DE19623955A1 - Stabilised control or standard solutions of bilirubin - Google Patents

Stabilised control or standard solutions of bilirubin

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    • G01N33/728—Bilirubin; including biliverdin

Abstract

Bilirubin-containing standard serum (III) is claimed. (III) contains a compound of formula (I) and/or (II). R1, R2 = H, OH, 1-8C alkyl, COOR5, SO3R5; R3 = H, OH; R4 = H, COOR5, COR5, SO3R5; R5 = H or 1-6C alkyl; R' = H, halogen, 1-6C alkyl; and R" = H, 1-6C alkyl, 1-6C alkoxy. Also claimed are (1) the use of (I) and/or (II) to stabilise bilirubin in solutions; (2) production of (III) by adding (I) and/or (II) to a standard serum containing bilirubin; (3) determination of bilirubin by measuring bilirubin in a sample, measuring bilirubin in (III), and calculating the concentration from the measurements; (4) a method of increasing the storage stability of standard and control sera by adding (I) and/or (II); and a kit for measuring bilirubin in samples, containing (III).

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein stabiles, Bilirubin enthaltendes Kontroll- beziehungsweise Eichserum.The invention relates to a stable, bilirubin-containing control or Calibration serum.

Zur analytischen Überprüfung der methodischen Richtigkeit einzelner Parameter in Human­ seren von Patienten werden Kontrollflüssigkeiten serum-ähnlicher Zusammensetzung einge­ setzt, die die zu bestimmenden Parameter in bekannten, genau festgelegten Konzentrationen enthalten. Man unterscheidet Spezialkontroll- beziehungsweise Eichseren, die zur Kontrolle beziehungsweise zur Eichung von ganz bestimmten Parametern dienen und sogenannte Universalkontroll- beziehungsweise Eichseren, die zur Kontrolle beziehungsweise zum Eichen möglichst aller gängiger Parameter nach sämtlichen in der Praxis üblicherweise durchgeführten Bestimmungsmethoden einsetzbar sind.For analytical verification of the methodological accuracy of individual parameters in human Patients are given control fluids of serum-like composition sets the parameters to be determined in known, well-defined concentrations contain. One differentiates special control or calibration serums, which are to control or serve for the calibration of very specific parameters and so-called Universal control or calibration serums used for control or oak as far as possible all common parameters after all in practice usually performed Determination methods are used.

Die Anforderungen, die an solche Produkte im klinisch-chemischen Routinebetrieb gestellt werden, umfassen:The requirements placed on such products in routine clinical chemistry will include:

  • - eine genau bekannte Konzentration der Meßparameter muß eingehalten werden;- A well-known concentration of the measurement parameters must be complied with;
  • - die Konzentrationen müssen im medizinisch relevanten Meßbereich (normal beziehungs­ weise pathologisch) liegen;- The concentrations must be in the medically relevant range (normal relationship wise pathologically);
  • - die Handhabung der Kontroll- beziehungsweise Eichseren muß einfach sein;- The handling of the control or calibration serums must be simple;
  • - die Kontroll- beziehungsweise Eichseren müssen eine möglichst lange Haltbarkeit besitzen.- The control or calibration serums must have the longest possible durability.

Bei einem Einsatz des Kontroll- beziehungsweise Eichserums bei Analyseautomaten werden hohe Anforderungen, besonders an die beiden letzten Punkte (Handhabung und Haltbarkeit) gestellt. Ein in Bezug auf Haltbarkeit kritischer aber wichtiger klinisch-chemischer Parameter ist die gegen Licht und Oxidationsmittel sehr empfindliche Substanz Bilirubin. Bilirubin wird bei der Diagnose, Differenzialdiagnose und Verlaufsbeurteilung des Ikterus gemessen. Während in frisch präparierten Seren humanen oder tierischen Ursprungs oder in Lyophilisaten die Bilirubinkonzentration - Lichteinwirkung ausgeschlossen - selbst bei Temperaturen um 25°C relativ lange konstant bleibt, unterliegt diese Substanz in Serumpools oder bei länger aufbewahrten Seren auch bei Temperaturen um 4°C einem raschen Abbau und damit einer Konzentrationsveränderung. Bei Verwendung von Eichseren mit verringerter meßbarer Bilirubinkonzentration würde dies zu falschen Bilirubinwerten in den Serumproben von Patienten und damit zu veränderten Therapieschlüssen führen. When using the control or calibration serum in automated analyzers high demands, especially on the last two points (handling and durability) posed. A critical but important clinico-chemical parameter in terms of durability is the very sensitive to light and oxidant bilirubin. Bilirubin is measured in the diagnosis, differential diagnosis and course assessment of jaundice. While in freshly prepared sera of human or animal origin or in lyophilisates the bilirubin concentration - excluded from light - even at temperatures 25 ° C remains constant for a relatively long time, this substance is subject in serum pools or at longer stored sera even at temperatures around 4 ° C a rapid degradation and thus one Concentration change. When using calibrated sera with reduced measurable Bilirubin concentration would lead to false bilirubin levels in the serum samples of Patients and thus lead to altered treatment conclusions.  

Durch Zusatz von Sulfhydryl-Komponenten, zum Beispiel Dithiothreitol oder Cystein, kann die Bilirubinoxidation verlangsamt werden (Trivin F., Odievre M., Lemonnier A. (1977) Clin. Chem. 23, 541-545). In US 4,201,694 wird die Stabilisierung von konjugiertem Bilirubin durch Zusatz einer Sulfhydryl-Komponente bei einem pH von 8.2-9.2 im Blutserum be­ schrieben. Auch Reduktionsmittel wie zum Beispiel Ascorbinsäure (Watson D. (1962) Clin. Sci. 22, 435-445) wirken dem oxidativen Bilirubinabbau entgegen.By adding sulfhydryl components, for example dithiothreitol or cysteine, the Slowing down bilirubin oxidation (Trivin F., Odievre M., Lemonnier A. (1977) Clin. Chem. 23, 541-545). In US 4,201,694, the stabilization of conjugated bilirubin by addition of a sulfhydryl component at a pH of 8.2-9.2 in the blood serum be wrote. Also reducing agents such as ascorbic acid (Watson D. (1962) Clin. Sci. 22, 435-445) counteract oxidative bilirubin degradation.

In WO 92/07088 wird die Stabilisierung von Bilirubin durch die Verwendung eines sauer­ stofflabilen Reagenzes, Glucose, Glucoseoxidase, eines Wasserstoffdonors, steriler Membran­ fragmente von Bakterien und einem reagenz-bindenden Agens erreicht. Dieses Verfahren ist jedoch offensichtlich zu aufwendig, zu komplex und zu teuer, um eine industrielle Verwert­ barkeit zu gewährleisten. Auch die Stabilisierung von Bilirubin durch Polyole in hohen Konzentrationen, zum Beispiel Ethylenglycol wird beschrieben (Louderback A., Jendrzejezak B., Doumas B.T., Foley Th., (1980) Fresenius Z. Anal. Chem. 301, 145). Die Kontroll- bezie­ hungsweise Eichseren können durch die Zugabe derart hoher Konzentrationen an Polyolen viskos werden. Dies kann bei den Pump- und Pipettierschritten der automatischen Analyse zu Schwierigkeiten und Ungenauigkeiten führen, wodurch die Zugabe hoher Konzentrationen an Polyolen nicht zweckmäßig ist. Bekannt ist auch, daß Metallionen den oxidativen Abbau­ prozeß des Bilirubins beschleunigen, während gleichzeitige Anwesenheit von metallionen­ komplexierenden Reagenzien, wie zum Beispiel EDTA, die Autooxidation verzögern (Fog J., Bakken A. F. (1967) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 20, 70-72; Fog J., Bugge-Asperheim (1964) Nature 203, 756-757; De Ewenson I. W., Gianturco F. A., Gramaccioni P. (1966) Experimentia XXII, 14-15; US 4,344,864).In WO 92/07088 the stabilization of bilirubin by the use of an acidic substance labile, glucose, glucose oxidase, a hydrogen donor, sterile membrane achieved fragments of bacteria and a reagent-binding agent. This procedure is However, obviously too costly, too complex and too expensive to an industrial use ensure availability. Also, the stabilization of bilirubin by polyols in high Concentrations, for example ethylene glycol, are described (Louderback A., Jendrzejezak B., Doumas B.T., Foley Th., (1980) Fresenius Z. Anal. Chem. 301, 145). The control relationship As calibration sera can by the addition of such high concentrations of polyols become viscous. This can be done during the pumping and pipetting steps of the automatic analysis Difficulties and inaccuracies lead to the addition of high concentrations Polyols is not appropriate. It is also known that metal ions oxidative degradation process of bilirubin accelerate, while simultaneous presence of metal ions complexing reagents, such as EDTA, which delay autooxidation (Fog J., Bakken A.F. (1967) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 20, 70-72; Fog J., Bugge-Asperheim (1964) Nature 203, 756-757; De Ewenson I.W., Gianturco F.A., Gramaccioni P. (1966) Experimentia XXII, 14-15; US 4,344,864).

Der Hauptnachteil aller erwähnter Methoden ist die Notwendigkeit, hohe Konzentrationen der vorgenannten Reagenzien einzusetzen. So kann sich ein Stabilisator für einen bestimmten Parameter oftmals bei der Bestimmung anderer Parameter störend auswirken. Reduzierenden SH-Verbindungen können zum Beispiel bei der anschließenden enzymatischen Umsetzung stören. Besonders kritisch ist die negative Wirkung auf PAP-Tests, zum Beispiel Creatinin- PAP oder Harnsäure-PAP. Der PAP-Test beinhaltet eine Indikatorreaktion, bei der H₂O₂ mit Phenol-Aminophenazon (PAP) unter Ausbildung eines roten Farbstoffes reagiert, dessen Absorption proportional der Creatinin-/Harnsäurekonzentration ist.The main disadvantage of all mentioned methods is the need to use high concentrations of to use the aforementioned reagents. So can a stabilizer for a given Often interfere with the determination of other parameters. reducing ends For example, SH compounds can be used in the subsequent enzymatic reaction to disturb. Particularly critical is the negative effect on PAP tests, for example creatinine PAP or uric acid PAP. The PAP test involves an indicator reaction in which H₂O₂ with Phenol-aminophenazone (PAP) reacts to form a red dye whose Absorption is proportional to creatinine / uric acid concentration.

Bei der Herstellung von Universalkontroll- beziehungsweise Eichseren ist es daher vorteilhaft, so wenig wie möglich Zusatzstoffe zu verwenden. Aufgabe der Erfindung war es, ein Kontroll- und Eichserum bereitzustellen, das Bilirubin in einer stabilisierten Form enthält, dessen Konzentration im medizinisch relevanten Meßbereich liegt, dessen Handhabung einfach ist und das eine lange Haltbarkeit besitzt. Die Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen näher charakterisierte Erfindung gelöst, die im wesentlichen in der Stabilisierung des Bilirubins in Kontroll- und Eichseren besteht. Dazu gehören die in den Ansprüchen näher charakterisierten chemischen Verbindungen, deren Verwendung, Verfahren zur Herstellung sowie Methoden zum Nachweis von Bilirubin, die Bilirubin schützen und die andere Tests, vor allem den PAP-Test, nicht stören. In the production of universal control or calibration serums it is therefore advantageous to use as few additives as possible. The object of the invention was a control and To provide calibrating serum containing bilirubin in a stabilized form, the Concentration is in the medically relevant range, its handling is easy and which has a long shelf life. The object is by the closer in the claims characterized in the invention characterized in substantially stabilizing the bilirubin in Control and calibration sera. These include those further characterized in the claims chemical compounds, their use, methods of preparation and methods for the detection of bilirubin, which protect bilirubin and the other tests, especially the PAP test, do not bother.  

Gegenstand der Erfindung ist ein bilirubin-haltiges Kontroll- beziehungsweise Eichserum, das eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I):The invention relates to a bilirubin-containing control or calibration serum, the a chemical compound of general formula (I):

wobei
R1 = H, OH, Alkylrest mit 1-8 C-Atomen, COOR5 oder SO₃R5
R2 = H, OH, Alkylrest mit 1-8 C-Atomen, COOR5 oder SO₃R5
R3 = H oder OH
R4 = H, COOR5, COR5 oder SO₃R5
R5 = H oder ein Alkylrest mit 1 bis 6 C-Atomen
bedeutet,
und/oder eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel (II)in which
R1 = H, OH, alkyl radical having 1-8 C atoms, COOR5 or SO₃R5
R2 = H, OH, alkyl radical having 1-8 C atoms, COOR5 or SO₃R5
R3 = H or OH
R4 = H, COOR5, COR5 or SO₃R5
R5 = H or an alkyl radical having 1 to 6 C atoms
means
and / or a chemical compound of the general formula (II)

wobei
R1 = H, Halogen: Cl, Br, F oder Alkyl: 1-6 C-Atome
R2 = H, Alkyl: C1-C6 oder Alkoxy: 1-6 C-Atome
bedeutet, enthält.in which
R1 = H, halogen: Cl, Br, F or alkyl: 1-6 C atoms
R2 = H, alkyl: C1-C6 or alkoxy: 1-6 C-atoms
means contains.

Besonders bevorzugt sind zum Beispiel die Verbindungen der Formel (I) mit:Particularly preferred are, for example, the compounds of the formula (I) with:

R1 = OH; R2 = OH; R3 = H; R4 = COOC₃H₇ (= Progallin®)R1 = OH; R2 = OH; R3 = H; R4 = COOC₃H₇ (= Progallin®)

undand

R1 = OH; R2 = H; R3 = OH; R4 = COC₄H₉ (= 2,4,5-Trihydroxybutyrophenon)R1 = OH; R2 = H; R3 = OH; R4 = COC₄H₉ (= 2,4,5-trihydroxybutyrophenone)

und die Verbindung der Formel (II) mit:and the compound of formula (II) with:

R1 = H; R2 = CH₃ (= 1-(4-Methylphenyl)-semicarbazid).R1 = H; R2 = CH₃ (= 1- (4-methylphenyl) semicarbazide).

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) beziehungsweise (II) werden in dem Kontroll- be­ ziehungsweise Eichserum in einer Konzentration von 0,001 bis 1,5 mmol/l, bevorzugt von 0,001 bis 0,1 mmol/l (Progallin®) beziehungsweise 0,01 bis 1,5 mmol/l (1-(4-Methoxyphenyl)- semicarbazid, 2,4,5-Trihydroxybutyrophenon, 1-(4-Methylphenyl)-semicarbazid, 1-Phenyl­ semicarbazid und 1-(3-Chlorphenyl)-semicarbazid) eingesetzt.The compounds of the general formula (I) or (II) are in the control be or calibration serum in a concentration of 0.001 to 1.5 mmol / l, preferably from 0.001 to 0.1 mmol / l (Progallin®) or 0.01 to 1.5 mmol / l (1- (4-methoxyphenyl) - semicarbazide, 2,4,5-trihydroxybutyrophenone, 1- (4-methylphenyl) semicarbazide, 1-phenyl semicarbazide and 1- (3-chlorophenyl) semicarbazide).

Besonders bevorzugt werden die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) beziehungsweise (II) in einer Konzentration von 0,03 bis 0,05 mmol/l (Progallin®), 0,03 bis 0,25 mmol/l (1-(4-Methoxy­ phenyl)-semicarbazid) 0,05 bis 0,25 mmol/l (1-(4-Methylphenyl)-semicarbazid), 0,15 bis 0,25 mmol/l (2,4,5-Trihydroxybutyrophenon und 1-Phenylsemicarbazid) beziehungsweise 0,15 bis 0,3 mmol/l (1-(3-Chlorphenyl)-semicarbazid) eingesetzt.Particularly preferred are the compounds of general formula (I) or (II) at a concentration of 0.03 to 0.05 mmol / l (Progallin®), 0.03 to 0.25 mmol / l (1- (4-methoxy phenyl) semicarbazide) 0.05 to 0.25 mmol / l (1- (4-methylphenyl) semicarbazide), 0.15 to 0.25 mmol / l (2,4,5-trihydroxybutyrophenone and 1-phenylsemicarbazide) respectively 0.15 to 0.3 mmol / l (1- (3-chlorophenyl) semicarbazide).

Der stabilisierende Effekt auf das im Kontroll- beziehungsweise Eichserum enthaltene Bilirubin tritt erst auf, wenn der Stabilisator und das Bilirubin enthaltende Kontroll- beziehungsweise Eichserum gemeinsam in einer Lösung vorliegen. Die Lagerung des Stabilisators und des Kontroll- beziehungsweise Eichserums kann folgendermaßen erfolgen:
Kontroll- beziehungsweise Eichserum und Stabilisator zusammen in lyophilisierter Form oder
Kontroll- beziehungsweise Eichserum und Stabilisator separat in lyophilisierter Form oder
Kontroll- beziehungsweise Eichserum lyophilisiert, Stabilisator in flüssiger Form oder
Kontroll- beziehungsweise Eichserum und Stabilisator zusammen in flüssiger Form.The stabilizing effect on the bilirubin contained in the control or calibration serum occurs only when the stabilizer and the bilirubin-containing control or calibration serum are present together in a solution. The storage of the stabilizer and of the control or calibration serum can be carried out as follows:
Control or calibration serum and stabilizer together in lyophilized form or
Control or calibration serum and stabilizer separately in lyophilized form or
Control or calibration serum lyophilized, stabilizer in liquid form or
Control or calibration serum and stabilizer together in liquid form.

Um einen zusätzlichen stabilisierenden Effekt zu erreichen, können das Kontroll- be­ ziehungsweise Eichserum und der Stabilisator bei niedrigen Temperaturen, gegebenenfalls unter dem Gefrierpunkt aufbewahrt werden.In order to achieve an additional stabilizing effect, the control be or calibration serum and the stabilizer at low temperatures, if appropriate kept below freezing.

Das erfindungsgemäße Kontroll- beziehungsweise Eichserum kann neben den Analyt­ parametern noch zusätzliche Hilfsstoffe, beispielsweise weitere Analytstabilisatoren, Detergenzien und Konservierungsstoffe enthalten. Dabei ist bei dem Zusatz dieser Hilfsstoffe stets darauf zu achten, daß die Messung bestimmter Parameter nicht störend beeinflußt wird.The control or calibration serum according to the invention can be used in addition to the analyte parameters additional auxiliary substances, for example further analyte stabilizers, Detergents and preservatives included. It is in the addition of these auxiliaries always make sure that the measurement of certain parameters is not disturbed.

Durch eine Aufbewahrung des Reagenzes unter einer Schutzgasatmosphäre, besonders einer N₂-Schutzgasatmosphäre, wird eine besonders hohe Stabilität des Bilirubins erzielt. Die Schutzgasatmosphäre wirkt sich außer auf die Stabilität des Bilirubins sehr günstig auf die Stabilität anderer Parameter, wie zum Beispiel Harnsäure aus. Die Stabilisierung des Bi­ carbonatwertes wird durch Zusatz von ca. 0,3 Vol.-% CO₂ zum N₂-Inertgas erreicht. Neben diesem Analytstabilisator können noch weitere einzelne analytstabilisierende Hilfsstoffe zuge­ setzt werden. So wirkt sich zum Beispiel ein Zusatz von EDTA stabilisierend auf den Eisen­ wert aus. Die Zugabe einer verdünnten Fe-Lösung bei der Herstellung des Kontroll- be­ ziehungsweise Eichserums in Gegenwart von EDTA, bevorzugt in einem Verhältnis von 1 : 1,1 (Fe/EDTA), führt zu stabilisierten Fe-Komplexen, die nicht von Lipoproteinen beziehungsweise Rinderserumalbumin zerstört werden.By storing the reagent under a protective gas atmosphere, especially one N₂ inert gas atmosphere, a particularly high stability of the bilirubin is achieved. The In addition to the stability of the bilirubin, the protective gas atmosphere has a very favorable effect on the Stability of other parameters, such as uric acid out. The stabilization of Bi carbonate value is achieved by addition of about 0.3 vol .-% CO₂ to N₂ inert gas. Next This analyte stabilizer can be added even more individual analyte-stabilizing auxiliaries be set. Thus, for example, an addition of EDTA has a stabilizing effect on the iron worth. The addition of a dilute Fe solution during the preparation of the control be or calibration serum in the presence of EDTA, preferably in a ratio of 1: 1.1 (Fe / EDTA), leads to stabilized Fe complexes that are not lipoproteins or bovine serum albumin are destroyed.

Die Zugabe von Creatin wirkt sich positiv auf die Stabilität des Parameters Creatinin aus, da die Creatinin-Hydrolyse hierdurch verhindert oder zumindest stark vermindert wird.The addition of creatine has a positive effect on the stability of the creatinine parameter, since the creatinine hydrolysis is thereby prevented or at least greatly reduced.

Für den Triglycerid-Parameter wird in bisher gebräuchlichen Kontroll- beziehungsweise Eich­ seren eine Eigelbfraktion eingesetzt. Trübungen sind bei einer solchen Zusammensetzung nicht auszuschließen. Durch den Ersatz dieser Eigelbfraktion durch Glycerin als Triglycerid kann diese potentielle Störung gänzlich vermieden werden. Glycerin zeigt auch bei längerer Lagerung keine Neigung zur Trübungsbildung und ist daher für den Einsatz im erfindungs­ gemäßen Kontroll- beziehungsweise Eichserum vorzüglich geeignet.For the triglyceride parameter is in previously conventional control or calibration used an egg yolk fraction. Turbidity is not in such a composition excluded. By replacing this egg yolk fraction with glycerol as triglyceride can  this potential disorder is avoided altogether. Glycerin shows even at longer Storage no tendency to opacification and is therefore for use in the invention appropriate control or calibration serum excellently suitable.

Der pH-Wert des Kontroll- beziehungsweise Eichserums wird durch Verwendung eines Puffers auf einen pH von vorzugsweise 6.0 bis 8.6 eingestellt.The pH of the control or calibration serum is determined by using a buffer adjusted to a pH of preferably 6.0 to 8.6.

Das erfindungsgemäße Kontroll- beziehungsweise Eichserum ist im ungeöffneten Zustand bei 4°C über 12 Monate hinaus stabil. Durch eine Aufbewahrung bei -20°C kann diese Stabilität noch deutlich erhöht werden. Auch in geöffnetem Zustand bei 10°C ist das Produkt mehrere Tage haltbar. Es eignet sich hervorragend als Qualitätskontroll- und Eichserum für Parameter der klinischen Diagnostik, insbesondere unter Berücksichtigung von Bilirubin. Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Kontroll- beziehungsweise Eichserum bei der automatischen klinischen Diagnostik verwendet.The control or calibration serum according to the invention is in the unopened state at 4 ° C. Stable beyond 12 months. Storage at -20 ° C can provide this stability still be significantly increased. Even when opened at 10 ° C, the product is several Durable for days. It is ideal as a quality control and calibration serum for parameters clinical diagnostics, especially taking into account bilirubin. Especially the control or calibration serum according to the invention is preferably used in the used automatic clinical diagnostics.

Ein weiterer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Kontroll- be­ ziehungsweise Eichserums, wobei von einer Rinderserumalbuminiösung ausgegangen wird, die mit den gewünschten Parametern bis zur gewünschten Parameterkonzentration vermischt wird, wobei die angegebenen und gegebenenfalls noch andere Hilfsmittel zugesetzt werden.Another object is a process for the preparation of the control invention be or calibration serum, assuming a bovine serum albumin solution, which mixes with the desired parameters up to the desired parameter concentration is added, wherein the specified and optionally other adjuvants are added.

Ein weiterer Gegenstand ist die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und/oder (II) zur Stabilisierung von Bilirubin in Lösungen.A further subject is the use of the compounds of the general formulas (I) and / or (II) for the stabilization of bilirubin in solutions.

Ein weiterer Gegenstand ist eine Methode zur Erhöhung der Lagerstabilität von bilirubin­ haltigen Eich- und Kontrollseren, die dadurch erreicht wird, daß Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) und/oder (II) zur Stabilisierung von Bilirubin in Lösungen zugegeben werden.Another object is a method for increasing the storage stability of bilirubin containing calibration and control sera, which is achieved in that compounds of the general Formulas (I) and / or (II) may be added to stabilize bilirubin in solutions.

Weiterhin ist Gegenstand der Erfindung eine Methode zum Nachweis von Bilirubin, die gekennzeichnet ist durch Messung des Bilirubingehaltes in der Probe, Messung von Bilirubin in einem erfindungsgemäßen Kontroll- oder Eichserum und anschließend Bestimmung des Bilirubingehaltes der Probe durch Vergleich der beiden Messungen. Die Bilirubin-Bestimmung in der Probe beziehungsweise im Kontroll- oder Eichserum erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden.Furthermore, the invention is a method for the detection of bilirubin, the characterized by measuring the bilirubin content in the sample, measuring bilirubin in a control or calibration serum according to the invention and then determination of the Bilirubin content of the sample by comparing the two measurements. The bilirubin determination in the sample or in the control or calibration serum according to the expert known methods.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Messung von Bilirubin in Proben, das das erfindungsgemäße Kontroll- und Eichserum enthält und in dem zusätzlich die zur Messung notwendigen Reagenzien enthalten sind.The invention also relates to a kit for measuring bilirubin in samples, which is the Contains control and calibration serum according to the invention and in addition to the measurement necessary reagents are included.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert:The invention is explained in more detail by the following examples:

Beispiel 1example 1 Stabilisierung von Bilirubin in KontrollserenStabilization of bilirubin in control sera

Für die Untersuchung der Bilirubinstabilität wird ein Progallin®-freies PPU (Precipath U: Universal-Kontrollserum mit Sollwerten im pathologischen Bereich; Boehringer Mannheim GmbH, Id. Nr. 171 760) mit den Stabilisatoren aufgestockt. Ein erstes Screening erfolgt mit verschiedenen Konzentrationen an Stabilisatoren. Die Proben werden in der Dunkelheit gelagert und anschließend D- und T-Bilirubinstabilitäten nach 4 Stunden bei 25°C gemessen (D-Bilirubin, auch δ-Bilirubin oder Bd ist kovalent an Albumin gebunden und hat darum eine Halbwertszeit von ca. 18 Tagen. T-Bilirubin steht für Gesamtbilirubin - konjugiert und nicht konjugiert). Die Messung von D- und T-Bilirubin erfolgte mit den entsprechenden Testkits von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland:
T-Bilirubin: Ident-No. 104 0804, Charge 64430201 (HiCo, DPD-Methode)
D-Bilirubin: Ident-No. 110 9774, Charge 64548901 (Jendrassik-Methode).To investigate the bilirubin instability, a Progallin®-free PPU (Precipath U: universal control serum with target values in the pathological area, Boehringer Mannheim GmbH, Id. No. 171 760) is supplemented with the stabilizers. An initial screening is done with different concentrations of stabilizers. The samples are stored in the dark and then measured D and T-bilirubinstabilities after 4 hours at 25 ° C (D-bilirubin, also δ-bilirubin or Bd is covalently bound to albumin and therefore has a half-life of about 18 days. T-bilirubin is total bilirubin-conjugated and unconjugated). The measurement of D and T bilirubin was carried out with the corresponding test kits from Boehringer Mannheim GmbH, Germany:
T-bilirubin: Ident-No. 104 0804, lot 64430201 (HiCo, DPD method)
D-bilirubin: Ident-No. 110 9774, Lot 64548901 (Jendrassik method).

Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse des Screenings.Table 1 shows the results of the screening.

Tabelle 1 Table 1

Die beanspruchten Substanzen zeigen einen positiven Einfluß auf die Stabilität von D- und T-Bili­ rubin.The claimed substances have a positive influence on the stability of D and T Bili ruby.

Tabellen 1 und 2 zeigen die Ergebnisse der Feinoptimierung der Konzentrationen dieser Sub­ stanzen. Gezeigt wird die Wiederfindung von D-Bilirubin (nach 4 Stunden bei 25°C) und Harnsäure gegen die Konzentration der entsprechenden Stabilisatoren. Die erfindungsgemäß eingesetzten Substanzen zeigen eine Stabilisierung von Bilirubin. Tables 1 and 2 show the results of the fine optimization of the concentrations of this sub punch. Shown is the recovery of D-bilirubin (after 4 hours at 25 ° C) and Uric acid against the concentration of the corresponding stabilizers. The invention Substances used stabilize bilirubin.  

Beispiel 2Example 2 Störungen im Creatinin-PAP-/Harnsäure-PAP-TestDisturbances in creatinine PAP / uric acid PAP test

Auch hier wurden verschiedene Konzentrationen der beanspruchten Substanzen gemäß Tabelle 2 eingesetzt.Again, various concentrations of the claimed substances according to Table 2 used.

Die Proben wurden wiederum in der Dunkelheit gelagert. Die Störungen im Harnsäure- und Creatinin-PAP-Test wurden jedoch nur einmal am Anfang des Experimentes gemessen. Für die Bestimmungen von Harnsäure- und Creatinin-PAP wurden die entsprechenden Testkits von Boehringer Mannheim GmbH, Deutschland, verwendet und entsprechend den Angaben des Herstellers die Tests durchgeführt.
Harnsäure-PAP: Ident-No. 144 6765, Charge 64834001 und
Creatinin-PAP: Ident-No. 148 9291, Charge 64720101.The samples were again stored in the dark. However, the uric acid and creatinine PAP tests were only measured once at the beginning of the experiment. For the determinations of uric acid and creatinine PAP, the corresponding test kits were used by Boehringer Mannheim GmbH, Germany, and the tests were carried out according to the manufacturer's instructions.
Uric acid PAP: Ident-No. 144 6765, lot 64834001 and
Creatinine PAP: Ident-No. 148 9291, lot 64720101.

Tabelle 2 Table 2

Die beanspruchten Substanzen zeigen unterschiedliche Effekte auf Harnsäure-PAP während die Auswirkungen auf den Creatinin-PAP einheitlich sind. Es ist möglich, mit der Verwendung der dargestellten Ergebnisse eine optimale Konzentration für die Stabilisatoren festzustellen, die eine hohe Stabilität von Bilirubin und eine niedrige Störung der PAP-Teste garantiert:The claimed substances show different effects on uric acid PAP during the effects on the creatinine PAP are consistent. It is possible with the use  the results presented show an optimal concentration for the stabilizers, which guarantees a high stability of bilirubin and a low disturbance of PAP tests:

Progallin®Progallin® 0,001-0,1 mmol/l0.001-0.1 mmol / l 2,4,5-Trihydroxybutyrophenon2,4,5-trihydroxybutyrophenone 0,01-1,5 mmol/l0.01-1.5 mmol / l 1-(4-Methylphenyl)-semicarbazid1- (4-methylphenyl) semicarbazide 0,01-1,5 mmol/l0.01-1.5 mmol / l 1-Phenylsemicarbazid1-phenylsemicarbazide 0,01-1,5 mmol/l0.01-1.5 mmol / l 1-(3-Chlorphenyl)-semicarbazid1- (3-chlorophenyl) semicarbazide 0,01-1,5 mmol/l0.01-1.5 mmol / l 1-(4-Methoxyphenyl)-semicarbazid1- (4-methoxyphenyl) semicarbazide 0,01-1,5 mmol/l0.01-1.5 mmol / l besonders bevorzugt sind: @particularly preferred are: @ Progallin®Progallin® 0,03-0,05 mmol/l0.03-0.05 mmol / l 2,4,5-Trihydroxybutyrophenon2,4,5-trihydroxybutyrophenone 0,15-0,25 mmol/l0.15-0.25 mmol / l 1-(4-Methylphenyl)-semicarbazid1- (4-methylphenyl) semicarbazide 0,05-0,25 mmol/l0.05-0.25 mmol / l 1-Phenylsemicarbazid1-phenylsemicarbazide 0,15-0,25 mmol/l0.15-0.25 mmol / l 1-(3-Chlorphenyl)-semicarbazid1- (3-chlorophenyl) semicarbazide 0,15-0,30 mmol/l0.15-0.30 mmol / l 1-(4-Methoxyphenyl)-semicarbazid1- (4-methoxyphenyl) semicarbazide 0,03-0,25 mmol/l0.03-0.25 mmol / l

Es kann folglich gezeigt werden, daß die beanspruchten Substanzen bei entsprechender Optimierung sowohl als Bilirubinstabilisatoren als auch als nicht-störende Substanzen im Creatinin-PAP und Harnsäure-PAP eingesetzt werden können.It can thus be shown that the claimed substances at corresponding Optimization as bilirubin stabilizers as well as non-interfering substances in the Creatinine PAP and uric acid PAP can be used.

Für bilirubin-haltige Eichseren oder Kontrollseren, die eine andere Zusammensetzung als das in den Beispielen 1 und 2 verwendete Serum besitzen, können sich bevorzugte Konzentrationsbereiche ergeben, die geringfügig von den hier genannten Bereichen abweichen. Ein Fachmann kann anhand einfacher Untersuchungen, wie in Beispiel 1 und 2 gezeigt, die jeweilig bevorzugten Konzentrationen leicht ermitteln.For bilirubin-containing calibrated sera or control sera having a composition other than that described in Examples of serum used in Examples 1 and 2 may be preferred Concentration ranges that differ slightly from the areas mentioned here. A person skilled in the art can, by means of simple examinations, as shown in Examples 1 and 2, the easily determine the respective preferred concentrations.

Claims (12)

1. Bilirubin-haltiges Kontroll- beziehungsweise Eichserum, dadurch gekennzeichnet, daß eine chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I): wobei
R1 = H, OH-Alkylrest mit 1-8 C-Atomen, COOR5 oder SO₃R5
R2 = H, OH, Alkylrest mit 1-8 C-Atomen, COOR5 oder SO₃R5
R3 = H oder OH
R4 = H, COOR5, COR5 oder SO₃R5
R5 = H oder Alkylrest mit 1-6 C-Atomen
bedeutet
und/oder eine chemische Verbindungen der allgemeinen Formel (II): wobei
R1 = H, Halogen (bevorzugt CL, BR, F) oder Alkylrest mit 1-6 C-Atomen
R2 = H, Alkylrest mit 1-6 C-Atomen, Alkoxyrest mit 1-6 C-Atomen,
bedeutet,
enthalten ist. 1. bilirubin-containing control or calibration serum, characterized in that a chemical compound of the general formula (I): in which
R1 = H, OH-alkyl radical having 1-8 C atoms, COOR5 or SO₃R5
R2 = H, OH, alkyl radical having 1-8 C atoms, COOR5 or SO₃R5
R3 = H or OH
R4 = H, COOR5, COR5 or SO₃R5
R5 = H or alkyl radical with 1-6 C atoms
means
and / or a chemical compound of the general formula (II): in which
R1 = H, halogen (preferably CL, BR, F) or alkyl radical having 1-6 C atoms
R 2 = H, alkyl radical having 1-6 C atoms, alkoxy radical having 1-6 C atoms,
means
is included. 2. Kontroll- beziehungsweise Eichserum gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Verbindung der allgemeinen Formel (I) R1 = OH, R2 = OH, R3 = H, R4 = COOC₃H₇ (= Progallin®)oderR1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = COC₄H₉ (= 2,4,5-Trihydroxybutyrophenon)ist.2. control or calibration serum according to claim 1, characterized in that the chemical compound of general formula (I) R1 = OH, R2 = OH, R3 = H, R4 = COOC₃H₇ (= Progallin®) or R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = COC₄H₉ (= 2,4,5-trihydroxybutyrophenone). 3. Ein Kontroll- beziehungsweise Eichserum gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die chemische Verbindung der allgemeinen Formel (II) R1 = H, R2 = CH₃ (= 1-(4-Methylphenyl)-semicarbazid))ist.3. A control or calibration serum according to claim 1 and 2, characterized gekenn characterized in that the chemical compound of the general formula (II) R1 = H, R2 = CH₃ (= 1- (4-methylphenyl) semicarbazide)). 4. Ein Kontroll- beziehungsweise Eichserum gemäß einem der Anspruche 1 bis 3. das zusätzliche Konservierungsmittel oder/und Analytstabilisatoren enthält.4. A control or calibration serum according to one of claims 1 to 3. the contains additional preservatives and / or analyte stabilizers. 5. Ein Kontroll- beziehungsweise Eichserum gemäß Anspruch 1, das unter Schutzgas auf­ bewahrt wird.5. A control or calibration serum according to claim 1, which is under protective gas is preserved. 6. Ein Kontroll- beziehungsweise Eichserum gemäß einem der Ansprüche 1-5, bei dem die Einsatzkonzentrationen der chemischen Verbindungen der Formeln (I) und/oder (II) zwischen 0,001 und 1,5 mmol/l liegen.6. A control or calibration serum according to any one of claims 1-5, wherein the Use concentrations of the chemical compounds of the formulas (I) and / or (II) between 0.001 and 1.5 mmol / l. 7. Verwendung chemischer Verbindungen der Formeln (I) und/oder (II) zur Stabilisierung von Bilirubin in Lösungen.7. Use of chemical compounds of the formulas (I) and / or (II) for stabilization of bilirubin in solutions. 8. Verfahren zur Stabilisierung von Bilirubin in einer Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel (I) und/oder (II) der bilirubin-haltigen Lösung zugegeben wird. 8. A method for the stabilization of bilirubin in a solution, characterized in that a compound of formula (I) and / or (II) is added to the bilirubin-containing solution becomes.   9. Verfahren zur Herstellung eines Kontroll- beziehungsweise Eichserums dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel (I) und/oder eine Verbindung der Formel (II) einer bilirubin-haltigen Kontroll- bzw. Eichserum zugesetzt wird.9. A method for producing a control or calibration serum thereby in that a compound of the formula (I) and / or a compound of the Formula (II) is added to a bilirubin-containing control or calibration serum. 10. Eine Methode zum Nachweis von Bilirubin durch
  • a) Messung von Bilirubin in der Probe
  • b) Messung von Bilirubin in einem Kontroll- oder Eichserum mit einem definierten Bilirubingehalt
  • c) Bestimmung des Bilirubingehaltes durch Vergleich der Messung a) mit der Messung b), dadurch gekennzeichnet, daß ein Kontroll- oder Eichserum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 verwendet wird.
10. A method for the detection of bilirubin by
  • a) Measurement of bilirubin in the sample
  • b) Measurement of bilirubin in a control or calibration serum with a defined bilirubin content
  • c) Determination of the bilirubin content by comparing the measurement a) with the measurement b), characterized in that a control or calibration serum according to one of claims 1 to 6 is used.
11. Eine Methode zur Erhöhung der Lagerstabilität von bilirubin-haltigen Eich­ beziehungsweise Kontrollseren, dadurch gekennzeichnet, daß eine chemische Verbindung der Formel (I) und/oder (II) gemäß Anspruch 1 zugegeben wird.11. A method for increasing the storage stability of bilirubin-containing calibration or control sera, characterized in that a chemical Compound of formula (I) and / or (II) is added according to claim 1. 12. Kit zur Messung von Bilirubin in Proben, dadurch gekennzeichnet, daß ein bilirubin­ haltiges Kontroll- beziehungsweise Eichserum gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und zusätzliche zur Messung erforderliche Reagenzien enthalten sind.12. Kit for the measurement of bilirubin in samples, characterized in that a bilirubin containing control or calibration serum according to any one of claims 1 to 6 and additional reagents required for measurement are included.
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