DE19619576A1

DE19619576A1 - Separating strongly hydrophobic proteins and peptides

Info

Publication number: DE19619576A1
Application number: DE1996119576
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr Ise; Ruediger Dr Nave; Wolfram Dr Steinhilber
Original assignee: Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik GmbH
Current assignee: Takeda GmbH
Priority date: 1996-05-15
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 1997-11-20

Abstract

Separation and determination of strongly hydrophobic proteins, protein fragments and modifications, and strongly hydrophobic peptides by dissolving the samples in an organic medium, subjecting them to thin-layer chromatography and detecting the hydrophobic proteins.

Description

Technical field

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von stark hydrophoben Proteinen, Proteinfragmenten und -modifikationen sowie von stark hydrophoben Peptiden.The invention relates to a method for the detection and determination of highly hydrophobic Proteins, protein fragments and modifications as well as highly hydrophobic peptides.

State of the art

Die Quantifizierung von hydrophoben Proteinen ist mit den herkömmlich üblichen Techniken nicht oder nur unzureichend möglich. Die für die Auftrennung von hydrophilen Proteinen üblichen Methoden, wie z. B. "Western blotting" sind für hydrophobe Proteine nur bedingt anwendbar, weil zum einen die Auftrennung auf dem SDS-Gel unzureichend ist und zum anderen der Transfer der Proteine auf die üblichen Membranen allenfalls als semiquantitativ zu bezeichnen ist. Eine Trennung von geringfügig modifizierten Proteinen (z. B. Methylester) läßt sich über Gelelectrophorese nicht bewerkstelligen. Die Anwendung von immunologischen Methoden, wie. z. B. ELISA ist sehr problematisch, weil diese in der Regel nur in wäßrigen Systemen durchgeführt werden können. Organische Lösungsmittel können mit dem Material der Mikrotiterplatten reagieren und sie unbrauchbar machen. Die zu quantifizierenden Analyten liegen zumeist nur in Spuren vor. Oft sind gerade hydrophobe Proteine zudem mit anderen lipophilen Substanzen assoziiert (z. B. Lipide), was eine Quantifizierung nach herkömmlichen Methoden unmöglich macht. Beim ELISA werden die Komponenten nicht voneinander abgetrennt.The quantification of hydrophobic proteins with conventional techniques is not or only insufficiently possible. The usual methods for the separation of hydrophilic proteins, such as e.g. B. "Western blotting" are only partially applicable for hydrophobic proteins, because on the one hand Separation on the SDS gel is insufficient and secondly the transfer of the proteins to the usual membranes can at best be described as semi-quantitative. A minor separation modified proteins (e.g. methyl esters) cannot be achieved by gel electrophoresis. The Application of immunological methods, such as. e.g. B. ELISA is very problematic because it is in the Usually can only be carried out in aqueous systems. Organic solvents can with react to the material of the microtiter plates and make them unusable. The ones to be quantified Analytes are usually only present in traces. Often, hydrophobic proteins are also in common with others lipophilic substances associated (e.g. lipids), which is a quantification according to conventional methods makes impossible. In the ELISA, the components are not separated from one another.

Description of the invention

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, das es erlaubt, hydrophobe Proteine, Proteinfragmente und -modifikationen sowie stark hydrophobe Peptide zu trennen und zu quantifizieren.The aim of the invention is to provide a method which allows hydrophobic proteins, Separate and quantify protein fragments and modifications as well as highly hydrophobic peptides.

Ein weiteres Ziel ist, eine Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Bestimmung von, z. B. durch Acetylierung oder Oxydation, geringfügig modifizierten Proteinen möglich macht.Another goal is to provide a method that enables the determination of, e.g. B. by Acetylation or oxidation, slightly modified proteins possible.

Ein weiteres Ziel ist es, ein solches Verfahren anzugeben, das sich insbesondere zur Bestimmung von hydrophoben Host-Cell-Proteinverunreinigungen (HCP) bei der biotechnologischen Produktion von hydrophoben Proteinen, wie z. B. des äußerst hydrophoben Lungsurfactantproteins SP-C, eignet.Another goal is to specify such a method, which is particularly suitable for determining Hydrophobic host cell protein contaminants (HCP) in the biotechnological production of hydrophobic proteins, such as B. the extremely hydrophobic lung surfactant protein SP-C, is suitable.

Es wurde nun gefunden, daß diese Ziele erreicht werden durch dünnschichtchromatographische Trennung des in einem organischen Medium gelösten Proteingemischs und immunologische Detektion der aufgetrennten Proteine.It has now been found that these goals are achieved by thin layer chromatography Separation of the protein mixture dissolved in an organic medium and immunological detection of the separated proteins.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Trennung und Quantifizierung von stark hydro phoben Proteinen, Proteinfragmenten und -modifikationen sowie von stark hydrophoben Peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die zu untersuchenden Proben in einem organischen Medium gelöst werden, einer Dünnschichtchromatographie unterworfen werden und die hydrophoben Proteine immunologisch sichtbar gemacht werden.The invention therefore relates to a method for the separation and quantification of strongly hydro phobic proteins, protein fragments and modifications as well as strongly hydrophobic peptides, the characterized in that the samples to be examined are dissolved in an organic medium be subjected to thin layer chromatography and the hydrophobic proteins be made immunologically visible.

Weitere Gegenstände ergeben sich aus den Unteransprüchen.Further objects result from the subclaims.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß für den Schritt der dünnschichtchromatographischen Trennung an sich bekannte Vorgehensweisen und Materialien, die an die hydrophoben Eigenschaften der zu trennenden Proteine angepaßt wurden, zielführend sind. Als Chromatographie-Platten kommen alle Platten in Frage, deren Beschichtung sich zur Trennung von hydrophoben Mischungen in organi schen Medien eignen. Als besonders geeignet erwiesen sich hiervon die von der Firma Merck Darm stadt unter dem Handelsnamen Diol vertriebenen HPTLC-Platten, die eine modifizierte Silica-Matrix aufweisen. Als Laufmittel für die Dünnschichtchromatographie eignen sich für hydrophobe Proteine organische Lösungsmittel und Lösungsmittelgemische, z. B. aus Chloroform und Methanol. Besonders zweckmäßig sind Gemische von unpolaren und polaren Lösungsmitteln, wobei als unpolare Lösungs mittel insbesondere Chloroform, Methylenchlorid und Toluol und als polare Lösungsmittel kurzkettige Alkohole, insbesondere Methanol, Ethanol und Isopropanol in Frage kommen.It was surprisingly found that for the step of thin layer chromatography Separation of procedures and materials known per se, based on the hydrophobic properties the proteins to be separated have been adapted are expedient. Coming as chromatography plates all plates in question, the coating of which separates hydrophobic mixtures into organic media. Of these, those from Merck Darm proved to be particularly suitable is sold under the trade name Diol HPTLC plates, which have a modified silica matrix exhibit. Suitable solvents for thin layer chromatography for hydrophobic proteins organic solvents and solvent mixtures, e.g. B. from chloroform and methanol. Especially Mixtures of non-polar and polar solvents are expedient, with non-polar solutions medium in particular chloroform, methylene chloride and toluene and short-chain as polar solvent Alcohols, especially methanol, ethanol and isopropanol come into question.

Das Auftragen der Proben auf die Platten sowie die Durchführung der Trennung erfolgen auf übliche Weise, beispielsweise mittels handelsüblicher Automaten.The samples are applied to the plates and the separation is carried out in the usual way Way, for example by means of commercial machines.

Zur Vorbereitung auf die immunologische Detektion werden die Platten nach der dünnschichtchromato graphischen Trennung getrocknet. Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen werden die Platten mit einer geeigneten Blockierlösung, z. B. Gelatine oder Proteine, inkubiert. Die Platten werden dann mit dem primären Antikörper inkubiert. Trägt dieser keine Markierung, kann die Detektion mit Hilfe eines markierten zweiten Antikörpers erfolgen. Für die Detektion können alle gängigen Detektions verfahren angewendet werden. Nach Entfernen von überschüssigem erstem Antikörper durch Waschen wird mit einem markierten sekundären Antikörper inkubiert. Nach dem Waschen werden die markierten Antikörper detektiert. Deren Visualisierung erfolgt auf übliche Weise, z. B. durch Zusatz von Luminol und Wasserstoffperoxid, beispielsweise unter Zuhilfenahme des ECL(Enhanced Chemiluminescence)- Detektionsverfahrens der Firma Amersham Buchler, welches sehr sensitiv ist. Bei der Reinheitsanalyse im Hinblick auf geringfügige chemische Modifikationen können die Substanzen auf den DC-Plättchen direkt nach der Trennung auch mit üblichen Proteinfärbereagenzien nachgewiesen werden. To prepare for the immunological detection, the plates are after the thin layer chromatography graphic separation dried. The plates are used to saturate non-specific binding sites with a suitable blocking solution, e.g. B. gelatin or proteins, incubated. The plates are then incubated with the primary antibody. If this does not have a label, the detection can be done with the help a labeled second antibody. For the detection all common detection can procedures are applied. After removing excess first antibody by washing is incubated with a labeled secondary antibody. After washing, the marked ones Antibody detected. They are visualized in the usual way, e.g. B. by adding luminol and hydrogen peroxide, for example with the help of ECL (Enhanced Chemiluminescence) - Detection method by Amersham Buchler, which is very sensitive. In the purity analysis With regard to minor chemical modifications, the substances on the TLC plates can directly after the separation can also be detected with conventional protein staining reagents.

Im folgenden wird die Erfindung exemplarisch anhand eines Verfahrens zur Bestimmung der Host-Cell- Proteinverunreinigungen in einem biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von r-SP-C mittels E. coli beschrieben.In the following, the invention is exemplified on the basis of a method for determining the host cell Protein contamination in a biotechnological process for the production of r-SP-C using E. coli described.

example 1. Obtaining HCP for immunization purposes

Im Einklang mit literaturbekannten Vorgehensweisen und mit einschlägigen behördlichen Vor schriften wurde eine Antigenfraktion aus der Endphase des Downstream-Prozesses angestrebt. Deshalb wurden für die Immunisierung HCPs aus einer Fermentationsphase entnommen, bei der das r-SP-C zu 80 bis 90% rein ist. Zur Entnahme der HCP-Antigenfraktion wurden 60 g Einschluß körper (inclusion bodies) aus einer 10 l Leerfermentation (blank fermentation) benutzt. Diese Ein schlußkörper wurden in derselben Art und Weise aufgearbeitet wie dies nach dem Herstel lungsprotokoll zur Reinigung des r-SP-C-Proteins geschieht.In accordance with procedures known from the literature and with relevant official requirements An antigen fraction from the final phase of the downstream process was targeted. For this reason, HCPs were taken from a fermentation phase during which the r-SP-C is 80 to 90% pure. 60 g of inclusion was taken to remove the HCP antigen fraction bodies (inclusion bodies) from a 10 l empty fermentation (blank fermentation) are used. This one Final bodies were worked up in the same way as this after the manufacture protocol for the purification of the r-SP-C protein is done.

2. Production of Antisera

1 mg HCP, gelöst in 95%igem Isopropanol vom pH-Wert 2 wurde in einem Vakuum-Konzentrator (speedvac® zur Trockne gebracht, in 0,5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline) resuspendiert, mit 0,5 ml Adjuvans (ABM-S für die Basisimmunisierung und AMB-N für die Boosterinjektionen) gemischt und jeweils in einer Menge von 1 mg Kaninchen subkutan injiziert. Das Immunisierungsschema erfolgte nach Standardprotokollen: Nach der Primärimmunisierung erfolgten bis zu sechsmal alle 4 Wochen Boosterinjektionen. Blutabnahmen erfolgten jeweils 10 Tage nach der letzten Injektion, um die Entwicklung des Titers zu verfolgen. Sobald der Titer zufriedenstellend war, wurden 50 ml Blut abgenommen und nach Standardverfahren Serum hergestellt.1 mg of HCP, dissolved in 95% isopropanol of pH 2, was in a vacuum concentrator (speedvac® brought to dryness in 0.5 ml phosphate buffered saline (phosphate buffered saline), with 0.5 ml adjuvant (ABM-S for the basic immunization and AMB-N for the Booster injections) mixed and injected subcutaneously in an amount of 1 mg rabbit. The immunization schedule was based on standard protocols: after primary immunization there were booster injections up to six times every 4 weeks. Blood samples were taken 10 times each Days after the last injection to monitor the development of the titer. As soon as the titer was satisfactory, 50 ml of blood was drawn and serum by standard procedures produced.

3. Determination of the titer

Zur Bestimmung des Titers wurden die individuellen Seren bei verschiedenen Verdünnungen mittels der als Immuno-Dünnschichtchromatographie (Immuno-TLC) bezeichneten neuen Methode analy siert. Verdünnungen von 1 : 5000, 1:10000, 1 : 20000 und 1 : 50000 wurden verwendet, um 4, 16, 62,5 und 250 ng HCP zu analysieren. Bei einer Verdünnung von 1 : 10000 erkannten alle unter suchten Kaninchen-Antikörper HCP-Komponenten im Verhältnis zu der Menge an Gesamtprotein. Antisera mit ähnlichem Titer wurden gepoolt und reanalysiert. Das Serum wurde nach Standard verfahren charakterisiert und in Aliquots bei -20°C gelagert.To determine the titer, the individual sera were used at various dilutions the new method called immuno-thin layer chromatography (Immuno-TLC) siert. Dilutions of 1: 5000, 1: 10000, 1: 20000 and 1: 50000 were used to make 4, 16, Analyze 62.5 and 250 ng HCP. At a dilution of 1: 10000, everyone recognized Rabbit antibodies looked for HCP components in relation to the amount of total protein. Antisera with a similar titer were pooled and reanalysed. The serum became standard characterized and stored in aliquots at -20 ° C.

4. Sample preparation and thin layer chromatography (TLC)

Die zu analysierenden Proben wurden in einem Vakuum-Konzentrator getrocknet und in 20 bis 200 µl CHCl₃/MeOH gelöst. Für die Dünnschichtchromatographie wurden HPTLC-Platten mit einer veränderten Silica-Matrix, wie sie von der Firma Merck Darmstadt unter dem Handelsnamen Diol vertrieben werden, benutzt. Das Auftragen der Proben auf die HPTLC-Platten wurde automatisch unter Benutzung eines Lingomat IV (Camag, Berlin) ausgeführt. Nach dem Probenauftrag wurden die Platten luftgetrocknet und ein der Chromatographie unter Benutzung einer CHCl₃ : MeOH- Mischung [CHCl₃/MeOH/25%ige NH₄OH/H₂O = 32,5/15/112 (Volumenverhältnis)] als flüssige Phase unterworfen. Nach der Chromatographie wurden die Platten getrocknetThe samples to be analyzed were dried in a vacuum concentrator and in 20 to 200 ul CHCl₃ / MeOH dissolved. For thin layer chromatography, HPTLC plates with a changed silica matrix, such as that from Merck Darmstadt under the trade name Diol are distributed, used. The application of the samples to the HPTLC plates became automatic carried out using a Lingomat IV (Camag, Berlin). After the sample order were placed the plates are air-dried and chromatographed using a CHCl₃: MeOH Mixture [CHCl₃ / MeOH / 25% NH₄OH / H₂O = 32.5 / 15/112 (volume ratio)] as a liquid Phase subjected. After the chromatography, the plates were dried

5. Immunostaining of HCP with anti-HCP antibodies

Zur Absättigung von nichtspezifischen Bindungsstellen wurden die getrockneten HPTLC-Platten für 4 Stunden mit 3%iger Fisch-Gelatine in PBS, die 150 mM NaCl, 12 mM Na₂HPO₄ und 3 mM NaH₂PO₄ (pH 7,4) enthielt, inkubiert. Danach wurden die Platten über Nacht inkubiert und in Gegenwart des primären Antikörpers gewöhnlich bei einer Verdünnung von 1 : 10000 leicht ge schüttelt. Ungebundene Antikörper wurden durch mehrmaliges Waschen mit TBS/T aus 4 mM Tris- HCl, 100 mM NaCl, 0,05% Tween-20 (pH 7,4) entfernt. Zur Hybridisierung mit dem Primäranti körper wurden die Platten 2 Stunden mit Meerrettichperoxidase konjugiertem Sekundärantikörper bei einer Verdünnung von 1 : 80000 im TBS/T inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden wie oben beschrieben durch mehrmaliges Waschen der Platten mit TBS/T entfernt. Immunreaktive Komplexe wurden unter Verwendung von ECL-Detektionssystems von Amersham Buchler visualisiert. Die Platten wurden für 20 bis 60 Sekunden mit einem Röntgenfilm (Hyperfilm Amersham) inkubiert.The dried HPTLC plates were used to saturate non-specific binding sites for 4 hours with 3% fish gelatin in PBS, the 150 mM NaCl, 12 mM Na₂HPO₄ and 3 mM Contained NaH₂PO₄ (pH 7.4), incubated. The plates were then incubated overnight and in Presence of the primary antibody usually at a 1: 10,000 dilution shakes. Unbound antibodies were washed by washing with TBS / T from 4 mM Tris HCl, 100mM NaCl, 0.05% Tween-20 (pH 7.4) removed. For hybridization with the primary anti The plates were made into a secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase for 2 hours incubated at a dilution of 1: 80000 in TBS / T. Unbound antibodies were as above described by washing the plates several times with TBS / T. Immunoreactive complexes were visualized using Amersham Buchler's ECL detection system. The Plates were incubated with an X-ray film (Hyperfilm Amersham) for 20 to 60 seconds.

6. Staining and immunostaining of SP-C

Um Modifikationen an SP-C zu detektieren (z. B. Methylester am C-Terminus und Methionin sulfoxid) können die mittels DC getrennten Proteinformen über Anfärbung mit Ponceau S detektiert werden. Eine sensitivere Möglichkeit besteht in dem Einsatz von SP-C Antikörpern und der oben angegebenen Methode in Analogie zu der HCP-Bestimmung.To detect modifications at SP-C (e.g. methyl ester at the C-terminus and methionine sulfoxide), the protein forms separated by TLC can be detected by staining with Ponceau S. will. A more sensitive option is the use of SP-C antibodies and the above specified method in analogy to the HCP determination.

7. Video imaging of the X-ray films and computer evaluation

Zur Quantifizierung der Immunkomplexe wurden die Röntgenfilme mit einem Video-Imager (Cybertech, Berlin, Deutschland) digitalisiert. Die Signalintensitäten auf den Röntgenfilmen wurden durch Computer-Auswertung unter Benutzung der Software Wincam (Cybertech) ausgewertet.To quantify the immune complexes, the X-ray films were taken with a video imager (Cybertech, Berlin, Germany) digitized. The signal intensities on the X-ray films were evaluated by computer analysis using the software Wincam (Cybertech).

8. Quantification of HCP

Zur Bestimmung von HCP in r-SP-C-Proben wurden Teilmengen pur oder nach Zusatz von 2,5, 5,0 bzw. 10,0 ng HCP analysiert. Die Mengen von HCP in den individuellen Proben wurden durch linea re Regressionsrechnung bestimmt. Prozentwerte wurden durch die Formel % = (ng HCP × 100)/ng r-SP-C bestimmt.To determine HCP in r-SP-C samples, subsets were added neat or after adding 2.5, 5.0 or 10.0 ng HCP analyzed. The amounts of HCP in the individual samples were determined by linea re regression calculation determined. Percentages were calculated using the formula% = (ng HCP × 100) / ng r-SP-C determined.

Um geringe Mengen von HCP in r-SP-C zu quantifizieren, ist es notwendig den Hauptteil des Zielproteins von dem geringen Anteil von HCP zu trennen. Dies wird durch Dünnschichtchromato graphie bewerkstelligt. Die Nachweisgrenze für HCP wurde analysiert durch Versetzen von 5 µg hochreinem r-SP-C mit ng-Mengen von HCP. Unter diesen Bedingungen waren 0,125 ng HCP die geringste Menge, die von dem endogenen HCP-Gehalt von r-SP-C unterschieden werden konnte. Die Menge der Probe, die durch Immuno-TLC analysiert werden kann, hängt von dem HCP-Gehalt ab. Für r-SP-C-Proben, die weniger als 0,1% HCP enthalten, werden 1 bis 5 µg r-SP-C analysiert. Da es möglich ist, Mengen von r-SP-C bis zu 20 µg durch Dünnschichtchromatographie zu separieren und die Quantifizierungsgrenze bei der Luminographie 1 ng beträgt (bei Benutzung von 5 µg zugesetztem r-SP-C), konnte HCP theoretisch bis hinunter zu 0,005% detektiert werden. Der Nachweis von 0,002% HCP erscheint als verläßliche Quantifizierungsgrenze unter Standardbedingungen.To quantify small amounts of HCP in r-SP-C, it is necessary to do most of the Separate the target protein from the small amount of HCP. This is done by thin layer chromatography graphic accomplished. The detection limit for HCP was analyzed by adding 5 µg high purity r-SP-C with ng quantities of HCP. Under these conditions, 0.125ng HCP was the smallest amount that could be distinguished from the endogenous HCP content of r-SP-C. The amount of sample that can be analyzed by Immuno-TLC depends on the HCP content from. For r-SP-C samples containing less than 0.1% HCP, 1 to 5 µg r-SP-C are analyzed. Since it is possible to add amounts of r-SP-C up to 20 µg by thin layer chromatography separate and the quantification limit for luminography is 1 ng (when using 5 µg added r-SP-C), HCP could theoretically be detected down to 0.005%. Of the Detection of 0.002% HCP appears as a reliable quantification limit below Standard conditions.

Claims

1. A method for the separation and determination of highly hydrophobic proteins, protein fragments and modifications and of highly hydrophobic peptides, characterized in that the samples to be examined are dissolved in an organic medium, subjected to a thin layer chromatography and the hydrophobic proteins are detected.

2. The method according to claim 1, characterized in that the detection by immuno logical methods are done.

3. The method according to claim 1, characterized in that the detection by Staining methods are carried out.

4. The method according to claim 1, characterized in that for the thin layer chromato plates coated with a modified silica matrix can be used.

5. The method according to claim 1, characterized in that Gemi as the organic medium ces of solvents are used in which highly hydrophobic proteins or peptides are soluble.

6. The method according to claim 5, characterized in that Gemi as the organic medium chloroform and methanol can be used.