DE19621572A1 - Localized cell death in plants - Google Patents

Localized cell death in plants

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Abstract

The invention relates to nucleic acid molecules for production of localised cell death in plants, and vectors containing said nucleic acid molecules. It also relates to plant cells and plants which are genetically modified by said nucleic acid molecules.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, eine Methode zur Erzeugung neuer Pflanzen, die eine neue DNA-Sequenz enthalten und bei Expression des in der DNA-Sequenz enthaltenen Gens einen lokalisierten Zelltod zeigen, diese neuen Pflanzen sowie die Verwendung der DNA-Sequenzen zur Erzeugung eines lokalisierten Zelltods in Pflanzen.The present invention relates to new DNA sequences, one Method of creating new plants that have a new DNA sequence included and when expressing the contained in the DNA sequence These new plants show a localized cell death gene and the use of the DNA sequences to generate a localized cell death in plants.

Pflanzen werden durchweg von verschiedensten Pathogenen attackiert. Ein besonderes Problem in Bezug auf den Angriff von Pflanzen durch Pathogene entsteht bei der heutigen Form der Landwirtschaft, die dadurch charakterisiert ist, daß aufgrund des großflächigen Anbaus von Monokulturen mittels züchterischer Methoden eingebrachte Resistenzen relativ rasch durch Muta­ tionen auf Seiten der Schädlinge überkommen werden.Plants are consistently of various pathogens attacked. A particular problem related to the attack from Plants caused by pathogens arise in today's form of  Agriculture, which is characterized in that due to the large-scale cultivation of monocultures by means of breeding Muta introduced resistance relatively quickly on the pest side.

Prinzipiell werden zwei Arten der Resistenz bei Pflanzen unter­ schieden, die vertikale und die horizontale Resistenz. Bei der vertikalen Resistenz handelt es sich in der Regel um eine Gen-für-Gen-Beziehung in dem Sinne, daß einem bestimmten Avirulenz­ gen des Pathogens ein bestimmtes Resistenzgen der Pflanze gegenübersteht. Dies bedeutet, daß die vertikale Resistenz in der Regel monogen ist und daher auch am leichtesten durch­ brochen wird. Die horizontale Resistenz wird nicht monogen vererbt, sondern in der Regel durch eine Reihe von Loci be­ stimmt. Die horizontale Resistenz führt zu keiner vollständigen Resistenz, wie dies die vertikale Resistenz vermag, ist jedoch in der Regel, da viele Loci involviert sind, dauerhafter.There are basically two types of resistance in plants differentiate, the vertical and the horizontal resistance. In the vertical resistance is usually one Gene-by-gene relationship in the sense that a certain avirulence a certain resistance gene of the plant against the pathogen faces. This means that the vertical resistance in is usually monogenic and therefore the easiest will break. The horizontal resistance does not become monogenic inherited, but usually be through a series of loci Right. The horizontal resistance does not lead to complete Resistance, however, is how vertical resistance is usually, since many loci are involved, more permanent.

Im Falle der vertikalen Resistenz, d. h. im Falle des Vorliegens eines Resistenzgens auf der Seite der Pflanze und eines Aviru­ lenzgens auf der Seite des Pathogens, äußert sich die Resistenz in dem Auftreten von lokalen Nekrosen, die mit einer hypersen­ sitiven Reaktion seitens der Pflanze einhergehen.In the case of vertical resistance, i.e. H. in the case of the existence a resistance gene on the side of the plant and an aviru resistance to the pathogen, resistance expresses itself in the appearance of local necrosis with hypersen plant reaction.

Obwohl die hypersensitive Reaktion, die im folgenden als "HR" bezeichnet wird, in ihren Einzelheiten nicht vollständig ver­ standen ist, ist es deutlich, daß die pflanzlichen Wirtszellen im Bereich der HR einen raschen Zelltod erleiden. Zum einen führt dieser rasche Zelltod zum Einschluß und damit zur Lokali­ sierung des Pathogens, zum anderen ist davon auszugehen, daß das Pathogen durch Radikale, die während der HR entstehen, geschädigt wird. Darüber hinaus führt eine HR in vielen Fällen zum Phänomen der sogenannten systemisch erworbenen Resistenz. Diese systemisch erworbene Resistenz wird allgemein nach der englischen Bezeichnung "systemic acquired resistance" als SAR bezeichnet.Although the hypersensitive response, hereinafter referred to as "HR" is not fully ver in its details stood, it is clear that the plant host cells suffer rapid cell death in the area of HR. On the one hand this rapid cell death leads to inclusion and thus to localization the pathogen, on the other hand it can be assumed that the pathogen caused by radicals that arise during HR, is damaged. In addition, HR leads in many cases on the phenomenon of so-called systemically acquired resistance. This systemically acquired resistance is generally based on the English term "systemic acquired resistance" as SAR  designated.

Die SAR stellt einen interessanten Spezialfall der pflanzlichen Resistenz gegenüber Pathogenen dar. Kennzeichnend ist dabei, daß eine Pflanze, die eine SAR aufgrund einer Infektion durch ein bestimmtes Pathogen aufweist, die erworbene Resistenz nicht nur gegenüber dem die SAR erzeugenden Pathogen besitzt, sondern gegenüber einem sehr viel breiteren Spektrum von Pathogenen.The SAR represents an interesting special case of herbal Resistance to pathogens. Characteristic is that a plant that has a SAR due to infection by shows a certain pathogen, the acquired resistance does not only against the pathogen that produces the SAR, but against a much broader spectrum of pathogens.

Insofern ist die SAR eine sehr erstrebenswerte Reaktion der Pflanze, da sie in vielen Fällen in einer breiten Resistenz mündet, welche einer horizontalen Resistenz nahekommt (vgl. z. B. Ryals et al (1992) SEB Symposium 49, 205-229).In this respect, the SAR is a very desirable response from the Plant, as in many cases it is of broad resistance flows which comes close to horizontal resistance (cf. e.g. B. Ryals et al (1992) SEB Symposium 49, 205-229).

Die Mechanismen, die zur Bildung der SAR führen, sind partiell verstanden. In vielen Fällen ist gezeigt worden, daß zur Aus­ bildung einer SAR eine lokale Nekrose von Zellen, verbunden mit einer HR notwendig ist. Eine Nekrose, die allein das Ergebnis einer Verwundung darstellt, oder aufgrund von anderen abio­ tischen Stressoren induziert wird, ist in der Regel nicht ausreichend zur Erzeugung einer SAR. Desweiteren ist gezeigt worden, daß in vielen Fällen die SAR mit einem erhöhten Niveau an Salicylsäure korreliert (vgl. z. B. Metraux et al (1990) Science 250, 1004-1006; Malamy et al (1990) Science 250, 1002-1004). Dies ist auch dadurch gezeigt worden, daß exogene Salicylsäure, wenn sie zu nicht-infizierten Pflanzen gegeben wird, eine SAR induzieren kann (vgl. z. B. White (1979) Virology 99, 410-412; Palva et al (1994) Molecular Plant-Microb. Interactions 7, 356-363). Desweiteren ist beobachtet worden, daß in transgenen Pflanzen, in denen über die Expression einer bakteriellen Salicylat-Hydroxylase die Salicylsäuremenge verringert wurde, keine SAR ausgebildet werden kann (Gaffney et al (1993) Science 261, 754-756). Die SAR kann auch durch eine Reihe von anderen Chemikalien, wie z. B. 2,6-Dichlor- Isonikotinsäure induziert werden (Uknes et al (1992), The Plant Cell 4, 645-656). The mechanisms that lead to the formation of SAR are partial Roger that. In many cases it has been shown that to SAR formation is a local necrosis of cells associated with an HR is necessary. A necrosis that alone results represents a wound, or due to other abio table stressors is usually not sufficient to generate a SAR. It is also shown that in many cases the SAR has an elevated level correlated to salicylic acid (see e.g. Metraux et al (1990) Science 250, 1004-1006; Malamy et al (1990) Science 250, 1002-1004). This has also been shown by the fact that exogenous Salicylic acid when added to non-infected plants can induce a SAR (see e.g. White (1979) Virology 99, 410-412; Palva et al (1994) Molecular Plant-Microb. Interactions 7, 356-363). Furthermore, it has been observed that in transgenic plants in which the expression of a bacterial salicylate hydroxylase the amount of salicylic acid was reduced, no SAR can be trained (Gaffney et al (1993) Science 261, 754-756). The SAR can also go through a number of other chemicals, such as B. 2,6-dichloro- Isonicotinic acid can be induced (Uknes et al (1992), The Plant Cell 4, 645-656).  

In der Literatur sind bisher verschiedene Systeme beschrieben worden, die zu einem lokalisierten Zelltod führen. Beispiele dafür sind die Expression einer bakteriellen Ribonuklease in transgenen Pflanzen (Strittmatter et al (1995) Biotechnology 13, 1085-1089). Ein weiteres System ist die gleichzeitige Expression von Resistenzgenen aus einer Wirtspflanze und korrespondierenden Avirulenzgenen aus Pathogenen (WO 91/15585). Ein spezifisches Beispiel ist die Expression des Avr9-Gens aus dem Pilz Cladosporium fulvum und des Cf-9-Gens aus Tomate (WO 95/31564; für eine Übersicht vgl. auch de Witt (1992) Annual Review in Plant Pathology 30, 301-418, zur Benennung weiterer für eine solche Problemlösung in Frage kommender Avirulenz- und Resistenzgene). In WO 95/31564 wird in all­ gemeiner Art beschrieben, daß die Nukleotidsequenz oder -sequenzen, welche im Zusammenhang mit lokalisiertem Zelltod und der Erzeugung von SAR beschrieben werden, ein oder mehrere Gene umfassen können, wobei das spezifische Ausführungsbeispiel das Resistenzgen Cf-9 und das Avirulenzgen Avr9 beschreibt.Various systems have been described in the literature to date that lead to localized cell death. Examples for this are the expression of a bacterial ribonuclease in transgenic plants (Strittmatter et al (1995) Biotechnology 13, 1085-1089). Another system is the simultaneous Expression of resistance genes from a host plant and corresponding avirulence genes from pathogens (WO 91/15585). A specific example is the expression of the Avr9 gene the fungus Cladosporium fulvum and the Cf-9 gene from tomato (WO 95/31564; for an overview see also de Witt (1992) Annual Review in Plant Pathology 30, 301-418, for designation further one for such a problem solving Avirulence and resistance genes). In WO 95/31564 in all generally described that the nucleotide sequence or sequences, which are associated with localized cell death and the generation of SAR are described, one or more Genes may include the specific embodiment describes the resistance gene Cf-9 and the avirulence gene Avr9.

Als weitere Beispiele für die Verwendung einer Nukleotidsequenz oder die Kombination von Nukleotidsequenzen, die zu einer Pflanzenzellennekrosis und einer SAR führen, werden in WO 95/31564 folgende mögliche Ansätze genannt: ein Ubiquitin­ konjugierenden Enzym, das Gen-VI-Protein aus Cauliflower Mosaic Virus, ein virales Coat-Protein in gleichzeitiger Gegenwart eines entsprechenden pflanzlichen Resistenzgens, ein bakteriel­ les Hairpin-Protein, das N′-Gen aus Tabak, das Kartoffelvirus- Hüllprotein und die avirulente Dominante, sowie verschiedene Resistenz- und Avirulenzgen-Kombinationen (z. B. Cf-2 aus Tomate und Avr2 aus C. fulvum, Cf-4 aus Tomate und Avr4 aus C. fulvum). Desweiteren werden eine RNAse, das Diphterietoxin sowie Protonenpumpen wie bakterielle Protonenpumpen genannt.As further examples of the use of a nucleotide sequence or the combination of nucleotide sequences that lead to a Plant cell necrosis and a SAR result in WO 95/31564 called the following possible approaches: an ubiquitin conjugating enzyme, the gene VI protein from Cauliflower Mosaic Virus, a simultaneous presence of a viral coat protein a corresponding plant resistance gene, a bacterial les Hairpin protein, the N'-gene from tobacco, the potato virus Coat protein and the avirulent dominant, as well as various Resistance and avirulence gene combinations (e.g. Cf-2 from tomato and Avr2 from C. fulvum, Cf-4 from tomato and Avr4 from C. fulvum). Furthermore, an RNAse, the diphtheria toxin as well as proton pumps such as bacterial proton pumps.

Wie bereits oben beschrieben, ist die SAR ein sehr attraktives Resistenzphänomen. Das Problem besteht jedoch darin, daß die SAR züchterisch bisher nicht behandelt werden konnte, da vermutlich zu viele Loci involviert und/oder die Genprodukte nicht bekannt sind. Es ist somit eine der Aufgaben der biotech­ nologischen Forschung, alternative Wege sowohl für einen lokalisierten Zelltod als auch die damit häufig einhergehende SAR aufzuzeigen.As already described above, the SAR is a very attractive one Resistance phenomenon. The problem, however, is that the  SAR could not yet be treated in breeding because probably too many loci involved and / or the gene products are not known. It is therefore one of the tasks of biotech biological research, alternative ways for both localized cell death as well as the often associated To show SAR.

Es ist eine wichtige Aufgabe der Erfindung, neue Nukleinsäure­ sequenzen bzw. Proteine bereitzustellen, mit deren Hilfe in Pflanzen oder Pflanzenzellen ein lokalisierter Zelltod und ggf. zusätzlich eine systemisch erworbene Resistenz (SAR) ausgelöst werden können. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, neue Nukleinsäuremoleküle zu liefern, die dazu dienen können, in Pflanzen männliche Sterilität zu erzeugen. Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschrei­ bung.It is an important object of the invention to create new nucleic acid to provide sequences or proteins with the help of Plants or plant cells a localized cell death and possibly systemically acquired resistance (SAR) was also triggered can be. Another object of the invention is in delivering new nucleic acid molecules that serve can produce male sterility in plants. Further Objects of the invention result from the following description exercise.

Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche, insbesondere basierend auf der Bereitstellung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, deren Expression in Pflanzen ein lokalisiertes Absterben von Pflanzenzellen bewirkt, gelöst.These tasks are covered by the subjects of the independent Claims, in particular based on the provision of the DNA sequences according to the invention, their expression in plants localized death of plant cells causes resolved.

Wir haben überraschend gefunden, daß bestimmte Nukleinsäurese­ quenzen gezielt zur Auslösung des lokalisierten Zelltods einge­ setzt werden können, indem sie die Erzeugung eines Proteins oder Proteinfragments auslösen, dessen enzymatische Aktivität den Zelltod bewirkt. Insbesondere haben wir experimentell zei­ gen können, daß die Expression einer Nukleinsäuresequenz aus Erwinia amylovora, die für eine sekretierte Form einer Levan­ sucrase kodiert, in Pflanzen zur Ausbildung einer HR führt, die des weiteren mit dem Auftreten einer SAR gekoppelt sein kann.We have surprisingly found that certain nucleic acids sequences targeted to trigger localized cell death can be set by producing a protein or trigger protein fragments, its enzymatic activity causes cell death. In particular, we have experimentally gene that expression of a nucleic acid sequence Erwinia amylovora, which is responsible for a secreted form of a Levan encoded, leads to the formation of HR in plants, which can also be coupled with the occurrence of a SAR.

Ebenso konnte das Auftreten von Nekrosen bei Expression eines Invertase-Gens aus Saccharomyces cerevisiae in transgenen Pflanzen beobachtet werden. In diesem Fall wurde die Sekretion des Genprodukts aus der Pflanzenzelle durch Fusion der für die Invertase kodierenden Region mit N-terminalen Signalsequenzen des Proteinase-Inhibitor II-Proteins aus Solanum tuberosum ermöglicht.The occurrence of necrosis when expressing a Invertase gene from Saccharomyces cerevisiae in transgenic Plants are observed. In this case, the secretion of the gene product from the plant cell by fusion of the for the  Invertase coding region with N-terminal signal sequences of the proteinase inhibitor II protein from Solanum tuberosum enables.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine oder Fragmente davon kodieren, die bei Expression zum Absterben der Zelle führen. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle um Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine mit der biologischen Aktivität einer Fructosyltransferase oder eines biologisch aktiven Fragments davon kodieren. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Nukleinsäuresequenz um eine Nukleinsäuresequenz, die für Proteine mit der biologischen Aktivität einer sekretierten Levansucrase oder eines biologisch aktiven Fragments davon kodiert.The present invention thus relates to nucleic acid molecules which code for proteins or fragments thereof, which in Expression lead to cell death. In a preferred one Embodiment is the invention Nucleic acid molecules around nucleic acid molecules that are used for proteins with the biological activity of a fructosyltransferase or encode a biologically active fragment thereof. In a particularly preferred embodiment is the Nucleic acid sequence around a nucleic acid sequence which is for Proteins with the biological activity of a secreted Levansucrase or a biologically active fragment thereof encoded.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine mit der biologischen Aktivität einer sekretierten Invertase oder eines biologisch aktiven Fragments davon kodieren.In a further particularly preferred embodiment are nucleic acid molecules that are used for proteins with the biological activity of a secreted invertase or one encode biologically active fragments thereof.

Biologisch aktives Fragment bedeutet im Zusammenhang mit dieser Erfindung, daß die vermittelte biologische Aktivität zur Erzeugung eines Zelltods ausreicht.Biologically active fragment means in connection with this Invention that the mediated biological activity for Generation of cell death is sufficient.

Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase kodieren, sind aus verschiedenen Organismen beschrieben worden, so z. B. aus, Bacillus amylo­ liauefaciens (Tang et al. (1990) Gene 96, 89-93), Bacillus subtilis (Fonet et al. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 119, 795-800), Erwinia amylovora (Geier und Geider (1993) Physiol. Mol. Plant Pathol. 42, 387-404).Nucleic acid sequences necessary for proteins with the enzymatic Encoding activity of a Levansucrase are different Organisms have been described, e.g. B. from, Bacillus amylo liauefaciens (Tang et al. (1990) Gene 96, 89-93), Bacillus subtilis (Fonet et al. (1984) Biochem. Biophys. Res. Commun. 119, 795-800), Erwinia amylovora (Geier and Geider (1993) Physiol. Mol Plant Pathol. 42, 387-404).

Besonders bevorzugt beinhaltet ein erfindungsgemäßes Nuklein­ säuremolekül die im Ausführungsbeispiel 1 benannte kodierende Region aus Erwinia amylovora.A nucleic acid according to the invention particularly preferably contains acid molecule which encodes in Example 1  Region from Erwinia amylovora.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäure­ moleküle, deren Sequenzen sich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes von Sequenzen der o.g. Nukleinsäuremoleküle unterscheiden und die für ein Protein oder ein Fragment davon kodieren, das die biologische Aktivität einer sekretierten Levansucrase aufweist.The present invention further relates to nucleic acid molecules whose sequences differ due to the degeneration of the genetic codes of sequences of the above Nucleic acid molecules differ and that for a protein or fragment thereof encode the biological activity of a secreted Levansucrase exhibits.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können beliebige Nukleinsäuremoleküle sein, insbesondere DNA- oder RNA-Moleküle, beispielsweise cDNA, genomische DNA, mRNA etc. Sie können natürlich vorkommende oder durch gentechnische oder chemische Syntheseverfahren hergestellte Moleküle sein.The nucleic acid molecules according to the invention can be any Be nucleic acid molecules, in particular DNA or RNA molecules, for example cDNA, genomic DNA, mRNA etc. You can naturally occurring or by genetic engineering or chemical Molecules produced synthetic processes.

Erfindungsgemäß sind die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Transkription und Translation in der Pflanzenzelle gewähr­ leisten. Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnologischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie eine neue, einen lokalen Zelltod bewirkende enzymatische Aktivität aufweisen.According to the invention, the nucleic acid molecules of the present Invention linked to regulatory elements that the Ensure transcription and translation in the plant cell Afford. By providing the invention Nucleic acid molecules now have the option of being vegetable Cells using genetic engineering methods change that they cause a new, local cell death have enzymatic activity.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß der lokale Zelltod in Pflanzen unter Verwendung der erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuresequenzen ggf. gezielt ausgelöst werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform steht die Nuklein­ säuresequenz, die für die den lokalen Zelltod verantwortliche enzymatische Aktivität kodiert, unter der Kontrolle pathogen­ induzierter Promotoren. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung liegt die Nukleinsäuresequenz in Kombination mit dem prp1-1-Promotor aus Kartoffel vor.A particular advantage of the invention is that the local cell death in plants using the Invention appropriate nucleic acid sequences are optionally triggered can. In a preferred embodiment, the nucleus is acid sequence that is responsible for local cell death encoded enzymatic activity, pathogenic under control induced promoters. In a particularly preferred The nucleic acid sequence is in combination with the prp1-1 promoter from potato.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen beinhalten die Kombination der für den Zelltod verantwortlichen Nukleinsäuresequenz mit in Pflanzen aktiven gewebe- oder entwicklungsspezifischen Promo­ toren. Besonders bevorzugt ist ein Nukleinsäuremolekül, in dem die kodierende Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines antheren- oder tapetumspezifischen Promotors steht.Other preferred embodiments include the combination the nucleic acid sequence responsible for cell death with in  Plant active tissue or development specific promo goals. A nucleic acid molecule in which the coding nucleic acid sequence under the control of a anther or wallpaper specific promoter.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Vektoren und Mikroorganismen zu liefern, deren Verwendung die Herstellung neuer Pflanzen, in denen ein lokalisierter Zelltod erzeugt werden kann, ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch die Bereit­ stellung der erfindungsgemäßen Vektoren und Mikroorganismen gelöst, die die den lokalen Zelltod verursachenden neuen Nukleinsäuresequenzen enthalten.Another object of the invention is to use vectors and To deliver microorganisms, the use of which is the manufacture new plants in which localized cell death produces can be made possible. This task is done by the ready position of the vectors and microorganisms according to the invention resolved the new ones causing local cell death Contain nucleic acid sequences.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch Vektoren, insbe­ sondere Plasmide, Cosmide, Viren, Bakteriophagen und andere in der Gentechnik gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten und gegebenen­ falls für den Transfer der erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ moleküle auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen eingesetzt werden können.The present invention thus also relates to vectors, in particular special plasmids, cosmids, viruses, bacteriophages and others in Genetic engineering common vectors that described above Contain and given nucleic acid molecules according to the invention if for the transfer of the nucleic acid according to the invention molecules are used on plants or plant cells can.

Ebenso betrifft die Erfindung transformierte Mikroorganismen, wie Bakterien, Viren, Pilze, die die erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenzen enthalten.The invention also relates to transformed microorganisms, such as bacteria, viruses, fungi, the nucleic acids according to the invention contain acid sequences.

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen Elementen, die die Transkription und Translation in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen gewährleisten.In a preferred embodiment, those are in the vectors contained nucleic acid molecules linked to regulatory Elements related to transcription and translation ensure prokaryotic and eukaryotic cells.

Gegebenenfalls können die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung durch Enhancer-Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen ergänzt sein. Diese regulatorischen Sequenzen beinhalten z. B. auch Signalsequenzen, die für den Transport des Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen. Optionally, the nucleic acid sequences of the invention through enhancer sequences or other regulatory sequences be supplemented. These regulatory sequences include e.g. B. also signal sequences necessary for the transport of the gene product a certain compartment.  

Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung neue Pflanzen bereit­ zustellen, die sich durch einen lokalen Zelltod auszeichnen, der ggf. mit dem Erwerb einer SAR gekoppelt ist. Eine weitere Aufgabe besteht darin, Pflanzen zu liefern, die männlich steril sind.It is also an object of the invention to prepare new plants deliver that are characterized by local cell death, which may be linked to the acquisition of a SAR. Another The task is to deliver plants that are male sterile are.

Diese Aufgaben werden durch die Übertragung der erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuremoleküle und ihre Expression in Pflanzen, die ggf. gezielt gesteuert werden kann, gelöst.These tasks are accomplished by transferring the invention appropriate nucleic acid molecules and their expression in plants, which can be controlled in a targeted manner if necessary.

Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ moleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer Methoden dahingehend zu verändern, daß sie im Vergleich zu Wildtypzellen eine neue enzymatische Aktivität aufweisen, und es als Folge davon zu lokalem Zelltod kommt.By providing the nucleic acid according to the invention Molecules now have the ability to plant cells to change by means of genetic engineering methods that they have a new enzymatic compared to wild-type cells Exhibit activity, and as a result, local cell death is coming.

In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich daher bei den erfindungsgemäßen Wirtszellen um pflanzliche Zellen, die aufgrund der Gegenwart und Expression eines zusätzlich einge­ führten erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen eine neue enzymatische Aktivität aufweisen, die für einen lokalen Zelltod verantwortlich ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um transgene pflanzliche Zellen, die eine neue Levansucrase oder Invertase aufweisen.In a preferred embodiment, therefore the host cells according to the invention are plant cells which due to the presence and expression of an additional one compared to the inventive nucleic acid molecule non-transformed cells have a new enzymatic activity which is responsible for local cell death. In a particularly preferred embodiment is transgenic plant cells that have a new levan sucrase or Have invertase.

Alternativ kann die neue enzymatische Aktivität, die den Zelltod bedingt, als selbstreplizierendes System in die Zelle eingebracht werden.Alternatively, the new enzymatic activity that the Cell death results in a self-replicating system in the cell be introduced.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls transgene Pflanzen, die die oben beschriebenen transgenen Pflanzenzellen, in denen die neuen Nukleinsäuremolelüle integriert in das pflanzliche Genom vorliegen, enthalten. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Pflanzen, in deren Zellen die erfindungsgemäße Nukleinsäure­ sequenz in selbstreplizierender Form vorliegt, d. h. die Pflanzenzelle enthält die fremde DNA auf einem eigenständigen Nukleinsäuremolekül.The invention also relates to transgenic plants which the transgenic plant cells described above, in which the new nucleic acid molecules integrated into the plant genome are present. The invention also relates to Plants in whose cells the nucleic acid according to the invention  sequence is in self-replicating form, d. H. the Plant cell contains the foreign DNA on an independent Nucleic acid molecule.

Bei den Pflanzen, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ molekülen transformiert sind und in denen aufgrund der Einführung eines solchen Moleküls ein für einen lokalisierten Zelltod verantwortliches Protein synthetisiert wird, kann es sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder dikotyle Nutzpflanze. Beispiele für monokotyle Pflanzen sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) gehören. Bei den dicotylen Nutzpflanzen sind u. a. zu nennen Baumwolle, Leguminosen, wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen, Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis sein. Besonders bevorzugt sind die Getreide, Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, Zucker­ rübe, Raps, Soja, Tomate und Kartoffel.In the plants with the nucleic acid according to the invention molecules are transformed and in which due to the Introduction of such a molecule one for a localized one Protein responsible for cell death is synthesized, it can are basically any plant. Preferably it is a monocot or dicot crop. examples for monocotyledonous plants are the plants belonging to the genera Avena (oats), Triticum (wheat), Secale (rye), Hordeum (Barley), oryza (rice), panicum, pennisetum, setaria, sorghum (Millet), Zea (corn) belong. With dicotyledonous crops are u. a. to name cotton, legumes, like legumes and in particular alfalfa, soybean, rapeseed, tomato, sugar beet, Potato, ornamental plants, trees. More crops can Fruit (especially apples, pears, cherries, grapes, Citrus, pineapple and bananas), oil palms, tea, cocoa and Coffee bushes, tobacco, sisal and medicinal plants Rauwolfia and be digital. Cereals are particularly preferred, Wheat, rye, oats, barley, rice, corn and millet, sugar turnip, rapeseed, soy, tomato and potato.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstöcke etc., wobei dieses Ver­ mehrungsmaterial gegebenenfalls oben beschriebene transgene Pflanzenzellen enthält, sowie Teile dieser Pflanzen wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.The invention also relates to propagation material from plants according to the invention, for example seeds, fruits, Cuttings, tubers, rhizomes etc., this ver propagation material optionally described above transgenes Contains plant cells, as well as parts of these plants such as Protoplasts, plant cells and calli.

Die Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen, die aufgrund der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle eine im Vergleich zu Pflanzen, die die Nukleinsäuremoleküle nicht enthalten, erhöhte Salicylsäurekonzentration aufweisen. Weiter betrifft die Erfindung Pflanzen, die sich im Vergleich zu Pflanzen, die die neuen Nukleinsäuremoleküle nicht enthalten, durch eine erhöhte Krankheitsresistenz auszeichnen.The invention also relates to plants which, owing to the Expression of the nucleic acid molecules according to the invention Compared to plants that don't have the nucleic acid molecules contain, have increased salicylic acid concentration. The invention further relates to plants that are compared  to plants that the new nucleic acid molecules don't included, characterized by increased disease resistance.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um Pflanzen, die aufgrund der Expression eines Levansucrase- Gens aus E. amylovora oder eines Invertase-Gens aus Hefe, einen lokalen Zelltod zeigen, der ggf. mit der Ausprägung einer SAR einhergeht.In a particularly preferred embodiment, it is for plants that are due to the expression of a levan sucrase Gene from E. amylovora or an invertase gene from yeast, one show local cell death, possibly with the form of a SAR goes along.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Pflanzen, die durch die Expression eines der erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ moleküle männlich steril sind.The present invention also relates to plants which by the expression of one of the nucleic acids according to the invention molecules are male sterile.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirts­ zellen, insbesondere prokaryontische und eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen Nukleinsäuremolekül oder einem Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, und Zellen, die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien oder Pilzzellen sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.In a further embodiment, the invention relates to hosts cells, especially prokaryotic and eukaryotic cells, those with a nucleic acid molecule described above or a Vector were transformed or infected, and cells by such host cells and the described Contain nucleic acid molecules or vectors. The host cells can be bacteria or fungal cells as well as vegetable or be animal cells.

Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die sich durch einen lokalen Zelltod auszeichnen, bereitzustellen.The present invention is also based on the object Process for the production of plants characterized by a distinguish local cell death.

Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer Pflanzen, die einen lokalisierten Zelltod zeigen und die gegebenenfalls zusätzlich durch den Erwerb einer SAR gekennzeichnet sind, sowie Pflanzen, die aufgrund des lokalierten Zelltods männlich steril sind, möglich ist.This problem is solved by methods with the help of which Generation of new plants that cause localized cell death show and, if necessary, additionally by acquiring a SAR are marked, as well as plants that are due to the localized cell deaths are male sterile, is possible.

Zur Erzeugung solcher neuer Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die neuen Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert werden, d. h. daß stabile Transformanten erzeugt werden. Zum anderen kann ein erfindungs­ gemäßes Nukleinsäuremolekül, dessen Expression in der Pflanzen­ zelle das Absterben der Zelle bewirkt, in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstreplizierendes System enthalten sein. So können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle z. B. in einem Virus enthalten sein, mit dem die Pflanze bzw. Pflanzenzelle in Kontakt kommt.There are various ways to create such new plants Methods. On the one hand, plants or plant cells can With the help of conventional genetic engineering transformation methods  be changed so that the new nucleic acid molecules in the plant genome is integrated, d. H. that stable Transformants are generated. Second, an invention appropriate nucleic acid molecule, its expression in the plants cell causes cell death in the plant cell or the plant as a self-replicating system be. Thus, the nucleic acid molecules according to the invention can be used e.g. B. contained in a virus with which the plant or Plant cell comes into contact.

Erfindungsgemäß werden Pflanzenzellen, die aufgrund der Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz eine neue, einen Zelltod bewirkende Aktivität besitzen, durch ein Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfaßt:According to the invention, plant cells, which are due to the Expression of a nucleic acid sequence according to the invention have new activity causing cell death by a Process prepared comprising the following steps:

  • a) Herstellung einer Expressionskassette, die folgende DNA- Sequenzen umfaßt:a) Production of an expression cassette which contains the following DNA Sequences include:
  • - einen Promotor, der die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleistet;- a promoter that translates into ensures plant cells;
  • - mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäure­ sequenz, die für ein Protein oder ein Fragment davon kodiert, dessen enzymatische Aktivität in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod bewirkt, wobei die Nukleinsäuresequenz in Sense-Orientierung an das 3′-Ende des Promotors gekoppelt ist; und- At least one nucleic acid according to the invention sequence for a protein or fragment encoded thereof, whose enzymatic activity in Planting causes localized cell death, whereby the nucleic acid sequence in sense orientation the 3'-end of the promoter is coupled; and
  • - gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript, das an das 3′-Ende der kodierenden Region gekoppelt ist.- If necessary, a termination signal for the Termination of transcription and addition of a poly A tail to the corresponding one Transcript encoding at the 3′-end Region is coupled.
  • b) Transformation pflanzlicher Zellen mit der in Schritt a) hergestellten Expressionskassette.b) Transformation of plant cells with that in step a) produced expression cassette.
  • c) Regeneration transgener Pflanzen und gegebenenfalls die Vermehrung der Pflanzen.c) regeneration of transgenic plants and possibly the Propagation of plants.

Alternativ kann eine oder mehrere erfindungsgemäße Nuklein­ säuresequenzen als selbstreplizierendes System in die Pflanzen­ zelle bzw. Pflanze eingebracht werden.Alternatively, one or more nuclei according to the invention acid sequences as a self-replicating system in the plants cell or plant are introduced.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und der durch sie kodierten Proteine aufzuzeigen.Another object of the invention is to use the nucleic acid sequences according to the invention and that by them to show coded proteins.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäßen Verwendungen der neuen DNA-Moleküle zur Erzeugung von Pflanzen, die sich durch einen lokalisierten Zelltod und ggf. durch eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Krankheitsresistenz auszeichnen, gelöst.This object is achieved by the uses of the invention new DNA molecules to create plants that stand out localized cell death and possibly by comparison Characterize increased disease resistance to wild type, solved.

Des weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zur Erzeugung von Pflanzen, die männliche steril und somit besonders geeignet für die Hybridzüchtung sind.Furthermore, the invention relates to the use of Nucleic acid sequences according to the invention for generating Plants that are male sterile and therefore particularly suitable for are hybrid breeding.

Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls die Verwendung des prp1-1-Promotors zur Erzeugung von Pflanzen, bei denen ein lokalisierter Zelltod auftritt und insbesondere induziert werden kann.The invention also relates to the use of the prp1-1 promoter for the production of plants in which a localized cell death occurs and in particular induced can be.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Levansucrase-Gens oder eines Invertase-Gens zur Erzeugung von Pflanzen, die sich durch einen lokalisierten Zelltod auszeichnen.The invention also relates to the use of a Levansucrase gene or an invertase gene for generating Plants that are characterized by localized cell death award.

Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase oder einer Invertase, um in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod hervorzurufen.The invention further relates to the use of a protein the enzymatic activity of a levan sucrase or a Invertase to localize cell death in plants to evoke.

Die vorliegende Erfindung umfaßt somit jede mögliche Form des Einsatzes der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, deren Expression in Pflanzen das Absterben von Zellen bewirkt, sowie des Einsatzes der erfindungsgemäßen Proteine oder Fragmente davon, deren enzymatische Aktivität den Zelltod herbeiführen.The present invention thus encompasses every possible form of Use of the nucleic acid molecules according to the invention, their  Expression in plants causes cell death, as well the use of the proteins or fragments according to the invention of which the enzymatic activity causes cell death.

Für den genannten Promotor kommt im Prinzip jeder in den für die Transformation gewählten Pflanzen funktionale Promotor in Betracht, der die Bedingung erfüllt, daß die von ihm regulierte Expression zu einer lokalisierten Nekrose führt und die Pflanze nicht zu großflächig zum Absterben bringt. Besonders sinnvoll erscheinen hierfür Promotoren, die spezifisch bei Befall durch Pathogene lokal induziert werden. Dabei schließt der Begriff Pathogen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Pilze, Bakterien, Viren, Insekten sowie Nematoden ein. Solche Promotoren sind bekannt und in der Literatur beschrieben, vgl. z. B. Martini et al (1993) Molecular and General Genetics 236, 179-186, oder WO 94/17194. Wenn solche Promotoren nicht bekannt sind, so ist das Konzept zur Isolierung solcher Promotoren dem Fachmann bekannt. Dabei werden in einem ersten Schritt aus einem Gewebe, welches von einem bestimmten Pathogen befallen ist, die poly(A)⁺ RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA-Klonen, die auf poly(A)⁺ RNA-Molekü­ len aus einem nicht-infizierten Gewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)⁺ RNA-Moleküle lediglich bei Befall durch das Pathogen induziert werden. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNA′s Promotoren isoliert, die sodann für die Expression der hier beschriebenen kodieren­ den Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können.In principle, everyone comes into the for the promoter mentioned the transformation chosen plants in functional promoter Consideration that meets the condition that the one he regulates Expression leads to localized necrosis and the plant does not die off too extensively. Particularly useful For this purpose promoters appear that are specific when infested by Pathogens can be induced locally. The term closes Pathogen in the context of the present invention fungi, bacteria, Viruses, insects and nematodes. Such promoters are known and described in the literature, cf. e.g. B. Martini et al (1993) Molecular and General Genetics 236, 179-186, or WO 94/17194. If such promoters are not known, it is Concept for isolating such promoters is known to the person skilled in the art. In a first step, a tissue, which is infected by a certain pathogen, the poly (A) ⁺ RNA isolated and a cDNA library was created. In a second step are generated with the help of cDNA clones based on poly (A) ⁺ RNA molecules len based on a non-infected tissue, from the first Bank uses hybridization to identify those clones their corresponding poly (A) ⁺ RNA molecules only at Infestation can be induced by the pathogen. Then be isolated with the help of these cDNA's promoters identified in this way, which then code for the expression of those described here the nucleic acid sequences can be used.

Eine Alternative zur Erreichung des Ziels, daß die Pflanze in vielen Bereichen aufgrund der Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle einen lokalisierten Zelltod aufweist, besteht darin, einen konstitutiven Promotor zu verwenden, diesen Promotor aber von der kodierenden Sequenz der erfin­ dungsgemäßen DNA-Moleküle durch die Insertion eines trans­ posablen Elements (Transposon) zu trennen. Von Transposons ist bekannt, daß sie in somatischen Geweben exzisieren. Solche Exzisionen führen dazu, daß Promotor und kodierende Sequenz in direkten Kontakt gebracht werden und führen somit zur Bildung der für den lokalisierten Zelltod verantwortlichen enzymatischen Aktivität. Transposons sind in der Literatur beschrieben und kloniert und stehen in reicher Auswahl zur Verfügung, wie z. B. Ac/Ds (Aktivator/Dissoziation- Transposonfamilie), En/Spm aus Mais (Enhancer/Suppressor­ mutator-Transposonfamilie; vgl. Düring and Sarlinger (1986) Ann. Rev. Genet. 20, 175 für eine Übersicht).An alternative to achieving the goal that the plant in many areas due to the expression of the invention Nucleic acid molecules has localized cell death, is to use a constitutive promoter this promoter but from the coding sequence of the inventions DNA molecules according to the invention by inserting a trans separable positive elements (transposon). From transposons is  known to excite in somatic tissues. Such Excisions lead to promoter and coding sequence in be brought into direct contact and thus lead to education those responsible for localized cell death enzymatic activity. Transposons are in the literature described and cloned and are available in rich selection Available, such as B. Ac / Ds (activator / dissociation- Transposon family), En / Spm from maize (enhancer / suppressor mutator transposon family; see. During and Sarlinger (1986) Ann. Rev. Genet. 20, 175 for an overview).

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Erzeugung eines lokalen Zelltodes kann neben der beschriebenen Anwendung zur Erzeugung einer systemisch erworbenen Resistenz (SAR) gegenüber Pathogenen und somit zur Erzeugung von Pflanzen, die sich durch eine erhöhte Krankheitsresistenz auszeichnen, auch zur Erzeugung von männlich sterilen Pflanzen genutzt werden. Männlich sterile Pflanzen spielen in der Pflanzenzüchtung, insbesondere in der Hybridzüchtung, eine bedeutende Rolle. Zu diesem Zweck wird die für die den Zelltod verursachende enzymatische Aktivität kodierende Nukleinsäure­ sequenz mit einem antheren- oder tapetumspezifischen Promotor gekoppelt. Beispiele für solche Promotoren werden z. B. in WO92/13956 und WO92/13957 genannt. Dies führt zum Absterben der Antheren und damit zur Unterbindung der Pollenbildung. Ein Restorer-Gen, das mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz gemeinsam verwendet werden kann, würde die den Zelltod bewirkende enzymatische Aktivität unterdrücken. So wurde z. B. bei der Verwendung der für eine Levansucrase kodierenden Region die Bildung des Produkts, dies bedeutet des Levans, durch eine gleichzeitige Expression einer Levanase im Zellraum beeinflußt werden. Alternativ wurde die Expression eines entsprechenden Antisense-Konstrukts die den lokalisierten Zelltod verursachen­ de enzymatische Aktivität aufgrund einer Antisense-Suppression beeinflussen. Ebenso könnte die Expression der erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuremoleküle und damit die daraus resultierende zelltötende Aktivität durch das Phänomen der Cosuppression durch das zusätzliche Einbringen von Sense-Konstrukten in die Pflanzenzelle beeinflußt werden.The use of the nucleic acid molecules according to the invention for Local cell death can be generated in addition to that described Use to create systemically acquired resistance (SAR) against pathogens and thus for the generation of Plants that are characterized by increased disease resistance award, also for the production of male sterile plants be used. Male sterile plants play in the Plant breeding, especially in hybrid breeding, a significant role. For this purpose the cell death Nucleic acid encoding causative enzymatic activity sequence with an anther or wallpaper specific promoter coupled. Examples of such promoters are e.g. B. in WO92 / 13956 and WO92 / 13957. This leads to the death of the Anthers and thus to prevent pollen formation. On Restorer gene with the nucleic acid sequence according to the invention can be used together, which would result in cell death suppress enzymatic activity. So z. B. when using the region coding for a levan sucrase the formation of the product, that is, the Levan, by a simultaneous expression of a levanase in the cell space is affected will. Alternatively, the expression of a corresponding Antisense construct that cause localized cell death de enzymatic activity due to antisense suppression influence. Likewise, the expression of the Invention appropriate nucleic acid molecules and thus the resulting  cell killing activity by the phenomenon of cosuppression through the additional introduction of sense constructs into the Plant cell are affected.

Desweiteren können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen zusammen mit Promotoren verwendet werden, die in Pflanzen durch abiotische Stimuli, wie z. B. Chemikalien, Ozon, UV-Strahlung, extreme Temperaturen, Trockenheit, Salz, induziert werden. Beispiele für solche Promotoren finden sich in der Literatur, so z. B. in Williams et al. (1992) Biotechnology 10, 540.Furthermore, the nucleic acid sequences according to the invention used together with promoters used in plants abiotic stimuli such as B. chemicals, ozone, UV radiation, extreme temperatures, dryness, salt. Examples of such promoters can be found in the literature, so z. B. Williams et al. (1992) Biotechnology 10, 540.

Es besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß die für den lokalen Zelltod verantwortliche enzymatische Aktivität in jedem beliebigen Kompartiment der pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Form des Proteins oder eines Fragments davon gewählt, die im extra­ zellulären Raum, d. h. im Apoplast, lokalisiert ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die kodierende Sequenz der Levansucrase verwendet, wie sie aus Erwinia amylovora isoliert worden ist.There is basically the possibility that the for the local cell death responsible enzymatic activity in each any compartment of the plant cell can. In a preferred embodiment, the shape of the Protein or a fragment thereof chosen in the extra cellular space, d. H. in the apoplast, is localized. In a particularly preferred embodiment is the coding Sequence of levansucrase used as derived from Erwinia amylovora has been isolated.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Invertase-Gen aus S. cerevisiae als Fusion mit Signalsequenzen, die die Sekretion des Genprodukts aus dem Zell inneren gewährleistet, eingesetzt.In a further preferred embodiment, the Invertase gene from S. cerevisiae as a fusion with signal sequences, which secrete the gene product from the cell interior guaranteed, used.

Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine mit der biologischen Aktivität einer Levan­ sucrase oder Invertase kodieren oder biologisch aktive Fragmente davon und die mit einem der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle hybridisieren. Der Begriff biologisch aktive Fragmente bezieht sich auf Fragmente, die das Absterben der Pflanzenzelle bewirken können. Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfindung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben sind.The invention also relates to nucleic acid molecules, those for proteins with the biological activity of a Levan encode sucrase or invertase or biologically active Fragments thereof and those with one of those described above Hybridize nucleic acid molecules. The term biological active fragments refers to fragments that are dying the plant cell can cause. The term "hybridization" means hybridization in the context of this invention conventional hybridization conditions, preferably under stringent conditions, as for example in Sambrook et  al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Nukleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden.Nucleic acid molecules with the molecules of the invention hybridize, z. B. from genomic or from cDNA libraries be isolated.

Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nukleinsäure­ moleküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al, supra).The identification and isolation of such nucleic acid Molecules can use the invention Nucleic acid molecules or parts of these molecules or the Reverse complements of these molecules occur, e.g. B. means Hybridization according to standard methods (see e.g. Sambrook et al, supra).

Somit betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz oder Teile davon zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen aus Pflanzen oder anderen Organismen.Thus, the invention also relates to the use of a DNA sequence according to the invention or parts thereof Identification and isolation of homologous sequences from plants or other organisms.

Als Hybridisierungssonde können z. B. Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, die exakt oder im wesentlichen die oben aufgeführten Nukleotidsequenzen oder Teile dieser Sequenzen aufweisen. Bei den als Hybridisierungssonde verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente handeln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfindungs­ gemäßen Nukleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Sequenz kodierten Proteine erforderlich. Hierzu stehen dem Fachmann eine Reihe von molekularbiologischen, biochemischen und biotechnologischen Standardverfahren zur Verfügung. As a hybridization probe z. B. nucleic acid molecules used exactly or essentially the above listed nucleotide sequences or parts of these sequences exhibit. In the used as a hybridization probe Fragments can also be synthetic fragments, which have been produced with the help of common synthetic techniques and their sequence essentially with that of an invention according nucleic acid molecule. You have genes identified and isolated that with the invention Hybridizing nucleic acid sequences is a determination of Sequence and an analysis of the properties of this Sequence encoded proteins required. For this stand the Specialist in a range of molecular biological, biochemical and standard biotechnological processes are available.  

Die mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen hybridi­ sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und allelische Varianten der oben beschriebenen DNA-Moleküle, die eine Levansucrase oder Invertase kodieren oder ein biologisch, d. h. enzymatisch aktives Fragment davon. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nukleinsäuremoleküle verstanden, die lang genug sind, um ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase oder Invertase oder einer vergleichbaren enzymatischen Aktivität, die lokalisierten Zelltod bedingt, zu kodieren. Der Ausdruck Derivat bedeutet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen. Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens 40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vorzugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Abweichungen zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen können dabei durch Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination entstanden sein.The hybridi with the nucleic acid molecules according to the invention Molecules also include fragments, derivatives and allelic variants of the DNA molecules described above, the encode a Levansucrase or Invertase or a biological, d. H. enzymatically active fragment thereof. Among fragments parts of the nucleic acid molecules are understood which are long enough to be a polypeptide with the enzymatic Levansucrase or invertase activity or comparable enzymatic activity that localized Cell death requires coding. The term derivative means in this connection that the sequences of these molecules differ from the sequences of the nucleic acid molecules described above distinguish one or more positions and a high one Show degree of homology to these sequences. Homology means a sequence identity of at least 40%, in particular an identity of at least 60%, preferably over 80% and particularly preferably over 90%. The deviations too the nucleic acid molecules described above can by Deletion, addition, substitution, insertion or recombination have arisen.

Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struk­ turelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nukleinsäure­ molekülen oder den durch sie kodierten Proteinen besteht. Bei den Nukleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschrie­ benen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, handelt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funk­ tion ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftretende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus anderen Organismen, oder um Mutationen, wobei diese Modifi­ kationen auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln. Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich auftretende als auch um synthetisch hergestellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten handeln.Homology also means that functional and / or struc tural equivalence between the nucleic acid in question molecules or the proteins encoded by them. At the nucleic acid molecules homologous to those described above are molecules and represent derivatives of these molecules, are usually variations of these molecules, the modifications represent the same biological radio exercise. It can be both natural occurring variations are, for example, sequences from other organisms, or to mutations, these modifi cations may have occurred naturally or through targeted mutagenesis. Furthermore, it can the variations on synthetically produced sequences act. The allelic variants can be both naturally occurring as well as synthetically manufactured or  act variants generated by recombinant DNA techniques.

Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Proteine weisen bestimmte gemeinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzym­ aktivität, Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation etc. gehören. Weitere gemeinsame Charakteristika können physikalische Eigenschaften wie z. B. das Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Verhalten, Sedimen­ tationskoeffizienten, Löslichkeit, spektroskopische Eigenschaf­ ten, Stabilität, pH-Optimum, Temperatur-Optimum etc. darstel­ len. Des weiteren können natürlich die Produkte der von den Proteinen katalysierten Reaktionen gemeinsame oder ähnliche Merkmale aufweisen.The of the different variants of the invention Proteins encoded by nucleic acid molecules have certain common characteristics. For this, e.g. B. Enzyme activity, molecular weight, immunological reactivity, Conformation etc. Other common characteristics can physical properties such. B. the running behavior in gel electrophoresis, chromatographic behavior, sediments tion coefficients, solubility, spectroscopic properties stability, pH optimum, temperature optimum, etc. len. Furthermore, the products of those of the Proteins catalyzed reactions common or similar Features.

Der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Levansucrase kann beispielsweise durch den Nachweis der Bildung von Levan erfolgen (vgl. Ebskamp et al (1994) Bio/Technology 12, 272-275). Dieser Nachweis beruht darauf, daß sich ein Protein mit einer Levansucrase-Aktivität nachweisen läßt, wenn Protein­ extrakte mit Saccharose inkubiert werden und das sich bildende Levan als Polyfructan mit Fructose-spezifischen Agentien nach­ gewiesen wird. Es ist gleichfalls möglich, durch Shot-Gun-Expression in z. B. E. coli bei Kultivation auf Saccharose­ haltigem Medium Levan als Polymer in situ bei Verwendung von Replikaplatten nachzuweisen.Evidence of the enzymatic activity of levansucrase can for example by demonstrating the formation of Levan take place (cf. Ebskamp et al (1994) Bio / Technology 12, 272-275). This detection is based on the fact that a protein with a Levansucrase activity if protein extracts are incubated with sucrose and the resulting Levan as a polyfructan with fructose-specific agents is pointed. It is also possible through shot gun expression in z. B. E. coli when cultivated on sucrose containing medium Levan as polymer in situ when using Evidence of replica plates.

Der Nachweis der enzymatischen Aktivität der Invertase kann nach Schaewen et al. (1990) EMBO J.9, 3033-3044 durchgeführt werden.Evidence of the enzymatic activity of the invertase can according to Schaewen et al. (1990) EMBO J.9, 3033-3044 will.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pAcYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transfor­ mation von E. coli-Zellen verwendet. Transformierte E. coli- Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wieder­ gewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen Restriktions­ analysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipu­ lation können die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA- Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen oder anderen Plasmiden kloniert werden.To prepare the introduction of foreign genes into higher plants a large number of cloning vectors are available, which have a replication signal for E. coli and a marker gene Selection of transformed bacterial cells included. Examples of such vectors are pBR322, pUC series,  M13mp series, pAcYC184 etc. The desired sequence can be on a suitable restriction interface in the vector be introduced. The plasmid obtained is used for the Transfor mation of E. coli cells used. Transformed E. coli Cells are grown in a suitable medium and then harvested and lysed. The plasmid is back won. As an analysis method to characterize the plasmid DNA obtained are generally restriction analyzes, gel electrophoresis and other biochemical molecular biological methods used. After every manipulation lation, the plasmid DNA can be cleaved and DNA Fragments can be linked to other DNA sequences. Each Plasmid DNA sequence can be in the same or different plasmids to be cloned.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agro­ bacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Alternativ können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, z. B. über eine virale Infektion, als selbstreplizierendes System ohne nachfolgende Integration in das pflanzliche Genom in die Zellen eingebracht werden.For the introduction of DNA into a plant host cell There are a variety of known techniques available the person skilled in the art will find the appropriate method without difficulty can determine. These techniques include transformation plant cells with T-DNA using agro bacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes as Transformation means, the fusion of protoplasts, the direct gene transfer of isolated DNA in protoplasts that Electroporation of DNA, the introduction of DNA by means of the biolistic method and other possibilities. Alternatively the nucleic acid molecules according to the invention, e.g. B. about a viral infection, as a self-replicating system without subsequent integration into the plant genome in the cells be introduced.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selek­ tierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen.In the injection and electroporation of DNA into plant cells are no special requirements per se Plasmids. The same applies to direct gene transfer. Simple plasmids such as e.g. B. pUC derivatives used will. But should whole cells be transformed from this Plants are regenerated, the presence of a selek  animal marker gene necessary. The experts are familiar Known selection marker and it poses no problem for him represents selecting a suitable marker.

Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen­ zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den ein­ zuführenden Genen verbunden werden.Depending on the method of introducing desired genes into the plants cell may require additional DNA sequences. Will e.g. B. for the transformation of the plant cell the Ti or Ri Plasmid used, at least the right boundary, but often the right and left boundaries of the Ti and Ri plasmid contained T-DNA as the flank region with the one supplying genes.

Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequen­ zen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helfer­ plasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein.If Agrobacteria are used for the transformation, the DNA to be inserted is cloned into special plasmids, and either in an intermediate or in a binary Vector. The intermediate vectors can be due to sequences zen, which are homologous to sequences in the T-DNA, by homologous Recombination in the Ti or Ri plasmid of the agrobacteria to get integrated. This also contains those for the transfer the vir region necessary for T-DNA. Intermediate vectors can do not replicate in agrobacteria. Using a helper plasmids can be the intermediate vector on Agrobacterium tumefaciens are transmitted (conjugation). Binary vectors can replicate in both E. coli and Agrobacteria. They contain a selection marker gene and a linker or Polylinker, which is from the right and left T-DNA border region be framed. You can go straight into the agrobacteria be transformed (Holsters et al (1978) Molecular and General Genetics 163, 181-187). That serving as the host cell Agrobacterium is said to be a plasmid that carries a vir region contain. The vir region is for the transfer of the T-DNA into the Plant cell necessary. Additional T-DNA may be present.

Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transfor­ mation von Pflanzenzellen verwendet. The agrobacterium transformed in this way becomes a transfor mation of plant cells used.  

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzen­ zellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515; Hoekema in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrokkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985) Chapter V; Fraley et al (1993) Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al (1985) EMBO J. 4, 277-287 beschrieben worden.The use of T-DNA for the transformation of plants cells has been intensively examined and is sufficient in EP 120 515; Hoekema in: The Binary Plant Vector System, Offsetdrokkerÿ Kanters B.V., Alblasserdam (1985) Chapter V; Fraley et al (1993) Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 and An et al (1985) EMBO J. 4, 277-287.

Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Aarobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzen­ zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten können, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerations­ methoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten-Transformation sind bekannt (vgl. z. B. Wilmitzer L. (1993) Transgenic Plants, in: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.) Vol. 2, 627-659, V.C.H. Weinheim - New York - Basel - Cambridge).For the transfer of the DNA into the plant cell, plant Explants expediently with Agrobacterium tumefaciens or Aarobacterium rhizogenes can be cultivated. From the infected Plant material (e.g. leaf pieces, stem segments, roots, but also protoplasts or suspension-cultivated plants cells) can then in a suitable medium, which Antibiotics or biocides for the selection of transformed cells whole plants can be regenerated again. The The plants are regenerated according to the usual regeneration methods methods using known culture media. The so obtained plants can then on the presence of imported DNA are examined. Other ways of Introduction of foreign DNA using the biolistic Process or by protoplast transformation are known (see e.g. Wilmitzer L. (1993) Transgenic Plants, in: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.) Vol. 2, 627-659, V.C.H. Weinheim - New York - Basel - Cambridge).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium­ basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al (1993) Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei et al (1994) Plant J. 6, 271-282; Deng et al (1990) Science in China 33, 28-34; Wilmink et al (1992) Plant Cell Reports 11, 76-80; May et al (1995) Bio/Technology 13, 486-492; Conner und Domiss (1992) Int. J. Plant Sci. 153, 550-555; Ritchie et al (1993) Trans­ genic Res. 2, 252-265).While the transformation of dicotyledonous plants via Ti plasmid Vector systems with the help of Agrobacterium tumefaciens probably is established, recent works indicate that too monocot plants of transformation using Agrobacterium based vectors are very accessible (Chan et al (1993) Plant Mol. Biol. 22, 491-506; Hiei et al (1994) Plant J. 6, 271-282; Deng et al (1990) Science in China 33, 28-34; Wilmink et al (1992) Plant Cell Reports 11, 76-80; May et al (1995) Bio / Technology 13, 486-492; Conner and Domiss (1992) Int. J. Plant Sci. 153, 550-555; Ritchie et al (1993) Trans  genic Res. 2, 252-265).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformationen mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al (1993) Bio/Technology 11, 1553-1558; Ritala et al (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al (1990) Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), die Protoplasten-Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.Alternative systems for the transformation of monocotyledonous plants are the transformations using the biolistic approach (Wan and Lemaux (1994) Plant Physiol. 104, 37-48; Vasil et al (1993) Bio / Technology 11, 1553-1558; Ritala et al (1994) Plant Mol. Biol. 24, 317-325; Spencer et al (1990) Theor. Appl. Genet. 79, 625-631), the protoplast transformation, the Electroporation of partially permeabilized cells that Introduction of DNA using glass fibers.

Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al (1990) Biotechnology 8, 833-844; Gordon-Kamm et al (1990) Plant Cell 2, 603-618; Koziel et al (1993) Biotechnology 11, 194-200). In EP 292 435 wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen, weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen erhalten werden können. Shillito et al ((1989) Bio/Technology 7, 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwendig ist, von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen eine sich teilende Protoplastenkultur mit der Fähigkeit zu Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro Kultivierungszeit von sieben bis acht Monaten erhalten Shillito et al Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormalitäten in der Morphologie und der Reproduktion aufweisen.The transformation of maize is specific in the literature variously described (see e.g. WO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875; Fromm et al (1990) Biotechnology 8, 833-844; Gordon-Kamm et al (1990) Plant Cell 2, 603-618; Koziel et al (1993) Biotechnology 11, 194-200). In EP 292 435 a Process described, with the aid of which, starting from a slimy, soft (friable) granular corn callus, fertile Plants can be preserved. Shillito et al ((1989) Bio / Technology 7, 581) have observed in this context that it is also for the regenerability to fertile plants is necessary to start from callus suspension cultures which is a dividing protoplast culture with the ability to regenerate plants, can be produced. After one in in vitro cultivation time of seven to eight months Shillito et al plants with viable offspring that however, abnormalities in morphology and reproduction exhibit.

Prioli und Söndahl ((1989) Bio/Technology 7, 589) beschreiben die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais- Protoplasten, der Cateto-Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Autoren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen Pflanzen von einer Anzahl verschiedener Faktoren, wie z. B. vom Genotyp, vom physiologischen Zustand der Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen, abhängig ist. Prioli and Sondahl ((1989) Bio / Technology 7, 589) regeneration and extraction of fertile plants from maize Protoplasts, the Cateto maize inbred line Cat 100-1. The Authors suspect that protoplast regeneration is too fertile Planting a number of different factors, such as B. from Genotype, the physiological state of the donor cells and the cultivation conditions.  

Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, supra; Ritala et al, supra) und für Weizen (Nehra et al (1994) Plant J. 5, 285-297).Also the successful transformation of other types of grain has already been described, e.g. B. for barley (Wan and Lemaux, supra; Ritala et al, supra) and for wheat (Nehra et al (1994) Plant J. 5, 285-297).

Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418, Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl- Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die Selektion trans­ formierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestatten.Once the inserted DNA is in the genome of the plant cell integrated, so it is usually stable and stays there in the descendants of the originally transformed cell receive. It usually contains a selection marker, the the transformed plant cells resistance to one Biocide or an antibiotic such as kanamycin, G418, bleomycin, Hygromycin, methotrexate, glyphosate, streptomycin, sulfonyl Urea, gentamycin or phosphinotricin u. a. mediated. Of the individually selected markers should therefore select trans formed cells versus cells to which the inserted DNA missing, allow.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transfor­ mierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den Pflanzen­ zellen können Samen gewonnen werden.The transformed cells grow within the plant in the usual way (see also McCormick et al (1986) Plant Cell Reports 5, 81-84). The resulting plants can be normal to be grown and with plants that transfor the same possessed inheritance or other inheritance, crossed will. The resulting hybrid individuals have that corresponding phenotypic properties. From the plants cells can be harvested.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.Two or more generations should be attracted to ensure that the phenotypic trait is stable is retained and inherited. Seeds should also be harvested to ensure that the appropriate phenotype or other peculiarities have been preserved.

Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich eines lokalisierten Zelltods und/oder einer SAR und/oder erhöhter Krankheitsresistenz und/oder männlicher Sterilität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.Transgenic lines can also be determined by conventional methods that are homozygous for the new nucleic acid molecules and their phenotypic behavior towards one  localized cell death and / or an SAR and / or increased Disease resistance and / or male sterility were examined and compared to that of hemizygotic lines.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente dieser Moleküle zur Identifizierung und Isolierung homologer Moleküle, die Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase oder Invertase kodieren oder Fragmente derartiger Proteine aus Pflanzen oder anderen Organismen. Für die Definition des Begriffes "Homologie" siehe oben.Another object of the present invention is Use of the nucleic acid molecules according to the invention or Parts of these molecules or their reverse complement Molecules to identify and isolate homologous molecules the proteins with the enzymatic activity of a levan sucrase or encode invertase or fragments of such proteins Plants or other organisms. For the definition of For the term "homology" see above.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.The following examples serve to explain the Invention.

BeispieleExamples

In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet:The following methods are used in the examples:

  • 1. Klonierungsverfahren:
    Für die Klonierung in E. coli wurde der Vektor pBluescript II SK (Stratagene) verwendet.
    1. Cloning procedure:
    The vector pBluescript II SK (Stratagene) was used for cloning in E. coli.
  • 2. Bakterienstämme:
    Für den Bluescript-Vektor und die Lss8-Konstrukte wurde der E. coli-Stamm DH5alpha (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.
    2. Bacterial strains:
    E. coli strain DH5alpha (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) was used for the Bluescript vector and the Lss8 constructs.
  • 3. Transformation von Kartoffeln:
    Zehn kleine, mit dem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffelsterilkultur (Solanum tuberosum L. cv.) Desiree) wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant. 15, 473) mit 2% Saccharose gelegt, welches 50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere Inkubation für zwei Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die Blätter zur Kallus-Induktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylamino­ purin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glukose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20 µg/l Naphthylessigsäure, 20 µg/l Giberellinsäure, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar gelegt.
    3. Transformation of potatoes:
    Ten small leaves of a potato sterile culture (Solanum tuberosum L. cv.) Desiree) wounded with the scalpel were placed in 10 ml of MS medium (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15, 473) with 2% sucrose, which was 50 µl of an Agrobacterium tumefaciens culture grown under selection overnight. After gently shaking for 3-5 minutes, incubation was continued for two days in the dark. The leaves were then used for callus induction on MS medium with 1.6% glucose, 5 mg / l naphthylacetic acid, 0.2 mg / l benzylamino purine, 250 mg / l claforan, 50 mg / l kanamycin and 0.8% Bacto agar placed. After a week's incubation at 25 ° C. and 3000 lux, the leaves were induction on MS medium with 1.6% glucose, 1.4 mg / l zeatin ribose, 20 μg / l naphthylacetic acid, 20 μg / l giberellic acid, 250 mg / l Claforan, 50 mg / l kanamycin and 0.8% Bacto agar.
  • 4. Transformation von Tabakpflanzen und Regeneration intakter Pflanzen:
    Eine Übernachtkultur des entsprechenden Agrobacterium tumefaciens-Klons wurde für drei Minuten bei 6500 rpm abzentrifugiert, und die Bakterien wurden in YEB-Medium resuspendiert. Tabakblätter einer Tabaksterilkultur (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) wurden in kleine, ca. 1 cm² große Stücke zerschnitten und in der Bakterien­ suspension gebadet. Die Blattstücke wurden anschließend auf MS-Medium (0,7% Agar) gelegt und zwei Tage im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Blattstücke zur Sproßinduktion auf MS-Medium (0,7% Agar) mit 1,6% Glukose, 1 mg/l 6-Benzylaminopurin, 0,2 mg/l Naphthyl­ essigsäure, 500 mg/l Claforan und 50 mg/l Kanamycin gelegt. Das Medium wurde alle sieben bis zehn Tage gewechselt. Wenn sich Sprosse entwickelt hatten, wurden die Blattstücke in Glasgefäße, die dasselbe Medium enthielten, überführt. Entstehende Sprosse wurden abge­ schnitten und auf MS-Medium mit 2% Saccharose und 250 mg/l Claforan gegeben und aus ihnen ganze Pflanzen regeneriert.
    4. Transformation of tobacco plants and regeneration of intact plants:
    An overnight culture of the corresponding Agrobacterium tumefaciens clone was centrifuged for three minutes at 6500 rpm and the bacteria were resuspended in YEB medium. Tobacco leaves from a tobacco sterile culture (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) were cut into small pieces of approx. 1 cm² and bathed in the bacteria suspension. The leaf pieces were then placed on MS medium (0.7% agar) and incubated for two days in the dark. The leaf pieces were then sprouted on MS medium (0.7% agar) with 1.6% glucose, 1 mg / l 6-benzylaminopurine, 0.2 mg / l naphthylacetic acid, 500 mg / l claforan and 50 mg / l Kanamycin placed. The medium was changed every seven to ten days. When shoots had developed, the leaf pieces were transferred to glass jars containing the same medium. Resulting shoots were cut off and placed on MS medium with 2% sucrose and 250 mg / l Claforan and whole plants were regenerated from them.
  • 5. RNA-Extraktion und Northern Blot-Experimente:
    RNA wurde aus gefrorenem Pflanzenmaterial isoliert, wie beschrieben in Logemann et al (1987) Anal. Biochem. 163, 21-26. Die RNA wurde in 40% Formamid denaturiert. Anschließend wurde die RNA gelelektrophoretisch auf Formaldehyd/Agarose-Gelen aufgetrennt und nach dem Gellauf auf Nylonmembranen (Hybond N; Amersham, UK) geblottet. Die Hybridisierung gegen eine radioaktiv­ markierte DNA-Sonde erfolgte nach Standardmethoden (z. B. Sambrook et al, supra).
    5. RNA extraction and Northern blot experiments:
    RNA was isolated from frozen plant material as described in Logemann et al (1987) Anal. Biochem. 163, 21-26. The RNA was denatured in 40% formamide. The RNA was then separated by gel electrophoresis on formaldehyde / agarose gels and, after the gel run, blotted on nylon membranes (Hybond N; Amersham, UK). Hybridization against a radiolabelled DNA probe was carried out according to standard methods (e.g. Sambrook et al, supra).
  • 6. Pflanzenhaltung:
    Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum) wurden im Gewächs­ haus bei 60% Luftfeuchtigkeit und 22°C für 16 Stunden im Licht und 15°C für 8 Stunden in Dunkelheit gehalten. Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum) wurden im Gewächshaus bei 60% Luftfeuchtigkeit und 25°C für 14 Stunden im Licht und 20°C für 10 Stunden in Dunkelheit gehalten.
    6. Plant husbandry:
    Potato plants (Solanum tuberosum) were kept in the greenhouse at 60% humidity and 22 ° C for 16 hours in the light and 15 ° C for 8 hours in the dark. Tobacco plants (Nicotiana tabacum) were kept in the greenhouse at 60% humidity and 25 ° C for 14 hours in the light and 20 ° C for 10 hours in the dark.
  • 7. Bestimmung von Salicylsäuregehalten:
    Zur Bestimmung des Gehaltes an Salicylsäure wurden die Methoden, wie bei Yalpani et al (1991) The Plant Cell 3, 809-818 und Gaffney et al (1993) Science 261, 754-756 beschrieben, eingesetzt.
    7. Determination of salicylic acid contents:
    The methods described in Yalpani et al (1991) The Plant Cell 3, 809-818 and Gaffney et al (1993) Science 261, 754-756 were used to determine the content of salicylic acid.
Beschreibung der AbbildungenDescription of the pictures

Abb. 1: zeigt das Auftreten nekrotischer Bereiche in transgenen Tabakpflanzen, die mit dem Kon­ strukt Lss8 transformiert worden sind. Fig. 1: shows the appearance of necrotic areas in transgenic tobacco plants that have been transformed with the construct Lss8.

Abb. 2: zeigt die Menge an Salicylsäure in transgenen Tabakpflanzen (1-5) im Vergleich zu Wildtyp­ pflanzen (6-7). Fig. 2: shows the amount of salicylic acid in transgenic tobacco plants ( 1-5 ) compared to wild-type plants ( 6-7 ).

Abb. 3: zeigt das Ergebnis eines Northern Blot- Experiments. Zur Analyse wurden jeweils 30 µg poly(A)⁺-mRNA aus verschiedenen transgenen Tabakpflanzen (Spur 1-5) und zwei nicht­ transformierten Tabakpflanzen (Spur 6-7) verwendet. Als Sonde wurde eine cDNA des PR- 1-1-Gens verwendet. Fig. 3: shows the result of a Northern blot experiment. 30 µg poly (A) (mRNA from different transgenic tobacco plants (lane 1-5 ) and two non-transformed tobacco plants (lane 6-7 ) were used for the analysis. A cDNA of the PR-1-1 gene was used as a probe.

AusführungsbeispieleEmbodiments Ausführungsbeispiel 1Embodiment 1

Konstruktion eines chimären Gens bestehend aus der kodierenden Region des Levansucrase-Gens aus Erwinia amylovora und einer verkürzten Promotorregion des prp1-1-Gens aus Solanum tuberosum.Construction of a chimeric gene consisting of the coding Region of the levansucrase gene from Erwinia amylovora and one truncated promoter region of the prp1-1 gene from Solanum tuberosum.

Zunächst wurde mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI und XbaI ein Fragment des prp1-1-Promotors, das die Nukleotide +31 bis -402 umfaßt, aus dem Plasmid pBS42-1 (Martini et al (1993) Mol. Gen. Genetics 236, 179-186) herausgeschnitten. Dieses EcoRI- XbaI-Promotorfragment wurde anschließend in den Vektor BINAR (Höfgen und Willmitzer (1992) Plant Science 87, 45-54) ligiert, wobei aus dem Vektor BINAR durch Verwendung der gleichen Enzyme der CaMV 35S-Promotor herausgeschnitten wurde. Der entstandene binäre Vektor enthält somit die prp1-1-Promotorregion und das Terminationssignal des Octopinsynthase-Gens (OCS), getrennt durch Restriktionsschnittstellen des pVC18-Polylinkers, der das Einfügen kodierender Regionen und somit die Konstruktion entsprechender Expressionskassetten erlauben. Anschließend wurde die kodierende Region der Levansucrase mit Hilfe der Restriktionsenzyme XbaI und SalI aus dem Vektor pEa-LSK5 (Geier und Geider (1993) Physiol. Mol. Plant Pathology 42, 387-404) herausgeschnitten und in den analog geschnittenen, das prp1-1- Promotorfragment enthaltenden Vektor eingesetzt. Dieser als Lss8 bezeichnete Vektor wurde sodann in Agrobacterium tumefaciens transformiert und zur Transformation von Tabak­ pflanzen und Kartoffelpflanzen eingesetzt.First, the restriction enzymes EcoRI and XbaI a fragment of the prp1-1 promoter, which the nucleotides +31 to -402, from plasmid pBS42-1 (Martini et al (1993) Mol. Gene. Genetics 236, 179-186) cut out. This EcoRI XbaI promoter fragment was then inserted into the BINAR vector (Höfgen and Willmitzer (1992) Plant Science 87, 45-54), taking from the vector BINAR using the same enzymes the CaMV 35S promoter was cut out. The resulting one binary vector thus contains the prp1-1 promoter region and that Termination signal of the octopine synthase gene (OCS), separated by restriction sites of the pVC18 polylinker that the Insert coding regions and thus the construction allow appropriate expression cassettes. Subsequently the coding region of Levansucrase was created with the help of the Restriction enzymes XbaI and SalI from the vector pEa-LSK5 (Geier and Geider (1993) Physiol. Mol. Plant Pathology 42, 387-404) cut out and into the analog cut, the prp1-1- Vector containing promoter fragment used. This as Vector designated Lss8 was then in Agrobacterium tumefaciens transformed and to transform tobacco  plants and potato plants.

Ausführungsbeispiel 2Embodiment 2 Analyse transgener Tabak- und Kartoffelpflanzen, die den Vektor Lss8 enthaltenAnalysis of transgenic tobacco and potato plants using the vector Lss8 included

Transgene Tabak- und Kartoffelpflanzen wurden wie oben beschrieben transformiert, selektioniert und regeneriert. Nach Bewurzelung in Sterilkultur wurden ca. 50 unabhängige Transfor­ manten im Gewächshaus in Erde überführt. 6 bis 8 Linien, die einen durch das Auftreten von nekrotischen Flecken eindeutig gekennzeichneten Phänotyp aufwiesen, konnten identifiziert werden (siehe Abb. 1). Die Analyse dieser nekrotischen Bereiche auf das Vorhandensein von Levan, nach der oben beschriebenen Methode, erbrachte eindeutig den Nachweis von Levan. Diese Pflanzen, die aufgrund der Expression des chimären Genkonstrukts pLSS8 einen lokalisierten Zelltod aufwiesen, wurden sodann im Gewächshaus weiteren Analysen unterzogen.Transgenic tobacco and potato plants were transformed, selected and regenerated as described above. After rooting in sterile culture, approx. 50 independent transformants were transferred to soil in the greenhouse. 6 to 8 lines with a phenotype clearly identified by the appearance of necrotic spots could be identified (see Fig. 1). Analysis of these necrotic areas for the presence of Levan using the method described above clearly demonstrated Levan. These plants, which had localized cell death due to the expression of the chimeric gene construct pLSS8, were then subjected to further analyzes in the greenhouse.

Ausführungsbeispiel 3Embodiment 3 Bestimmung des SalicylsäuregehaltsDetermination of the salicylic acid content

Der Salicylsäuregehalt verschiedener Transformanten wurde nach den oben angegebenen Methoden bestimmt. Wie aus Abb. 2 ersichtlich ist, weisen die transgenen Tabakpflanzen, die sich durch einen lokalisierten Zelltod auszeichnen, eine um einen Faktor 2-8 höhere Salicylsäuremenge im Vergleich zu Wildtyp­ pflanzen auf. The salicylic acid content of various transformants was determined using the methods given above. As can be seen from Fig. 2, the transgenic tobacco plants, which are characterized by localized cell death, have a 2-8 times higher amount of salicylic acid compared to wild-type plants.

Ausführungsbeispiel 4Embodiment 4 Analyse der Expression von typischen PR-ProteinenAnalysis of the expression of typical PR proteins

Die systemisch erworbene Resistenz (SAR) ist durch die koordi­ nierte Expression mehrerer Gene gekennzeichnet (Ward et al (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094). Zu den Genprodukten dieser sogenannten SAR-Gene gehören die PR-Proteine (Pathogenesis­ related proteins) (vgl. Van Loon (1985) Plant Mol. Biol. 4, 111-116). Da ein Zusammenhang zwischen der Expression der PR- Proteine und der Entstehung der SAR als gesichert gilt, kann die Expression typischer PR-Proteine als Indiz für die Entste­ hung bzw. das Vorhandensein einer SAR herangezogen werden. Die Expression von PR-Proteinen in Pflanzen, die das chimäre Lss8- Gen expremieren, wurde mittels Northern Blot-Analyse unter­ sucht. Wie in Abb. 3 zu erkennen ist, läßt sich sowohl in grünen als auch in den bereits nekrotische Flecken aufweisenden Bereichen der Tabakpflanzen, die Expression des homologen PR1- 1-Gens nachweisen, während dies in nicht-transformierten Kontrollpflanzen nicht der Fall ist.The systemically acquired resistance (SAR) is characterized by the coordinated expression of several genes (Ward et al (1991) The Plant Cell 3, 1085-1094). The gene products of these so-called SAR genes include the PR proteins (pathogenesis-related proteins) (cf. Van Loon (1985) Plant Mol. Biol. 4, 111-116). Since a connection between the expression of the PR proteins and the formation of the SAR is considered to be established, the expression of typical PR proteins can be used as an indication of the formation or the presence of a SAR. The expression of PR proteins in plants which express the chimeric Lss8 gene was examined by means of Northern blot analysis. As can be seen in Fig. 3, the expression of the homologous PR1-1 gene can be detected both in green and in the areas of the tobacco plants which already have necrotic spots, while this is not the case in non-transformed control plants.

Claims (56)

1. DNA-Sequenz I, bestehend aus den folgenden Bestandteilen, die in der 5′-3′-Orientierung aneinandergereiht sind:
  • a) ein in Pflanzen funktionsfähiger, lokal induzierbarer bzw. lokal aktiver Promotor,
  • b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein oder ein Fragment davon kodiert, dessen enzymatische Aktivität in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod verursacht und
  • c) gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript
1. DNA sequence I, consisting of the following components, which are strung together in the 5'-3 'orientation:
  • a) a promoter that is functional, locally inducible or locally active in plants,
  • b) at least one nucleic acid sequence which codes for a protein or a fragment thereof, the enzymatic activity of which causes localized cell death in plants and
  • c) optionally a termination signal for the termination of the transcription and the addition of a poly-A tail to the corresponding transcript
sowie ggf. davon abgeleitete DNA-Sequenzen.and any DNA sequences derived therefrom. 2. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei der Promotor ein pathogen-induzierter Promotor ist.2. DNA sequence I according to claim 1, wherein the promoter is pathogen-induced promoter. 3. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 2, wobei der Promotor der prp1-1-Promotor aus Solanum tuberosum ist.3. DNA sequence I according to claim 2, wherein the promoter of prp1-1 promoter from Solanum tuberosum. 4. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei der Promotor ein gewebespezifischer Promotor ist.4. DNA sequence I according to claim 1, wherein the promoter is tissue-specific promoter. 5. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei der Promotor ein entwicklungsspezifischer Promotor oder ein Promotor, der durch einen abiotischen Stimulus induziert werden kann, ist.5. DNA sequence I according to claim 1, wherein the promoter development-specific promoter or a promoter promoted by an abiotic stimulus can be induced. 6. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Promotor ein antheren- oder tapetumspezifischer Promotor ist. 6. DNA sequence I according to claim 4 or 5, wherein the Promoter is an anther or wallpaper specific promoter.   7. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei ein in Pflanzen konstitutiver Promotor mit einem transposablen Element so kombiniert ist, daß der Promotor und die mindestens eine Nukleinsäuresequenz durch das Transposon voneinander getrennt sind.7. DNA sequence I according to claim 1, wherein a in plants constitutive promoter with a transposable element like this is combined that the promoter and the at least one Nucleic acid sequence separated by the transposon are. 8. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Protein oder ein Fragment davon kodiert, das die enzymatische Aktivität einer Fructosyltransferase aufweist.8. DNA sequence I according to claim 1, wherein the Nucleic acid sequence for a protein or a fragment thereof encodes the enzymatic activity of a Has fructosyl transferase. 9. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 8, wobei die Fructosyltrans-ferase eine Levansucrase ist.9. DNA sequence I according to claim 8, wherein the Fructosyltransferase is a levan sucrase. 10. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Protein, welches in einem Enterobakterium in sekretierter Form vorkommt, oder ein Fragment davon kodiert.10. DNA sequence I according to claim 8 or 9, wherein the Nucleic acid sequence for a protein which is in a Enterobacterium occurs in secreted form, or a Fragment of it encoded. 11. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 10, wobei das Enterobakterium Erwinia amylovora ist.11. DNA sequence I according to claim 10, wherein the Enterobacterium Erwinia amylovora is. 12. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei der Promotor der prp1-1-Promotor aus Solanum tuberosum und die Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz aus Erwinia amylovora ist, die für ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase oder ein Fragment davon kodiert.12. DNA sequence I according to claim 1, wherein the promoter the prp1-1 promoter from Solanum tuberosum and the Nucleic acid sequence a nucleic acid sequence from Erwinia amylovora is responsible for a protein with the enzymatic Activity of a levan sucrase or a fragment thereof. 13. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz für ein Protein oder ein Fragment davon kodiert, das die enzymatische Aktivität einer Invertase besitzt und wobei diese Nukleinsäuresequenz derart durch Signalsequenzen modifiziert ist, daß in Pflanzen die Sekretion des Genproduktes gewährleistet ist. 13. DNA sequence I according to claim 1, wherein the Nucleic acid sequence for a protein or a fragment thereof encodes that has the enzymatic activity of an invertase and whereby this nucleic acid sequence by Signal sequences is modified that in plants the secretion of the gene product is guaranteed.   14. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 13, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für eine Invertase oder ein aktives Fragment davon kodiert, aus Saccharomyces cerevisiae stammt.14. DNA sequence I according to claim 13, wherein the Nucleic acid sequence necessary for an invertase or an active one Coded fragment thereof comes from Saccharomyces cerevisiae. 15. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 14, wobei als Nukleinsäuresequenz das Invertase-Gen suc2 oder Teile davon verwendet werden.15. DNA sequence I according to claim 14, wherein as Nucleic acid sequence the invertase gene suc2 or parts thereof be used. 16. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 13, wobei die Signal­ sequenzen aus N-terminalen Bereichen des Proteinase-Inhibitor II-Gen aus Solanum tuberosum stammen.16. DNA sequence I according to claim 13, wherein the signal sequences from N-terminal regions of the proteinase inhibitor II gene originate from Solanum tuberosum. 17. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, wobei das Terminationssignal jenes des Octopin-Synthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens ist.17. DNA sequence I according to claim 1, wherein the Termination signal that of the octopine synthase gene Agrobacterium tumefaciens is. 18. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, die zusätzliche Enhancer-Sequenzen oder andere regulatorische Sequenzen enthält.18. DNA sequence I according to claim 1, the additional Enhancer sequences or other regulatory sequences contains. 19. DNA-Sequenz I gemäß Anspruch 1, bei der die kodierende Nukleinsäuresequenz in der Antisense-Orientierung vorliegt.19. DNA sequence I according to claim 1, wherein the coding nucleic acid sequence in the antisense orientation is present. 20. Vektoren, welche die DNA-Sequenz I gemäß einem der vorangehenden Ansprüche enthalten.20. Vectors which the DNA sequence I according to one of the preceding claims included. 21. Vektor-Plasmid Lss8.21. Vector plasmid Lss8. 22. Transformierte Mikroorganismen, welche die DNA- Sequenz I gemäß einem der vorangehenden Ansprüche enthalten.22. Transformed microorganisms that Sequence I according to one of the preceding claims. 23. Pflanzen, die eine DNA-Sequenz I gemäß einem der Ansprüche 1 bis 21 oder eine davon abgeleitete DNA-Sequenz enthalten sowie Teile dieser Pflanzen oder deren Vermehrungs­ material, wie Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen oder Stecklinge, usw., sowie die Nachkommen dieser Pflanzen.23. Plants that have a DNA sequence I according to one of the Claims 1 to 21 or a DNA sequence derived therefrom contain as well as parts of these plants or their propagation material such as protoplasts, plant cells, calli, seeds,  Tubers or cuttings, etc., as well as the offspring of these Plants. 24. Pflanzen gemäß Anspruch 23, die mindestens ein für eine systemisch erworbene Resistenz typisches Phänomen ausprägen.24. Plants according to claim 23, the at least one for a systemically acquired resistance typical phenomenon express. 25. Pflanzen gemäß Anspruch 23 oder 24, die eine im Vergleich zu Pflanzen, die die DNA-Sequenz I nicht enthalten, erhöhte Salicylsäure-Konzentration aufweisen.25. Plants according to claim 23 or 24, the one in Compared to plants that do not contain DNA sequence I, have increased salicylic acid concentration. 26. Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 23 bis 25, die sich durch eine im Vergleich zu Pflanzen, die die DNA-Sequenz I nicht enthalten, erhöhte Krankheitsresistenz auszeichnen.26. Plants according to any one of claims 23 to 25, the compared to plants that have the DNA sequence I not included, distinguish increased disease resistance. 27. Pflanzen gemäß Anspruch 23, die männlich steril sind.27. Plants according to claim 23 which are male sterile. 28. Dikotyle Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27.28. Dicotyledonous plants according to one of claims 23 to 27. 29. Pflanzen gemäß Anspruch 28, bei denen es sich um Nutzpflanzen, insbesondere Baumwolle, Sojabohne, Raps, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen oder Bäume, handelt.29. Plants according to claim 28, which are Useful plants, especially cotton, soybean, rapeseed, tomato, Sugar beet, potato, ornamental plants or trees. 30. Monokotyle Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 23 bis 27.30. Monocot plants according to one of claims 23 to 27. 31. Pflanzen gemäß Anspruch 30, bei denen es sich um Getreide, insbesondere Hafer, Weizen, Roggen, Gerste, Reis, Hirse oder Mais, handelt.31. Plants according to claim 30, which are Cereals, in particular oats, wheat, rye, barley, rice, Millet or corn. 32. Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 23 bis 31, in denen die DNA-Sequenz I integriert im Genom der Pflanze vorliegt, sowie die Nachkommen dieser Pflanzen. 32. Plants according to one of claims 23 to 31, in which the DNA sequence I integrated into the genome of the plant is present, as well as the descendants of these plants.   33. Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 23 bis 31, die die DNA-Sequenz I in Form eines selbstreplizierenden Systems, z. B. einem Virus bzw. viraler Nukleinsäuremoleküle, enthalten.33. Plants according to any one of claims 23 to 31, the DNA sequence I in the form of a self-replicating system, e.g. B. a virus or viral nucleic acid molecules. 34. Verfahren zur Herstellung der Pflanzen gemäß einem der Ansprüche 23 bis 33, folgende Schritte umfassend:
  • a) Herstellung einer DNA-Sequenz I, bestehend aus den folgenden Bestandteilen, die in der 5′-3′-Orientierung aneinandergereiht sind:
  • - ein in Pflanzen funktionsfähiger, lokal induzierbarer bzw. lokal aktiver Promotor,
  • - mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein oder ein Fragment davon kodiert, dessen enzymatische Aktivität in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod verursacht und
  • - gegebenenfalls ein Terminationssignal für die Termination der Transkription und die Addition eines poly-A-Schwanzes an das entsprechende Transkript, sowie ggf. davon abgeleitete DNA- Sequenzen;
  • b) Übertragung der DNA-Sequenz I auf pflanzliche Zellen und gegebenenfalls Integration der DNA-Sequenz I in das pflanzliche Genom,
  • c) Regeneration vollständig transformierter Pflanzen und gegebenenfalls Vermehrung dieser Pflanzen.
34. A method for producing the plants according to one of claims 23 to 33, comprising the following steps:
  • a) Preparation of a DNA sequence I, consisting of the following components, which are strung together in the 5'-3 'orientation:
  • a promoter which is functional, locally inducible or locally active in plants,
  • - at least one nucleic acid sequence coding for a protein or a fragment thereof, the enzymatic activity of which causes localized cell death in plants and
  • - if necessary, a termination signal for the termination of the transcription and the addition of a poly-A tail to the corresponding transcript, and, if appropriate, DNA sequences derived therefrom;
  • b) transfer of the DNA sequence I to plant cells and optionally integration of the DNA sequence I into the plant genome,
  • c) Regeneration of completely transformed plants and, if appropriate, multiplication of these plants.
35. Verfahren gemäß Anspruch 34, wobei die Pflanzen oder Pflanzenteile die DNA-Sequenz I in Form eines selbstreplizierenden Systems enthalten.35. The method of claim 34, wherein the plants or Plant parts of the DNA sequence I in the form of a self-replicating system included. 36. Verwendung der DNA-Sequenz I und/oder der Vektoren gemäß Anspruch 20 oder 21 und/oder der transformierten Mikroorganismen gemäß Anspruch 22 zur Transformation von Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten) und Pflanzen (einschließlich Pflanzenzellen, Pflanzenteilen und Samen).36. Use of DNA sequence I and / or the vectors according to claim 20 or 21 and / or the transformed Microorganisms according to claim 22 for the transformation of  Plant cells (including protoplasts) and plants (including plant cells, plant parts and seeds). 37. Verwendung der DNA-Sequenz I zur Erzeugung von Pflanzen, bei denen ein lokalisierter Zelltod auftritt und insbesondere induziert werden kann.37. Use of DNA sequence I to generate Plants with localized cell death and in particular can be induced. 38. Verwendung der DNA-Sequenz I zur Erzeugung von Pflanzen, die mindestens ein für eine systemisch erworbene Resistenz typisches Merkmal aufweisen.38. Use of DNA sequence I to generate Plants that have at least one for a systemically acquired one Resistance typical characteristic. 39. Verwendung der DNA-Sequenz I zur Erzeugung von Pflanzen, die eine im Vergleich zu Pflanzen, die die DNA- Sequenz I nicht enthalten, erhöhte Salicylsäure-Konzentration aufweisen.39. Use of DNA sequence I to generate Plants that one versus plants that the DNA Sequence I not included, increased salicylic acid concentration exhibit. 40. Verwendung der DNA-Sequenz I zur Erzeugung von Pflanzen, die eine im Vergleich zu Pflanzen, die die DNA- Sequenz I nicht enthalten, erhöhte Krankheitsresistenz aufweisen.40. Use of DNA sequence I to generate Plants that one versus plants that the DNA Sequence I not included, increased disease resistance exhibit. 41. Verwendung der DNA-Sequenz I zur Erzeugung von Pflanzen, die männlich steril sind.41. Use of DNA sequence I to generate Plants that are male sterile. 42. Verwendung des prp1-1-Promotors zur Erzeugung von Pflanzen, bei denen ein lokalisierter Zelltod auftritt und insbesondere induziert werden kann, und/oder die mindestens ein für eine systemisch erworbene Resistenz typisches Merkmal und/oder erhöhte Krankheitsresistenz aufweisen.42. Use of the prp1-1 promoter to generate Plants with localized cell death and in particular can be induced, and / or the at least one characteristic of a systemically acquired resistance and / or have increased disease resistance. 43. Verwendung einer für Levansucrase kodierenden Nukleinsäuresequenz aus Erwinia amylovora oder von Teilen davon, um in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod hervorzurufen. 43. Use of a coding for Levansucrase Nucleic acid sequence from Erwinia amylovora or from parts of causing localized cell death in plants to evoke.   44. Verwendung einer für Levansucrase kodierenden Nukleinsäuresequenz aus Erwinia amylovora oder Teile davon, um in Pflanzen eine erhöhte Krankheitsresistenz zu erzielen.44. Use of a coding for Levansucrase Nucleic acid sequence from Erwinia amylovora or parts thereof to achieve increased disease resistance in plants. 45. Verwendung einer für Levansucrase kodierenden Nukleinsäuresequenz aus Erwinia amylovora oder Teile davon, um in Pflanzen männliche Sterilität zu erzeugen.45. Use of a Levansucrase coding Nucleic acid sequence from Erwinia amylovora or parts thereof to produce male sterility in plants. 46. Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase oder eines Fragments davon, um in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod hervorzurufen.46. Use of a protein with the enzymatic Activity of a levan sucrase or a fragment thereof in order to Plants cause localized cell death. 47. Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase oder eines Fragments davon, um in Pflanzen eine erhöhte Krankheitsresistenz zu erzielen.47. Use of a protein with the enzymatic Activity of a levan sucrase or a fragment thereof in order to Plants to achieve increased disease resistance. 48. Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase oder eines Fragments davon, um in Pflanzen männliche Sterilität zu erzeugen.48. Use of a protein with the enzymatic Activity of a levan sucrase or a fragment thereof in order to Plants to produce male sterility. 49. Verwendung einer für eine Invertase kodierenden Nukleinsäuresequenz oder Teile davon, um in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod hervorzurufen.49. Use of a coding for an invertase Nucleic acid sequence or parts thereof to be used in plants localized cell death. 50. Verwendung einer für eine Invertase kodierenden Nukleinsäuresequenz oder Teile davon, um in Pflanzen eine erhöhte Krankheitsresistenz zu erzielen.50. Use of a coding for an invertase Nucleic acid sequence or parts thereof to be used in plants to achieve increased disease resistance. 51. Verwendung einer für eine Invertase kodierenden Nukleinsäuresequenz oder Teile davon, um in Pflanzen männliche Sterilität zu erzeugen.51. Use of a coding for an invertase Nucleic acid sequence or parts thereof to be male in plants To produce sterility. 52. Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Invertase oder eines Fragments davon, um in Pflanzen einen lokalisierten Zelltod hervorzurufen. 52. Use of a protein with the enzymatic Activity of an invertase or a fragment thereof to convert into Plants cause localized cell death.   53. Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Invertase oder eines Fragments davon, um in Pflanzen erhöhte Krankheitsresistenz zu erzielen.53. Use of a protein with the enzymatic Activity of an invertase or a fragment thereof to convert into Plants to achieve increased disease resistance. 54. Verwendung eines Proteins mit der enzymatischen Aktivität einer Invertase oder eines Fragments davon, um in Pflanzen männliche Sterilität zu erzeugen.54. Use of a protein with the enzymatic Activity of an invertase or a fragment thereof to convert into Plants to produce male sterility. 55. Verwendung einer für eine Levansucrase kodierenden Nukleinsäuresequenz aus Erwinia amylovora oder Teile davon bzw. ihrer reversen Komplemente zur Identifizierung und Isolierung homologer Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen Aktivität einer Levansucrase kodieren oder Fragmente derartiger Proteine aus Pflanzen oder anderen Organismen.55. Use of a coding for a Levansucrase Nucleic acid sequence from Erwinia amylovora or parts thereof or their reverse complements for identification and isolation homologous sequences for proteins with the enzymatic Encode activity of a Levansucrase or fragments of such Proteins from plants or other organisms.
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