMV-IT-Virus durch, bei der das HyTK-Fusionsgen und das large T-Gen deletiert werden. Der Phänotyp der Tumorzellen sollte in der Abfolge des Experiments wie folgt sein: PuroS, HygroS, GCVR, G418S 1.Virus RuroS, HygroR, GCVS, G418S 2.Virus PuroR, HygroS, GCRR, G418S.Different tumor material is obtained surgically, processed mechanically / enzymatically into single cell suspensions, infected with the HyTK-LOX-CMV-IT virus or control virus, plus and minus selection markers (hygromycin) are cultured and the growth kinetics determined. Possibly. the infection is an accumulation of tumor cells, eg. , By separation with antibodies specific for tumor-associated antigens, to prevent virus-infected cells (eg, fibroblasts) that contaminate the tumor material from overgrowing the tumor cells. The demonstration that tumor cells have indeed been immortalized can be guided by staining with antibodies that recognize tumor-associated antigens and by PCR for certain oncogenes. In addition, the frequency with which long-term cultures are obtained in a large T-dependent manner is determined as a function of the tumor cell type. After different numbers of passages, the cell lines are infected with the virus BABE-CRE-Puro and selected for puromycin resistance. In the cells infected with both viruses, the CRE recombinase performs LOX-specific recombination of the HyTK-LOX-CMV-IT virus, deleting the HyTK fusion gene and the large T gene. The phenotype of the tumor cells in the sequence of the experiment should be as follows: Puro S , Hygro S , GCV R , G418 S 1.Virus Ruro S , Hygro R , GCV S , G418 S 2.Virus Puro R , Hygro S , GCR R , G418 p .
Entsprechend diesem Schema wird anhand der Bestimmung der Wachstumskinetik und der sequentiellen Selektion der Zellen mit Puromycin, Gancyclovir und Hygromycin annäherungsweise bestimmt, mit welcher Frequenz nach Infektion mit dem 2. Virus spezifische Rekombination durchgeführt wird (RoroR vs. GCVR). Die Frequenz wird zusätzlich genau dadurch bestimmt, daß die Zellen nach Infektion direkt in Gegenwart von Puromycin kloniert werden und anschließend prozentual GCVRR-Zellen bestimmt werden. Ferner wird sichergestellt, daß alle Zellen, die keine spezifische Rekombination durchgeführt haben, eliminiert sind (GCVR und Gegenkontrolle HygroS), d. h. nur large T-negative Zellen in der Kultur übrigbleiben. Dies wird molekular durch PCR mit large T-spezifischen Primern analysiert.According to this scheme, the determination of the growth kinetics and the sequential selection of the cells with puromycin, gancyclovir and hygromycin approximates the frequency with which specific recombination is carried out after infection with the second virus (Roro R vs. GCV R ). In addition, the frequency is determined precisely by cloning the cells directly after infection in the presence of puromycin and then determining percentage GCVR R cells. Furthermore, it is ensured that all cells which have not performed any specific recombination are eliminated (GCV R and control Hygro S ), ie only large T-negative cells remain in the culture. This is analyzed molecularly by PCR with large T-specific primers.
Tumorzellen, von denen aus einem Tumorbiopsat eine Zellkultur angelegt wird, haben in der Regel eine begrenzte Lebensspanne von 10-20 Passagen. Aus einem Mammakarzinombiopsat wird eine Zellkultur angelegt, und die Zellen entweder mit dem large T-Retrovirus infiziert oder unbehandelt gelassen. Wie aus Abb. 2 zu sehen ist, führt die Infektion mit den large T-Retrovirus zu einer kontinuierlichen Proliferation der Zellen über mehrere Zellkulturpassagen. Die nicht-infizierten Zellen nahmen an Zahl sukzessive in Kultur ab, und es ließ sich keine Zellkultur etablieren. Dies beweist, daß sich mit Hilfe des large T-Virus Zellinien aus dem Tumorbiopsat isolieren lassen.Tumor cells, from which a tumor biopsy is applied to a cell culture, usually have a limited lifespan of 10-20 passages. From a breast carcinoma biopsy, a cell culture is established and the cells are either infected with the large T retrovirus or left untreated. As can be seen from Fig. 2, infection with the large T retrovirus leads to continuous proliferation of the cells over several cell culture passages. The uninfected cells decreased in number successively in culture, and no cell culture could be established. This proves that can be isolated from the tumor biopsy using the large T virus cell lines.
NIH3T3-Zellen werden zunächst mit dem large T-Retrovirus infiziert und die HygroR-Zellen selektioniert. Anschließend werden die Zellen mit dem CRE-Rekombinase-Retrovirus infiziert, und die PuroR-Zellen selektioniert. Dann wird mit GCV gegen alle Zellen selektioniert, bei denen keine Rekombination, bei der large T- und Thymidinkinase-Gene deletiert wurden, stattgefunden hat. Daraufhin werden die Zellen mit einem large T-spezifischen Antikörper angefärbt. Die Tabelle zeigt, daß nach Infektion mit dem large T-Virus quasi alle Zellen eine starke Kernfärbung aufweisen. Nach Infektion mit dem CRE-Rekombinase-Virus und GCV-Selektion war keine Färbung mit dem large T-Antikörper mehr nachweisbar.NIH3T3 cells are first infected with the large T retrovirus and the Hygro R cells are selected. Subsequently, the cells are infected with the CRE recombinase retrovirus and the Puro R cells are selected. GCV is then selected against all cells in which no recombination involving the deletion of large T and thymidine kinase genes has occurred. Then the cells are stained with a large T-specific antibody. The table shows that after infection with the large T virus virtually all cells have a strong nuclear staining. After infection with the CRE recombinase virus and GCV selection no staining with the large T antibody was more detectable.
Zwei-Schritt konditionales Immortalisationssystem für primäre humane Tumorzellen. Retrovirusvektor HyTK-LOX-CMV-IT enthält die Erkennungssequenzen der Bakteriophagen-Rekombinase CRE (LOX), ein Fusionsgen, welches für Hygromycin und die Herpes Virus Thymidinkinase kodiert (HyTK) und den large T-Bereich aus SV40 (IT) unter CMV-Promotorkontrolle (CMV). Retrovirusvektor BABE- CRE-Puro enthält die CRE-Rekombinase unter LTR-Kontrolle und das Puromycingen unter SV40-Promotorkontrolle. Nicht maßstabsgerecht gezeichnet.Two-step conditional immortalization system for primary human tumor cells. The retrovirus vector HyTK-LOX-CMV-IT contains the Recognition sequences of the bacteriophage recombinase CRE (LOX), a fusion gene, which is responsible for hygromycin and the herpes virus Thymidine kinase encodes (HyTK) and the large T region from SV40 (IT) under CMV promoter control (CMV). Retrovirus vector BABE- CRE-Puro contains the CRE recombinase under LTR control and the Puromycin gene under SV40 promoter control. Not to scale drawn.
Eine Zellsuspension aus einem Mammakarzinombiopsat wurde angelegt und entweder mit dem Retrovirus HyTK-LOX-CMV-IT infiziert (∎) oder unbehandelt gelassen (⚫). Die Infektion erfolgte in der zweiten Woche. Die Pfeile geben die Zeitpunkte an, an denen die konfluente Zellkultur 1:10 ausgedünnt wurde.A cell suspension from a breast carcinoma biopsy was and either with the retrovirus HyTK-LOX-CMV-IT infected (∎) or left untreated (⚫). The infection took place in the second week. The arrows indicate the times on which the confluent cell culture was thinned 1:10.
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