DE19626750A1 - Preparative isolation of bio-molecules on carrier having specific binding component - Google Patents
Preparative isolation of bio-molecules on carrier having specific binding componentInfo
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung von Biomolekülen im präparativen Maßstab.The present invention relates to a device for isolating Preparative-scale biomolecules.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt im wesentlichen einen Träger mit einem Trägermaterial auf dem eine Bindungskomponente für die Biomoleküle gebunden ist. Daneben beinhaltet die erfindungsgemäße Vorrichtung einen Biosensor. - Geeignete Träger - wie z. B. Glas - sowie Trägermaterialien - wie z. B. Titandioxid oder Tantal(V)oxid -, die zu einer Ausbildung von - vorzugsweise kovalenten - Bindungen zu der Bindungskomponente befähigt sind, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Bindungskomponenten kommen Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Bindungsmoleküle, DNA, RNA, Enzyme, Proteine, Peptide wie auch Zellorganellen, Zellmembranen oder ganze Zellen in Frage.The device according to the invention essentially comprises a carrier a carrier material on which a binding component for the biomolecules is bound. In addition, the device according to the invention includes a Biosensor. - Suitable carriers - such. B. glass - as well as support materials - such as e.g. B. titanium dioxide or tantalum (V) oxide - which leads to the formation of - preferably covalent - capable of binding component are known from the prior art. As binding components come antigens, antibodies, receptors, binding molecules, DNA, RNA, Enzymes, proteins, peptides as well as cell organelles, cell membranes or whole cells in question.
Biosensoren an sich sind aus dem Stand der Technik bekannt:
unter einem Biosensor versteht man allgemein eine Vorrichtung, die
biochemische Wechselwirkungen mißt. Nach diesem Prinzip arbeiten ganz
allgemein Biosensoren, die aus einem Signalgeber, einem Signalwandler, der
das biologische Signal in ein meßtechnisch erfaßbares Signal umwandelt, und
aus einer signalverarbeitenden Vorrichtung bestehen. Dabei basieren derartige
Biosensoren auf der Kopplung von Biomolekülen, die als Rezeptoren im
weitesten Sinne spezifische Analyte "erkennen", mit physikochemisch
arbeitenden Transduktoren. Als biologische Komponenten können in solchen
Sensoren ebenfalls Antigene, Antikörper, Rezeptoren, Bindungsmoleküle,
DNA, RNA, Enzyme, Proteine, Peptide etc. eingesetzt werden. Auch hier ist
der Einsatz von Zellorganellen, Zellmembranen oder ganzen Zellen möglich.Biosensors per se are known from the prior art:
A biosensor is generally understood to be a device that measures biochemical interactions. Biosensors, which consist of a signal transmitter, a signal converter which converts the biological signal into a signal which can be detected by measurement technology, and a signal processing device work in accordance with this principle in general. Such biosensors are based on the coupling of biomolecules, which "recognize" specific analytes in the broadest sense as receptors, with physico-chemical transducers. Antigens, antibodies, receptors, binding molecules, DNA, RNA, enzymes, proteins, peptides etc. can also be used as biological components in such sensors. Here too, cell organelles, cell membranes or whole cells can be used.
Im Prinzip kann jedoch jedes gewünschte Molekül, das zu einer Interaktion bzw. einer beispielsweise koordinativen Bindung befähigt ist, mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung isoliert werden.In principle, however, any desired molecule that leads to an interaction or a coordinative bond, for example, is capable of using the device according to the invention are isolated.
Ein Vorteil der biologischen Erkennung liegt in der spezifischen Unterscheidung auch von sehr ähnlichen Strukturen und Verbindungen und in ihrer hohen Affinität. Biosensoren besitzen damit die Eigenschaft zur Wechselwirkung auch mit kleinsten Substanzmengen. Dazu wird eine Bindungskomponente z. B. ein Antikörper auf der Sensoroberfläche kovalent immobilisiert. Kommt es zur Bindung eines Antigens an den Antikörper, so hat dies eine physikalische oder chemische Änderung an der Biosensoroberfläche - wie z. B. Massenzuwachs sowie eine Änderung der optischen Eigenschaften, etc. - zur Folge, die gemessen werden kann.One advantage of biological detection is the specific one Differentiation of very similar structures and connections and in their high affinity. Biosensors therefore have the property of Interaction even with the smallest amounts of substance. This will be a Binding component z. B. an antibody on the sensor surface covalently immobilized. If an antigen binds to the antibody, it has this is a physical or chemical change on the biosensor surface - such as B. increase in mass and a change in the optical properties, etc. - result that can be measured.
Auf diese Weise erhält man ein Sensorsignal, das eine spezifische Wechselwirkung zwischen Antikörper und Antigen widerspiegelt. Die Überträger-Komponente - bzw. der "Transduktor" - des Biosensors wandelt dieses Signal in ein meßbares elektrisches Signal um, das ggf. durch eine - nachgeschaltete - elektronische Komponente verstärkt wird [Scheller und Schubert, Biosensoren, Verlag Birkhäuser, Basel 1989; Hall, Biosensors, Buckingham - Open Univ. Press 1990; Schmid (Hrsg.) Biosensors, International Workshop 1987, GBF-Monographs, Vol. 10, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim 1987; Präve et al. (Hrsg.), "Biosensors - A Decade of Research" in Karube und Sode, Japan. Jahrbuch Biotechnologie, Bd. 2, S. 183, Verlag Hanser, München 1988; Trends in Biotechnol., 6 (1988) 310]. Daneben ist ein optischer Sensor zum selektiven Nachweis von Substanzen und zur Detektion von Brechzahländerungen in Meßsubstanzen in der Europäischen Patentschrift EP 0 226 604 beschrieben, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.In this way you get a sensor signal that is specific Interaction between antibody and antigen reflects. The Transmitter component - or the "transducer" - of the biosensor converts convert this signal into a measurable electrical signal, which may be downstream - electronic component is strengthened [Scheller and Schubert, Biosensors, Verlag Birkhäuser, Basel 1989; Hall, biosensors, Buckingham - Open Univ. Press 1990; Schmid (ed.) Biosensors, International Workshop 1987, GBF-Monographs, Vol. 10, VCH Publishing company, Weinheim 1987; Preve et al. (Ed.), "Biosensors - A Decade of Research "in Karube and Sode, Japan. Biotechnology Yearbook, Vol. 2, p. 183, published by Hanser, Munich 1988; Trends in Biotechnol., 6 (1988) 310]. Next to it is an optical sensor for the selective detection of Substances and for the detection of refractive index changes in measuring substances in the European patent EP 0 226 604, to the content Reference is made.
Allerdings waren mit dem Biosensor bis zum heutigen Tage allein nur Bestimmungen im analytischen Maßstab möglich, während für die Aufgabe, die Biosensortechnik in präparativen Größenordnungen nutzbar zu machen, aus dem Stand der Technik bislang keine Lösungsvorschläge zu entnehmen sind.However, with the biosensor to date, only Determinations on an analytical scale possible while for the task that To make use of biosensor technology in preparative orders of magnitude No proposed solutions have so far been found in the prior art.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit u. a. darin, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die es ermöglicht, Biomoleküle in präparativen Größenordnungen zu immobilisieren und - beispielsweise nach einer Elution - auch im präparativen Maßstab zur Verfügung zu stellen.The object of the present invention is therefore u. a. in it To provide a device that allows biomolecules in immobilize preparative orders of magnitude and - for example after an elution - also available on a preparative scale.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein vorteilhaftes Verfahren zur Immobilisierung geeigneter Liganden im präparativen Maßstab auf den eingangs genannten Trägermaterialien zur Verfügung zu stellen.Another object of the present invention is to provide a advantageous method for immobilizing suitable ligands in the preparative scale on the carrier materials mentioned at the outset To make available.
Gelöst werden die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgaben durch die in den kennzeichnenden Teilen der Ansprüche beschriebene Vorrichtung, die es ermöglicht, eine genügend große Anzahl vom Biomolekülen (größer 1 pMol) präparativ - und vorzugsweise kovalent - zu immobilisieren. Als besonders vorteilhaft hat sich dabei die Carboxylierung der Oberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Bernsteinsäureanhydrid und u. a. mit Polyglutaminsäure erwiesen.The objects on which the present invention is based are achieved by those described in the characterizing parts of the claims Device that allows a sufficient number of biomolecules (greater than 1 pmole) preparative - and preferably covalent - to immobilize. The carboxylation of the surface of the Device according to the invention with succinic anhydride and u. a. With Proven polyglutamic acid.
Beide erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen es, Carboxylfunktionen auf der Sensoroberfläche einzuführen, die leicht Proteine, Peptide, Rezeptoren etc. über die freie Aminofunktionen kovalent im Rahmen einer Amidbindung zu immobilisieren.Both methods according to the invention make it possible to have carboxyl functions to introduce the sensor surface that easily proteins, peptides, receptors etc. covalently via the free amino functions within the framework of an amide bond immobilize.
Auf der durch die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Verfügung gestellten präparativ nutzbaren Oberfläche wird z. B. ein Antikörper kovalent immobilisiert. Bindet ein Antigen aus der über den Sensor gepumpten Lösung an die auf der erweiterten Oberfläche immobilisierten Antikörper, so werden diese im präparativen Maßstab gebunden. Die Lösung läßt sich im Kreis führen, so daß eine kontinuierliche Anreicherung von Antigen aus einem sehr kleinen Probenvolumen vorgenommen werden kann. Der Biosensor informiert den Betreiber in Echtzeit, ob eine Bindung zwischen Antikörper und Antigen stattfindet und wann die Sensoroberfläche mit gebundenem Antigen optimal belegt ist.On the provided by the device according to the invention preparative surface is z. B. an antibody covalently immobilized. Binds an antigen from the solution pumped through the sensor to the antibodies immobilized on the extended surface these bound on a preparative scale. The solution can be found in a circle lead so that a continuous enrichment of antigen from a very small sample volume can be made. The biosensor informs the operator in real time whether there is a bond between antibody and antigen takes place and when the sensor surface with bound antigen is optimal is occupied.
Kommt es zu einer biochemischen Bindung zwischen einem - z. B. auf einer Biosensoroberfläche immobilisierten - Antikörper und einem spezifischen Antigen, so erhält man - wie oben beschrieben, durch die physikalische bzw. chemische Änderung der Sensoroberfläche, und damit der optischen Eigenschaften der Oberfläche - ein Sensorsignal. Man erreicht damit nicht nur, daß der Antikörper in einer präparativen Größenordnung immobilisiert wird, sondern auch eine präparative Immobilisierung beispielsweise des Antigens auf der gesamten zur Reaktion befähigten Oberfläche.If there is a biochemical bond between a - e.g. B. on one Immobilized biosensor surface - antibody and a specific Antigen is obtained, as described above, by the physical or chemical change of the sensor surface, and thus the optical Surface properties - a sensor signal. It’s not just that the antibody is immobilized on a preparative scale, but also preparative immobilization of the antigen, for example on the entire surface capable of reaction.
Das Sensorprinzip basiert auf dem integriert optischen Gitterkoppler. Der eigentliche Sensor besteht aus einem Glassubstrat der Größe 15 × 50 mm dessen Oberfläche einen optisch hochbrechenden Film zum Beispiel aus TiO₂ Siliciumnitrit, Zirkonoxid oder Ta₂O₅ oder anderen geeigneten Materialen, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, trägt. In der geometrischen Mitte des Sensors befindet sich ein optisches Gitter, über das ein Laserstrahl in die Grenzschicht zwischen Glassubstrat und optisch hochbrechender Schicht sowie hochbrechende Schicht und Luft (bzw. Wasser) unter Totalreflexion propagiert.The sensor principle is based on the integrated optical grating coupler. Of the The actual sensor consists of a glass substrate measuring 15 × 50 mm the surface of which is an optically high-index film, for example made of TiO₂ Silicon nitrite, zirconium oxide or Ta₂O₅ or other suitable materials are known from the prior art. In the geometric center of the There is an optical grating over which a laser beam enters the sensor Boundary layer between glass substrate and optically high refractive index layer as well highly refractive layer and air (or water) with total reflection propagates.
Der Laserstrahl koppelt unter einem ganz bestimmten Winkel α in den optisch hochbrechenden Film ein. Dieser Einkopplungswinkel ist abhängig von der optischen Oberflächeneigenschaft des optisch hochbrechenden Films am Einkopplungspunkt des Laserstrahls. Durch Bindung von Molekülen auf der Oberfläche an diesem Einkopplungspunkt verändert sich die optische Oberflächeneigenschaft des Films und damit der Einkopplungswinkel α₁. Methoden zur Bindung von geeigneten Detektionsmolekülen - wie z. B. Antikörpern - sind ebenfalls aus dem Stand der Technik bekannt. Der neue Einkopplungswinkel α₂ ergibt sich somit aus α₁+Δα. Wobei Δα die Verschiebung des neuen Einkopplungswinkels ist. Die Verschiebung des Einkopplungswinkels um Δα läßt sich hochsensitiv messen und ist ein Maß für die Bindung von Molekülen an die Sensoroberfläche.The laser beam couples optically into the optically at a certain angle high-index film. This coupling angle depends on the optical surface property of the optically high refractive index film Coupling point of the laser beam. By binding molecules on the The surface at this coupling point changes the optical Surface property of the film and thus the coupling angle α₁. Methods for binding suitable detection molecules - such as. B. Antibodies - are also known from the prior art. The new Coupling angle α₂ thus results from α₁ + Δα. Where Δα the Shift of the new coupling angle is. The shift of the Coupling angle around Δα can be measured in a highly sensitive manner and is a measure of the binding of molecules to the sensor surface.
Nachdem die Oberfläche belegt ist, wird mit einer geeigneten Lösung nachgewaschen, die eventuell unspezifisch gebundene Substanzen von der Oberfläche entfernt. Die Bindung zwischen Antikörper und Antigen wird dadurch aber nicht gelöst.After the surface is covered, use a suitable solution washed, the possibly non-specifically bound substances from the Surface removed. The binding between the antibody and antigen will but not solved by it.
Im nachfolgenden Schritt läßt sich die Bindung zwischen Antigen und Antikörper durch z. B. einer pH Änderung der umgebenden Lösung, durch Änderung der Ionenstärke, durch Änderung der Zusammensetzung des Puffers, durch Änderung der Temperatur etc. lösen und es kommt zur Elution.In the subsequent step, the bond between antigen and Antibodies by e.g. B. a pH change in the surrounding solution Change in ionic strength by changing the composition of the Loosen buffers by changing the temperature etc. and elution occurs.
Dies kann zum Beispiel durch eine pH Änderung an der Sensoroberfläche erfolgen, d. h. man pumpt eine 0.01 N HCl, pH 2,0 Lösung über die Sensoroberfläche. Dadurch wird die Bindung zwischen Antikörper und Antigen aufgehoben und das Antigen eluiert von der Oberfläche. Das zu eluierende Antigen kann dann - beispielsweise - direkt in einen Massenspektrographen, Sequenzer, HPLC-Anlage oder ein anderes analytisches Gerät überführt werden, um weiter chemisch physikalisch oder biologisch charakterisiert zu werden. Daneben läßt es sich zur weiteren biochemischen Charakterisierung separat auffangen - z. B. ELISA, enzymatische Spaltung, peptide mapping, enzymatische Aktivität etc. This can be caused, for example, by a pH change on the sensor surface done, d. H. a 0.01 N HCl, pH 2.0 solution is pumped over the Sensor surface. This breaks the bond between the antibody and antigen picked up and the antigen elutes from the surface. The one to be eluted Antigen can then - for example - directly in a mass spectrograph, Sequencer, HPLC system or another analytical device transferred to be further characterized chemically, physically or biologically will. In addition, it can be used for further biochemical characterization collect separately - e.g. B. ELISA, enzymatic cleavage, peptide mapping, enzymatic activity etc.
Die Reaktionsoberfläche der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie der Biosensor, bzw. der an der Sensoroberfläche immobilisierte Antikörper läßt sich durch einen geeigneten Puffer leicht rekonditionieren und ist danach zu einem weiteren Isolierungszyklus bereit.The reaction surface of the device according to the invention and the Biosensor, or the antibody immobilized on the sensor surface easily recondition with a suitable buffer and is then closed ready for another isolation cycle.
Auf diese Weise lassen sich leicht alle Biomoleküle bzw. Moleküle (z. B. Rezeptoren, Antigene, Antikörper, DNA, RNA, Proteine, Peptide, Enzyme, etc.) im präparativen Maßstab isolieren, die einen spezifischen Bindungspartner besitzen. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung hat ferner den Vorteil, daß das Biosensorsignal in Echtzeit eine Information liefert, ob eine spezifische Wechselwirkung zwischen z. B. Antikörper/Antigen nicht nur auf der Probenoberfläche, sondern auf der gesamten zur Reaktion befähigten Oberfläche stattfindet und eröffnet somit die Möglichkeit, einer präparativen Isolierung und weiteren Charakterisierung des - beispielsweise - gebundenen Antigens (im Fall einer kovalenten Immobilisierung des Antikörpers auf der Oberfläche).In this way, all biomolecules or molecules (e.g. Receptors, antigens, antibodies, DNA, RNA, proteins, peptides, enzymes, etc.) isolate on a preparative scale that a specific binding partner have. The device of the present invention also has the advantage of that the biosensor signal provides real-time information whether a specific interaction between e.g. B. Antibodies not only on the Sample surface, but on the whole enabled to react Surface takes place and thus opens up the possibility of a preparative Isolation and further characterization of the - for example - bound Antigen (in the case of covalent immobilization of the antibody on the Surface).
Die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung läßt sich u. a. zur Isolierung Vielzahl von Biomolekülen - wie z. B. Antigenen, Antikörpern, Rezeptoren, Rezeptorbindungsmolekülen, DNA, RNA, Peptiden, Proteinen, Enzymen, Enzymkomplexen, Zellen, Zellfragmenten, Zellorganellen, Zellmembranen etc. - einsetzen. Diese Verbindungen lassen sich in Mengen isolieren, die ausreichen, weitere chemische und physikalische Charakterisierungen durchzuführen.The device according to the present invention can u. a. for insulation Variety of biomolecules - such as B. antigens, antibodies, receptors, Receptor binding molecules, DNA, RNA, peptides, proteins, enzymes, Enzyme complexes, cells, cell fragments, cell organelles, cell membranes etc. - deploy. These compounds can be isolated in amounts that sufficient, further chemical and physical characterizations perform.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, ohne sie auf diese Beispiele einzuschränken, wobei für den Fachmann sofort aus den Beispielen wie auch aus der Beschreibung eindeutig ersichtlich ist, daß weitere vorteilhafte Ausführungen der vorliegenden Erfindung gemäß dieser Offenbarung möglich sind.The following examples are intended to illustrate the present invention without restrict them to these examples, being immediately off to those skilled in the art the examples and the description clearly show that further advantageous embodiments of the present invention according to this Revelation are possible.
Die beigefügten Abbildungen verdeutlichen folgende experimentellen Befunde, wobei eine detaillierte Erläuterung der Figuren in den nachfolgenden Beispielen erfolgt:The attached figures illustrate the following experimental findings, with a detailed explanation of the figures in the examples below he follows:
Fig. 1 gibt das Sensogramm der Bindung von Avidin wieder. Dargestellt ist das Aufwachsen der Schichtdicke in nm in Abhängigkeit von der Zeit, Fig. 1 shows the sensogram of avidin binding. The growth of the layer thickness in nm as a function of time is shown
Fig. 2 gibt die Bindung von einem biotinilierten Antikörper an den mit Avidin kovalent belegten Sensor wieder; auch hier wird die Schichtdicke in nm in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt, Fig. 2 is the binding of a biotinylated antibody to the avidin covalently occupied by the sensor again; here too the layer thickness is shown in nm as a function of time,
Fig. 3 gibt die Bindung von LZ-Peptid an einen mit anti-LZ-Peptid-Antikörper belegten Sensor wider. Das Diagramm zeigt den Bindungsverlauf (Schichtdicke) in Abhängigkeit von der Zeit, Fig. 3 shows the binding of LZ peptide is contrary to an occupied with anti-LZ-peptide antibodies sensor. The diagram shows the course of the bond (layer thickness) as a function of time,
Fig. 4 stellt die Bindung von Cytochrom C und Lysozym an einen mit anti- Lysozym-Antikörper belegten Sensor graphisch dar. Die Bindung wird anhand der Schichtdicke in nm in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt, Fig. 4 illustrates the binding of cytochrome C, and lysozyme to a coated with anti-lysozyme antibody sensor graphic. The binding is illustrated by the layer thickness in nm as a function of time,
Fig. 5 zeigt ein Massenspektrogramm des mittels des erfindungsgemäßen Sensors isolierten Lysozyms. Fig. 5 shows a mass spectrogram of the isolated by the inventive sensor lysozyme.
In der Mitte der erfindungsgemäßen Vorrichtung befindet sich der Biosensor - wie z. B. der ASI Biosensor - wie er beispielsweise von der Firma ASI AG Zürich kommerziell vertrieben wird - für das BIOS-1 Gerät mit den Maßen 15×50 mm. Der Detektionspunkt des Sensors mit dem integriert optischen Gitter zweckmäßigerweise in der geometrischen Mitte der zur Reaktion befähigten Oberfläche angeordnet. Die so ausgestaltete Oberfläche ist mit einer Durchflußzelle umgeben die es erlaubt, die Oberfläche des Sensors mit den Maßen 15×50 mm fast vollständig zu nutzen. Diese Durchflußzelle ermöglicht es, die zu untersuchende Flüssigkeit über die Oberfläche und den Sensor zu pumpen. Ist auf der Sensoroberfläche z. B. ein Antikörper kovalent immobilisiert, so fängt dieser sein spezifisches Antigen (falls vorhanden) aus der über den Sensor gepumpten Lösung und es kommt zu einem Sensorsignal. Durch eine weitere Vergrößerung der Oberfläche, z. B. durch Vergrößerung der Dimension der zur Reaktion befähigten Oberfläche, durch Porenstruktur in der Oberfläche oder durch Aufbau eines dreidimensionalen Netzwerkes aus z. B. Antikörpern, läßt sich die Bindungskapazität der erfindungsgemäßen Vorrichtung noch weiter steigern. The biosensor is located in the middle of the device according to the invention. such as B. the ASI biosensor - as for example from the company ASI AG Zurich is sold commercially - for the BIOS-1 device with the dimensions 15 × 50 mm. The detection point of the sensor with the integrated optical grating expediently in the geometric center of those capable of reaction Surface arranged. The surface designed in this way has a Flow cell surrounding which allows the surface of the sensor with the Dimensions 15 × 50 mm almost completely usable. This flow cell enables the liquid to be examined over the surface and the sensor pump. Is on the sensor surface z. B. an antibody covalently immobilized, this catches its specific antigen (if available) the solution pumped through the sensor and a sensor signal is generated. By further enlarging the surface, e.g. B. by enlarging the Dimension of the surface capable of reaction, by pore structure in the Surface or by building a three-dimensional network from z. B. Antibodies, the binding capacity of the invention Increase device even further.
Als Beispiel wird die Herstellung einer carboxylierten Sensoroberfläche auf einem ASI 1400 Sensor beschrieben. Der ASI 1400 Sensor besitzt eine TiO₂/SiO₂ Oberfläche.One example is the production of a carboxylated sensor surface an ASI 1400 sensor. The ASI 1400 sensor has one TiO₂ / SiO₂ surface.
Der Sensorchip wird 1 h in halbkonzentrierter HNO₃ bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend mit Wasser gewaschen und bei 100°C 1 h lang getrocknet. Anschließend wird der Sensor in einer 1.5% Lösung aus Aminopropyltriethoxysilan in Xylol für 3 h im Rückfluß gekocht. Man wäscht mit Xylol und Methanol nach und trocknet für 1 h im Vakuum.The sensor chip is 1 h in semi-concentrated HNO₃ at room temperature incubated, then washed with water and at 100 ° C for 1 h dried. Then the sensor is made in a 1.5% solution Aminopropyltriethoxysilane in xylene boiled under reflux for 3 h. You wash with Xylene and methanol and dry for 1 h in vacuo.
Aminofunktionalisierung durch CVD [Chemical Vapor Deposition] oder Plasma CVD.Amino functionalization by CVD [Chemical Vapor Deposition] or plasma CVD.
Der Sensor wird danach in einer 0.2 M Lösung aus Bernsteinsäureanhydrid in Aceton bei Raumtemperatur für 3 h inkubiert (der pH wird mit 1 M NaOH auf pH 8.0 gehalten). Danach wird mit Tetrachlorkohlenstoff, Methanol und Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet und aufgehoben.The sensor is then placed in a 0.2 M solution of succinic anhydride Incubate acetone at room temperature for 3 h (the pH is raised with 1 M NaOH pH 8.0 maintained). Thereafter, carbon tetrachloride, methanol and water washed and dried under vacuum and saved.
2 g Polyglutaminsäure werden in 100 ml Wasser gelöst und eine Lösung aus NHS/EDC in einem molaren Verhältnis von 1 Teilen EDC/NHS zu 5 Teilen Glutaminsäuremonomer zugegeben. Man läßt 10 min. bei RT unter Rühren reagieren. Anschließend gibt man den aminopropylierten Sensor dazu und inkubiert für 1 h. Danach wird mit Wasser, mit 0.01 N HCl und Wasser nachgewaschen. Man trocknet und lagert im Vakuum.2 g of polyglutamic acid are dissolved in 100 ml of water and a solution NHS / EDC in a molar ratio of 1 part EDC / NHS to 5 parts Glutamic acid monomer added. It is left for 10 min. at RT with stirring react. Then add the aminopropylated sensor and incubated for 1 h. Then with water, with 0.01 N HCl and water washed. It is dried and stored in a vacuum.
Der nach obiger Vorschrift hergestellte carboxylierte Sensorchip ASI 1400 wird in den Biosensor ASI 1400 eingespannt und alternierend je 5 min. mit PBS + 0.05% Tween 20 und 0.01 N HCl bei einem Fluß von 15 µl/min. gewaschen. Alle nachfolgenden Schritte werden bei einem Fluß von 15 µl/min. durchgeführt.The carboxylated sensor chip ASI 1400 manufactured according to the above regulation is clamped in the ASI 1400 biosensor and alternately 5 min. with PBS + 0.05% Tween 20 and 0.01 N HCl at a flow of 15 µl / min. washed. All subsequent steps are at a flow of 15 ul / min. carried out.
Der Sensor wird mit 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 für 4 min. gewaschen (Fig. 1, Marker 1). Danach wird eine Lösung aus 30 µg/ml Avidin in 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 für 13 min über den Sensor gepumpt. Es erfolgt eine nichtkovalente ionische Bindung von Avidin an die carboxylierte Sensoroberfläche (Marker 2). Anschließend wird der Sensor mit 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 nachgewaschen (Marker 3). Um die Funktionstüchtigkeit des Sensors zu überprüfen, wird anschließend für 8 min. mit PBS + 0.05% Tween 20 (Marker 4), 6 min mit 0.01 N HCl pH 2.0 (Marker 5), 2 min. mit PBS + 0.05% Tween 20 (Marker 6) und zum Schluß 4.5 min. mit 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 gewaschen (Marker 7). Da die Sensoroberfläche noch nicht aktiviert war, sollte bei diesen Waschvorgängen die Grundlinie (Marker 1) wieder erreicht werden. Wie die Fig. 1 belegt, ist dies der Fall.The sensor is with 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 for 4 min. washed ( Fig. 1, marker 1 ). Then a solution of 30 µg / ml avidin in 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 is pumped over the sensor for 13 min. Avidin is noncovalently bound to the carboxylated sensor surface (marker 2 ). The sensor is then washed with 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 (marker 3 ). To check the functionality of the sensor, it is then for 8 min. with PBS + 0.05% Tween 20 (marker 4 ), 6 min with 0.01 N HCl pH 2.0 (marker 5 ), 2 min. with PBS + 0.05% Tween 20 (marker 6 ) and finally 4.5 min. washed with 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 (marker 7 ). Since the sensor surface was not yet activated, the baseline (marker 1 ) should be reached again during these washing processes. As shown in FIG. 1, this is the case.
Über den Sensor wird eine 0.1 M NHS/EDC Lösung in Wasser für 11 min. gepumpt (Marker 8). Dabei erfolgt eine Aktivierung der Carboxylfunktionen am Sensor. Anschließend wird überschüssiges Aktivierungsreagenz weggewaschen. Dazu wird über den Sensor 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 für 4 min. gepumpt (Marker 9). Zur kovalenten Bindung von Avidin wird jetzt eine Lösung aus 30 µg/ml Avidin in 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 für 12 min (Marker 10). Danach wird 6 min. mit 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 gewaschen (Marker 11). Um restliche aktivierte Carboxylfunktionen am Sensor zu neutralisieren, wird mit einem kurzen Puls aus PBS + 0.05% Tween 20 und für 5 min. mit 1 M Ethanolamin/HCl pH 9.0 und anschließendem kurzen Puls mit PBS + 0.05% Tween 20 gewaschen (Marker 12). Anschließend wird für 3 min. mit 0.01 N HCl pH 2.0 (Marker 13), 4 min. mit PBS + 0.05% Tween 20 (Marker 14) und 4 min. mit 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 gewaschen (Marker 15). Das neue Sensorsignalplateau entspricht einer Bindung von 3.1 ng/mm² Avidin an der Sensoroberfläche (Marker 16), was einer 82%igen Belegung der Sensoroberfläche mit Avidin gleichkommt, unter der Annahme, daß Avidin ein globuläres Molekül mit einer Masse von ca. 60 000 Dalton ist.A 0.1 M NHS / EDC solution in water is placed over the sensor for 11 min. pumped (marker 8 ). The carboxyl functions are activated on the sensor. Excess activation reagent is then washed away. For this purpose, 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 for 4 min. pumped (marker 9 ). For covalent binding of avidin is now a solution of 30 µg / ml avidin in 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 for 12 min (marker 10 ). Then 6 min. washed with 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 (marker 11 ). To neutralize remaining activated carboxyl functions on the sensor, use a short pulse of PBS + 0.05% Tween 20 and for 5 min. washed with 1 M ethanolamine / HCl pH 9.0 and then a short pulse with PBS + 0.05% Tween 20 (marker 12 ). Then for 3 min. with 0.01 N HCl pH 2.0 (marker 13 ), 4 min. with PBS + 0.05% Tween 20 (marker 14 ) and 4 min. washed with 5 mM NaH₂PO₄ pH 6.2 (marker 15 ). The new sensor signal plateau corresponds to a binding of 3.1 ng / mm² avidin on the sensor surface (marker 16 ), which corresponds to an 82% coverage of the sensor surface with avidin, assuming that avidin is a globular molecule with a mass of approx. 60,000 daltons is.
Marker 16 gibt das neue Sensorsignal-Plateau nach der kovalenten Bindung des Avidins wieder.Marker 16 shows the new sensor signal plateau after the covalent binding of the avidine.
Biotinilierte Moleküle besitzen eine sehr hohe Affinität zu Avidin. Avidin bindet das am Protein kovalent gebundene Biotin. Der Sensor wird über einen Zeitraum von 5 min. mit PBS + 0.05% Tween 20 gewaschen (Fig. 2, Marker 1). Danach wird eine Lösung aus 25 µg/ml biotinilierter Kaninchen Antikörper in PBS + 0.05% Tween 20 für 11 min. über den Sensor gepumpt (Marker 2). Es erfolgt dabei die Bindung des biotinilierten Antikörpers an den mit Avidin kovalent belegten Sensor. Anschließend wird mit PBS + 0.05% Tween 20 für 7 min. gewaschen (Marker 3). Danach nochmals mit 0.01 N HCl pH 2.0 für 6 min. nachgewaschen (Marker 4). Danach wird für 10 min. wieder mit PBS + 0.05% Tween 20 gewaschen. Das neue Sensorplateau (Marker 5) spiegelt die Bindung des biotinilierten Antikörpers an den mit Avidin kovalent belegten Sensor wider. Der Fluß beträgt in allen Schritten 20 µl/min.Biotinylated molecules have a very high affinity for avidin. Avidin binds the biotin covalently bound to the protein. The sensor is operated over a period of 5 min. washed with PBS + 0.05% Tween 20 ( Fig. 2, marker 1 ). Then a solution of 25 µg / ml biotinylated rabbit antibody in PBS + 0.05% Tween 20 for 11 min. pumped over the sensor (marker 2 ). The biotinylated antibody binds to the sensor covalently coated with avidin. Then with PBS + 0.05% Tween 20 for 7 min. washed (marker 3 ). Then again with 0.01 N HCl pH 2.0 for 6 min. washed (marker 4 ). Then it is for 10 min. washed again with PBS + 0.05% Tween 20. The new sensor plateau (marker 5 ) reflects the binding of the biotinylated antibody to the sensor covalently coated with avidin. The flow is 20 µl / min in all steps.
PBS Puffer wird für einen Zeitraum von 20 min. über den mit anti-LZ-Antikörper belegten Sensor bei einem Fluß von 20 µl/min. über den Sensor gepumpt (Fig. 3, Marker 1). Anschließend wird eine Lösung aus 30 µg/ml LZ-Peptid in PBS Puffer über einen Zeitraum von 20 min. über den Sensor gepumpt (Marker 2). Dabei erfolgt eine Bindung des LZ-Proteins an den Antikörper. Danach wird für 20 min. mit PBS-Puffer nachgewaschen (Marker 3). Anschließend wird mit 0.01 N HCl (pH 2.0) über einen Zeitraum von 5 min. gewaschen (Marker 4). Danach wird erneut mit PBS (Marker 5), 1 M Ethanolamin (pH 8.0) (Marker 6), PBS (Marker 7), 0.01 N HCl (pH 2.0) (Marker 8) und PBS (Marker 9) regeneriert. Dabei erreicht das Sensorsignal wieder seinen Ausgangswert (Marker 10) wie am Anfang des Sensogramms (Marker 1). Bei einem nachfolgenden gleichen Versuchsablauf - wie im vorbeschriebenen Beispiel - wird ein nahezu kongruentes Sensogramm erhalten.PBS buffer is kept for a period of 20 min. via the sensor coated with anti-LZ antibody at a flow of 20 µl / min. pumped over the sensor ( Fig. 3, marker 1 ). Then a solution of 30 µg / ml LZ peptide in PBS buffer over a period of 20 min. pumped over the sensor (marker 2 ). The LZ protein binds to the antibody. Then it is for 20 min. washed with PBS buffer (marker 3 ). Then with 0.01 N HCl (pH 2.0) over a period of 5 min. washed (marker 4 ). Then regenerate again with PBS (marker 5 ), 1 M ethanolamine (pH 8.0) (marker 6 ), PBS (marker 7 ), 0.01N HCl (pH 2.0) (marker 8 ) and PBS (marker 9 ). The sensor signal again reaches its initial value (marker 10 ) as at the beginning of the sensogram (marker 1 ). In a subsequent, identical test sequence - as in the example described above - an almost congruent sensogram is obtained.
An den gemäß nach Vorschrift hergestellten carboxylierten Sensor wird über die EDC/NHS-Chemie ein anti-Lysozym-Antikörper kovalent immobilisiert. Dabei folgt die Immobilisierung der Vorschrift zur Bindung von Avidin. Als Bindungspuffer zur kovalenten Immobilisierung dient 10 mMol Natriumactetat- Lösung (pH = 4.8).To the carboxylated sensor manufactured according to the instructions, over the EDC / NHS chemistry covalently immobilized an anti-lysozyme antibody. The immobilization follows the regulation for binding avidin. As Binding buffer for covalent immobilization serves 10 mmol sodium acetate Solution (pH = 4.8).
Fig. 4 zeigt die Bindung von Lysozym an den mit anti-Lysozym-Antikörper belegten Sensor. Fig. 4 shows the binding of lysozyme to the occupied with anti-lysozyme antibody sensor.
Nachdem der Sensor mit anti-Lysozym-Antikörper belegt ist, wird zuerst PBS- Puffer (Marker 1) und anschließend eine Lösung aus 20 µl Cytochrom C in PBS-Puffer mit einem Fluß von 30 µl/min. über den Sensor gepumpt (Marker 2). Dabei findet kein Bindung von von Cytochrom C statt. - Danach wird mit PBS-Puffer gewaschen (Marker 3). Nach der Regenerierung des Sensors mit 0.01 N HCl (pH 2.0) (Marker 4), PBS (Marker 5), Ethanolamin (Marker 6), 0.01 N HCl (pH 2.0) (Marker 7) und PBS (Marker 8) wird eine Lösung von 20 µg/ml Lysozym in PBS Puffer bei einem Fluß von 2 µl/min. mit 0.01 N HCl (pH 2.0) über einen Zeitraum von 10 min. eluiert. Das Eluat der ersten 5 Minuten wird gesammelt. 1 µl des Eluates werden in einen Massensprektrographen gegeben und aus dieser Probe die Masse bestimmt (Fig. 5). Es ist ein Massepeak von 14.269.9 nachweisbar; das Integral unter dem Peak entspricht 4.7 nMol Protein. Dies ergibt bei einem Gesamteluat von 10 µl eine Gesamtmenge an präparativ isoliertem Lysozym von 47 nMol.After the sensor is coated with anti-lysozyme antibody, first PBS buffer (marker 1 ) and then a solution of 20 ul cytochrome C in PBS buffer with a flow of 30 ul / min. pumped over the sensor (marker 2 ). There is no binding of cytochrome C. - Then wash with PBS buffer (marker 3 ). After regeneration of the sensor with 0.01 N HCl (pH 2.0) (marker 4 ), PBS (marker 5 ), ethanolamine (marker 6 ), 0.01 N HCl (pH 2.0) (marker 7 ) and PBS (marker 8 ), a solution is obtained of 20 µg / ml lysozyme in PBS buffer at a flow of 2 µl / min. with 0.01 N HCl (pH 2.0) over a period of 10 min. eluted. The eluate from the first 5 minutes is collected. 1 μl of the eluate are placed in a mass spectrometer and the mass is determined from this sample ( FIG. 5). A mass peak of 14.269.9 is detectable; the integral below the peak corresponds to 4.7 nmol protein. With a total eluate of 10 µl, this gives a total amount of preparatively isolated lysozyme of 47 nmol.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2001002538A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Mirus Corporation | Substrates for nucleic acid immobilization onto solid supports |
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1996
- 1996-07-03 DE DE1996126750 patent/DE19626750A1/en not_active Withdrawn
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WO2001002538A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-11 | Mirus Corporation | Substrates for nucleic acid immobilization onto solid supports |
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