DE19618032C2 - Shelf-life pre-prepared MALDI sample carrier - Google Patents

Shelf-life pre-prepared MALDI sample carrier

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DE19618032C2
DE19618032C2 DE1996118032 DE19618032A DE19618032C2 DE 19618032 C2 DE19618032 C2 DE 19618032C2 DE 1996118032 DE1996118032 DE 1996118032 DE 19618032 A DE19618032 A DE 19618032A DE 19618032 C2 DE19618032 C2 DE 19618032C2
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    • H01BASIC ELECTRIC ELEMENTS
    • H01JELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02Details
    • H01J49/04Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
    • H01J49/0409Sample holders or containers
    • H01J49/0418Sample holders or containers for laser desorption, e.g. matrix-assisted laser desorption/ionisation [MALDI], surface enhanced laser desorption/ionisation [SELDI] plates

Description

Die Erfindung betrifft vorpräparierte Probenträger für die matrixunterstützte ionisierende La serdesorption großer Analytmoleküle (MALDI) zur Erzeugung von Ionen der Analytsubstanz für deren massenspektrometrische Untersuchung. The invention relates to pre-prepared sample holder for matrix-assisted ionizing La serdesorption large analyte molecules (MALDI) for generating ions of the analyte for the mass spectrometric analysis.

Das Verfahren der massenspektrometrischen Untersuchungen von großmolekularen Analyt substanzen mit Ionisierung durch laserinduzierte Desorption besteht darin, den Probenträger mit oberflächlich aufgebrachter Analytsubstanz einem Lichtpuls aus einem Laser auszusetzen, der auf die Probenoberfläche fokussiert wird. The method of mass spectrometric investigations of large molecule analyte substances with ionization by laser-induced desorption is to expose the sample support with surface-applied analyte a light pulse from a laser which is focused onto the sample surface. Dieser Lichtpuls erzeugt Ionen der Analytmole küle, die dann mit ionenoptischen Mitteln der massenspektrometrischen Analyse zugeführt werden. This light pulse generates ions of the molecules Analytmole, which are then supplied with ion-optical means of mass spectrometric analysis. Es finden dabei insbesondere Flugzeitmassenspektrometer, aber auch ionenspeichern de Massenspektrometer, wie Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen (häufig einfach "Ionen fallen" genannt) oder Ionen-Zyklotron-Resonanz-Massenspektrometer ("ICR-Spektrometer"), Anwendung. It found in particular flight mass spectrometer, as well as ion-store de mass spectrometer, such as high-frequency quadrupole ion trap (often simply "fall ions" called) or ion cyclotron resonance mass spectrometer ( "ICR spectrometer") application.

Für den besonderen Fall der Flugzeitmassenspektrometrie wird der Probenträger konstant auf eine Hochspannung zwischen 6 und 30 Kilovolt gelegt, dem in einer Entfernung von 10 bis 20 Millimetern eine Grundelektrode auf Erdpotential gegenüberliegt. For the particular case of flight mass spectrometry, the sample carrier is constantly set to a high voltage 6 to 30 kV, to which a ground electrode is opposed to a spacing of 10 to 20 mm at ground potential. Ein Laserpuls von typi scherweise etwa 4 Nanosekunden Dauer übernimmt die Ionisierung. A laser pulse of typi cally about 4 nanoseconds assumes the ionization. Die Ionen werden durch das elektrische Feld zur Grundelektrode hin beschleunigt und erhalten dabei alle die gleiche kinetische Energie. The ions are accelerated by the electric field to the base electrode back and thereby obtained all the same kinetic energy. Jenseits der Grundelektrode befindet sich die feldfreie Flugstrecke des Flugzeitmassenspektrometers. Beyond the basic electrode is the field-free flight path of flight mass spectrometer. Am Ende der Flugstrecke werden die ankommenden Ionen de tektiert, aus ihrer Flugzeit läßt sich - bei gleicher kinetischer Energie - ihre Masse bestimmen. At the end of the route the incoming ions are de tektiert, can be calculated from their flight time - with the same kinetic energy - determine their mass. Bei Verwendung von ionenspeichernden Massenspektrometern wie Quadrupol-Ionenfallen oder ICR-Spektrometern werden die desorptiv erzeugten Ionen mit ionenoptischen Mitteln in die Speicherzellen der Massenspektrometer überführt und dort massenspektrometrisch unter sucht. When using ion-storage mass spectrometers such as quadrupole ion traps or ICR spectrometers, the ion desorption generated are transferred with ion-optical means into the memory cells of the mass spectrometer, and there investigated by mass spectrometry.

Für die Ionisierung von großen Analytmolekülen durch die weithin bekannte matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI = matrix assisted laser desorption and ionization), die in den vergan genen Jahren eine große Verbreitung gefunden hat, werden die großen Moleküle der Analyt substanz auf dem Probenträger in eine Schicht winziger Kristalle einer niedermolekularen Ma trixsubstanz eingelagert (siehe dazu DE 41 43 071 C2). For ionization of large molecules through the well-known matrix-assisted laser desorption (MALDI = matrix assisted laser desorption and ionization), which has found a widespread use over the past few years, the large molecules of analyte are substance on the sample carrier in a layer of tiny crystals a low molecular weight Ma trixsubstanz incorporated (see DE 41 43 071 C2). Der Laserlichtpuls verdampft praktisch momentan eine geringe Menge der Matrixsubstanz. The laser light pulse evaporates almost instantaneously a small amount of matrix substance. Die Dampfwolke nimmt zunächst praktisch den gleichen Raum ein wie die Festsubstanz, steht also unter hohem Druck. The vapor cloud initially assumes practically the same space as the solid substance, that is under high pressure. Auch die großen Analytmoleküle werden in die zunächst winzige Dampfwolke überführt. The large analyte molecules are transferred into the first tiny cloud of steam. Bei der Bildung der Dampfwolke wird ein geringer Teil der Moleküle, und zwar sowohl der Matrix- wie auch der großen Analytmoleküle, ionisiert. In forming the vapor cloud is a small fraction of molecules, both the matrix as well as the large analyte molecules are ionized. Anschließend dehnt sich die Dampfwolke in einem adiabati schen und isentropischen Prozess ähnlich einer Explosion in das umgebende Vakuum aus. Then the vapor cloud expands in a adiabati rule and isentropic process similar to an explosion into the surrounding vacuum. So lange während der Ausdehnung der Dampfwolke noch Kontakt der Moleküle untereinander besteht, findet durch Ionen-Molekül-Reaktionen eine fortgesetzte Ionisierung der großen Analytmoleküle auf Kosten der kleineren Matrixionen statt. As long as the expansion of the vapor cloud even contact of the molecules is among themselves, continued ionization of large analyte molecules takes place by ion-molecule reactions at the expense of the smaller matrix ions.

Die ins Vakuum expandierende Dampfwolke beschleunigt durch ihre adiabatische Ausdehnung nicht nur die Moleküle und Ionen der Matrixsubstanz, sondern durch viskose Mitnahme auch die Moleküle und Ionen der Analytsubstanz. The expanding into the vacuum vapor cloud accelerated by its adiabatic expansion, not only the molecules and ions of the matrix substance, but by viscous drag the molecules and ions of the analyte. Die dabei auftretende Streuung der Anfangsge schwindigkeiten bei laserinduzierter Ionisierung beeinträchtigt und begrenzt die Massenauflö sung der Flugzeitmassenspektrometer. The thereby occurring scattering of Anfangsge speeds impaired in laser-induced ionization and limits the Massenauflö solution of flight mass spectrometer. Es gibt jedoch eine Methode, die Ionen wieder zeitlich zu fokussieren und damit das Auflösungsvermögen zu verbessern. However, there is again time to focus the ion and thus improving the resolution of a method.

Für die anderen genannten Arten der Massenspektrometrie ist die Streuung der Anfangsener gien ebenfalls schädlich, da sie den Einfangprozess der Ionen in den Speicherzellen erschwert. For the other mentioned types of mass spectrometry, the spread of initial Sener technologies is also harmful because it complicates the capture process of the ions in the memory cells. Hier ist noch keine Methode zur Verbesserung des Einfangs bekannt. There is still no method for improving the capture known.

Die Matrixsubstanz muß gegenwärtig verschiedenartige Aufgaben gleichzeitig erfüllen, wobei stets nur ein gewisser Kompromiß erreicht werden kann: Sie muß die Analytmoleküle in ihre Kristalle aufnehmen und über das Aufwachsen der Kristalle auf dem Probenträger festhalten. The matrix substance must fulfill various tasks simultaneously present, always only some compromise can be achieved: it must absorb the analyte molecules in their crystals and hold on the growth of crystals on the sample carrier. Sie muß das Licht der Laserstrahlung effektiv absorbieren und so in kürzester Zeit genügend Energie für die momentane Verdampfung aufnehmen. They must absorb the light of the laser radiation effectively and absorb enough energy for the instantaneous evaporation so in no time. Während der Verdampfung muß sie eine solch hohe Plasmatemperatur erreichen, daß ein nicht zu kleiner Bruchteil der Moleküle ioni siert vorliegt, andererseits darf die Matrixsubstanz nicht - etwa durch Zersetzung - ihre zur Ionisierung befähigenden Eigenschaften verlieren. During evaporation, it has to reach such a high temperature plasma that a not too small fraction of the molecules present ioni Siert, on the other hand, the matrix substance must not - for example by decomposition - lose their empowering ionization properties. Sie muß dann im anschließenden Ionisie rungsprozeß die großen Analytmoleküle durch Protonierung ionisieren. You must then repeated in subsequent Ionisie approximately process the large analyte molecules ionize by protonation.

Dieses Aufgabenspektrum ist sehr schwierig zu erfüllen; This range of tasks is very difficult to meet; die Matrixsubstanzen sind daher recht komplexer Natur. the matrix substances are therefore complex in nature.

Bisherige Präparationsmethoden verlangen eine frische Präparation, wobei Analyt und Matrix zu gleicher Zeit in einer Lösung auf den Probenträger gebracht und dort getrocknet werden. Previous methods of preparation require a fresh preparation, said analyte and matrix are brought at the same time in a solution on the sample carrier and dried there. Dieses Verfahren verfolgt das Ziel, die Analytmoleküle in die Mikrokristalle der Matrixsub stanz einzuschließen, die sich beim Trocknen des aufgebrachten Tröpfchens bilden. This method aims to include the analyte molecules in the microcrystals of the Matrixsub substance that form upon drying of the applied droplet. Es sind nur einige wenige Verfahren bekannt geworden, erst die Matrixsubstanz und später die Analytsub stanz auf den Probenträger aufzubringen, und diese Verfahren verlangen zumeist ein zumindest teilweises Anlösen der vorher aufgebrachten Matrixkristalle (siehe beispielsweise GB 2 236 185 A, GB 2 235 528 A und GB 2 235 529 A, besonders mit Aufsprühen der Matrixschicht). There are only a few methods become known until the matrix substance and later the Analytsub substance to the sample carrier to apply, and these procedures usually require an at least partial solubilization of previously deposited matrix crystals (see for example GB 2236185 A, GB 2235528 A and GB 2,235,529 A, especially with spraying the matrix layer).

Auch eine vorpräparierte, lackartige Matrixschicht ist bekanntgeworden (GB 2 287 315 A). Also, a pre-prepared, paint-like matrix layer has become known (GB 2287315 A).

Selbst bei einer Vorpräparation der Matrixschicht und späterem Aufbringen der Analytsubstanz muß die Matrixschicht relativ frisch aufgebracht werden. Even with a pre-preparation of the matrix layer and later application of the analyte, the matrix layer must be relatively freshly applied. Der Grund dafür ist, daß die bisher bekannt gewordenen Matrixsubstanzen ganz überwiegend empfindlich gegenüber Oxidation, Hydrolyse und anderen verändernden Prozessen durch Luftbestandteile sind und sich daher leicht zersetzen. The reason is that the hitherto known matrix substances are predominantly sensitive to oxidation, hydrolysis and other processes by changing atmospheric composition and therefore decompose easily. Sie sind - besonders in der feinen Verteilung auf der Oberfläche einer Träger platte - spätestens nach einigen Tagen für den vorliegenden Zweck der Ionisation unbrauchbar. They are - particularly in fine distribution on the surface of a carrier plate - after a few days at least for the present purpose of ionization unusable. Selbst die längere Lagerung der Matrixsubstanzen in angebrochenen Flaschen ist kritisch und nicht zu empfehlen. Even the prolonged storage of the matrix substances in opened bottles is critical and not recommended.

Diese Verfahren sind also nicht geeignet, große Anzahlen von MALDI-Trägerplatten vorzu präparieren und dann zu verbrauchen. Thus, these methods are not suitable for preparing large numbers of MALDI carrier plates vorzu and then consume. Insbesondere sind sie nicht für eine industrielle Vorprä paration verkaufbarer Probenträger geeignet. In particular, they are not suitable for industrial Vorprä paration salable sample carrier.

Darüberhinaus sind Verfahren bekannt geworden, die Analytmoleküle beim Aufbringen auf den Probenträger in situ zu verändern, um die Aussagefähigkeit der massenspektrometrischen Un tersuchungsmethode zu vergrößern. Furthermore, processes have been disclosed to modify the analyte molecules, when applied to the sample carrier in situ to tersuchungsmethode to increase the meaningfulness of the mass spectrometric Un. Beispielsweise können Proteine durch einen tryptischen oder andersartigen enzymatischen Verdau in charakteristischer Weise so in Bruchstücke zer legt werden, daß über eine Messung der Molekulargewichte dieser Bruchstücke eine sofortige Identifizierung des aufgebrachten Proteins anhand von Protein-Datenbanken möglich wird. For example, proteins may be prepared by tryptic or other types of enzymatic digestion in a characteristic manner so sets zer in fragments are that by measuring the molecular weights of these fragments immediate identification of the applied protein based on protein databases is possible. Krankhafte Veränderungen eines bekannten Proteins können ebenfalls durch einen solchen Verdau mit anschließender Messung der Molekulargewichte der Bruchstücke festgestellt wer den, wobei es sogar möglich ist, das veränderte Teilstück der Proteinkette zu erkennen. Abnormal changes of a known protein may also determined by such digestion followed by measuring the molecular weights of the fragments who to, and it is even possible to detect the altered portion of the protein chain. Die dazu notwendigen Enzyme sind relativ stabil. The necessary enzymes are relatively stable. Sie könnten einer vorpräparierten Matrix schicht beigegeben werden, wenn diese haltbar vorpräpariert werden könnte und wenn die En zyme nicht in direkter Berührung zu den meist sauren Ionisiersubstanzen der Matrix aufge bracht werden könnten. They could be added to a pre-prepared matrix layer if it could be pre-prepared durable and could be introduced if the En zyme not in direct contact to the most acidic Ionisiersubstanzen the matrix up. Da es jedoch keine lagerfähige Matrixpräparation gibt, verlangt auch diese Methode jeweils frischen Ansatz. However, since there is no storable matrix preparation, this method also requires each fresh approach. Sie ist damit sehr aufwendig. It is therefore very expensive.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, das Verfahren zur Präparation von MALDI-Schichten und das MALDI-Verfahren der Ionisierung von Analytmolekülen selbst so abzuwandeln, daß eine Vorpräparierung der Probenträger erfolgen kann, und zwar so, daß die Probenträger über län gere Zeit ohne Funktionsverlust gelagert werden können. It is the object of the invention, even as to modify the process for the preparation of MALDI-layers and the MALDI method of ionization of analyte molecules in that a pre-preparation of the sample carrier can be done in such a way that the sample carrier via Lan Gere time stored without loss of function can be. Die vorpräparierten Probenträger sollen es ermöglichen, die Analytmoleküle in einfacher Weise aufzubringen, beispielsweise in der Form automatisch aufpipettierter Tröpfchen. The pretreated sample carrier should make it possible, for example in the form automatically aufpipettierter droplets deposit the analyte in a simple manner. Die Analytsubstanzen sollen von der vorprä parierten Schicht so festgehalten werden, daß sie waschbar werden, um Reste an Puffersub stanzen oder Salzen zu entfernen. The analyte to be held by the vorprä parried layer so as to be washable to punch or residues at Puffersub to remove salts. Es ist also das Ziel, die verwendeten Matrixkomponenten für die Ionisierung der Analytsubstanzen vor Zersetzung während des Transportes oder der Lage rung zu schützen und das Aufbringen der Analytmoleküle zu erleichtern. It is therefore the aim of protecting the used matrix components for the ionization of the analyte from decomposition during transportation or able tion and to facilitate the application of the analyte molecules. Es soll insbesondere möglich sein, vorpräparierte Probenträger industriell herstellbar und vertreibbar zu machen. It should in particular be possible to make pre-prepared sample carrier industrialize and distributable.

Darüber hinaus sollen auch Vorpräparierungen unter Einschluß anderer Reaktionspartner er möglicht werden, beispielsweise mit Enzymen zum charakteristischen Verdau von Proteinen, aber auch mit anderen Chemikalien zur gezielten Veränderung der Analytsubstanzen. In addition, he should be Vorpräparierungen enables the inclusion of other reactants, such as enzymes for digestion of proteins characteristic, but also with other chemicals for the targeted modification of the analyte.

Die Erfindung soll einen MALDI-Probenträger mit hoher Ionenausbeute und hoher Empfind lichkeit liefern, um mit eingesetzten Probenmengen von nur wenigen Femtomol arbeiten zu können. The invention is to provide a MALDI sample carrier with high ion yield and high sensitivity respectively, in order to work with inserted sample volumes of only a few femtomols. Er soll darüber hinaus durch eine gleichmäßige Schicht automatisch ablaufende MALDI-Prozesse ermöglichen. It should also enable self-running by a uniform layer MALDI processes.

Es ist der Grundgedanke der Erfindung, das Aufgabenspektrum, das die Matrixsubstanz zu erfüllen hat, auf zwei oder mehr Substanzkomponenten aufzuteilen, und dabei einer Substanz komponente die zusätzliche Aufgabe des Schutzes der anderen Substanzkomponenten zuzu weisen. It is the basic idea of ​​the invention, the range of tasks that has to comply with the matrix substance, distributed between two or more components substance, while a substance component, the additional task of protecting the other components have zuzu substance. Dabei liegt der Erfindung die experimentell gewonnene Erkenntnis zugrunde, daß für einen erfolgreichen MALDI-Prozess die Analytmoleküle und die Moleküle der ionisierenden Substanzkomponente nicht schon im festen Zustand in Berührung sein müssen. Here, the invention is based on the knowledge obtained experimentally based on the analyte molecules and the molecules of the ionizing substance component is not already in the solid state must be in contact for a successful MALDI process. Diese Berüh rung im festen Zustand, im idealen Fall der Einbau der Analytmoleküle in die Mikrokristalle der Matrixsubstanz, war bisher das Ziel aller Präparationsverfahren. This Berüh tion in the solid state, in the ideal case, the installation of the analyte in the microcrystals of the matrix substance, has been the goal of all preparation methods.

Eine Aufteilung des Aufgabenkatalogs auf zwei Substanzen kann nach diesem Grundgedanken der Erfindung etwa so aussehen: A division of the object catalog two substances may look like according to this basic idea of ​​the invention:

  • a) eine erste Matrixsubstanz (ein "Binder") übernimmt die adsorptive Bindung der Analy moleküle an einer vorzugsweise glatten Oberfläche, sie übernimmt die Bindung an die Unterlage, sie kann vorzugsweise die Energieabsorption übernehmen, sie übernimmt ins besondere die Bildung der Plasmawolke und sie übernimmt zusätzlich nach dem Grundge danken dieser Erfindung den Schutz der ionisierenden Matrixkomponente; a) a first matrix substance (a "binder") takes over the adsorptive binding of Analy molecules on a preferably smooth surface, it takes over the binding to the support, it may preferably take the energy absorption, it assumes in particular the formation of the plasma cloud, and it accepts in addition to the Grundge this invention, thanks to the protection of ionizing matrix component;
  • b) mindestens eine weitere Matrixsubstanz (ein "Ionisierer"), die vorzugsweise molekular in der ersten Substanz gelöst ist, übernimmt die Ionisierung der Analytmoleküle in der Plas mawolke; b) at least one further mawolke matrix substance (an "ionizer"), which is preferably molecularly dissolved in the first substance, accepts the ionization of analyte molecules in der Plas; sie kann aushilfsweise auch die Energieabsorption übernehmen, wenn diese nicht von der ersten oder von weiteren Matrixsubstanzen übernommen wird. it can aushilfsweise take over the energy absorption when it is not taken over by the first or of other matrix materials.

Der Schutz der ionisierenden Matrixkomponenete kann am besten verwirklicht werden, wenn der (oder die) Ionisierer ganz in einer luft- und wasserdichten Masse des Binders eingeschlos sen werden kann. The protection of ionizing Matrixkomponenete can best be realized when the (or) ionizer can be quite an airtight and watertight mass of the binder is Schlos sen. Es ist daher ein weitergehender Gedanke der Erfindung, einen lackartig ver arbeitbaren Binder zu verwenden, der den Ionisierer in molekularer Lösung in die Lackmasse aufnehmen kann. It is therefore a more extensive idea of ​​the invention to use a paint-like ver arbeitbaren binder which can absorb the ionizer in molecular solution in the paint composition.

Es ist nun für den MALDI-Prozess notwendig, daß der Binder die Moleküle des Ionisierers bei der Desorption freigibt. It is now necessary for the MALDI process in that the binder releases the molecules of the ionizer during desorption. Das kann beispielsweise durch vollständige Verdampfung geschehen. This can be done for example by complete evaporation. Da aber lackartige Schichten in der Regel aus polymeren Molekülen aufgebaut sind, ist eine solche vollständige Verdampfung nicht ohne weiteres möglich. Since, however, paint-like coatings are generally built up from polymeric molecules, such complete evaporation is not readily possible. Es ist daher ein weiterer Erfin dungsgedanke, daß der Binder die Freigabe der Moleküle des Ionisierers am besten erfüllen kann, wenn er sich bei Laserlichtbeschuß in kleine Moleküle zersetzt. It is therefore a further OF INVENTION dung thought that the binder can best meet the release of the molecules of the ionizer, when it decomposes in laser light bombardment into small molecules. Als besonders vorteilhaft bieten sich hier polymere Sprengstoffe an, die sich bei Erhitzung durch den Laserstrahl exo therm in die kleinen Moleküle Wasser, Kohlenmonoxid, Kohlendioxid, Stickstoff und Wasser stoff zersetzen. To be particularly advantageous here polymeric explosives are on, which decompose upon heating by the laser beam exo therm in the small molecules of water, carbon monoxide, carbon dioxide, nitrogen and hydrogen. Es muß aber nicht unbedingt ein solch starker exothermer Zersetzungsvorgang wie bei Sprengstoffen sein, auch schwach exotherme oder sogar leicht endotherme Zerset zungsvorgänge, deren Energiezufuhr aus dem Laserlicht stammt, können hier eingesetzt wer den. but it need not necessarily be such a strong exothermic decomposition process as explosives, Zung operations weakly exothermic or endothermic even slightly Zerset whose energy supply comes from the laser light, you will use the who.

Der Binder muß aber auch die Aufgabe der adsorptiven Bindung der Analytmoleküle über nehmen können, da die umschlossenen Moleküle des Ionisierers diese Aufgabe nicht überneh men können. but the binder must be able to take on the task of adsorptive binding of the analyte molecules through because the enclosed molecules of the ionizer men not Unhold this task can. Es ist nun ein weiterer Erfindungsgedanke, hier hochadsorptive Polymerstruktu ren zu benutzen, wie sie etwa aus Adsorptionssäulen zur Reinigung von hochmolekularen or ganischen Stoffen oder von Blotmembranen zum Blotten 2D-elektrophoretischer Trennung bekannt sind. There is now a further inventive idea to use this highly adsorptive Polymerstruktu reindeer, as they are known for example from adsorption columns for the purification of high molecular weight or ganic substances or blot membranes for blotting 2D electrophoretic separation.

Eine hervorragende Kombination einer hochadsorptiven, zur Lackherstellung geeigneten poly mer strukturierten Substanz mit erwünschtem Sprengstoff Charakter ist die Nitrozellulose (korrekter: Zellulosenitrat, Kurzzeichen nach DIN: CN), deren Explosivität sich darüber hinaus durch den Grad der Nitrierung einstellen läßt. An excellent combination of a highly adsorptive, suitable for paint manufacture poly mer structured substance with erwünschtem explosive character is the nitrocellulose (correct: Cellulose nitrate, abbreviations according to DIN: CN), the explosiveness can be adjusted by the degree of nitration beyond. Man spricht bei Stickstoffgehalten zwischen 10,5 und 12,5% von Zellulosedinitrat (Collodiumwolle), bei solchen zwischen 12,5 und 14,14% von Zellulosetrinitraten (Schießbaumwolle). One speaks (gun cotton) in nitrogen content from 10.5 to 12.5% ​​of Zellulosedinitrat (collodion), in such 12.5 to 14.14% of Zellulosetrinitraten. Beide Sorten verpuffen bei Erhitzung, die Ver puffungsheftigkeit nimmt mit höherer Nitrierung zu. Both varieties fizzle when heated, the United increases with higher nitration to puffungsheftigkeit. Zellulosenitrate bestehen aus etwa 100 bis 3500 teil- bis vollnitrierten Glukose-Einheiten. Cellulose nitrates consist of about 100 to 3500 partly to vollnitrierten glucose units.

Der Binder kann, muß aber nicht notwendig die Aufgabe der Lichtabsorption übernehmen. The binder may, but need not necessarily take on the task of light absorption. Diese Aufgabe kann durch eine Derivatisierung des Zellulosenitrats gelöst werden, wobei ab sorptive Molekülgruppen in das Zellulosegerüst eingebaut werden. This object can be achieved by derivatization of cellulose nitrate, which are incorporated into the cellulose backbone from sorptive molecular groups. Durch Wahl der Molekül gruppen kann man sich an die Wellenlänge des verwendeten Lasers anpassen. By choosing the molecule groups can be adapted to the wavelength of the laser used. - Es ist aber auch möglich, diese Aufgabe einer dritten Matrixsubstanz zu übertragen. - It is also possible to assign this task to a third matrix substance. Zellulosenitrat ist hervor ragend färbbar, und kann somit für beliebige Wellenlängen undurchsichtig gemacht werden. Cellulose nitrate is produced outstanding colorable, and can be made opaque for arbitrary wavelengths.

Das Zellulosenitrat kann sehr einfach in Azeton gelöst als Lackschicht auf den Probenträger aufgebracht werden, sowohl durch Sprühen (siehe GB 2 235 528 A und GB 2 235 529 A), Streichen oder Drucken. The cellulose nitrate can be very easily dissolved in acetone are applied as a lacquer layer on the sample carrier, both by spraying (see GB 2,235,528 A and GB 2,235,529 A), painting or printing. Es wird eine gleichmäßige und glatte Schicht erzeugt, die wiederum auch eine Grundvoraussetzung sowohl für die Automatisierbarkeit der Probenvorbereitung und wie auch für die Automatisierbarkeit der MALDI-Ionisierung ist. There is produced a uniform and smooth layer, which in turn is a prerequisite both for the automation of sample preparation and as well as for the automation of the MALDI ionization. Eine gleichmäßige Schicht dicke ist auch für die Genauigkeit der Massenbestimmung notwendig. A uniform layer thickness is also necessary for the accuracy of the mass determination. Aus Zellulosenitrat wer den technisch die sogenannten Nitrolacke hergestellt. Cellulose nitrate who produced the most technically called nitrocellulose lacquers. Nitrolacke verwenden meist das weniger nitrierte Zellulosedinitrat als Grundstoff. Nitrovarnishes usually use the less nitrided Zellulosedinitrat as a raw material. Erst die Nitrierung der Zellulose ermöglicht die Lö sung des entstehenden Produkts in organischen Lösemitteln. Only the nitration of the cellulose allows Lö solution of the resulting product in organic solvents.

Die Zellulosegrundstruktur ist besonders günstig für die oberflächliche Bindung der Analyt moleküle wegen ihrer besonders starken Adsorptivität. The cellulose basic structure is particularly advantageous for the surface binding of the analyte molecules because of their particularly strong adsorptivity. Da Nitrozellulose nicht in Wasser lös bar ist, kann man Proteine, wasserlösliche Polymere und andere großmolekulare Analytsub stanzen sehr einfach aus wässeriger Lösung auf die Lackschicht aufbringen. Since nitrocellulose is not lös bar in water, can be proteins, water-soluble polymers and other high molecular Analytsub punching very easily from an aqueous solution on the layer of varnish applied. Nitrozellulose wird häufig für Blotmembranen verwendet; Nitrocellulose is commonly used for blot membranes; sie hat gegenüber anderen, meist teuereren Blotmem branen den Nachteil, daß die Analytmoleküle sehr fest, für viele Untersuchungsmethoden zu fest, an der Oberfläche haften. it has over other, generally more expensive Blotmem membranes the disadvantage that the analyte molecules very tightly, for many research methods to determine adhere to the surface. Dieser Nachteil ist im vorliegenden Fall ein Vorteil. This disadvantage is an advantage in this case. Die wässe rige Lösung von hochmolekularen Analytsubstanzen wie Proteinen enthält neben den Analyt molekülen häufig noch stabilisierende Puffersalze und andere für den Ionisierungsprozess schädliche Bestandteile. The wässe engined solution of high molecular weight proteins such as analyte contains the analyte molecules often still stabilizing buffer salts and other harmful components for the ionization process. Die feste Haftung der Analytmoleküle und die Wasserunlöslichkeit der Nitrozellulose ermöglicht ein leichtes und verlustarmes Waschen der aufgebrachten großmole kularen Analytsubstanz. The firm adhesion of the analyte molecules and the water insolubility of the nitrocellulose enables easy and low-loss washing the applied großmole secular analyte.

Sprengstoffe mit ihrer exothermen Zersetzung führen auch gleichzeitig zu einer sehr konstan ten Wolkenbildung, dadurch ergeben sich für die Flugzeit-Massenspektrometrie günstige Vor aussetzungen für eine hohe Massengenauigkeit. Explosives with their exothermic decomposition lead simultaneously to a very konstan th cloud formation, this causes for the flight mass spectrometry favorable ago prerequisites for a high mass accuracy. Kleinere Energieunterschiede im Laserlicht strahl spielen eine untergeordnete Rolle. Smaller energy differences in the laser light beam play a subordinate role. Der Sprengstoff wird dabei so dünn aufgetragen (teilweise nur Bruchteile eines Mikrometers), daß ein selbständiges Nachbrennen in Nachbar bereiche unterbleibt, da der Probenträger stark kühlt und die Verbrennung löscht. The explosive is applied so thin (partially only fractions of a micrometer), in that an independent afterburning in neighboring areas will be omitted, because the sample carrier cools strong and deletes the combustion. Im Gegen satz zu normalem MALDI, bei dem man Laserlichtfokusdurchmesser von 100 bis 200 Mikro meter bevorzugt, um großflächig eine dünne Schicht der Matrixoberfläche abzutragen, kann man bei Sprengstoff-MALDI mit Fokusdurchmessern von 5 bis 20 Mikrometern arbeiten. In contrast to normal MALDI, in which preferably laser light focus diameter of 100 to 200 microns in order to ablate a large area, a thin layer of the matrix surface, can work in explosive MALDI with focal diameters of 5 to 20 micrometers. Es wird dabei innerhalb dieses Durchmessers die gesamte Schicht bis auf den Probenträger dar unter abgetragen. It is in this case removed down to the sample carrier is within this diameter under the entire layer.

Das Aufbringen der Analytmoleküle auf die Oberfläche der Lackschicht hat den weiteren Vor teil, daß die so gebildeten Ionen der Analytmoleküle nach Ausdehnung der Wolke eine weit geringere Streuung ihrer Anfangsgeschwindigkeiten zeigen. The application of the analyte molecules on the surface of the coating layer has some further provides that the ions of the analyte molecules thus formed show by expansion of the cloud a much less dispersion in their initial velocities. Die Ionen lassen sich daher viel besser in Speicherzellen von ionenspeichernden Massenspektrometern einfangen, und sie erhö hen die Genauigkeit der Massenbestimmung in Flugzeit-Massenspektrometern. Therefore, the ions can be better captured in memory cells of ion storage mass spectrometers, and she raised stabili hen the accuracy of the mass determination in time of flight mass spectrometers.

Um die aufgebrachte Schicht auch gegen nicht-wässrige Lösungsmittel unlöslich zu machen, ist es besonders vorteilhaft, die meist fadenförmigen Moleküle der Lackschicht nach Aufbringen auf den Probenträger zumindest an der Oberfläche zu vernetzen. In order to make the coated layer against non-aqueous solvent is insoluble, it is particularly advantageous to crosslink to the sample carrier, at least on the surface, the most threadlike molecules of the resist layer after application. Das kann durch Zugabe eines Brückenbildners geschehen, aber auch durch ionisierende Bestrahlung, zum Beispiel mit UV- Licht. This can be done by addition of a bridging agent, but also by ionizing radiation, for example with UV light. Für die oberflächliche Vernetzung von Zellulosenitrat hat sich Diisocyanat als Brücken bildner bewährt, das restliche OH-Gruppen benachbarter Molekülstränge miteinander verbin det. For the surface cross-linking of cellulose nitrate to diisocyanate has proven formers as bridges, the remaining OH groups of adjacent strands together molecule verbin det. Diese Vernetzung unterbindet die Lösbarkeit in organischen Lösemitteln. This networking eliminates the solubility in organic solvents. Die Vernetzung unterbindet nicht die Zersetzlichkeit des Zellulosenitrats unter Einwirkung der Laserstrahlung. The cross-linking does not prevent the instability of cellulose nitrate under the action of laser radiation.

Es hat sich experimentell erwiesen, daß die Konzentration des Ionisierers nicht hoch zu sein braucht. It has proved experimentally that the concentration of the ionizer does not need to be high. Unsere Versuche haben sich allerdings auf Alpha-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure (kurz "Alpha-Cyano") beschränkt. Our tests, however ( "alpha-cyano" for short) limited to alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid. Mit etwa 10% Alpha-Cyano in 90% Nitrozellulose erhält man einen nahezu klaren Lack, der sich sehr dünn aufbringen läßt. With about 10% alpha-cyano in 90% nitrocellulose gives a virtually clear lacquer which can be applied very thin. Er bildet eine gute Grundlage für die Ionisierung von praktisch allen Arten von Proteinen, die leicht aus wässriger Lösung auf die Oberfläche des wasserunlöslichen Lacks aufgebracht werden können. It forms a good basis for the ionization of practically all types of proteins that can be easily applied from aqueous solution onto the surface of the water paint.

Es ist jedoch zu erwarten, daß die Suche nach bessereren Ionisierern bald Ergebnisse liefern wird, die die Ausbeute an Analytionen, die jetzt etwa bei 1/10000 Ionen pro Analytmolekül liegt, ganz wesentlich erhöhen werden. It is expected, however, that the search for bessereren ionizers will yield results soon, which will be very substantially increase the yield of analyte ions, which is about 1/10000 ions per analyte molecule now.

Es können in der Lackschicht auch mehrere ionisierende Substanzen gleichzeitig untergebracht werden. There can be accommodated simultaneously in the coating film, several ionizing substances. Sie können sowohl als eine einzige Lösung mit mehreren Komponenten auf den Pro benträger aufgebracht sein, aber auch als schichtartiger Aufbau mit mehreren Lacklösungen übereinander, die jeweils nur eine einzige ionisierende Komponente enthalten. They may be applied benträger as a single solution with several components on the Pro but each containing only a single ionizing component as a layer-like structure with several lacquer solutions, one above the other. Die Lack schichten - sowohl als Einzelkomponenten-Schicht, als Mehrkomponenten-Schicht wie auch als Mehrschichten-Aufbau - können durch eine schützende Deckschicht wasser- und luftdicht abgedeckt sein. The paint layers - both as a single component layer, as a multi-component layer as well as a multi-layer structure - may be covered by a waterproof and airtight protective overcoat. Die Deckschicht enthält zweckmäßigerweise keinen Ionisierer. The covering layer expediently contains no ionizer. Die Vernetzung kann sich auf die Deckschicht oder sogar nur auf die Oberfläche der Deckschicht beschränken. The crosslinking can be limited to the top layer or even on the surface of the top layer.

Für den MALDI-Prozess ist es erforderlich, daß die Dampfwolke in einem Gebiet definierten elektrischen Potentials entsteht. For the MALDI process, it is necessary that the vapor cloud is formed in an area defined electrical potential. Da die Lackschicht nichtleitend ist, hat es sich als günstig er wiesen, einen leitenden Probenträger zu verwenden. Since the coating layer is not conductive, it has to be favorable, he instructed to use a conducting sample carrier. Im Falle einer Verwendung von nichtlei tenden Probenträgern ist eine oberflächliche Metallisierung angebracht. In case of use of sample carriers nichtlei Tenden a superficial metallization is attached. Diese kann sehr dünn, sogar fast durchsichtig sein, um einen Laserbeschuß von der Rückseite her durch den Proben träger hindurch zu ermöglichen. This may even be almost transparent very thin, to allow a laser bombardment from the back through the sample carrier through.

Um Aufladungen der Lackschicht zu vermeiden, oder um die Lackschicht selbst leitend zu ma chen, kann dem Lack auch ein Leiter in disperser Form zugesetzt werden. To avoid charges the paint layer or the paint layer itself is conductive to ma chen, the paint can also be a director be added in dispersed form. Dazu kann beispiels weise Kohlenstoff in feinster, disperser Form verwendet werden. For this purpose, carbon can be used in Example finest dispersed form.

Durch solcherart leitfähig gemachte Schichten ist es möglich, Probenträgerplatten herzustellen, die direkt als Blotmembran zum Blotten zweidimensional durch Gel-Elektrophorese getrennter Eiweiße benutzt werden können. By of such rendered conductive layers, it is possible to manufacture sample support plates, which can be used directly as a blotting membrane for blotting two-dimensionally by gel electrophoresis separated proteins. Die 2-dimensionale Abtastung durch MALDI ergibt eine Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber üblichen Färbungsmethoden, die bei mehreren Zeh nerpotenzen liegt und darüberhinaus zuverlässige Information über das Molekulargewicht bie tet. The 2-dimensional scanning by MALDI results in an increase in sensitivity to conventional coloring methods is nerpotenzen at more toe and beyond tet reliable information about the molecular weight of BR.

Wenn wir vom Blotten absehen, so werden die Analytmoleküle meist einfach durch Aufbringen eines winzigen Tröpfchens der Analytlösung auf die adsorptive Schicht aufgebracht. If we disregard the blotting, the analyte molecules are usually simply applied by applying a tiny droplet of the analyte to the adsorptive layer. Die glatte Lackschicht erlaubt dabei ein automatisches Aufpipettieren kleiner Tröpfchen, in denen sich gelöste Analytmoleküle befinden. The smooth coating layer allows it an automatic pipetting small droplets in which dissolved analyte molecules are located. Die Tröpfchen behalten auf der Lackschicht eine etwa halb kugelige Form, aus der die Analytmoleküle in relativ kurzer Zeit durch Diffusion und feste Adsorption an der Lackoberfläche herausgezogen werden. The droplets retain on the paint layer an approximately semi-spherical shape, from which the analyte molecules are pulled out in a relatively short time by diffusion and adsorption fixed at the paint surface. Das Tröpchen muß oft nicht einmal eintrocknen, nach Adsorption der Analytmoleküle kann der Rest einfach abgewaschen werden. The Tröpchen often does not even have to dry, after adsorption of analyte molecules the rest can simply be washed off. Auch die Substanzen aus eingetrockneten Tröpfchen können gewaschen werden. The substances from dried droplets can be washed. Das ist be sonders vorteilhaft, da so auch störende Puffersubstanzen und Salze der Lösung entfernt wer den können. This is advantageous be Sonder, as well as interfering buffer substances and salts of the solution away who can.

Die Oberfläche unter einem Tröpfchen mit etwa 10 Nanoliter Lösung hat etwa 250 Mikrome ter Durchmesser und kann dabei größenordnungsmäßig 10 Femtomol an Analytmolekülen auf nehmen, die eine monomolekulare Adsorptionsschicht bilden. The surface under a droplet of about 10 nanoliters solution has about 250 Mikrome ter diameter and can in this case take on the order of 10 femtomoles of analyte molecules which form a monomolecular adsorption layer. Ist die Konzentration wesentlich geringer als ein Picomol pro Mikroliter, so kann die Lösung nach jeweiligem Trocknen des Tröpfchens - eventuell unter Einschluß mehrerer Waschvorgänge - mehrfach aufpipettiert wer den. If the concentration is much lower than a picomole per microliter, the solution can by respective drying of the droplet - possibly including multiple washes - repeatedly pipetted who the. Die Fläche des Tröpfchens kann während der Spektrenaufnahme durch mehrere Laser schüsse abgetastet werden und ergibt nach Addition der Meßwerte sehr gute Spektren der Analytsubstanz. The area of ​​the droplet can be sampled during the recording of spectra by a plurality of laser shots, and gives, after addition of the measured values ​​very good spectra of the analyte. Meist können von einem einzigen Fleck sogar mehrere Spektren gewonnen werden. Usually even more spectra can be obtained from a single spot. Diese Spektren haben wegen der Gleichmäßigkeit der Auftragung alle die gleiche Qualität. These spectra have because of the uniformity of the application, all the same quality.

Für hochverdünnte Analytlösungen, bei denen ein aufgebrachter Tropfen nicht genügend Mo leküle für eine massenspektrometrische Untersuchung enthält, hat sich eine andere Art der Probenträger bewährt. For highly diluted analyte solutions, which does not contain an applied drop enough Mo leküle for mass spectrometric investigation, a different type of sample carrier has been proven. Die adsorptive Matrixschicht nach dieser Erfindung wird auf die Ober fläche von winzigen magnetischen Kügelchen ("magnetic beads") aufgebracht, die in Durch messern von einem bis 100 Mikrometern erhältlich sind. The adsorptive matrix layer according to this invention is applied to the upper surface of tiny magnetic beads ( "magnetic beads"), which are available in diameters from one to 100 micrometers. Besonders vorteilhaft ist es hier, die Matrixschicht durch Vernetzung vollkommen unlöslich zu machen. It is particularly advantageous here to make the matrix layer completely insoluble by crosslinking. Die Kügelchen werden dann in kleiner Anzahl der sehr verdünnten Analytlösung beigegeben. The beads are then added in small number of very dilute analyte. Durch langandauernden und bewegten Kontakt können so die Analytmoleküle praktisch quantitativ adsorptiv an die Oberfläche der Kügelchen gebunden werden. By long-lasting and moving contact so that analyte molecules can be virtually quantitatively bound adsorptively to the surface of the beads. Wenn dabei keine restlose Adsorption erfolgen soll, wird die restliche Analytlösung nicht durch freiwerdende Substanzen der Matrix verunrei nigt. If this produces no residue-free adsorption to take place, the remaining analyte is not released substances of the matrix contami nigt. Die Kügelchen lassen sich anschließend durch magnetische Spezialwerkzeuge aus der Lösung herausholen und auf eine flache Probenträgerunterlage bringen. The beads can be subsequently removed by magnetic pick up tools from the solution and put on a flat sample support surface. Dort können sie durch magnetische Kräfte, durch übergelegte Feinstgitter oder aber einfach durch Ankleben befestigt werden. There they can be fixed by gluing by magnetic forces, through overlaid fine-screen or easy. Sie werden, nach Überführung ins Vakuum, direkt vom Laser beschossen und liefern ein hervorragendes MALDI. They are bombarded by conversion into the vacuum from the laser and provide an excellent MALDI. Auch die Kügelchen lassen sich so vorpräparieren, daß sie ver sand- und lagerfähig werden. The beads can be vorpräparieren so that they are ver sand and storable.

Die Kügelchen sind besonders effektiv einsetzbar, wenn nur geringste Mengen an Analytsub stanz vorliegen, weil sie die Analytmoleküle praktisch vollständig auch aus sehr verdünnten Lösungen oder aus kleinsten Volumina adsorbieren können. The beads are particularly effective used when only small amounts of Analytsub substance present because they can adsorb even from very dilute solutions or small volumes, the analyte molecules virtually completely. Dabei braucht die Lösung nicht pipettiert oder sonstwie transportiert werden, und es werden daher die Verluste durch Wand adsorptionen so gering wie möglich gehalten. The solution need not be pipetted or otherwise transported, and therefore the losses due to wall adsorption as small as possible. Es lassen sich in dieser Weise sogar Analytsub stanzen aus einzelnen biologischen Zellen einer massenspektrometrischen Analyse zuführen. It can even be Analytsub stamping from individual biological cells of a mass spectrometric analysis performed in this manner.

Die bisher verwendeten MALDI-Verfahren verlangten notwendigerweise eine Bestrahlung des Probenträgers von der Probenseite her, da jeweils nur eine sehr geringe Matrixmenge an der Oberfläche verdampft wurde, also jeweils nur ein Bruchteil der Schichtdicke abgetragen wur de. The MALDI method previously used necessarily required forth irradiation of the sample carrier from the sample side, because only a very small amount of matrix was evaporated on the surface, so only a fraction of the layer thickness WUR removed de. Auch die Verwendung von magnetischen Kügelchen verlangt einen Beschuß von der Pro benseite her, da die Kügelchen undurchsichtig sind. The use of magnetic beads required forth bombardment by the wheel end by Pro, since the beads are opaque.

Werden jedoch flache Probenträger benutzt, so kann ein anderes Verfahren verwendet werden, da die Verwendung einer dünnen Sprengstofflackschicht zu einer vollständigen Verdampfung eines kleinen Schichtbereiches führt, so daß eine nackte Stelle des Probenträgers übrigbleibt. however, flat sample carrier is used, another method may be used, since the use of a thin explosive varnish layer leads to a complete vaporization of a small layer area, so that a naked body of the sample carrier remains. Es ist daher möglich, die Matrixschicht von der Rückseite eines für die Laserstrahlung durch sichtigen Probenträgers her zu bestrahlen und so zu verdampfen. It is therefore possible to irradiate the matrix layer from the back of the laser radiation into account sample carrier ago and evaporate like that. Es ist also ein weiterer Ge danke der Erfindung, durchsichtige Probenträger zu verwenden, die jedoch zur Aufrechterhal tung stabiler elektrischer Potentiale oberflächlich leitend gemacht werden. It is therefore a further Ge thank the invention to use transparent sample carrier, however, be made superficially conductive at the Upright Sustainer tung stable electrical potential. Die Rückseite des Probenträgers ist für den Laserstrahl in der Ionenquelle viel leichter zugänglich als die Vorder seite, auf der die Beschleunigungs- und Fokussierungsblenden mit ihren hohen Spannungen einem senkrechten Aufschuß oder einem Aufschuß mit kurzer Brennweite im Wege stehen und sehr trickreiche Konstruktionen notwendig machen. The back of the sample carrier is much more accessible for the laser beam in the ion source than the front page, on the acceleration and focusing aperture with their high voltages a vertical Aufschuß or Aufschuß short focal length stand in the way and make it very tricky constructions necessary.

Auf die Wellenlänge des Lasers, die bei bisherigen MALDI-Verfahren immer sehr wichtig war und die Auswahl der Matrixsubstanzen mit bestimmt hat, kommt es nur noch in zweiter Linie an, da es der einzige Zweck der Laserstrahlung ist, den Sprengstoff zu zünden und ein Plasma genügend hoher Temperatur zu erzeugen. To the wavelength of the laser, which was very important in recent MALDI technique over and the selection of the matrix substances has determined, it depends only secondarily because it is the only purpose of the laser radiation to detonate the explosives and plasma sufficiently high temperature to produce.

Fig. 1 zeigt eine Anordnung eines flachen, metallischen Probenträgers 1 mit einer Lackschicht 2 aus Zellulosenitrat mit eingelagerten Molekülen einer Substanz wie beispielsweise 10% Al pha-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure, die beim MALDI-Vorgang zur Ionisierung der auf die Schicht aufgebrachten Analytmoleküle dient. Fig. 1 shows an arrangement of a flat metallic sample support 1 with a resist layer 2 made of cellulose nitrate with intercalated molecules of a substance, such as 10% Al shows pha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid in the MALDI process to ionize the coating applied to the layer analyte is used. Der Probenträger hat die für Mikrotiterplatten eingeführte Größe von 8 × 12 cm 2 und ist mit Schwalbenschwanzführungen 3 versehen, mit denen die Platte auf einem Führungsschlitten befestigt werden kann. The sample carrier being introduced for microplates size of 8 × 12 cm 2 and is provided with dovetail guides 3 with which the plate can be mounted on a carriage. Der Probenträger ist auf seiner Schichtseite poliert, um das eingestrahlte Laserlicht zu reflektieren und so eine gute Ab sorption des Lichts zu ermöglichen. The sample carrier is polished on its layer side, to reflect the incident laser light and thus to allow a good Ab absorption of light.

Eine günstige Ausführungsform ist die in Fig. 1 gezeigte flache, metallische Trägerplatte in der für Mikrotiterplatten standardisierten Größe von 8 × 12 cm 2 . A favorable embodiment is that shown in Fig. 1 flat metal support plate in the standard microtiter plate size of 8 × 12 cm 2. Diese Größe paßt in alle gän gigen Mikropipettieranlagen und stellt somit eine günstige Voraussetzung für die automatische Probenaufbringung dar. Die Schwalbenschwanzführungen 3 lassen sich zur Befestigung auf beweglichen Probentischen verwenden, auch im Vakuum des Massenspektrometers wird die Platte über diese Führungen einfach gehaltert. This size fits all gan Gigen Mikropipettieranlagen and thus constitutes a favorable condition for the automatic sample application. The dovetail guides 3 can be used for mounting on movable sample table, even in the vacuum of the mass spectrometer, the plate is simply mounted on these guides. Für die Verwendung im Vakuum haben sich Führungen bewährt, deren Oberfläche mit Tetrafluorethen ("Teflon®") überzogen wurde. For use in vacuum guides have proven whose surface was coated with tetrafluoroethylene ( "Teflon").

Diese Platte wird nun auf ihrer Probenseite erfindungsgemäß mit der Matrixschicht überzogen. This plate is then coated on its sample side according to the invention with the matrix layer. Dabei wird von einem Lack ausgegangen, der aus in Azeton aufgelöstem Zellulosenitrat mit einem Nitrierungsgrad von etwa 12% und einer Kettenlänge ("Viskosität") von etwa 100 bis 200 Glukosegruppen und einem geringen Anteil an Alpha-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure besteht, die ebenfalls im Azeton gelöst ist. This is based on a varnish from dissolved in acetone cellulose nitrate having a nitrification degree of about 12% and a chain length ( "viscosity") consists of about 100 to 200 glucose groups and a minor proportion of alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid, which is also dissolved in acetone. Die Schicht muß sehr dünn sein, sie beträgt nur wenige Mi krometer. The layer must be very thin, it is only a few Mi krometer. Zum Auftragen haben sich besonders zwei Verfahren bewährt: das bekannte elektri sche Sprühverfahren und das Aufbringen eines Tröpfchens auf die sich schnell drehende Trä gerplatte (siehe dazu EP 0 034 318 A2). For applying particularly two processes have proved: the known electrical specific spraying and applying a droplet on the rapidly rotating Trä carrier plate (see EP 0034318 A2). Das Aufbringen erfolgt erst in einer Umgebung mit gesättigtem Azetondampf, worauf plötzlich angewärmte reine Luft aufgeblasen wird. The application is only in an environment saturated acetone vapor, whereupon suddenly warmed fresh air is inflated. Die Trocknung erfolgt dann in wenigen Sekunden und erzeugt eine sehr gleichmäßige Schicht. The drying then takes place in a few seconds and produces a very uniform layer. Zellulosenitrat ohne Alpha-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure oder andere ionisierende Substanzen haben keine ionisierende Wirkung während des MALDI-Prozesses. Cellulose nitrate without alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid or other ionizing substances have no ionizing effect during the MALDI process.

Die etwa 10-prozentige Zugabe von Alpha-Cyano-4-Hydroxi-Zimtsäure hat bisher alle von uns untersuchten als Analytmoleküle verwendeten Peptide und Proteine ionisieren können. The approximately 10-percent addition of alpha-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid has been all of us studied peptides and proteins used as analyte molecules can ionize. Es ist jedoch zu erwarten, daß für andere Analytsubstanzen andere Ionisierer bessere Ergebnisse lie fern. However, it is to be expected that other analyte other ionizer better results lie far. Man kann dann leicht verschiedenartige Probenträgersorten verwenden. You can then use slightly different types of sample carrier places. Es ist aber auch möglich, verschiedene Ionisierer in dem gleichen Matrixgemisch zu verwenden. but it is also possible to use different ionizer in the same matrix mixture. Sollten sich die verschiedenen Ionisierer nicht in der gleichen Lösung vertragen, so kann man einen schichtwei sen Aufbau wählen mit Schichten, die verschiedene Ionisierer enthalten. the various ionizer should not be tolerated in the same solution, so you can choose a schichtwei sen structure with layers containing different ionizer. Für den Benutzer ist es vorteilhaft, wenn eine einzige Trägerplattensorte für alle analytischen Aufgaben benutzt werden kann. For the user, it is advantageous when a single carrier plate variety can be used for all analytical tasks.

Diese Trägerplatten sind auch für die schnelle Analyse sehr großer Zahlen an Proben geeignet (sogenannte "massiv-parallele Verarbeitung"). These carrier plates ( "massively parallel processing" so-called) for the rapid analysis of very large numbers of samples suitable. Es lassen sich bei einem Millimeter Abstand auf eine Trägerplatte 9600 Probenflecken aufbringen und analysieren. It can be applied 9600 sample spots and to analyze at one millimeter spacing on a carrier plate. Bei einem halben Millimeter Abstand lassen sich 38400 Proben aufbringen. In half a millimeter distance is 38,400 samples can muster. Rechnet man 2 Sekunden Analysezeit pro Pro benfleck, so kann man diese 38400 Proben in etwa 6 Stunden analysieren. Extrapolating 2 seconds per analysis time Pro benfleck, one can analyze the 38400 samples in about 6 hours. Diese Zielsetzung liegt für medizinische Reihenuntersuchungen vor. This objective is available for medical screening. Automaten für die schnelle Belegung von Trägern mit solchen Probenanzahlen sind zur Zeit in Entwicklung. Automated express assignment of carriers with such numbers of samples are currently in development.

Diese Trägerplatten verlangen eine Konzentration des Analyten von etwa einem Picomol pro Mikroliter. These support plates require a concentration of the analyte of approximately one picomole per microliter. Umgerechnet in Gewichtskonzentrationen entspricht das in etwa einem Gewichts anteil von einem Millionstel des Lösemittels (1 ppmw). Converted to equivalent in concentrations by weight the proportion in about a weight of one millionth of the solvent (1 ppmw). Das ist eine geringe Konzentration, niedriger als sie normalerweise bei chromatographischen oder elektrophoretischen Trennvor gängen anfällt. This is a low concentration, lower than those normally obtained in chromatographic or electrophoretic SECTIONING transitions.

Sollte die verwendete Konzentration aber noch viel geringer sein, so kann man eine ganz ande re Art der Probenträger verwenden, die aus magnetisierbaren Kügelchen von etwa 10 Mikro metern Durchmesser bestehen. If the concentration used but still be much smaller, so you can use a very oth er type of sample carrier, pass the meters of magnetizable spheres of about 10 microns in diameter. Diese werden ebenfalls mit einem lackartigen Überzug der Ma trix überzogen, und können wie die Trägerplatten über längere Zeiten gelagert werden. They are also coated with a varnish-like coating trix of the Ma, and can be stored for long periods as the carrier plates. Eine geringe Anzahl der Kügelchen wird dann der sehr verdünnten Lösung für längere Zeit und un ter starker Bewegung beigegeben. A small number of the beads is then added to the very dilute solution for a long time and un ter strong movement. Die adsorptive Oberfläche der Kügelchen nimmt dann die Analytsubstanz aus der Lösung auf und hält sie fest. The adsorptive surface of the beads then receives the analyte from the solution and holds them. Die Kügelchen können dann mit magneti sierbaren Spezialwerkzeugen aus der Lösung entnommen, gewaschen, und auf eine flache Un terlage aufgebracht werden. The beads can then be removed with magnetizable special tools from the solution, washed, and applied to a flat Un terlage. Sie werden dort befestigt und dem MALDI-Prozess zugeführt. They are fixed there and fed to the MALDI process.

Die Kügelchen lassen sich sehr leicht mit einer dünnen Matrixschicht überziehen, indem man sie einzeln durch einen sehr feinen (elektrisch erzeugten) Lacksprühstrahl fallen läßt. The beads can be coated with a thin layer matrix is ​​very easy, by allowing them to fall separately through a very fine (electrically generated) Lacksprühstrahl. Nach dem Verlassen des Lacksprühstrahls sind die Kügelchen nach Durchmessen einer Strecke von etwa 20 Zentimetern trocken und können daher einfach in einem Glas aufgefangen werden. After leaving the Lacksprühstrahls the beads are dry after By measuring a distance of about 20 centimeters, and can therefore be easily collected in a jar. Die Ein richtung einer heißen Wirbelschicht im Glas verhindert das Zusammenbacken der noch frischen Kügelchen. The one direction of a hot fluidized bed in the glass prevents agglomeration of the still fresh beads. - Auch ein pneumatisches Versprühen der Kügelchen zusammen mit einer sehr verdünnten Lacklösung führt zu einer dünnen Lackschicht auf den Kügelchen. - Also a pneumatic spraying the beads with a very dilute paint solution leads to a thin coating layer on the beads.

Es ist nun eine häufig auftretende weitergehende analytische Aufgabe, aus einem Lösungsge misch, in dem sich nicht nur die interessierende Analytsubstanz befindet, die Analytsubstanz gezielt herauszuholen. It is now a common further analytical task of a mixed Lösungsge in which not only the interest analyte is to extract the analyte specifically. Man möchte beispielsweise aus einem Proteingemisch ein interessieren des Protein herausholen und auf Mißbildungen untersuchen. One might, for example, bring out an interest of the protein from a protein mixture and check for abnormalities. Diese Aufgabe kann, wie bekannt, durch Antikörper geleistet werden. This task can, as is known, be made by antibodies. Diese Antikörper lassen sich nun relativ leicht auf die lack artige Matrixschicht aufbringen und dort kovalent binden, ohne die Binde-Eigenschaften der Antikörper zu zerstören. These antibodies can now be relatively easy on the paint-like matrix layer applied and where they bind covalently without destroying the binding properties of antibodies. Solcherart vorgefertigte Probenträger sind dann ganz speziell auf die Analyse bestimmter Proteine eingerichtet. Of such prefabricated sample carriers are then specifically adapted to the analysis of specific proteins. Besonders die als Kügelchen ausgebildeten Proben träger können so verwendet werden. In particular, the formed beads as a sample carrier may be so used. In dieser Weise wird es beispielsweise möglich, aus einer einzigen Zelle ein ganz bestimmtes Eiweiß herauszuholen und zu untersuchen. In this way it is possible, for example, get a very specific protein from a single cell and investigate.

Aber auch die gezielte Veränderung der Analytmoleküle läßt sich so erreichen. But the targeted modification of the analyte can be achieved this way. So ist es bei spielsweise für die Identifizierung von Eiweißen günstig, das Eiweiß einer enzymatischen Ver dauung zuzuführen, die die Kette der Aminosäuren zwischen oder nach jeweils genau defi nierten Aminosäurepaaren auftrennt. It is favorable for the identification of proteins in the pitch, feed the protein to an enzymatic digestion of Ver, which separates the chain of amino acids between or after in each case exactly defi ned amino acid pairs. So trennt beispielsweise das Enzym Trypsin nach dem Aminosäurepaar Lysin und Argenin. For example, the enzyme trypsin is separated after the pair of amino acids lysine and arginine. Die Molekulargewichte der Teilstücke aus dem trypti schen Verdau lassen sehr schnell über eine Protein-Datenbank eine Identifizierung zu. The molecular weights of the cuts from the trypti rule digestion can very quickly a protein database an identification. Dieser Verdau kann nun in situ auf dem Probenträger vorgenommen werden. This digestion can now be carried out in situ on the sample carrier. Dazu ist es erforderlich, Trypsin (oder ein anderes Enzym) auf dem Probenträger adsorbiert oder sonstwie fest gebun den zu haben. This requires, trypsin (or other enzyme) adsorbed on the sample carrier or have otherwise established TIALLY to. Da die Enzyme relativ stabil sind, lassen sie sich auf den Probenträgern lange lagern. Since the enzymes are relatively stable, they can be stored on the sample carriers for long. Sie müssen jedoch von den in der Regel sauren Ionisierern ferngehalten werden, was aber durch den lackförmigen Aufbau der Schicht gewährleistet ist. but they must be kept away from the generally acidic ionizers, but this is ensured by the paint-like structure of the layer. Für diese Art der Vorpräpa rierung mit veränderlichen Biochemikalien sind sowohl flache Trägerplatten wie auch magneti sierbare Kügelchen geeignet. both flat support plates as well magneti matable beads are suitable for this type of Vorpräpa turing with varying biochemicals.

Claims (23)

1. Probenträger ( 1 ) für die matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) einer Analytsub stanz zum Zwecke einer massenspektrometrischen Analyse, der eine vorpräparierte Ma trixschicht ( 2 ) aufweist, die alle Matrixkomponeten, die zur Ionisierung der Moleküle der Analytsubstanz während des Desorptionsprozesses notwendig sind, und eine lackartige Komponente enthält, die die anderen Matrixkomponenten dicht umschließt und so vor Veränderungen während einer Lagerung und eines Transportes schützt. 1. The sample carrier (1) for the matrix-assisted laser desorption (MALDI) a Analytsub substance for the purpose of mass spectrometric analysis of a pre-prepared Ma trixschicht (2), all Matrixkomponeten that are necessary for the ionization of the molecules of the analyte during the desorption process, and includes a paint-like component, which tightly encloses the other matrix components and protects against changes during storage and transit.
2. Probenträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Matrix schicht für die Analytsubstanzen adsorptiv ist, so daß sie vor der massenspektrometri schen Analyse aus einer aufgebrachten Lösung adsorptiv mit den Analytsubstanzen bela den werden kann. 2. The sample support according to claim 1, characterized in that the surface of the matrix layer is adsorptively for the analyte so that it adsorptively loaded with the analyte prior to the analysis rule massenspektrometri from a solution applied may be the.
3. Probenträger nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die lack artige Matrixkomponente so beschaffen ist, daß sie während des Desorptionsvorganges durch die Laserstrahlung in kleinere Moleküle zersetzt wird. 3. The sample support according to any one of claims 1 or 2, characterized in that the paint-like matrix component is such that it is decomposed into smaller molecules during the desorption process by the laser radiation.
4. Probenträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die durch die Laserstrahlung zersetzbare, lackartige Matrixkomponente ein Sprengstoff oder eine sprengstoffähnliche Substanz mit Fähigkeit zur Verpuffung ist. 4. The sample carrier according to claim 3, characterized in that said decomposable by the laser radiation, paint-like matrix component is an explosive or explosive-like substance with ability to deflagration.
5. Probenträger nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Zellulosenitrat als zersetzba re, lackartige Matrixkomponente verwendet wird. 5. The sample carrier according to claim 4, characterized in that cellulose nitrate as re zersetzba, paint-like matrix component is used.
6. Probenträger nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Zellulosenitrat mit einem optimalen Nitrierungsgrad zwischen 11,5 und 13% Stickstoff verwendet wird. 6. The sample carrier according to claim 5, characterized in that cellulose nitrate is used with an optimum degree of nitration 11.5 to 13% nitrogen.
7. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lackschicht nach Aufbringen auf den Probenträger zumindest oberflächlich vernetzt und dadurch unlöslich gemacht wird. 7. The sample carrier according to any preceding claim, characterized in that the lacquer layer at least superficially cross-linked after application to the sample support and thereby made insoluble is.
8. Probenträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Vernetzung durch Be strahlung erzeugt wird. 8. The sample carrier according to claim 7, characterized in that the crosslinking is radiation produced by Be.
9. Probenträger nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Brückenbildner für die Vernetzung verwendet wird. 9. The sample carrier according to claim 7, characterized in that a bridging agent is used for crosslinking.
10. Probenträger nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Diisocyanat als Brücken bildner verwendet wird. 10. The sample carrier according to claim 9, characterized in that diisocyanate is used as bridges formers.
11. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere verschiedenartige Substanzen als Matrixkomponenten für die Ionisierung der Analytsubstanz vorhanden sind. 11. The sample carrier according to any one of the preceding claims, characterized in that several different substances are present as matrix components for the ionization of the analyte.
12. Probenträger nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixkomponenten in gemeinsamer Lösung als Lackschicht aufgebracht werden. 12. The sample carrier according to claim 11, characterized in that the matrix components are applied as a coating layer in a common solution.
13. Probenträger nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Matrix komponenten in verschieden Lackschichten übereinander eingebettet sind. 13. The sample carrier according to claim 11, characterized in that the various matrix components are embedded in different paint layers one above the other.
14. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lackschicht durch eine Deckschicht abgedeckt wird, die keine Matrixkomponente für die Ionisierung der Analytsubstanz enthält. 14. The sample carrier according to any preceding claim, characterized in that the lacquer layer is covered by a cover layer that does not contain a matrix component for the ionization of the analyte.
15. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine weitere Komponente die Matrix färbt und so für das verwendete Laserlicht absorptiv macht. 15. The sample carrier according to any one of the preceding claims, characterized in that a further component color the matrix and so does absorptive for the laser light used.
16. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrixschicht durch eine weitere Komponente elektrisch leitfähig gemacht wird. 16. The sample carrier according to one of the preceding claims, characterized in that the matrix layer is made electrically conductive by another component.
17. Probenträger nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß feinstdispergierter Kohlen stoff als elektrisch leitfähige Komponente verwendet wird. 17. The sample carrier according to claim 16, characterized in that feinstdispergierter carbon material is used as the electrically conductive component.
18. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er aus kleinen magnetischen Kügelchen (magnetic beads) besteht. 18. The sample carrier according to any preceding claim, characterized in that it consists of small magnetic beads (magnetic beads) is made.
19. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche der Matrixschicht mit Reagenzien belegt ist, die die aufzubringenden Ana lytmoleküle chemisch verändern. 19. The sample carrier according to one of the preceding claims, characterized in that the surface of the matrix layer is covered with reagents that chemically modify the applied Ana lytmoleküle.
20. Probenträger nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenzien an die Oberfläche kovalent gebunden sind. 20. The sample carrier according to claim 19, characterized in that the reagents are bound covalently to the surface.
21. Probenträger nach einem der vorhergehenden Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekenn zeichnet, daß Enzyme als Reagenzien verwendet werden, die aufgebrachte Proteine in charakteristischer Weise zerschneiden können. 21. The sample carrier according to claim 19 or 20, characterized in that enzymes are used as reagents, the applied proteins can be cut in a characteristic manner.
22. Probenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Ober fläche mit Agenzien belegt ist, die ganz spezifisch bestimmte Arten von Analytmolekülen festhalten können. 22. The sample carrier according to any one of claims 1 to 20, characterized in that the upper surface is coated with agents that can hold the very specifically certain types of analyte molecules.
23. Probenträger nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß Antikörper als Agenzien verwendet werden. 23. The sample carrier according to claim 22, characterized in that antibodies are used as agents.
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