DE19621728A1 - Pre-analysis treatment of fibrin containing sample - Google Patents
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Abstract
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Fibrin enthaltenden Lösungen, durch das eine zuverlässigere Bestimmung von Fibrin in Körperflüssigkeiten, insbesondere eine Bestimmung mit automatischen Analysegeräten, ermöglicht wird.The present invention relates to a method for treatment of solutions containing fibrin, through which a more reliable Determination of fibrin in body fluids, especially one Determination with automatic analyzers is made possible.
Fibrin entsteht bei Aktivierung des Blutgerinnungssystems durch Einwirkung von aktivem Thrombin auf Fibrinogen. Dabei wird das Fibrinogenmolekül, das aus zwei Paaren von α-, β- und γ-Ketten besteht, durch das Thrombin in Fibrinmonomere gespalten, die als DES-AA-Fibrin oder Fibrin I und DES-AA-BB-Fibrin oder Fibrin II bezeichnet werden. Diese Fibrinmonomere lagern sich dann anein ander und und werden durch Faktor XIII zu einem Fibringerinnsel vernetzt. Lösliches Fibrin ist bei verschiedenen Gerinnungs störungen, insbesondere der Verbrauchs-Coagulopathie nachweisbar. Für die klinische Diagnostik ist es daher wichtig, Fibrinmonomere in Körperflüssigkeiten zuverlässig neben Fibrinogen nachweisen zu können.Fibrin occurs when the blood coagulation system is activated Effect of active thrombin on fibrinogen. It will Fibrinogen molecule consisting of two pairs of α, β and γ chains consists of cleaved by the thrombin in fibrin monomers, which as DES-AA-fibrin or fibrin I and DES-AA-BB-fibrin or fibrin II be designated. These fibrin monomers then accumulate other and and become a fibrin clot by factor XIII networked. Soluble fibrin is at various coagulations disorders, especially the consumption coagulopathy detectable. For clinical diagnostics, it is therefore important to use fibrin monomers reliably detect in body fluids in addition to fibrinogen can.
Ein spezifischer Sandwich-Immunoassay zum Nachweis von Fibrin unter Verwendung eines Fibrin-spezifischen monoklonalen Antikör pers als Fängerantikörper ist bei Scheefers-Borchel et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7091-7095, beschrieben. Der Nachweis einer Bindung von Fibrin an diesen Antikörper erfolgt mit einem polyklonalen Peroxidase-markierten Anti-Fibrinogen-Antikör per.A specific sandwich immunoassay for the detection of fibrin using a fibrin-specific monoclonal antibody pers as capture antibody is in Scheefers-Borchel et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 7091-7095. Of the Detection of fibrin binding to this antibody is carried out with a polyclonal peroxidase-labeled anti-fibrinogen antibody by.
Es wurde nun festgestellt, daß bei der Bestimmung von Fibrin in Körperflüssigkeiten nach dieser Methode relativ häufig unplausibel niedrige Fibrinwerte erhalten werden bzw. Fibrin überhaupt nicht nachgewiesen werden kann, obwohl ein anderes Fibrinbestimmungsver fahren eindeutig das Vorhandensein von Fibrinmonomeren anzeigte.It has now been found that when fibrin is determined in Body fluids are relatively implausible using this method low fibrin values are obtained or fibrin is not obtained at all can be detected, although another fibrin determination method drive clearly indicated the presence of fibrin monomers.
Ein anderes Problem ist, daß mit dieser Methode zum Teil auch Werte in Proben gemessen werden, die keine Fibrinmonomere bzw. sehr geringe Mengen davon enthalten wie z. B. Normalplasmen. Another problem is that with this method partly too Values are measured in samples that do not contain fibrin monomers or contain very small amounts such as B. normal plasmas.
Besonders gravierend wirkt sich dieser Nachteil in automatisierten Test-systemen aus.This disadvantage has a particularly serious effect in automated systems Test systems.
In EP-A-0 534 444 wird ein Verfahren zur Vorbehandlung einer Fibrin enthaltenden Probe beschrieben, bei dem die oben genannten Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise vermieden werden sollen. Dieses Verfahren umfaßt das Versetzen der Probe mit Rhodanid-, Jodid-, Magnesium- oder/und Guanidiniumionen und eine Inkubation der erhaltenen Probelösung. Nach der Inkubation wird die Probenlösung gegebenenfalls verdünnt und anschließend der Fibringehalt ermittelt.EP-A-0 534 444 describes a method for pretreating a Fibrin-containing sample described in which the above Disadvantages of the prior art at least partially avoided should be. This procedure involves adding the sample Rhodanide, iodide, magnesium or / and guanidinium ions and one Incubation of the sample solution obtained. After incubation if necessary, dilute the sample solution and then the Fibrin content determined.
B-in Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß die Konzen tration der zur Vorbehandlung verwendeten Ionen oft sehr hoch sein muß, z. B. eine Rhodanidkonzentration von 4 mol/l. Diese hohe Konzentration führt in bestimmten Analysenautomaten bei der anschließenden Fibrinbestimmung zu einer hohen Restkonzentration der zur Denaturierung verwendeten Ionen, welche zu falschen Testergebnissen führen kann. Noch ein weiterer Nachteil des Verfahrens gemäß EP-A-0 534 444 besteht darin, daß die Inkubationsdauer zur Vorbehandlung der Probe bei bestimmten Testformaten oft zu lange ist, um einen einwandfreien Testablauf in gängigen Analyseautomaten zu gewährleisten. Außerdem können die in EP-A-0 534 444 offenbarten Substanzen beim anschließenden Nachweisschritt auch in niedriger Konzentration die Signalbildung beispielsweise in einem Elektrochemilumineszenzsystem stören.B-disadvantage of this method is that the conc tration of the ions used for pretreatment can often be very high must, e.g. B. a rhodanide concentration of 4 mol / l. This high In certain automatic analyzers, concentration leads to subsequent fibrin determination to a high residual concentration of the ions used for denaturation, which lead to wrong ones Test results. Yet another disadvantage of the Process according to EP-A-0 534 444 is that the Incubation period for pretreatment of the sample with certain Test formats are often too long to run properly to ensure in common automated analyzers. In addition, the substances disclosed in EP-A-0 534 444 during the subsequent Detection step, even in low concentration, signal formation interfere, for example, in an electrochemiluminescent system.
Eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe war es daher, die für die Vorbehandlung benötigte Konzentration an Denaturierungsmittel zu verringern, so daß eine problemlose Durchführung der Fibrinbestimmung in einem automatisierten Analysegerät möglich ist. Eine weitere, der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, neue Denaturierungsmittel für die Vorbehandlung von Fibrin enthaltenden Proben bereitzustel len, bei denen die Nachteile des Standes der Technik mindestens teilweise vermieden werden können. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, die Inkubationsdauer bei der Vorbehandlung der Probe zu verringern, um eine universelle Anwendbarkeit von automatisierten Testgeräten zu gewährleisten.It was an object underlying the present invention therefore, the concentration required for the pretreatment To reduce denaturing agents so that a problem-free Execution of the fibrin determination in an automated Analyzer is possible. Another of the present invention underlying task was to create new denaturants for the pretreatment of samples containing fibrin len, where the disadvantages of the prior art at least can be partially avoided. Yet another job of present invention was the incubation period at Pretreatment of the sample to reduce to a universal To ensure applicability of automated test equipment.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Fibrin enthaltenden Probe, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe mit einem Verfahren zur Behandlung einer Fibrin enthaltenden Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit einem Fibrinmonomerkomplex- Dissoziationsmittel und mindestens einem Mittel, ausgewählt ausIn a first aspect, the present invention relates to a A method of treating a sample containing fibrin, which is characterized in that the sample with a method for the treatment of a sample containing fibrin, thereby characterized in that the sample is mixed with a fibrin monomer complex Dissociation agent and at least one agent selected from
- (a) einem Chelatbildner,(a) a chelating agent,
- (b) einem Salz ohne bzw. mit geringer dissoziierender Wirkung auf Fibrinmonomerkomplexe und(b) a salt with no or little dissociating effect Fibrin monomer complexes and
- (c) einer Fibrin-bindefähigen Substanz versetzt und die erhaltene Probenlösung inkubiert.(c) a fibrin-bindable substance is added and the resultant Incubated sample solution.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß die Wirkung von Dissoziationsmitteln bei der Vorbehandlung einer Fibrin-enthal tenden Probe durch Zusatz von Chelatbildnern, Salzen ohne eigene signifikante dissoziierende Wirkung oder/und Fibrin-bindefähigen Substanzen verstärkt werden kann. Besonders bevorzugt ist der Zusatz von Chelatbildnern oder/und von nicht-dissoziierend wirkenden Salzen. Auf diese Weise kann eine Verringerung der Konzentration an Dissoziationsmitteln in der Vorbehandlungslösung um vorzugsweise mehr als 50% erreicht werden, wodurch eine entsprechende Verringerung der durch das Dissoziationsmittel hervorgerufenen Störungen bei der nachfolgenden Fibrinmonomer- Bestimmung in einem automatisierten Testgerät erreicht werden kann.Surprisingly, it was found that the effect of Dissociation agents in the pretreatment of a fibrin-containing tendency sample by adding chelating agents, salts without their own significant dissociative effect and / or fibrin-binding ability Substances can be reinforced. The is particularly preferred Addition of chelating agents and / or non-dissociating acting salts. In this way, a reduction in Concentration of dissociation agents in the pretreatment solution preferably be achieved by more than 50%, whereby a corresponding reduction in the rate of dissociation caused disturbances in the subsequent fibrin monomer Determination can be achieved in an automated test device can.
Das Fibrinmonomerkomplex-Dissoziationsmittel gemäß vorliegender Erfindung ist in der Lage, die Dissoziation von nicht-kovalenten Fibrinmonomerkomplexen, z. B. Komplexen von mehreren Fibrin monomeren, Komplexen von Fibrinmonomeren mit Fibrinogen oder Komplexen von Fibrinmonomeren mit sonstigen Proteinen zu bewirken. Vorzugsweise ist das Dissoziationsmittel eine chaotrope oder/und wasserstoffbrückensprengende Substanz. Das Dissoziationsmittel gemäß vorliegender Erfindung wird in einer wirksamen Konzentration eingesetzt, d. h. in einer Konzentration, die zu einer mindestens partiellen Dissoziation von in einer zu bestimmenden Fibrinmonomer-Probe vorliegenden Fibrinmonomerkomplexen und somit zur Erhöhung des Meßsignals bei einer anschließenden Fibrin monomer-Bestimmung führt. Die Bestimmung dieser wirksamen Konzentration für ein gegebenes Dissoziationsmittel ist für den Fachmann ohne weiteres möglich.The fibrin monomer complex dissociation agent according to the present Invention is capable of non-covalent dissociation Fibrin monomer complexes, e.g. B. complexes of several fibrin monomers, complexes of fibrin monomers with fibrinogen or To effect complexes of fibrin monomers with other proteins. The dissociation agent is preferably a chaotropic or / and hydrogen-bridging substance. The means of dissociation according to the present invention is in an effective concentration used, d. H. in a concentration that is at least one partial dissociation of to be determined in one Fibrin monomer sample present fibrin monomer complexes and thus to increase the measurement signal in a subsequent fibrin monomer determination leads. Determining this effective Concentration for a given dissociation agent is for the Specialist easily possible.
Das Dissoziationsmittel kann beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus chaotropen bzw. Wasserstoffbrückensprengenden Substanzen ausgewählt werden. Bevorzugte Beispiele sind die in EP-A-0 534 444 offenbarten Rhodanide, Jodide, Magnesium verbindungen oder Guanidiniumverbindungen. Weiterhin als Dissoziationsmittel gut geeignet sind Harnstoff und dergleichen. Besonders bevorzugt sind Rhodanide, die im allgemeinen in Form von Alkalimetall - oder Ammoniumrhodaniden eingesetzt werden.The dissociation agent can be, for example, from the group consisting of chaotropic or hydrogen bridging Substances are selected. Preferred examples are those in EP-A-0 534 444 discloses rhodanides, iodides, magnesium compounds or guanidinium compounds. Furthermore as Dissociation agents are well suited to urea and the like. Rhodanides, which are generally in the form of Alkali metal or ammonium rhodanides can be used.
Weiterhin wurde festgestellt, daß auch organische aromatische Verbindungen, z. B. aromatische Carbonsäuren und aromatische Sulfonsäuren und Salze davon, insbesondere aromatische Ver bindungen mit einem Phenylgrundgerüst, sowie aliphatische Carbon- und Sulfonsäuren und Salze davon, insbesondere halogenierte aliphatische Carbonsäuren und halogenierte aliphatische Sulfonsäu ren und Salze davon als Dissoziationsmittel geeignet sind. Bevorzugt aus dieser Gruppe von Dissoziationsreagenzien sind Salicylsäure, Toluol-4-sulfonsäure, Phenylessigsäure, 3, 5-Dÿod-2- hydroxybenzoesäure, Trichloressigsäure oder Salze davon. Besonders bevorzugt ist Salicylsäure oder ein Salz davon, z. B. Natriumsali cylat. Bevorzugt können auch Kombinationen von mehreren der oben genannten Dissoziationsmittel eingesetzt werden. Eine besonders bevorzugte Kombination umfaßt Natriumsalicylat und Milchsäure.It was also found that organic aromatic Connections, e.g. B. aromatic carboxylic acids and aromatic Sulfonic acids and salts thereof, especially aromatic ver bonds with a phenyl backbone, as well as aliphatic carbon and sulfonic acids and salts thereof, especially halogenated aliphatic carboxylic acids and halogenated aliphatic sulfonic acid ren and salts thereof are suitable as dissociation agents. Preferred from this group of dissociation reagents Salicylic acid, toluene-4-sulfonic acid, phenylacetic acid, 3, 5-Dÿod-2- hydroxybenzoic acid, trichloroacetic acid or salts thereof. Especially preferred is salicylic acid or a salt thereof, e.g. B. Sodium cylate. Combinations of several of the above can also be preferred mentioned dissociation agents are used. A special one preferred combination includes sodium salicylate and lactic acid.
Überraschenderweise wurde weiterhin gefunden, daß die Inkubation zur Probenvorbehandlung besonders günstig bei extremen pH-Werten durchgeführt werden kann, d. h. beispielsweise bei einem pH-Wert 10 und insbesondere 12 oder bei einem pH-Wert 5 und ins besondere 3. Diese Inkubation bei extremen pH-Werten kann überraschenderweise zu einer weiteren erheblichen Verringerung der Inkubationsdauer und zu einer Verringerung der für die Vorbe handlung benötigten Konzentration an Dissoziationsmittel führen.Surprisingly, it was also found that the incubation for sample pretreatment particularly favorable at extreme pH values can be performed, d. H. for example at a pH 10 and in particular 12 or at a pH 5 and ins special 3. This incubation at extreme pH values can surprisingly to a further significant reduction in Incubation period and a reduction in the prep necessary concentration of dissociation agent.
Der Zusatz eines Chelatbildners, eines Salzes ohne bzw. mit geringer dissoziierender Wirkung auf Fibrinmonomerkomplexe oder/und einer Fibrin-bindefähigen Substanz ermöglicht überraschenderweise eine Verringerung der Konzentration des Dissoziationsmittels während der Probenvorbehandlung. Bei Durchführung der Vorbehandlung und der anschließenden Fibrinbe stimmung in einem automatisierten Testgerät kann die Konzentration des Dissoziationsmittels während der Vorbehandlung signifikant um bis zu 70% verringert werden, ohne daß nachteiliger Effekt bei der Fibrinbestimmung auftritt.The addition of a chelating agent, a salt with or without low dissociative effect on fibrin monomer complexes or / and a fibrin-bindable substance surprisingly a reduction in the concentration of Dissociation agent during sample pretreatment. At Carrying out the pretreatment and the subsequent fibrinbe The concentration in an automated test device can improve of the dissociation agent significantly during the pretreatment can be reduced by up to 70% without an adverse effect on the Fibrin determination occurs.
Als Chelatbildner werden vorzugsweise eine oder mehrere Ver bindungen mit mindestens 2 und insbesondere mit mindestens 3 chelatbildenden Gruppen verwendet, die ausgewählt sind aus Amino-, Nitrilo-, Hydroxy-, Carbonyl- und Carboxylgruppen. Besonders bevorzugt wird der Chelatbildner ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyaminen, Polycarbonsäuren, (Poly)oxy(poly)carbon säuren, (Poly)nitrilo(poly)carbonsäuren sowie Salzen und Derivaten davon (z. B. Ester, Amide, alkylsubstituierte Amine etc.).Chelating agents are preferably one or more ver bonds with at least 2 and in particular with at least 3 chelating groups used, which are selected from amino, Nitrilo, hydroxy, carbonyl and carboxyl groups. Especially the chelating agent is preferably selected from the group consisting of polyamines, polycarboxylic acids, (poly) oxy (poly) carbon acids, (poly) nitrilo (poly) carboxylic acids as well as salts and derivatives thereof (e.g. esters, amides, alkyl substituted amines etc.).
Weiterhin ist bevorzugt, daß der Chelatbildner ein aliphatisches Grundgerüst aufweist. Spezifisch geeignete Chelatbildner sind die als Titriplex® bekannten Komplexbildner, d. h. Nitrilotriessigsäu re, Ethylendiamintetraessigsäure, 1,2-Cyclohexylendinitrilotetra essigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, 3,6-Dioxaoctamethy lennitrilotetraessigsäure oder Salze davon. Die Konzentration des Chelatbildners in der Probenlösung wird zweckmäßigerweise so gewählt, daß die Konzentration des Denaturierungsmittels möglichst stark verringert werden kann. Vorzugsweise wird der Chelatbildner daher in einer Konzentration von 2 mmol/l bis 200 mmol/l und besonders bevorzugt 5 mmol/l bis 100 mmol/l eingesetzt.It is further preferred that the chelating agent is an aliphatic Has basic structure. Specifically suitable chelating agents are Complexing agents known as Titriplex®, d. H. Nitrilotriacetic acid right, ethylenediaminetetraacetic acid, 1,2-cyclohexylenedinitrilotetra acetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, 3,6-dioxaoctamethy lennitrilotetraacetic acid or salts thereof. The concentration of the Chelating agent in the sample solution is expediently so chosen that the concentration of the denaturing agent as possible can be greatly reduced. The chelating agent is preferred therefore in a concentration of 2 mmol / l to 200 mmol / l and particularly preferably 5 mmol / l to 100 mmol / l.
Als Salz ohne bzw. mit geringer dissoziierender Wirkung auf Fibrinmonomerkomplexe werden vorzugsweise ein oder mehrere Alkalimetall-, Ammonium- oder substituierte, z. B. C₁-C₄-Alkyl-sub stituierte Ammoniumsalze mit monovalenten Anionen verwendet. As a salt with no or little dissociating effect Fibrin monomer complexes are preferably one or more Alkali metal, ammonium or substituted, e.g. B. C₁-C₄ alkyl sub substituted ammonium salts with monovalent anions are used.
Beispiele geeigneter monovalenter Anionen sind etwa Halogenide, Nitrate und Chlorate. Bevorzugt sind Halogenide, z. B. Chloride oder Bromide. Besonders gute Ergebnisse wurden mit NaCl, KCl, RbCl oder/und CsCl erhalten.Examples of suitable monovalent anions are halides, Nitrates and chlorates. Halides, e.g. B. Chlorides or bromides. Particularly good results were obtained with NaCl, KCl, RbCl or / and get CsCl.
Die Konzentration des Salzes in der Probenlösung beträgt vorzugsweise mindestens 100 mmol/l, besonders bevorzugt mindestens 500 mmol/l. Die Obergrenze der Konzentration entspricht der Löslichkeitsgrenze des jeweils verwendeten Salzes.The concentration of the salt in the sample solution is preferably at least 100 mmol / l, particularly preferably at least 500 mmol / l. The upper limit of the concentration corresponds to the Solubility limit of the salt used in each case.
Als Fibrin-bindefähige Substanz wird vorzugsweise eine organische Verbindung mit einem kondensierten, aromatischen oder/und heteroaromatischen Ringsystem und mindestens einer hydrophilen Gruppe verwendet. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Verbindungen mit einem Naphthalin-Ringsystem, z . B. Aminonaphthalin oder Derivate davon, z. B. 1-Aminonaphthalin, 2-Amino-1,5- Naphthalindisulfonsäure, 8-Amino-2-Naphthalinsulfonsäure, 1-Amino- 2-Naphthol-4-Sulfonsäure oder 8-Amino-1-Naphthol-5-Sulfonsäure.An organic substance is preferably used as the fibrin-bindable substance Connection with a condensed, aromatic or / and heteroaromatic ring system and at least one hydrophilic Group used. The use of is particularly preferred Compounds with a naphthalene ring system, e.g. B. aminonaphthalene or derivatives thereof, e.g. B. 1-aminonaphthalene, 2-amino-1,5- Naphthalenedisulfonic acid, 8-amino-2-naphthalenesulfonic acid, 1-amino 2-naphthol-4-sulfonic acid or 8-amino-1-naphthol-5-sulfonic acid.
Vorzugsweise wird die Fibrin-bindefähige Substanz in einer Konzentration von mindestens 0,1 g/l in der Probenlösung während der Vorinkubation eingesetzt. Besonders bevorzugt beträgt die Konzentration zwischen 0,2 g/l und 10 g/l, insbesondere zwischen 0,2 g/l und 5 g/l.The fibrin-bindable substance is preferably in one Concentration of at least 0.1 g / l in the sample solution during pre-incubation. The is particularly preferably Concentration between 0.2 g / l and 10 g / l, especially between 0.2 g / l and 5 g / l.
Die Inkubationstemperatur ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im allgemeinen nicht besonders kritisch. Günstigerweise erfolgt die Inkubation bei einer Temperatur von 10 bis 50°C und vorzugs weise von 15-40°C. Da sich bei geringeren Inkubationstemperaturen die Inkubationsdauer im allgemeinen erhöht, sind bei einem automatisierten Test, bei dem eine möglichst geringe Inkubations dauer gewünscht wird, Temperaturen von 25-40°C bevorzugt.The incubation temperature is in the method according to the invention generally not particularly critical. Conveniently done incubation at a temperature of 10 to 50 ° C and preferred from 15-40 ° C. Because at lower incubation temperatures the incubation period is generally increased in one automated test in which the lowest possible incubation Duration is desired, temperatures of 25-40 ° C preferred.
Die Inkubationsdauer beträgt im allgemeinen bis zu 60 min, vorzugsweise 1 bis 60 min. Bei Verwendung eines automatisierten Testgeräts ist die Inkubationsdauer vorzugsweise die maximal mögliche, durch die Gerätespezifikation vorgegebene Inkubations dauer, die z. B. bei einem Hitachi-Gerät 5-10 min und bei einem Cobas Mira-Gerät 25 min beträgt.The incubation period is generally up to 60 min. preferably 1 to 60 min. When using an automated For the test device, the incubation period is preferably the maximum Possible incubations specified by the device specification duration, the z. B. in a Hitachi device 5-10 min and one Cobas Mira device is 25 minutes.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung neuer Dissoziationsmittel für die Inkubation einer Fibrin enthaltenden Probe. Beispiele für geeignete neue Fibrinmonomerkomplex-Dissoziationsreagenzien sind - wie bereits oben erwähnt - aromatische Verbindungen, insbesondere aromatische Carbonsäuren, aromatische Sulfonsäuren und Salze davon sowie aliphatische Carbon- und Sulfonsäuren, insbesondere halogenierte aliphatische Carbonsäuren, halogenierte aliphatische Sulfonsäuren und Salze davon sowie Kombinationen von mehreren derartigen Substanzen. Diese Verbindungen haben gegenüber den in EP-A-0 534 444 offenbarten ionischen Dissoziationsmitteln den Vorteil, daß die zur Probenvorbehandlung erforderliche Inkubationsdauer unter gewissen Bedingungen geringer sein kann. Ein weiterer Vorteil gegenüber den ionischen Dissoziationsmitteln besteht darin, daß die organischen Verbindungen eine geringere Störung bei der anschließenden Fibrinbestimmung verursachen, wenn ein Elektrochemilumineszenz-Nachweissystem verwendet wird.Another aspect of the present invention relates to Provision of new means of dissociation for the incubation of a Sample containing fibrin. Examples of suitable new ones Fibrin monomer complex dissociation reagents are - as before mentioned above - aromatic compounds, especially aromatic Carboxylic acids, aromatic sulfonic acids and salts thereof as well aliphatic carboxylic and sulfonic acids, especially halogenated aliphatic carboxylic acids, halogenated aliphatic sulfonic acids and salts thereof, and combinations of several such Substances. These compounds have compared to those in EP-A-0 534 444 disclosed ionic dissociation agents the advantage that the incubation period required for sample pretreatment certain conditions may be lower. Another advantage compared to the ionic dissociation agents is that the organic compounds have less interference with the subsequent fibrin determination if a Electrochemiluminescence detection system is used.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die überraschende Erkenntnis, daß eine Vorinkubation der Fibrin enthaltenden Probe auch ohne Zusatz von Denaturierungsmittel bei extremen pH-Werten zur Erzeugung spezifischer Signale bei einer anschließenden Fibrinmonomerbestimmung führt. Vorzugsweise wird hierzu die Probe auf einen pH-Wert 12 oder 3 gebracht und anschließend die erhaltene Probenlösung inkubiert. Besonders bevorzugt wird ein pH-Wert von 13 oder 2 verwendet. Bei einer Inkubation unter diesen extremen pH-Bedingungen wird überraschen derweise gefunden, daß eine Inkubationszeit von bis zu 5 min, besonders bevorzugt von 1 bis 5 min bereits ausreichend ist, um bei einem anschließenden Test ein spezifisches Signal zu erzeugen.Yet another aspect of the present invention relates to surprising finding that pre-incubation of fibrin containing sample even without the addition of denaturing agents extreme pH values for the generation of specific signals at a subsequent fibrin monomer determination leads. Preferably for this purpose the sample is brought to a pH of 12 or 3 and then incubated the sample solution obtained. Especially a pH of 13 or 2 is preferably used. At a Incubation under these extreme pH conditions will surprise you found that an incubation time of up to 5 minutes, is particularly preferably sufficient from 1 to 5 min generate a specific signal in a subsequent test.
Durch die erfindungsgemäße Vorbehandlung einer Fibrin enthaltenden Lösung wird bei der anschließenden Bestimmung des Fibringehalts insbesondere unter Verwendung eines automatisierten Testgeräts eine erhöhte Sensitivität und Zuverlässigkeit erreicht. Nach dem erfindungsgemäßen Inkubationsschritt und vor der eigentlichen Bestimmung kann ggf. ein Verdünnungsschritt erfolgen. Bei einer Vorinkubation außerhalb eines Analyseautomaten kann der Ver dünnungsschritt sehr variabel durchgeführt werden. Die Probelösung wird hierbei vorzugsweise in einem geeigneten Puffer im Verhältnis von 1 : 5 bis 1 : 500, besonders bevorzugt von 1 : 10 bis 1 : 200 von Probelösung zu Puffer verdünnt. Bei einer Vorinkubation innerhalb eines Analyseautomaten ist die Wahl des Verdünnungsgrades an die Gerätespezifikation gebunden und liegt beispielsweise im Bereich von 1 : 2 bis 1 : 8 von Probelösung zu Puffer.By the pretreatment according to the invention of a fibrin-containing Solution is in the subsequent determination of the fibrin content especially using an automated test device increased sensitivity and reliability. After this incubation step according to the invention and before the actual one If necessary, a dilution step can be carried out. At a Pre-incubation outside of an automated analyzer, the Ver thinning step can be carried out very variably. The trial solution is preferably in a suitable buffer in the ratio from 1: 5 to 1: 500, particularly preferably from 1:10 to 1: 200 from Sample solution diluted to buffer. With a pre-incubation inside of an automatic analyzer is the choice of the degree of dilution to the Device specification bound and is, for example, in the range from 1: 2 to 1: 8 from sample solution to buffer.
Es wurde festgestellt, daß gute Ergebnisse bei der Fibrinbe stimmung erhalten werden, wenn der pH-Wert der Probelösung nach dem Vorbehandlungsschritt auf einen für die Durchführung immunolo gischer Reaktionen geeigneten Bereich eingestellt wird. Dieser Bereich ist dem Fachmann bekannt und erstreckt sich erfahrungs gemäß etwa von pH 5-9.It has been found that good results with fibrinbe mood can be obtained when the pH of the sample solution the pretreatment step on one for performing immunolo suitable reactions is set. This The area is known to the expert and extends through experience according to about pH 5-9.
Die Ermittlung des Fibringehalts in der Probelösung erfolgt vorzugsweise durch immunologische Verfahren, insbesondere unter Verwendung von mindestens einem fibrinspezifischen monoklonalen Antikörper.The fibrin content in the sample solution is determined preferably by immunological methods, especially under Use of at least one fibrin-specific monoclonal Antibody.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird dabei der Fibringehalt der Probelösung durch einen heterogenen Sandwich- Assay ermittelt, wobei man die Probelösung mit einem immobilisier ten oder immobilisierbaren fibrinspezifischen ersten Antikörper und einem markierten zweiten Antikörper, der an einem Konjugat von Fibrin und dem ersten Antikörper binden kann, in Kontakt bringt und die Markierung auf an sich bekannte Weise bestimmt.In a particularly preferred embodiment, the Fibrin content of the sample solution through a heterogeneous sandwich Assay determined, the sample solution being immobilized th or immobilizable fibrin-specific first antibody and a labeled second antibody attached to a conjugate of Fibrin and the first antibody can bind in contact and the marking is determined in a manner known per se.
Der erste Antikörper ist immobilisiert bzw. immobilisierbar, d. h. er liegt an eine Festphase gebunden vor oder er ist so modifi ziert, daß er an eine Festphase bindefähig ist. Beispiele für immobilisierte Antikörper sind solche, die nach dem Fachmann bekannten Methoden an die Oberfläche einer Festphase, z. B. einen Plastikträger, fixiert sind. Eine derartige Fixierung kann beispielsweise durch nicht-kovalente Adsorption oder durch kovalente Kopplung des Antikörpers mit reaktiven Gruppen oder/und Spacermolekülen auf der Oberfläche der Festphase erfolgen. Ein Beispiel für einen immobilisierbaren Antikörper ist ein biotiny lierter Antikörper, der an eine mit Streptavidin oder Avidin beschichtete Festphase bindefähig ist. Die Herstellung von biotinylierten Antikörpern erfolgt üblicherweise so, daß ein reaktives Biotinderivat mit SH-Gruppen des Antikörpers zur Bildung des biotinylierten Antikörpers umgesetzt wird. Anstelle eines Antikörpers umgesetzt wird. Anstelle eines Antikörpers können dabei auch Antikörperfragmente wie etwa F(ab)₂-, Fab- oder Fab′- Fragmente eingesetzt werden (F. Fieber, Biotinylierung monoklona ler Antikörper in: Monoklonale Antikörper/Herstellung und Charakterisierung, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York (1990) 299-302).The first antibody is immobilized or immobilizable, i. H. it is bound to a solid phase or it is so modifiable adorns that it is bindable to a solid phase. examples for immobilized antibodies are those according to the expert known methods to the surface of a solid phase, for. B. one Plastic carrier, are fixed. Such fixation can for example by non-covalent adsorption or by covalent coupling of the antibody with reactive groups or / and Spacer molecules take place on the surface of the solid phase. On An example of an immobilizable antibody is a biotiny lated antibody that binds to one with streptavidin or avidin coated solid phase is bindable. The production of biotinylated antibodies usually take place in such a way that a reactive biotin derivative with SH groups of the antibody for formation of the biotinylated antibody is implemented. Instead of one Antibody is implemented. Instead of an antibody you can also antibody fragments such as F (ab) ₂-, Fab- or Fab′- Fragments are used (F. Fieber, biotinylation monoclonal Antibody in: Monoclonal Antibodies / Manufacturing and Characterization, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York (1990) 299-302).
Der erste Antikörper muß ein fibrinspezifischer Antikörper sein, d. h. er darf keine nennenswerte Reaktivität gegenüber Fibrinogen molekülen besitzen. Die Herstellung von fibrinspezifischen monoklonalen Antikörpern kann durch Immunisierung von Versuchs tieren mit dem Hexapeptid Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu gemäß dem Stand der Technik erhalten werden. Ein Beispiel für einen fibrin spezifischen monoklonalen Antikörper, der beim erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, ist der Antikörper 2B5 (ECACC 89112802), der durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem Heptapeptid Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg erhalten wurde. Zur Immunisierung wird das Peptid in bekannter Weise gebunden an Trägerproteine wie KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) eingesetzt (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78 (1981) 3404).The first antibody must be a fibrin specific antibody d. H. it must not have any significant reactivity to fibrinogen own molecules. The production of fibrin-specific monoclonal antibodies can be tested by immunization animals with the hexapeptide Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu according to the prior art of technology. An example of a fibrin specific monoclonal antibody, which in the invention The antibody 2B5 (ECACC 89112802), which is obtained by immunizing experimental animals with the Heptapeptide Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg was obtained. For The peptide is bound to immunization in a known manner Carrier proteins such as KLH (Keyhole Limpet Hemocyanine) are used (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 78 (1981) 3404).
Der zweite Antikörper ist ein markierter Antikörper, der mit dem Konjugat aus erstem Antikörper und Fibrin reagieren kann. Die Markierung dieses Antikörpers kann beispielsweise eine enzymati sche, fluoreszierende, lumineszierende, radioaktive oder NMR- aktive Gruppe sein. Beispiele für derartige Markierungsgruppen sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise trägt der Antikörper eine enzymatische Markierungsgruppe, z. B. Peroxidase (POD) oder alkalische Phosphatase. Die POD-Markierung kann beispielsweise nach Wilson und Nakane, Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies, in: Immunofluorescence and related staining techniques, (W. Knapp, K. Holubar, and G. Wick, eds.), Elsevier/North-HollandBiomedical Press, Seiten 215-224, erfolgen. Weiterhin bevorzugt sind lumineszenzfähige Markierungssysteme, z. B. Elektrochemilumines zenz-Gruppen wie etwa Rutheniumbipyridrin- oder Rutheniumphen anthrolin-Komplexe.The second antibody is a labeled antibody that matches the Conjugate from the first antibody and fibrin can react. The Labeling of this antibody can be, for example, an enzymat cal, fluorescent, luminescent, radioactive or NMR be an active group. Examples of such marker groups are known to the person skilled in the art. The antibody preferably carries a enzymatic labeling group, e.g. B. peroxidase (POD) or alkaline phosphatase. The POD marker can, for example after Wilson and Nakane, Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies, in: Immunofluorescence and related staining techniques, (W. Knapp, K. Holubar, and G. Wick, eds.), Elsevier / North-Holland Biomedical Press, pages 215-224. Are also preferred marking systems capable of luminescence, e.g. B. electrochemilumines zenz groups such as ruthenium bipyridrin or rutheniumphen anthroline complexes.
Der zweite Antikörper kann der gleiche Antikörper wie der erste Antikörper sein, d. h. er kann eine gleiche Bindungsstelle besitzen. Andererseits kann der zweite Antikörper vom ersten Antikörper verschieden sein. Beispielsweise sind als zweiter Antikörper auch solche Antikörper geeignet, die neben Fibrin auch noch Fibrinogen erkennen. Ein solcher Antikörper ist z. B. der Antikörper 1.156.317 (ECACC Nr. 89060902). Ferner kann der zweite Antikörper auch ein polyklonaler Antikörper oder ein Antikörper fragment sein.The second antibody can be the same antibody as the first Be antibodies, d. H. it can have the same binding site have. On the other hand, the second antibody from the first Antibodies may be different. For example, are second Antibodies are also suitable for antibodies that, in addition to fibrin still recognize fibrinogen. Such an antibody is e.g. B. the Antibody 1,156,317 (ECACC No. 89060902). Furthermore, the second Antibody also a polyclonal antibody or an antibody fragment.
Ein weiteres immunologisches Testverfahren, für das sich die erfindungsgemäße Methode der Probenvorbereitung eignet, ist ein Test unter Verwendung von Latex. Bei diesem Latextest lagern sich Latexpartikel, welche an der Oberfläche Antikörper gegen Fibrin tragen, an Fibrin (welches zwei gleiche Epitope trägt) an, wobei eine Aggregation erfolgt und die Trübung gemessen werden kann. Geeignete Testprinzipen sind beispielsweise in J. Clin. Immuno assay 13 (1990), 127-131, Ann. Clin. Biochem. 29 (1992), 22-42 und EP-A 0 356 964 beschrieben.Another immunological test procedure for which the Suitable method of sample preparation according to the invention is a Test using latex. During this latex test they camp Latex particles which have antibodies against fibrin on the surface to fibrin (which carries two identical epitopes), where aggregation takes place and the turbidity can be measured. Suitable test principles are described, for example, in J. Clin. Immuno assay 13 (1990), 127-131, Ann. Clin. Biochem. 29: 22-42 (1992) and EP-A 0 356 964.
Die Bestimmung der Fibrinmonomere kann in Gegenwart eines Entstörungsreagenz stattfinden. Beispiele für Entstörungsreagen zien sind polymere Substanzen wie etwa gegebenenfalls modifizierte unspezifische Polypeptide oder Proteine, z. B. Serumalbumine, Immunglobuline, TRSA, oder Polysaccharide, z. B. Dextransulfat. Auch Chelatbildner, z. B. EDTA können als Entstörungsreagenzien eingesetzt werden. Bevorzugte Entstörungsreagenzien sind acylier te, z. B. acetylierte oder succinylierte Proteine oder Polypeptide, wie etwa acetylierte Serumalbumine, insbesondere acetyliertes Rinderserumalbumin, gegebenenfalls in Kombination mit Chelatbild nern. The fibrin monomers can be determined in the presence of a Anti-interference reagent take place. Examples of interference suppression reagents cien are polymeric substances such as modified, if necessary non-specific polypeptides or proteins, e.g. B. serum albumin, Immunoglobulins, TRSA, or polysaccharides, e.g. B. dextran sulfate. Chelating agents, e.g. B. EDTA can be used as anti-interference reagents be used. Preferred interference-suppression reagents are acylated te, e.g. B. acetylated or succinylated proteins or polypeptides, such as acetylated serum albumin, especially acetylated Bovine serum albumin, possibly in combination with a chelated image nern.
Die Konzentration von polymeren Entstörungsreagenzien im Bestim mungsansatz ist vorzugsweise 0,01-0,5 Gew-%, besonders bevorzugt 0,05-0,2 Gew-%. Die Konzentration von Chelatbildnern im Bestim mungsansatz ist vorzugsweise 1-50 mmol/l, besonders bevorzugt 5-30 mmol/l.The concentration of polymeric interference suppressants in the determ is preferably 0.01-0.5% by weight, particularly preferred 0.05-0.2% by weight. The concentration of chelating agents in the determin The mixture is preferably 1-50 mmol / l, particularly preferably 5-30 mmol / l.
Durch Zusatz von Entstörungsreagenzien bei der Fibrinmonomerbe stimmung kann ein - selbst nach Probenvorbehandlung - noch gelegentlich auftretendes Störsignal unterdrückt werden.By adding anti-interference reagents to the fibrin monomer leg A mood can still exist - even after sample preparation Occasional interference signal can be suppressed.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzienkit, der neben anderen zur Fibrinbestimmung erforderlichen Komponenten auch ein Fibrinmonomerkomplex-Dissoziationsmittel und mindestens ein Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Chelat bildner, einem Salz ohne bzw. mit geringer dissoziierender Wirkung auf Fibrinmonomerkomplexe und einer Fibrin-bindefähigen Substanz in fester oder/und gelöster Form enthält. Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch ein Reagenzienkit, der neben anderen zur Fibrinbestimmung erforderlichen Komponenten ein Fibrinmonomerkomplex-Dissoziationsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus aromatischen und aliphatischen Carbon- und Sulfonsäure und Salzen davon enthält.Another object of the invention is a reagent kit that in addition to other components required for fibrin determination a fibrin monomer complex dissociation agent and at least one Medium selected from the group consisting of a chelate formers, a salt with little or no dissociative effect on fibrin monomer complexes and a fibrin-binding substance contains in solid or / and dissolved form. Another one The invention also relates to a reagent kit which, in addition to other components required for fibrin determination Fibrin monomer complex dissociation agent selected from the group consisting of aromatic and aliphatic carbon and Contains sulfonic acid and salts thereof.
Die Antikörper 2B5 und 1.156.317 wurden gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages mit den Hinterlegungsnummern ECACC 89 112 802 bzw. ECACC 89 060 902 bei ECACC, Porton Down, GB, hinterlegt.Antibodies 2B5 and 1,156,317 were raised in accordance with the provisions of Budapest contract with the deposit numbers ECACC 89 112 802 or ECACC 89 060 902 at ECACC, Porton Down, GB.
Die Erfindung soll weiterhin durch die folgenden Beispiele und Abbildungen verdeutlicht werden.The invention is further illustrated by the following examples and Illustrations are made clear.
Es zeigen:Show it:
Abb. 1 die verstärkende Wirkung von Chelatbildnern bei Vorbehandlung einer Fibrin enthaltenden Probe mit Rhodanid, Fig. 1, the enhancing effect of chelating agents in the pretreatment of a sample containing fibrin with thiocyanate,
Abb. 2 den Einfluß des pH-Werts auf eine Vorbehandlung mit Rhodanid, Fig. 2 the influence of pH on pretreatment with rhodanide,
Abb. 3 die Signalhöhe in Abhängigkeit von der Vorbehandlungs dauer und vom pH-Wert bei einer Vorbehandlung mit Rhodanid und EDTA, Fig. 3 shows the signal level depending on the pretreatment time and the pH value in a pretreatment with rhodanide and EDTA,
Abb. 4 die verstärkende Wirkung von EDTA auf eine Vorbehand lung mit Natriumsalicylat, Fig. 4 the reinforcing effect of EDTA on pretreatment with sodium salicylate,
Abb. 5 den Einfluß des pH-Werts auf eine Vorbehandlung mit Natriumsalicylat, Fig. 5 the influence of pH on pretreatment with sodium salicylate,
Abb. 6 die Signalhöhe in Abhängigkeit von der Vorbehandlungs dauer bei einer Vorbehandlung mit Natriumsalicylat und EDTA und Fig. 6 shows the signal level depending on the pretreatment time for a pretreatment with sodium salicylate and EDTA and
Abb. 7 das Ergebnis einer Vorbehandlung mit Salicylat, Chlor acetat, Toluol-4-sulfonat und Phenylacetat. Fig. 7 shows the result of pretreatment with salicylate, chloroacetate, toluene-4-sulfonate and phenylacetate.
Die Fibrinbestimmung erfolgte in Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten (TRSA-SA Mikrotiterplatten). Die Durchführung, wenn nicht anders beschrieben, wär wie folgt:The fibrin determination was carried out in streptavidin-coated Microtiter plates (TRSA-SA microtiter plates). The implementation, unless otherwise stated, would be as follows:
20 µl Probe (postoperatives Citratplasma) wurden mit jeweils 60 µl Vorbehandlungslösung vermischt. 16 µl dieses Gemisches wurden in eine Vertiefung der Mikrotiterplatte zur Vorbehandlung pipettiert. Die Vorbehandlung dauerte, wenn nicht anders be schrieben, 30 min.20 µl sample (postoperative citrate plasma) was mixed with 60 µl pretreatment solution mixed. 16 ul of this mixture were into a recess in the microtiter plate for pretreatment pipetted. The pretreatment lasted, if not different wrote, 30 min.
Nach Beendigung der Vorbehandlung wurden 200 µl biotinylierter fibrinspezifischer Antikörper (1 µg/ml eines Konjugats des Antikörpers 2B5 in Pufferlösung, ggf. mit Entstörungsreagenz, z. B. 0,15% acetyliertes Rinderserumalbumin (Aurion, Wageningen, NL)) zugegeben.After the pretreatment was completed, 200 ul biotinylated fibrin-specific antibody (1 µg / ml of a conjugate of Antibody 2B5 in buffer solution, if necessary with interference suppressor, e.g. B. 0.15% acetylated bovine serum albumin (Aurion, Wageningen, NL)) admitted.
Falls die Vorbehandlungslösung einen nicht neutralen pH-Wert aufwies, wurden erst 150 µl der Antikörperlösung und anschließend 50 µl Antikörperlösung, aufgestockt mit einer entsprechenden Menge HCl oder NaOH zugegeben. Die Neutralisierung wird visuell mit Phenolrot (in Konzentration 10 mg/l) überprüft.If the pretreatment solution has a non-neutral pH first showed 150 µl of the antibody solution and then 50 µl antibody solution, topped up with an appropriate amount HCl or NaOH added. The neutralization is visual with Phenol red (in a concentration of 10 mg / l) checked.
Anschließend wurde die Platte 30 min unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 3 × mit Waschlösung gewaschen.The plate was then shaken for 30 min Incubated at room temperature and then 3 × with washing solution washed.
Anschließend wurden 200 µl markierter Antikörper (Konjugat aus Peroxidase und monoklonalem Antikörper 1.156.317, POD-Aktivität 0,2 U/ml in Pufferlösung ggf. mit Entstörungsreagenz, z. B. 0,1% acetyliertes Rinderserumalbumin und 30 mmol/l EDTA) zugegeben.Then 200 µl of labeled antibody (conjugate from Peroxidase and monoclonal antibody 1,156,317, POD activity 0.2 U / ml in buffer solution, if necessary with interference suppressor, e.g. B. 0.1% acetylated bovine serum albumin and 30 mmol / l EDTA) added.
Die Platte wurde anschließend nochmals 30 min unter ständigem Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 3 × mit Waschlösung gewaschen.The plate was then again under constant stirring for 30 min Shake incubated at room temperature and then 3 times with Wash solution washed.
Nach der letzten Waschung werden 200 µl Peroxidase-Substratlösung (0,95 mg ABTS®/ml in Pufferlösung pH 4,5) zupipettiert. Die Extinktion wird abhängig von der Reaktionsgeschwindigkeit nach 5 bis 30 min bei 405 nm abgelesen.After the last wash, 200 ul peroxidase substrate solution (0.95 mg ABTS® / ml in pH 4.5 buffer solution). The Absorbance depends on the reaction rate after 5 up to 30 min at 405 nm.
Als Vergleichsmethode für alle Versuche wurde eine 30-minütige Vorbehandlung mit 5,33 mol/l KSCN als Denaturierungsmittel verwendet. A 30-minute test was used as a comparison method for all experiments Pretreatment with 5.33 mol / l KSCN as a denaturing agent used.
Chelatbildner verstärken die Wirkung von Dissoziations mitteln. Getestet wurden Titriplex® I (Nitrilotriessigsäure), III (Na₂-EDTA), IV (1,2-Cyclohexylendinitrilotetraessig säure), V (Diethylentriaminpentaessigsäure) und VI (3,6- Dioxaoctamethylendinitrilotetraessigsäure). Die Konzentration der Chelatbildner in der Vorbehandlungslösung war jeweils 50 mmol/l. Aus Abb. 1 ist ersichtlich, daß die Rhodanid- Konzentration von 2 mol/l ein gleich starkes Meßsignal wie die Vergleichsmethode (5,33 mol/l KSCN ohne Chelatbildner) ergab. Die hierdurch erreichte Verringerung der Rhodanid- Konzentration auf ca. 38% gegenüber der ohne Chelatbildner eingesetzten Konzentration bewirkt eine signifikante Stö rungsverringerung bei der nachfolgenden Fibrinmonomerbestim mung.Chelating agents increase the effect of dissociation agents. Titriplex® I (nitrilotriacetic acid), III (Na₂-EDTA), IV (1,2-cyclohexylenedinitrilotetraacetic acid), V (diethylenetriaminepentaacetic acid) and VI (3,6-dioxaoctamethylenedinitrilotetraacetic acid) were tested. The concentration of the chelating agents in the pretreatment solution was 50 mmol / l in each case. From Fig. 1 it can be seen that the rhodanide concentration of 2 mol / l gave an equally strong measurement signal as the comparison method (5.33 mol / l KSCN without chelating agent). The resulting reduction in the rhodanide concentration to approximately 38% compared to the concentration used without the chelating agent brings about a significant reduction in interference in the subsequent fibrin monomer determination.
Außer durch den Chelatbildner wird die Wirkung von Disso ziationsmitteln auch durch den pH-Wert beeinflußt. Die Ergebnisse für Rhodanid bei einer Variation des pH-Werts von 8-13 und der Rhodanid-Konzentration von 0-2 mol/l sind in Abb. 2 zusammengefaßt.In addition to the chelating agent, the effect of dissociation agents is also influenced by the pH. The results for rhodanide with a variation of the pH value from 8-13 and the rhodanide concentration from 0-2 mol / l are summarized in Fig. 2.
Bei einer Rhodanid-Konzentration 1 mol/l steigt das Meßsignal bei zunehmendem pH-Wert an. Bei pH 13 wird sogar ohne Rhodanid ein Signal erzeugt. Das maximale Signal nimmt mit zunehmendem pH-Wert ab. Bei einem pH-Wert von 13 wird das Signal durch Zusatz von KSCN nur noch geringfügig erhöht.With a rhodanide concentration of 1 mol / l this increases Measurement signal with increasing pH. At pH 13 even generates a signal without rhodanide. The maximum signal takes with increasing pH. At a pH of 13 that will Signal only slightly increased by adding KSCN.
Die in Abb. 1 und 2 gezeigten Daten wurden mit einer Vorbehandlungsdauer von 30 min erhoben. Der Zeittakt eines automatisierten Testgeräts, z. B. eines Hitachi-Analysegeräts, der nur unter großem Aufwand geändert werden kann, erlaubt jedoch nur eine Vorbehandlungszeit von 5 min. Wie aus Abb. 3 ersichtlich ist, reicht jedoch bei 2 mol/l KSCN, 50 mmol/l EDTA, pH 8, eine Vorbehandlungsdauer von 5 min bei weitem nicht aus. Durch eine Erhöhung des pH-Werts auf 12, insbesondere auf 13, wird aber bereits innerhalb der ersten 5 min das maximale Signal erreicht und damit eine Rahmenbe dingung für die Durchführung des Tests in einem Hitachi- Analyseautomaten erfüllt.The data shown in Fig. 1 and 2 were collected with a pretreatment time of 30 min. The timing of an automated test device, e.g. B. a Hitachi analyzer, which can only be changed with great effort, but only allows a pretreatment time of 5 min. As can be seen from Fig. 3, with 2 mol / l KSCN, 50 mmol / l EDTA, pH 8, a pretreatment time of 5 min is far from sufficient. By increasing the pH to 12, in particular to 13, the maximum signal is already reached within the first 5 minutes and thus a framework condition for carrying out the test in an automatic Hitachi analyzer is met.
Salicylsäure und Salze davon, z. B. Natriumsalicylat, erwiesen sich als zufriedenstellende Dissoziationsmittel. Auch im Falle von Salicylsäure kann durch Chelatbildner wie EDTA die signalerzeugende Wirkung drastisch verstärkt werden. Abb. 4 zeigt die signalverstärkende Wirkung von EDTA bei einer Natriumsalicylat-Konzentration in der Vorbehandlungs lösung von 1 mol/l und einem pH-Wert von 8. Aus Abb. 5 ist ersichtlich, daß die Effektivität von Natriumsalicylat mit steigendem pH-Wert zunimmt. Bezüglich des Zeitverlaufs liegt eine Vorbehandlung mit 1,5 mol/l Natriumsalicylat, 20 mmol/ EDTA, pH 8, fast innerhalb der für ein Hitachi-Analyse gerät bevorzugten Zeitdauer von 5 min (vgl. Abb. 6).Salicylic acid and salts thereof, e.g. B. sodium salicylate, proved to be satisfactory dissociation agents. In the case of salicylic acid as well, chelating agents such as EDTA can drastically enhance the signal-producing effect. Fig. 4 shows the signal-enhancing effect of EDTA with a sodium salicylate concentration in the pretreatment solution of 1 mol / l and a pH of 8. From Fig. 5 it can be seen that the effectiveness of sodium salicylate increases with increasing pH. With regard to the course of time, a pretreatment with 1.5 mol / l sodium salicylate, 20 mmol / EDTA, pH 8 is almost within the time period of 5 minutes preferred for a Hitachi analysis (see Fig. 6).
Neben Salicylat eignen sich auch weitere Phenylverbindungen wie 3,5-Dÿod-2-hydroxybenzoesäure, Toluol-4-sulfonat und Phenylacetat sowie Trichloracetat als Dissoziationsreagenzien bei der Vorbehandlung.In addition to salicylate, other phenyl compounds are also suitable such as 3,5-Dÿod-2-hydroxybenzoic acid, toluene-4-sulfonate and Phenylacetate and trichloroacetate as dissociation reagents during pretreatment.
Abb. 7 zeigt die Wirkung von Salicylat, Trichloracetat, Toluol-4-sulfonat und Phenylacetat in Gegenwart von 20 mmol/l EDTA, pH 8. Fig. 7 shows the effect of salicylate, trichloroacetate, toluene-4-sulfonate and phenylacetate in the presence of 20 mmol / l EDTA, pH 8.
Wie aus den Abb. 2 und 5 ersichtlich ist, wird bereits bei einer Inkubation mit 100 mmol/NaOH bereits ohne Zusatz von Dissoziationsmittel ein spezifisches Signal erzeugt. Die Höhe des Signals entspricht etwa 30% des Signals einer Vorbehandlung mit 5,33 mol/l KSCN.As can be seen from Figs. 2 and 5, a specific signal is generated even with an incubation with 100 mmol / NaOH without the addition of dissociation agents. The level of the signal corresponds to approximately 30% of the signal of a pretreatment with 5.33 mol / l KSCN.
Bei hohem pH-Wert wird eine Abhängigkeit der Signalstärke von der Dauer der Vorbehandlung gefunden. Dabei nimmt das Signal mit der Dauer der Vorbehandlung ab. Bevorzugt ist eine Vorbe handlungsdauer von bis zu max. 20 min, besonders bevorzugt bis zu max. 10 min.At high pH, the signal strength depends on the duration of the pretreatment found. The signal picks up with the duration of the pretreatment. Preference is preferred duration of action of up to max. 20 min, particularly preferred up to max. 10 min.
Nicht nur durch eine Vorbehandlung bei extrem hohem pH-Wert wird ein spezifisches Signal erzeugt, auch eine Vorbehandlung bei einem extrem geringen pH-Wert von z. B. 2 führt zu einem spezifischen Signal.Not just through pretreatment at an extremely high pH a specific signal is generated, including pre-treatment at an extremely low pH of e.g. B. 2 leads to one specific signal.
Die Fibrinbestimmung erfolgte in einem Latextest unter Verwendung von Latexpartikeln mit darauf immobilisierten Anti-Fibrin- Antikörpern. Die Durchführung, wenn nicht anders beschrieben, war wie folgt:The fibrin determination was carried out in a latex test using of latex particles with anti-fibrin immobilized on them Antibodies. The implementation, unless otherwise described, was as follows:
Ein Volumenanteil Probe wurde jeweils mit drei Volumenanteilen Vorbehandlungslösung vermischt und 30 min inkubiert.A volume fraction of sample was given three volume fractions each Pretreatment solution mixed and incubated for 30 min.
10 µl der Vorbehandlungslösung wurden mit 120 µl Pufferlösung und 120 µl einer Suspension von Latexpartikeln zusammengegeben. Der Nachweis erfolgte durch Messung der Trübungsänderung.10 µl of the pretreatment solution were mixed with 120 µl buffer solution and Combined 120 µl of a suspension of latex particles. Of the Evidence was provided by measuring the change in turbidity.
Als Vergleichsmethode für alle Versuche wurde eine Vorbehandlung mit 6 mol/l KSCN als Dissoziationsmittel verwendet.Pretreatment was used as a comparison method for all experiments with 6 mol / l KSCN used as a dissociation agent.
- a) Einfluß von Salzen ohne signifikante Dissoziationswirkung Salze ohne bzw. mit geringer dissoziierender Wirkung auf Fibrinmonomerkomplexe verstärken die Wirkung von Dissozia tionsmitteln. Getestet wurden NaCl, KCl, RbCl und ClCl.a) Influence of salts without significant dissociation effects Salts without or with little dissociating effect Fibrin monomer complexes increase the effect of dissozia agents. NaCl, KCl, RbCl and ClCl were tested.
Tabelle 1 zeigt, daß durch Zusatz von 1 mol/l Salz zu 6 mol/l KSCN eine Signalverbesserung um bis zu 30% erreicht wurde. Tabelle 2 zeigt, daß KCl alleine nicht wirksam ist, in Kombination mit KSCN jedoch zu einer deutlichen Verbesserung der Wirkung führt.Table 1 shows that by adding 1 mol / l salt to 6 mol / l KSCN a signal improvement of up to 30% was achieved. Table 2 shows that KCl alone is not effective, in Combination with KSCN, however, leads to a significant improvement the effect leads.
Fibrin-bindefähige Substanzen wie Aminonaphthalin und Derivate davon, z. B. Amino-Naphthalinsulfonsäure, können ebenfalls die Wirkung von Denaturierungsmitteln verbessern.Fibrin-binding substances such as aminonaphthalene and Derivatives thereof, e.g. B. amino-naphthalenesulfonic acid also improve the effect of denaturants.
Als Referenzlösung wurde 2 mol/l KSCN und 20 mmol/l EDTA (Tabelle 3) bzw. 4 mol/l KS⁶N (Tabelle 4) eingesetzt. Aus den Tabellen 3 und 4 ist ersichtlich, daß die Zugabe von Amino- Naphthalinsulfonsäure (ANS) eine zusätzliche Verbesserung bewirkte. 2 mol / l KSCN and 20 mmol / l EDTA were used as reference solutions (Table 3) or 4 mol / l KS⁶N (Table 4) used. From the Tables 3 and 4 show that the addition of amino Naphthalene sulfonic acid (ANS) an additional improvement caused.
c) Die Vorbehandlung mit einer Kombination aus Dissoziations mittel (KSCN), Chelatbildner (EDTA), Salz (KCl) und Amino- Naphthalinsulfonsäure zeigte ebenfalls hervorragende Ergeb nisse.c) Pretreatment with a combination of dissociations medium (KSCN), chelating agent (EDTA), salt (KCl) and amino Naphthalenesulfonic acid also showed excellent results nits.
Claims (39)
- (a) einem Chelatbildner,
- (b) einem Salz ohne bzw. mit geringer dissoziierender Wirkung auf Fibrinmonomerkomplexe und
- (c) einer Fibrin-bindefähigen Substanz versetzt und die erhaltene Probenlösung inkubiert.
- (a) a chelating agent,
- (b) a salt with little or no dissociative effect on fibrin monomer complexes and
- (c) a fibrin-bindable substance is added and the sample solution obtained is incubated.
- (a) einem Chelatbildner,
- (b) einem Salz ohne bzw. mit geringer dissoziierender Wirkung auf Fibrinmonomerkomplexe und
- (c) einer Fibrin-bindefähigen Substanz enthält.
- (a) a chelating agent,
- (b) a salt with little or no dissociative effect on fibrin monomer complexes and
- (c) contains a fibrin-bindable substance.
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110579614A (en) * | 2019-10-30 | 2019-12-17 | 天津市宝坻区人民医院 | Chemical luminescence method kit formula for eliminating fibrinogen interference |
-
1996
- 1996-05-30 DE DE1996121728 patent/DE19621728A1/en not_active Withdrawn
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN110579614A (en) * | 2019-10-30 | 2019-12-17 | 天津市宝坻区人民医院 | Chemical luminescence method kit formula for eliminating fibrinogen interference |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, 68305 MANNHEIM, DE |
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8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |