DE19616540A9 - Use of von Willebrand factor and pharmaceutical preparation - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines von Willebrand Faktor (vWF) mit einer verlängerten biologischen Halbwertszeit zur Herstellung einer Präparation zur Stabilisierung von Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII:C) in einem Säugetier. Außerdem wird eine pharmazeutische Präparation zur Verfügung gestellt, enthaltend einen biologisch aktiven FVIII:C/vWF-Komplex mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften, welcher Komplex einen vWF mit einer verlängerten biologischen Halbwertszeit enthält. The invention relates to the use of a von Willebrand factor (vWF) with an extended biological half-life for the production of a preparation for stabilizing blood coagulation factor VIII (FVIII: C) in a mammal. In addition, a pharmaceutical preparation is made available containing a biologically active FVIII: C / vWF complex with improved pharmacokinetic properties, which complex contains a vWF with an extended biological half-life.
Description
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Präparation enthaltend einen biologisch aktiven FVHI:C/vWF-Komplex sowie eine neue Verwendung eines von-Willebrand-Faktor-Präparates und ein diagnostisches Set zur Bestimmung eines Defektes der Hämostase in einem Patienten.The invention relates to a pharmaceutical preparation containing a biologically active FVHI: C / vWF complex as well as a new use of a von Willebrand factor preparation and a diagnostic set for determining one Defect of hemostasis in a patient.
Der vWF liegt in Humanplasma als heterogenes Homomultimere vor, mit einem Molekulargewicht von 450 kD bis zu mehr als 10 000 kD. Der vWF dient als Trägerprotein für den Gerinnungsfaktor VIII und trägt zur Adhäsion von Blutplättchen an das Endothel von verletzten Blutgefäßen bei.The vWF is present in human plasma as a heterogeneous homomultimer, with a molecular weight of 450 kD to to more than 10,000 kD. The vWF serves as a carrier protein for the coagulation factor VIII and contributes to the adhesion of blood platelets to the endothelium of injured blood vessels.
Bei der Hämophilie (Bluterkrankheit) ist die Blutgerinnung durch Mangel an bestimmten plasmatischen Blutgerinnungsfaktoren gestört. Bei der Hämophilie A beruht die Blutungsneigung auf einem Mangel an Faktor VIII bzw. einem Mangel an vWF. Die Behandlung der Hämophilie A erfolgt durch Ersatz des fehlenden Gerinnungsfaktors durch Faktorenkonzentrate aus Blutkonserven, z. B. durch intravenöse Infusion von Faktor VIII, eines vWF/Faktor-VJJJ-Komplexes oder von vWF.In hemophilia (blood disease), blood clotting is caused by a lack of certain plasmatic blood clotting factors disturbed. In hemophilia A, the bleeding tendency is due to a deficiency of factor VIII or a Lack of vWF. Hemophilia A is treated by replacing the missing coagulation factor with Factor concentrates from blood reserves, e.g. B. by intravenous infusion of factor VIII, a vWF / factor-VJJJ complex or from vWF.
Es gibt mehrere Krankheitsbilder, die auf Unter- oder Überproduktion des von-Willebrand-Faktors zurückzuführen sind. So führt z. B. eine Überproduktion von vWF zur vermehrten Neigung von Thrombosen, wohingegen eine Unterversorgung mit vWF eine vermehrte Blutungsneigung oder verlängerte Blutungszeit zur Folge hat.There are several clinical pictures that can be traced back to under- or over-production of the von Willebrand factor are. So z. B. an overproduction of vWF to an increased tendency to thrombosis, whereas a Undersupply with vWF results in an increased tendency to bleeding or a prolonged bleeding time.
Das von-Willebrand-Syndrom kann sich in mehreren Erscheinungsformen manifestieren. Alle Formen zeichnen sich durch eine verlängerte Blutungszeit aus, die durch ein absolutes Fehlen eines funktionellen vWF begründet sein können. Der Mangel an vWF kann auch eine phänotypische Hämophilie A hervorrufen, da der vWF ein wesentlicher Bestandteil des funktionellen Faktor VIII-Komplexes ist. In diesen Fällen ist die Halbwertszeit des Faktor VIII derart verringert, daß er seine spezielle Funktionen in der Blutgerinnung nicht wahrnehmen kann.Von Willebrand syndrome can come in several forms manifest. All forms are characterized by a prolonged bleeding time caused by a absolute lack of a functional vWF can be justified. The lack of vWF can also be phenotypic Cause haemophilia A, as the vWF is an essential part of the functional factor VIII complex. In In these cases the half-life of factor VIII is reduced to such an extent that it performs its special functions in blood coagulation can not perceive.
Patienten mit vw-Krankheit weisen einen Mangel an funktionell aktiven vWF auf, als Ursache für Blutungen. Zur Therapie der vW-Krankheit werden vor allem therapeutisehe Plasmakonzentrate vorgeschlagen, die den vWF enthalten. Der von Plasma stammende vWF (pdvWF) weist jedoch eine veränderte Multimerenverteilung auf. Die hochmolekularen Multimeren werden während des Herstellungsprozesses abgebaut, weshalb eine verringerte hämostatische Wirkung des Plasmakonzentrats vermutet wird. Für den Abbau der hochmolekularen vWF-Multimeren werden vor allem lösliche bzw. an Blutplättchen oder Leukocyten gebundene Proteasen verantwortlich gemacht. (Mannucci et al. Blood 83, 3018-3027 (1994).Patients with vw disease show a lack of functionally active vWF as a cause of bleeding. To the Treatment of vW disease is mainly therapeutic marriages Proposed plasma concentrates that contain the vWF. However, the plasma-derived vWF (pdvWF) has a changed multimer distribution. The high molecular weight multimers are broken down during the manufacturing process, which is why a reduced hemostatic Effect of the plasma concentrate is suspected. For the degradation of the high molecular weight vWF multimers are mainly soluble proteases or proteases bound to platelets or leukocytes are held responsible. (Mannucci et al. Blood 83, 3018-3027 (1994).
Zur Vermeidung von Problemen, die mit der Herstellung von pdvWF in Zusammenhang stehen, wurde bereits die Herstellung von rekombinantem vWF (rvWF) durch Fermentation von rekombinanten Zellen vorgeschlagen. Fischer et al. (FEBS Letters 351, 345-348 (1994)) beschreiben die Expression des vWF Wildtyps in CHO-Zellen. Die cDNA für vWF wurde in der EP-O 197 592 beschrieben. Der hergestellte rvWF wurde auf seine Molekularstruktur untersucht. Eine gelelektrophoretische Untersuchung hat gezeigt, daß die Multimerenstruktur des rvWF mit der idealen Struktür des pdvWF übereinstimmt, wobei die hochmolekularen Strukturen ebenfalls nachgewiesen werden konnten. Jedoch wurde gefunden, daß der rvWF nicht in die Triplett-Struktur aufgetrennt wird, welche für den pdvWF charakteristisch ist. Diese Triplett-Struktur enthält eine prominente Bande und zwei oder mehr Satellitenbanden, welche in einem Komplex mit der prominenten Bande des pdvWF auftreten.To avoid problems associated with the manufacture of pdvWF, the Proposed production of recombinant vWF (rvWF) by fermentation of recombinant cells. Fisherman et al. (FEBS Letters 351, 345-348 (1994)) describe the expression of the vWF wild type in CHO cells. the cDNA for vWF was described in EP-O 197 592. The rvWF produced was examined for its molecular structure. A gel electrophoretic investigation has shown that the multimeric structure of the rvWF with the ideal structure des pdvWF agrees, whereby the high molecular weight structures could also be detected. However it was found that the rvWF is not separated into the triplet structure which is characteristic of the pdvWF is. This triplet structure contains a prominent band and two or more satellite bands that are in one Complex occur with the prominent band of the pdvWF.
Die großtechnische Herstellung von rvWF wird von Schlokat et al. (Thrombosis and Haemostasis 73, Abstr. 993 (1995)) beschrieben. Der in CHO-Zellen hergestellte rvWF wurde chromatographisch gereinigt, wobei keine Reduktion der spezifischen Ristocetin-Kofaktoraktivität erfolgte. Durch die Co-expression des Enzyms Furin wurde die Prozessierung des Pro-Proteins zum reifen rvWF erreicht. Die erhaltene Ristocetin-Kofaktoraktivität war für alle untersuchten Klone relativ hoch, L B. 70 Einheiten pro Einheit ν WF-Antigen.The large-scale production of rvWF is described by Schlokat et al. (Thrombosis and Haemostasis 73, Abstr. 993 (1995)). The rvWF produced in CHO cells was purified by chromatography, with no reduction specific ristocetin cofactor activity. The processing was carried out through the co-expression of the enzyme furin of the pro-protein to mature rvWF. The ristocetin cofactor activity obtained was for all examined Clones relatively high, L B. 70 units per unit ν WF antigen.
Die Ristocetin-Kofaktoraktivität des vWF wird üblicherweise gemäß einer Vorschrift von Weiss et al. (Journal of Clinical Investigation 52, 2708-2716 (1973)) bestimmt. Dabei wird die Aktivität des vWF als Cofaktor für die Ristocetin induzierte Aggregation von Blutplättchen untersucht.The ristocetin cofactor activity of the vWF is usually determined according to a specification by Weiss et al. (Journal of Clinical Investigation 52, 2708-2716 (1973)). The activity of the vWF is used as a cofactor for ristocetin investigated induced platelet aggregation.
Diese Aktivität dient als Mass für die Wirksamkeit des vWF zur Behandlung der vw-Krankheit. Von Fricke et al. (Thrombosis and Haemostasis 70, 351-356 (1993)) wurde in einem Plasmastandard der World Health Organisation (WHO) für Faktor VIJJ und vWF ein sehr hohes Verhältnis von 0,92 Ristocetin-Kofaktoraktivität (RCoF) zu vWF-Antigen (vWF:Ag) gefunden.This activity serves as a measure of the effectiveness of the vWF in treating vw disease. From Fricke et al. (Thrombosis and Haemostasis 70, 351-356 (1993)) was in a plasma standard of the World Health Organization (WHO) found a very high ratio of 0.92 ristocetin cofactor activity (RCoF) to vWF antigen for factor VIJJ and vWF (vWF: Ag) found.
Die im Stand der Technik beschriebenen vWF-Präparate enthalten den vWF in proteolytisch abgebauter Form. Die Stabilität dieser Präparate ist dadurch begrenzt. Auch die Versuche zur Verhinderung der Proteolyse nach Abnahme einer Blutprobe in Gegenwart von entsprechenden Inhibitoren führten nicht zu einem vWF mit intakter Struktur.The vWF preparations described in the prior art contain the vWF in proteolytically degraded form. This limits the stability of these preparations. Also the Attempts to prevent proteolysis after taking a blood sample in the presence of appropriate inhibitors did not lead to a vWF with an intact structure.
Alle νWF-Konzentrate, die durch Reinigung des Proteins aus humanem Blutplasma erhalten werden oder in Kontakt mit biologischem Material aus Säugetieren getreten sind, sind außerdem potentiell mit dem Risiko behaftet, krankheitserregende Moleküle, wie z. B. Viren, vom Plasmaspender zu enthalten.All νWF concentrates made by purifying the protein obtained from human blood plasma or come into contact with biological material from mammals, are also potentially fraught with the risk of disease-causing molecules such. B. Viruses, from the plasma donor to contain.
Ein weiteres Problem für die vWF Präparate des Stand der Technik liegt in der geringen Halbwertszeit des vWF nach Verabreichung an einen Patienten. In diesem Zusammenhang mußte auch eine verringerte Halbwertszeit des FVJJJ:C festgestellt werden. Die Halbwertszeit für exogenen FVJJI:C liegt generell unter der von endogenen FVJJJ:C und ist im Fall von plasmatischen FVJJJ:C üblicherweise ca. 10 h, im Fall von rekombinantem FVJJI:C nicht mehr als ca. 12 h.Another problem for the prior art vWF preparations is the short half-life of the vWF after administration to a patient. In this context, a reduced half-life of the FVJJJ: C to be established. The half-life for exogenous FVJJI: C is generally lower than that of endogenous FVJJJ: C and in the case of plasmatic FVJJJ: C is usually approx. 10 h, in the case of recombinant FVJJI: C not more than approx. 12 h.
So liegt die Halbwertszeit für ein FVJJI:C/vWF Konzentrat von CENTRE REGIONAL DE TRANSFU-SION SANGUINE DE LILLE (FRANCE) gemäß Produktbeschreibung 1992 bei 10 bis 14 h; nach Gabe dieses Präparates konnte ein Anstieg des endogenen FVJJJ:C auf lediglich 1-3 Einheiten pro Milliliter in 24 h beobachtet werden. Für ein anderes FVJJI:C/vWF enthaltendes Präparat (Haemate® HS Behring) wird die Halbwertszeit mit 7 Stunden bei Typ 3 vW-Krankheit, 12,3 h bei Typ 2A und 13,8 h bei Typ 1 angegeben Die Erfindung stellt sich zur Aufgabe, das Indikationsspektrum für den vWF zu erweitern und eine verbesserte Pharmakokinetik von Faktor VJJJ in vivo zu erreichen.This is the half-life for a FVJJI: C / vWF concentrate from CENTER REGIONAL DE TRANSFU-SION SANGUINE DE LILLE (FRANCE) according to the 1992 product description at 10 am to 2 pm; after administration of this preparation an increase in the endogenous FVJJJ: C to only 1-3 units per milliliter in 24 h could be observed. For a Another FVJJI: C / vWF-containing preparation (Haemate® HS Behring), the half-life of 7 hours for type 3 vW disease, indicated 12.3 h for type 2A and 13.8 h for type 1. The object of the invention is to determine the spectrum of indications for the vWF and to achieve improved pharmacokinetics of factor VJJJ in vivo.
Die Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.The object is achieved by the subject matter of the claims.
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß FVJJJ:C in vivo besonders gut und lang andauernd stabilisiert werben kann, wenn von einem vWF mit der hohen Halbwertszeit von mehr als 20 h, vorzugsweise mindestens 30 h, eingesetzt wird. Als wirksame Komponente kann nicht nur nativer vWF bereitgestellt werden, sondern auch funktionell aktive Analoge, Derivate, Fragmente und Mutanten. Vorzugsweise wird rekombinanter vWF (rvWF) erfindungsgemäß eingesetzt. Es ist weiters bevorzugt, eine Fraktion des vWF in der erfindungsgemäßen Präparation zur Verfügung zu stellen.It has surprisingly been found that FVJJJ: C advertise particularly well and with long-term stabilization in vivo can, if used by a vWF with a long half-life of more than 20 h, preferably at least 30 h will. Not only native vWF can be provided as an effective component, but also functionally active ones Analogs, derivatives, fragments and mutants. According to the invention, recombinant vWF (rvWF) is preferably used. It is further preferred to make a fraction of the vWF available in the preparation according to the invention.
Der vWF kann durch chromatographische Reinigungsverfahren, insbesondere durch Ionenaustausch und/oder Af-The vWF can be purified by chromatographic purification, in particular by ion exchange and / or af-
finitätschromatographie fraktioniert werden, wobei die Fraktionen gewonnen werden können, die eine hohe Halbwertszeit bzw. anhaltende Erhöhung des Faktor-VIH-Spiegels in vivo zeigen.finity chromatography are fractionated, the Fractions can be obtained that have a long half-life or sustained increase in the factor VIH level show in vivo.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß durch die Verabreichung eines vWF mit verlängerter Halbwertszeit der FVIILC nicht nur stabilisiert wird, sondern FVIILC in nachhaltiger Weise endogen induziert wird. Die Induktion des körpereigenen FVHLC spielt vor allem dann eine Rolle, wenn der Organismus nicht mit exogenem FVHLC belastet werden soll. Im Fall einer vw-Krankheit wird oftmals gleichzeitig ein Mangel an FVIILC gefunden, obwohl der Patient nicht an Hämophilie A leidet (Pseudohämophilie). Die Verabreichung des FVIILC wäre daher nicht unbedingt erforderlich, falls durch die Verabreichung des vWF genügend endogener FVIILC produziert wird.It has surprisingly been found that the administration of a vWF with a prolonged half-life the FVIILC is not only stabilized, but FVIILC is induced endogenously in a sustainable manner. The induction of the body's own FVHLC plays a role above all, if the organism is not to be burdened with exogenous FVHLC. In the case of vw disease, often at the same time a lack of FVIILC was found, although the patient does not suffer from haemophilia A (pseudo-haemophilia). The administration of the FVIILC would therefore not be absolutely necessary, if sufficient through the administration of the vWF endogenous FVIILC is produced.
Eine Art der Pseudohämophilie ist zurückzuführen auf Mutationen im vWF-Molekül im Bereich zwischen 1 und 272, die die Bindung des FVULC beeinträchtigen. Im Fall von vWF Normandi ist beispielsweise eine Punktmutation für die fehlende Bindungskapazität für FVIILC verantwortlich. One type of pseudohemophilia is due to mutations in the vWF molecule in the range between 1 and 272, which affect the binding of the FVULC. In the case of vWF Normandi, for example, there is a point mutation responsible for the lack of binding capacity for FVIILC.
Dementsprechend eignet sich ein vWF mit einer verlängerten Halbwertszeit zur erfindungsgemäßen Anwendung an einen Patienten mit angeborenen oder erworbenen Mangel an funktionellem vWF. Erfindungsgemäß werden insbesondere die folgenden Krankheiten bzw. durch die Krankheiten verursachte Zustände gemäß der Klassifikation von Sadler et al, Thromb. Haemostasis 74: 161-166 (1995) behandelt. Darunter finden sich alle vw-Krankheiten, die auf Mutationen des vWF-Moleküls zurückzuführen sind, aber auch die νW-Krankheiten vom Typ 1, 2, 3, die durch einen Mangel an vWF gekennzeichnet sind. Diese Krankheiten sind unter den Begriff der funktionellen Störungen des vWF zu subsumieren.Accordingly, a vWF with a prolonged half-life is suitable for use according to the invention to a patient with a congenital or acquired lack of functional vWF. According to the invention in particular the following diseases or conditions caused by the diseases according to the classification of Sadler et al, Thromb. Haemostasis 74: 161-166 (1995). This includes all vw diseases that can be traced back to mutations in the vWF molecule, but also the νW diseases of types 1, 2, 3, which are caused by a Lack of vWF are marked. These diseases come under the concept of functional disorders of the vWF to subsume.
In einer speziellen Ausführungsform werden Krankheitszustände behandelt, die im Zusammenhang mit dem Auftreten von Antikörpern gegen vWF bzw. FVIILC stehen.In a special embodiment, disease states are treated that are related to the occurrence of antibodies against vWF or FVIILC.
Die Behandlung kann einerseits prophylaktisch und andererseits therapeutisch vorgenommen werden. Ein Präparat enthaltend vWF mit einer verlängerten Halbwertszeit eignet sich insbesondere für die Prophylaxe, z. B. vor einer möglichen Verletzung des Patienten oder vor einer Operation, welche mehrere Stunden dauert Die Verabreichung des vWF kann dabei je nach Art der Krankheit mit oder ohne Verabreichung von FVIILC kombiniert werden. Ein FVIILC Gehalt in der pharmazeutischen Präparation ist vor allem dann wünschenswert, wenn eine akute Blutung rasch gestillt werden soll. Da die Erhöhung des endogenen FVIILC Gehalts im Blut des Patienten erst nach einigen Stunden relevant wird, ist eine initiale Verabreichung von FVIILC gemeinsam mit dem νWF vorzuziehen.The treatment can be carried out prophylactically on the one hand and therapeutically on the other hand. A preparation containing vWF with a prolonged half-life is particularly suitable for prophylaxis, e.g. B. in front of a possible Injury to the patient or before an operation which lasts several hours The administration of the vWF can be combined with or without administration of FVIILC, depending on the type of disease. A FVIILC salary in pharmaceutical preparation is particularly desirable when acute bleeding is quickly stopped target. Since the increase in the endogenous FVIILC content in the patient's blood is only relevant after a few hours an initial administration of FVIILC together with the νWF is preferable.
Die Bereitstellung einer pharmazeutischen Präparation enthaltend FVIILC und vWF zur erfindungsgemäßen Anwendung hat den Vorteil, daß der FVIILC nicht nur in vivo stabilisiert wird, sondern auch in vitro. Im Fall von rvWF ist die Kombination mit rFVIILC oder einem entsprechenden funktionell aktiven Derivat, Analogen oder Mutanten besonders vorteilhaft. Die Stabilität des eingesetzten Präparates ist vor allem für Infusionspräparate relevant, welche über eine Dauer von mehreren Stunden einen Patienten infundiert werden können ohne Risiko der Veränderung des Präparates und deren Notwendigkeit der Veränderung des Dosierschemas. The provision of a pharmaceutical preparation containing FVIILC and vWF for use according to the invention has the advantage that the FVIILC is not only stabilized in vivo, but also in vitro. In the case of rvWF, the combination with rFVIILC or a corresponding functionally active derivative, analog or mutant in particular advantageous. The stability of the preparation used is particularly relevant for infusion preparations that have A patient can be infused for a period of several hours without the risk of changing the preparation and their need to change the dosing schedule.
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß der vWF mit der verlängerten Halbwertszeit die Pharmakokinetischen Eigenschaften des FVIILC wesentlich verbessert. So kann erfindungsgemäß auch ein Präparat zur Verfügung gestellt werden, welches den biologisch aktiven FVnLC/vWF-Komplex enthält, dessen verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften, wie eine hohe in vivo "recovery" (Wiederfindung oder biologische Verfügbarkeit) bzw. eine verlängerte Halbwertszeit in vivo für den FVIILC v.a. zurückzuführen sind auf den Gehalt an vWF mit einer verlängerten Halbwertszeit. Das erfindungsgemäße FVnLC/vWF-Präparat zeigt im allgemeinen eine biologische Halbwertszeit des FVIII: C von mehr als 13 h insbesondere mehr als 17 h, wobei auch Halbwertszeiten von mehr als 25 h möglich sind.It has surprisingly been found that the vWF with the extended half-life does the pharmacokinetics Properties of the FVIILC significantly improved. Thus, according to the invention, a preparation can also be made available which contains the biologically active FVnLC / vWF complex, its improved pharmacokinetic Properties such as high in vivo "recovery" (recovery or biological availability) or an extended half-life in vivo for the FVIILC can mainly be attributed to the vWF content with an extended Half-life. The FVnLC / vWF preparation according to the invention generally shows a biological one Half-life of FVIII: C of more than 13 hours in particular more than 17 hours, with half-lives of more than 25 hours also being possible.
Die in vivo "recovery" des erfindungsgemäßen Präparates ist üblicherweise im Bereich von 90 bis 100%, im Plasma.The in vivo "recovery" of the preparation according to the invention is usually in the range from 90 to 100% in the plasma.
Der FVIII: C Anstieg nach Gabe des vWF mit verlängerter Halbwertszeit kann bis auf 6 Einheiten pro Milliliter oder mehr herbeigeführt werden, während im Kontrollversuch bestätigt werden konnte, daß durch Gabe von Haemate® HS Behring im Tierversuch lediglich 3 Einheiten pro Milliliter erreicht worden sind.The FVIII: C increase after administration of the vWF with a prolonged half-life can be up to 6 units per milliliter or more can be brought about, while it was possible to confirm in the control experiment that the administration of Haemate® HS Behring only achieved 3 units per milliliter in animal experiments.
Für die erfindungsgemäße Anwendung eignet sich vor allem die mature Form des vWF, welcher zum Großteil proteolytisch prozessiert ist. Vorzugsweise wird der rvWF verwendet, der durch Kontakt mit einer Protease, wie z. B. Furin oder einer Protease vom Subtilisin-Typ, zumindest 80%, am meisten bevorzugt mehr als 90% bis zu 100%, proteolytisch prozessiert ist.The mature form of vWF, which is largely proteolytic, is particularly suitable for the application according to the invention is processed. Preferably, the rvWF is used, which by contact with a protease, such as. B. furin or a protease of the subtilisin type, at least 80%, most preferably more than 90% up to 100%, proteolytic is processed.
Erfindungsgemäß wird der vWF in der Art und Konzentration verabreicht, daß der FVIILC über einen Zeitraum von mindestens 48 Stunden, vorzugsweise mehr als 72 Stunden in vivo stabilisiert wird. Der FVIILC Gehalt in vivo gilt dann als stabil, wenn trotz Elimination von endogenen bzw. exogenen FVIILC zumindest 0,1, vorzugsweise mehr als 0,3, Units pro Milliliter Blut enthalten ist. Dieser Mindestgehalt an FVIILC gewährleistet einen minimalen Schutz des Patienten vor unerwünschten Blutungen.According to the invention, the vWF is administered in such a manner and concentration that the FVIILC over a period of time is stabilized in vivo for at least 48 hours, preferably more than 72 hours. The FVIILC salary in vivo is considered stable if, despite the elimination of endogenous or exogenous FVIILC, at least 0.1, preferably it contains more than 0.3 units per milliliter of blood. This minimum level of FVIILC ensures a minimum Protection of the patient from unwanted bleeding.
Entsprechend der lang andauernden Wirkung des vWF in vivo kann die initiale Dosis verringert werden, daß das pharmazeutische Präparat erfindungsgemäß ohne Nebenwirkungsreaktionen, wie Thrombosebildung, Thrombozytenaktivierung oder Thrombozytopänie an einem Patienten verabreicht werden kann.According to the long-lasting effect of the vWF in vivo, the initial dose can be reduced that the pharmaceutical Preparation according to the invention without side-effect reactions such as thrombosis or platelet activation or thrombocytopenia can be administered to a patient.
Die Verabreichung der Präparation kann mehrmals erfolgen, wobei durch die hohe Halbwertszeit des vWF längere Intervalle möglich sind, beispielsweise Intervalle von mehr als 12 Stunden, vorzugsweise etwa 24 Stunden (tägliche Verabreichung). Die effektive vWF Menge in der erfindungsgemäß verwendeten pharmazeutischen Präparation führt vorzugsweise zu einer Konzentration an vWF, beispielsweise gemessen als Antigen mit einem entsprechenden ELISA, von mehr als 2 Einheiten/ml Blut über einen Zeitraum von mehr als 24 Stunden, vorzugsweise mehr als 48 Stunden. Die effektive Menge an vWF soll weiters die Blutungscharakteristik normalisieren, d. h. die Blutungsintensität soll deutlich reduziert werden und ein Blutungsstillstand in kürzester Zeit nach einer Verletzung, insbesondere in weniger als 15 Minuten, vorzugsweise weniger als 10 Minuten, herbeigeführt werden.The preparation can be administered several times, with longer due to the high half-life of the vWF Intervals are possible, for example intervals of more than 12 hours, preferably about 24 hours (daily Administration). The effective amount of vWF in the pharmaceutical preparation used according to the invention preferably leads to a concentration of vWF, for example measured as an antigen with a corresponding one ELISA, of more than 2 units / ml blood over a period of more than 24 hours, preferably more than 48 hours. The effective amount of vWF should further normalize the bleeding characteristics, i. H. the intensity of bleeding is said to be significantly reduced and a bleeding arrest in the shortest possible time after an injury, in particular be brought about in less than 15 minutes, preferably less than 10 minutes.
Um die Übertragung von möglicherweise vorhandenen Viren zu verhindern, ist darauf zu achten, daß vorzugsweise pharmazeutische Präparationen zur Anwendungen kommen, die zur Inaktivierung bzw. Abreicherung von Viren behandelt sind.In order to prevent the transmission of any viruses that may be present, it should be ensured that preferably pharmaceutical preparations are used that treats for the inactivation or depletion of viruses are.
Zur Inaktivierung von Viren eignet sich insbesondere eine Hitzebehandlung in Lösung bzw. in festem Zustand, welche sowohl lipidumhüllte als auch nicht-lipidumhüllte Viren verläßlich inaktivieren kann. Beispielsweise wird die erfindungsgemäße Präparation gemäß der EPO 159 311 in festem, nassem Zustand hitzebehandelt. Andere Verfahren zurA heat treatment in solution or in the solid state is particularly suitable for inactivating viruses both lipid-enveloped and non-lipid-enveloped viruses can reliably inactivate. For example, the preparation according to the invention is in accordance with EPO 159 311 in solid, Heat treated when wet. Other methods of
Virus-Inaktivierung umfassen auch die Behandlung mit Detergenzien oder chaotropen Substanzen, beispielsweise gemäß der EP 0 519 901, WO 94/13329, DE 44 34 538, EP 0 131 740 und WO 90/15613.Virus inactivation also includes treatment with detergents or chaotropic substances, for example according to EP 0 519 901, WO 94/13329, DE 44 34 538, EP 0 131 740 and WO 90/15613.
Der vWF wird vorzugsweise als hochreines Protein eingesetzt, welches durch ein chromatographisches Reinigungsverfahren erhalten wird. Die chromatographische Reinigung erfolgt insbesondere durch Ionenaustauschchromatographie und/oder Affinitätschromatographie. Dafür können u. a. Materialien zum Anionenaustausch, darunter synthetische Trägermaterialien oder Träger auf Kohlenhydratbasis, mit Liganden, wie DEAE-, TMAE-, QAE-, Q- oder Aminoalkylgruppen herangezogen werden, bzw. Träger mit immobilisierten Substanzen, die eine spezifische Affinität für vWF aufweisen. Geeignete Affinitätsmaterialien enthalten beispielsweise Heparin. Dieses Reinigungsverfahren eignet sich v. a. für die großtechnische Gewinnung des rvWF.The vWF is preferably used as a highly pure protein, which is obtained by a chromatographic purification process is obtained. The chromatographic purification is carried out in particular by ion exchange chromatography and / or affinity chromatography. For this, inter alia. Anion exchange materials, including synthetic ones Carbohydrate-based carrier materials or carriers with ligands such as DEAE-, TMAE-, QAE-, Q- or Aminoalkyl groups are used, or carriers with immobilized substances that have a specific affinity for vWF. Suitable affinity materials contain, for example, heparin. This cleaning process is suitable v. a. for the large-scale extraction of the rvWF.
Dabei ist zu beachten, daß der vWF in der erfindungsgemäßen Präparation eine ausreichende Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau aufweist, daß auf den Zusatz üblicher Stabilisatoren verzichtet werden kann. In Ausnahmefällen kann aber auch während des Herstellungsverfahrens ein entsprechender Proteaseinhibitor zugesetzt werden, um die intakte Struktur zu erhalten. Zur weiteren Unterstützung der Stabilität des vWF kann das pharmazeutische Präparat auch ein Polyalkylenglycol, wie PEG oder Polypropylenglycol, oder Glycerin in einer Konzentration enthalten, die den vWF nicht präzipitiert und physiologisch verträglich ist.It should be noted that the vWF in the preparation according to the invention has sufficient resistance to it shows a proteolytic degradation that the addition of conventional stabilizers can be dispensed with. In exceptional cases however, a corresponding protease inhibitor can also be added during the manufacturing process, to keep the structure intact. To further support the stability of the vWF, the pharmaceutical preparation also contain a polyalkylene glycol, such as PEG or polypropylene glycol, or glycerine in a concentration which does not precipitate the vWF and is physiologically tolerable.
Die Formulierung der erfindungsgemäß angewandten Präparationen kann in an sich bekannter und üblicher Weise erfolgen, z. B. mit Hilfe von Salzen und gegebenenfalls Aminosäuren, aber auch in Gegenwart von Tensiden vorgenommen werden. Vorzugsweise werden Salze, wie z. B. Natriumchlorid oder Calziumchlorid, verwendet und ein pH im Bereich von 6-8 gewählt. Als Aminosäuren sind Glycin oder Lysin bevorzugt. Ebenso kann ein pharmazeutisch akzeptabler Puffer gewählt werden. Aufgrund der hohen Stabilität des vWF kann üblicherweise auf die Verwendung von Stabilisatoren, wie Trägerproteine oder Inhibitoren in der Formulierung verzichtet werden.The formulation of the preparations used according to the invention can be carried out in a conventional manner which is known per se take place, e.g. B. made with the help of salts and optionally amino acids, but also in the presence of surfactants will. Preferably salts, such as. B. sodium chloride or calcium chloride, used and a pH im Range of 6-8 selected. Glycine or lysine are preferred as amino acids. Likewise, a pharmaceutically acceptable one Buffer can be chosen. Due to the high stability of the vWF, the use of Stabilizers such as carrier proteins or inhibitors are dispensed with in the formulation.
Vorzugsweise kommt ein rvWF in einem Präparat zur Anwendung, welcher nach elektrophoretischer Analyse Multimerenbanden in Abwesenheit von Satellitenbanden zeigt. Dies entspricht der Struktur eines vWF als nicht-fragmentiertes, also intaktes Protein.A rvWF is preferably used in a preparation which, according to electrophoretic analysis, shows multimeric bands in the absence of satellite bands. This corresponds to the structure of a vWF as a non-fragmented, i.e. intact protein.
Vorzugsweise zeigt der rvWF im pharmazeutischen Präparat das gesamte Spektrum an Multimeren, insbesondere auch den vWF mit hohem Molekulargewicht, ähnlich der nativen Multimeren verteilung.The rvWF preferably shows the entire spectrum of multimers, in particular, in the pharmaceutical preparation also the vWF with high molecular weight, similar to the native multimers distribution.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird der rvWF in einer Form erhalten, die nach Verabreichung an ein Säugetier das Multimerenmuster mit einer Singulettstruktur beibehält. Eine proteolytische Aufspaltung der Singuletts in Satellitenbanden bleibt somit aus.According to a preferred embodiment, the rvWF is obtained in a form which, after administration to a Mammal maintains the multimeric pattern with a singlet structure. A proteolytic splitting of the singlets in Satellite bands are therefore absent.
Die bevorzugte Konzentration des vWF in der verabreichungsfertigen Lösung ist im Bereich von 1 bis 100 Einheiten/ml. Durch die hohe Reinheit des Präparates kann dieses auch in Konzentrationen bis zu 1000 E/ml formuliert werden. Die Aktivität ist durch die Ristocetin-mediierte Plättchenaggregation charakterisiert und wird als Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (RCoF) angegeben (siehe dazu Journal of Clinical Investigation 52, 2708-2716, 1973). Die übliche Dosis für den vWF liegt im Bereich von 40-80 RCoF-Einheiten/kg in Intervallen von 6^8 Stunden. Als initiale Dosis kann auch eine höhere Dosis bis zu 200 RCoF gewählt werden.The preferred concentration of vWF in the ready-to-use Solution is in the range of 1 to 100 units / ml. Due to the high purity of the preparation, this can can also be formulated in concentrations up to 1000 U / ml. The activity is through ristocetin-mediated platelet aggregation characterized and is given as ristocetin cofactor activity (RCoF) (see Journal of Clinical Investigation 52, 2708-2716, 1973). The usual dose for the vWF is in the range of 40-80 RCoF units / kg at intervals of 6 ^ 8 hours. As an initial dose a higher dose of up to 200 RCoF can also be selected.
In einer speziellen Ausführungsform enthält die erfindungsgemäß verwendete pharmazeutische Präparation den vWF als einzigen wesentlichen Bestandteil. Somit kann diese Präparation im wesentlichen aus hochgereinigtem vWF bestehen.In a special embodiment, the pharmaceutical preparation used according to the invention contains the vWF as the only essential component. Thus, this preparation can essentially consist of highly purified vWF exist.
Zur Herstellung der pharmazeutischen Präparationen kann der vWF aus Plasma oder einer Plasmapraktion gereinigt werden, wobei je nach Verwendungszweck die gleichzeitige Anreicherung oder Abreicherung des FVIII: C zweckmäßig ist. Wenn von einem Zellkulturüberstand ausgegangen wird kann der vWF ebenfalls in Anwesenheit oder Abwesenheit von FVIItC gereinigt und aufkonzentriert werden. FVHLC kann in diesem Fall entweder dem Zellkulturmedien zugesetzt werden bzw. von der Zelle coexprimiert werden.To produce the pharmaceutical preparations, the vWF can be purified from plasma or a plasma fraction depending on the intended use, the simultaneous enrichment or depletion of the FVIII: C is appropriate. If a cell culture supernatant is assumed, the vWF can also be present or Absence of FVIItC can be purified and concentrated. In this case, FVHLC can either be the cell culture media can be added or coexpressed by the cell.
Gemäß der Erfindung wird weiters ein diagnostisches Set zur Bestimmung einer phänotypischen Hämophilie A zur Verfügung gestellt, welchesAccording to the invention, a diagnostic set for determining a phenotypic haemophilia A is also used Provided which
a) vWF in einer pharmazeutisch akzeptablen Form unda) vWF in a pharmaceutically acceptable form and
b) ein Mittel zur Bestimmung der FVIII:C-Aktivität in einer Blutprobe des Patientenb) a means for determining the FVIII: C activity in a blood sample from the patient
enthält vorzugsweise wird ein vWF mit einer verlängerten Halbwertszeit eingesetzt, insbesondere vWF mit einer Halbwertszeit von mehr als 20 Stunden. rvWF ist für diesen Zweck besonders gut geeignet, da er frei von FVHLC-Aktivität zur Verfügung gestellt werden kann. Bei einem Patienten mit phänotypischer Hämophilie A verursacht die Verabreichung eines vWF Präparates den Anstieg des endogenen FVHLC Gehaltes. Dieser Anstieg ist um so signifikanter, wenn der vWF den FVIII: C in vivo erfindungsgemäß stabilisiert Falls der Patient jedoch an einem Defekt der Hemostase leidet, der einen Mangel an FVULC verursacht, wie, Hämophilie A, oder falls der Patient Antikörper gegen FVULC enthält, die einen Mangel an funktionell aktiven FVULC verursachen, bleibt der Anstieg des endogenen FVHI:C auf. Somit kann der νWF mit der verlängerten Halbwertszeit zur Herstellung einer Präparation verwendet werden, die die Differenzierung zwischen einer vW-Krankheit und einer vW-Krankheit mit einem gleichzeitigen Auftreten eines genomischen Defekts mit der folge eines FVULC Mangels, insbesondere Hämophilie A, verwendet werden.contains preferably a vWF with an extended half-life is used, in particular vWF with a half-life of more than 20 hours. rvWF is particularly well suited for this purpose as it is free of FVHLC activity can be made available. In a patient with phenotypic haemophilia A, the administration causes of a vWF preparation the increase in the endogenous FVHLC content. This increase is all the more significant, if the vWF stabilizes the FVIII: C in vivo according to the invention. However, if the patient suffers from a defect in the hemostasis that causes a deficiency in FVULC, such as, hemophilia A, or if the patient has antibodies against FVULC contains, which cause a lack of functionally active FVULC, the increase in endogenous remains FVHI: C on. Thus, the νWF can be extended with the Half-life can be used to produce a preparation that differentiates between a vW disease and a vW disease with a simultaneous occurrence of a genomic defect with the consequence of a FVULC deficiency, especially haemophilia A, can be used.
Das Mittel zur Bestimmung der FVIILC Aktivität ist entweder ein Mittel zur Bestimmung der Blutgerinnungsaktivität, wobei die Blutgerinnungszeit gemessen wird (Einstufentest oder Zweistufentest), oder aber ein chromogener Test bzw. ein Test zur Bestimmung von aktiven Blutgerinnungsenzymen, die in Abhängigkeit von der FVIILC Aktivität einer Probe wirken. Vorzugsweise wird ein chromogener Test zur Bestimmung der FVIILC Aktivität in einer Plasma- oder Serumprobe gemäß der EP 0 496 723 durchgeführt. Als chromogenes Substrat wird in diesem Fall ein Substrat für Faktor Xa eingesetzt.The means for determining FVIILC activity is either a means for determining blood clotting activity, whereby the blood clotting time is measured (one-step test or two-step test), or a chromogenic one Test or a test for the determination of active blood coagulation enzymes, which are dependent on the FVIILC activity work in a sample. Preferably, a chromogenic test to determine the FVIILC activity in a Plasma or serum sample carried out according to EP 0 496 723. A chromogenic substrate is used in this case Substrate used for factor Xa.
Es ist aber auch möglich die FVIII: C Aktivität mit Hilfe der aPTT (activated partial thromboplastin time) unter Verwendung eines Faktor VIII Mangelplasmas zu bestimmen. Die aPPT ist ein Beispiel für einen Test, welcher die Aktivierung der Blutgerinnung mit einem entsprechenden Aktivator vorsieht, worauf das Ausmaß der Blutgerinnung mit einem entsprechenden Mittel detektiert wird. Das Ausmaß der Blutgerinnung kann beispielsweise durch die Erfassung der Blutgerinnungszeit (Endpunktbestimmung) oder der Kinetik der Blutgerinnung detektiert werden.However, it is also possible to use the FVIII: C activity with the aid of aPTT (activated partial thromboplastin time) to determine a factor VIII deficiency plasma. The aPPT is an example of a test that shows activation the blood coagulation with an appropriate activator, after which the extent of the blood coagulation with a corresponding means is detected. The extent of blood clotting can be determined, for example the blood clotting time (end point determination) or the kinetics of blood clotting can be detected.
Die Erfindung wird weiters durch die nachfolgenden, die Erfindung nicht limitierende Beispiele näher beschrieben.The invention is further described in more detail by the following examples, which do not limit the invention.
ABBILDUNGEN
Abb. 1ILLUSTRATIONS
Fig. 1
Verlauf der Gerinnungsparameter in einem von Willebrand-defizienten Schwein nach Behandlung mit dem erfindungsgemäßen vWF-Präparat.Course of the coagulation parameters in a von Willebrand-deficient one Pig after treatment with the vWF preparation according to the invention.
Abb. 2Fig. 2
Verlauf der Gerinnungsparameter in einem von Willebrand-defizienten Schwein nach Behandlung mit einem plasmatischen vWF/FVHI-Konzentrat.Course of the coagulation parameters in a von Willebrand-deficient one Pig after treatment with a plasmatic vWF / FVHI concentrate.
Abb. 3Fig. 3
Behandlungsschema einer von Willebrand Faktor-immundepletierten Maus.Treatment regimen of a von Willebrand factor immunodepleted mouse.
Abb. 4Fig. 4
Blutungscharakteristik von von Willebrand Faktordefizienten immundepletierten Mäusen nach Behandlung mit plasmatischem von Willebrand Faktor und dem erfindungsgemäßen Präparat mit je 100 E RCoF/kg Körpergewicht im Vergleich zu normalen Mäusen und unbehandelten von Willebrand Faktor-defizienten immundepletierten Mäusen.Bleeding characteristics of von Willebrand factor-deficient immunodepleted mice after treatment with plasmatic von Willebrand factor and the preparation according to the invention each with 100 U RCoF / kg body weight im Comparison to normal mice and untreated von Willebrand factor-deficient immunodepleted mice.
Herstellung eines rekombinanten von Willebrand Faktors aus CHO-ZellenProduction of a recombinant von Willebrand factor from CHO cells
Ein CHO-Zellklon, der rekombinanten von Willebrand Faktor produziert, wird wie in Fischer et al, EEBS. Lett. 351: 345-348, 1994, beschrieben, hergestellt. Durch Transfektion mit einem für die cDNA humanen Furins kodierenden Vektor (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18: 664, 1990) wurde die Zellinie zur Co-Expression von humanem Furin gebracht. Derartige stabile Zellklone wurden im Großmaßstab in Perfusionsreaktoren auf Microcarriern fermentiert (Blüml et al., In: Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds. Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, 1994: 267-269).A CHO cell clone, the recombinant von Willebrand Factor produced is as in Fischer et al, EEBS. Lett. 351: 345-348, 1994. By transfection with a vector coding for the cDNA human furins (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18: 664, 1990) the cell line was made to coexpress human furin. Such stable cell clones have been found Fermented on a large scale in perfusion reactors on microcarriers (Blüml et al., In: Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds. Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, 1994: 267-269).
Die Reinigung wurde durch ein 2-stufiges chromatographisches Verfahren gemäß Thromb. Haemost. 73: 1160, 1995, durchgeführt. Die durch Elution mit Kochsalz desorbierte Fraktion wurde gewonnen und durch Gelfiltration über Sephadex G25 (Pharmacia) in einen Puffer, enthaltend 5 g/l Na3Citrat · 2H2O, 2 g/l NaCl, 5 g/l Glycin, 5 g/l L-Lysin · HCl und 0,62 g/l CaCl2 · 2H2O, pH 7,0, umgepuffert. Die Präparation war charakterisiert durch einen von Willebrand Faktor-Antigengehalt von 36,4 E/ml, gemessen in einem kommerziellen von Willebrand Faktor-ELISA (Boehringer Mannheim) und durch eine von Willebrand Faktor-Aktivität von 13,8 E/ml, gemessen mittels Ristocetin-mediierter Plättchenaggregation (Evans et al, Brit. J. Haematol. 37: 289-294,1977).The purification was carried out by a 2-step chromatographic method according to Thromb. Haemost. 73: 1160, 1995. The fraction desorbed by elution with common salt was collected and transferred by gel filtration through Sephadex G25 (Pharmacia) to a buffer containing 5 g / l Na 3 citrate 2H 2 O, 2 g / l NaCl, 5 g / l glycine, 5 g / L-Lysine · HCl and 0.62 g / L CaCl 2 · 2H 2 O, pH 7.0, re-buffered. The preparation was characterized by a von Willebrand factor antigen content of 36.4 U / ml, measured in a commercial von Willebrand factor ELISA (Boehringer Mannheim) and by a von Willebrand factor activity of 13.8 U / ml, measured by Ristocetin-mediated platelet aggregation (Evans et al, Brit. J. Haematol. 37: 289-294, 1977).
In vivo-Aktivität und Pharmakokinetik von rekombinantem von Willebrand Faktor in einem homozygoten von Willebrand Faktor-defizienten Schwein im Vergleich zu porcinemIn vivo activity and pharmacokinetics of recombinant von Willebrand factor in a homozygous von Willebrand Factor-deficient pig compared to porcinem
von Willebrand Faktorvon Willebrand factor
Für die Untersuchung können von Willebrand-defiziente Tiere, wie z. B. die von Roussi et al., Brit. J. Haematol. 90: 661-668 1995, beschriebenen homozygoten von Willebrand-defizienten Schweine, verwendet werden. In diesem Versuch wurde ein 4 Monate altes, 37 kg schweres, weibliches, homozygotes von Willebrand-defizientes Schwein eingesetzt. Dieses war charakterisiert durch eine Blutungszeit von über 30 Minuten, gemessen nach der Ohrblutungsmethode von Samama et al, Thromb. Haemostas. 71: 663-669, 1994, und einen von Willebrand Faktor-Plasmaspiegel von unter der Nachweisgrenze, sowohl im Antigen-ELISA als auch in der Ristocetincofaktoraktivität bestimmt. Die Faktor VIII-Aktivität betrug ca. 1 E/ml, gemessen als humaner Faktor VIE im 1-Stufen-Gerinnungstest (Immuno), 2-Stufen-Gerinnungstest (Immuno), oder chromogenem Faktor VIII-Test (Immunochrom FVIII: C, Immuno). For the investigation, von Willebrand-deficient animals, such as z. B. that of Roussi et al., Brit. J. Haematol. 90: 661-668 1995, described homozygous von Willebrand deficient ones Pigs, are used. In this experiment, a 4 month old, 37 kg, female, homozygous von Willebrand-deficient pig used. This was characterized by a bleeding time of over 30 minutes, measured according to the ear bleeding method by Samama et al, Thromb. Haemostas. 71: 663-669, 1994 and a von Willebrand factor plasma level of below the detection limit, both in the antigen ELISA and in the ristocetin cofactor activity. The factor VIII activity was approx. 1 U / ml, measured as human factor VIE in the 1-step coagulation test (Immuno), 2-step coagulation test (Immuno), or chromogenic factor VIII test (Immunochrom FVIII: C, Immuno).
Unter Narkose wurde dem Schwein eine erfindungsgemäße Präparation, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen wurde, in einer Dosis von 34 RCoF E/kg Körpergewicht injiziert. Unmittelbar vor der Infusion sowie 30 min., 1 Std., 2 Std., 3 Std., 6 Std., 9 Std., 12 Std., 24 Std. und 32 Std. nach Infusion wurden Blutproben genommen, daraus Citratplasma hergestellt und aus diesem von Willebrand Faktor-Antigen, Ristocetincofaktoraktivität und Faktor VIII nach den oben genannten drei Testmethoden bestimmt. Die Resultate sind Abb. 1 zu entnehmen. Es zeigte sich, daß nach etwa 24 Stunden, zu einem Zeitpunkt als keine Ristocetincofaktoraktivität des infudierten Präparates ex vivo mehr nachweisbar war, eine nachhaltige Verfünffachung des Plasmaspiegels an Faktor VIII eingetreten war. Für das vWF-Antigen konnte eine biologische Halbwertszeit von 32,4 Stunden errechnet werden.A preparation according to the invention, as described in Example 1, was obtained from the pig under anesthesia was injected at a dose of 34 RCoF U / kg body weight. Immediately before the infusion and 30 min., Blood samples were taken 1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 9 hours, 12 hours, 24 hours and 32 hours after the infusion Citrated plasma is produced and from this von Willebrand factor antigen, ristocetin cofactor activity and factor VIII determined by the above three test methods. The results are shown in Fig. 1. It turned out that after about 24 hours, at a point in time when there was no ristocetin cofactor activity of the infused preparation ex vivo was more detectable, a sustained five-fold increase in the plasma level of factor VIII had occurred. For the A biological half-life of 32.4 hours could be calculated for vWF antigen.
Als Kontrolle wurde ein porcines, plasmatisches von Willebrand Faktor-Präparat unmittelbar nach Entnahme der letzten Blutprobe demselben Schwein in einer Dosis von 45 RCoF E/kg Körpergewicht gegeben. Ebenso wie nach Gabe des erfindungsgemäßen Präparates wurden zum Zeitpunkt 30 min., Std., 2 Std., 3 Std., 6 Std., 9 Std., 12 Std., 24 Std. und 32 Std. nach Infusion Blutproben gezogen, aus diesen Plasma hergestellt und die entsprechenden Faktor VHI/von Willebrand Faktor-spezifischen Gerinnungsparameter bestimmt. Es zeigte sich, daß es auch hier zu einer Induktion des Faktor VIII kam, der jedoch bezogen auf den Ausgangswert nach ca. 10 Stunden aber nur den doppelten Wert erreichte und auch schneller wieder abnahm. Der porcine, plasmatische von Willebrand Faktor zeigte eine Halbwertszeit von ca. 10 Stunden. Als makroskopischen Parameter für die Normalisierung des im defizienten Tier gestörten Gerinnungssystems wurde die Blutungszeit bestimmt, die von über 30 Minuten vor Infusion des von Willebrand Faktors auf ca. 13 Minuten nach Infusion korrigiert werden konnte, wobei dieser Effekt auch noch 32 Stunden nach der Infusion nachweisbar war. Die Infusion des plasmatischen von Willebrand Faktor führte ebenso zu einer Korrektur der Blutungszeit auf ca. 15 Minuten während die Blutungszeit 24 Stunden nach der Infusion des plasmatischen von Willebrand Faktor-Präparates bereits wieder dem Ausgangswert entsprach, also keine Verkürzung feststellbar war.A porcine, plasmatic von Willebrand factor preparation was used as a control immediately after the last blood sample given to the same pig at a dose of 45 RCoF U / kg body weight. Just like after giving of the preparation according to the invention were at the time 30 minutes, hours, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 9 hours, 12 hours, 24 hours. and 32 hours after infusion, blood samples were drawn, plasma was prepared from this and the corresponding factor VHI / von Willebrand factor-specific coagulation parameters are determined. It turned out that here too there was an induction of factor VIII came, which, however, only reached twice the value after approx. 10 hours based on the initial value and also decreased more quickly. The porcine, plasmatic von Willebrand factor showed a half-life of approx. 10 hours. As a macroscopic parameter for the normalization of the disturbed coagulation system in the deficient animal the bleeding time was determined, that of over 30 minutes before infusion of the von Willebrand factor could be corrected to about 13 minutes after the infusion, with this effect still 32 hours after the infusion was detectable. The infusion of the plasmatic von Willebrand factor also led to a correction of the bleeding time to approx. 15 minutes while the bleeding time was 24 hours after the infusion of the plasmatic von Willebrand factor preparation already corresponded to the initial value, so no shortening was noticeable.
Pharmakokinetik der Multimere von rekombinantem von
Willebrand Faktor im SchweinPharmacokinetics of the multimers of recombinant of
Willebrand factor in the pig
Aus den Plasmaproben des Versuches aus Beispiel 2 wurde die Struktur der von Willebrand Faktor-Multimere durch SDS-Agarosegelelektrophorese im 2%igen Agarosegel nach der Methode von Ruggeri et al., Blood 57: 1140-1143, bestimmt. Dabei wurden die von Wille-The structure of the von Willebrand factor multimers was derived from the plasma samples from the experiment from Example 2 by SDS agarose gel electrophoresis in a 2% agarose gel by the method of Ruggeri et al., Blood 57: 1140-1143. The von Wille-
brand Faktor-Multimere durch eine immunenzyniatische Färbung nach Aihara et al, Thromb. Haemostas. 55: 263-267, 1986, sichtbar gemacht. Als primärer Antikörper wurde ein Kaninchen-anti-von Willebrand Faktor-Antiserum (Dakopatts. Glostrup, Denmark) in einer Verdünnung von 1 : 5000 verwendet. Als sekundärer Antikörper diente ein alkalische Phosphatase-konjugierter, affinitätsgereinigter Ziegen-anti-Kaninchen-IgG H + L Antikörper (Axell, Accurate Chemical and Scientific Corp., NY) in einer Verdünnung von 1 : 1000. Die Färbung der Proteinbanden erfolgte mittels des Nitroblau-tetrazolium-chloridbrom-indolyl-phosphatsubstratsystems. brand factor multimers by immunoenzynial staining according to Aihara et al, Thromb. Haemostas. 55: 263-267, 1986, made visible. A rabbit anti-von Willebrand factor antiserum was used as the primary antibody (Dakopatts. Glostrup, Denmark) used in a dilution of 1: 5000. Served as a secondary antibody an alkaline phosphatase-conjugated, affinity-purified goat anti-rabbit IgG H + L antibody (Axell, Accurate Chemical and Scientific Corp., NY) at a dilution of 1: 1000. The protein bands were stained using the nitro blue tetrazolium chloride bromo indolyl phosphate substrate system.
Vor Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Präparat konnte kein von Willebrand Faktor im Schwein nachgewiesen werden. Nach Gabe des Präparates zeigte sich, eine für den nativen Zustand atypische Struktur eines aus Singuletts bestehenden Multimerenmusters, welches auf einen nicht proteolytisch verdauten von Willebrand Faktor zurückzuführen ist. Diese Struktureigenschaft blieb über den gesamten Beobachtungszeitraum unverändert, d. h. keine proteolytische Degradation des Präparates fand statt. Das Präparat wurde allerdings entsprechend der Pharmakokinetik aus der Zirkulation sukzessive eliminiert Multimere des niedrigsten Molekulargewichtes blieben bis zu 32 Stunden nach Infusion des Präparates nachweisbar.Before treatment with the preparation according to the invention, no von Willebrand factor could be detected in pigs will. After administration of the preparation, a structure of singlets that was atypical for the native state was found existing multimer pattern, which can be traced back to a non-proteolytically digested von Willebrand factor is. This structural property remained unchanged over the entire observation period; H. no proteolytic Degradation of the preparation took place. However, according to the pharmacokinetics, the preparation was taken from the Circulation successively eliminated Lowest molecular weight multimers persisted for up to 32 hours after infusion of the preparation detectable.
In vivo-Aktivität und Pharmakokinetik eines plasmatischen von Willebrand/Faktor VIII-Konzentrates in einem homozygoten von Willebrand Faktor-defizienten SchweinIn vivo activity and pharmacokinetics of a plasmatic von Willebrand / Factor VIII concentrate in a homozygous von Willebrand factor-deficient pig
Analog zum Beispiel 2 wurde einem 91 kg schweren weiblichen, homozygoten, vWF-defizienten Schwein ein humanes, plasmatisches FVIH/vWF-Konzentrat, HAE-MATE HS 1000 (Fa. Behring), in einer Dosierung von 34 RCoF E/kg KG gegeben. Dieses Präparat ist ein Faktor VEH- und von Willebrand Faktor-enthaltendes Konzentrat. Entsprechend wurde mit der Gabe des von Willebrand Faktors dem Schwein eine Dosis von 17 EE FVEEE/kg KG verabreicht. Unmittelbar vor der Infusion sowie 30 min., 1 Std., 2 Std., 3 Std., 6 Std., 9 Std., 12 Std., 24 Std. und 32 Std. nach der Infusion wurden Blutproben genommen, Citratplasma hergestellt und aus diesem von Willebrand Faktor-Antigen, Ristocetincofaktoraktivität und Faktor VEEE nach den im Beispiel 2 beschriebenen Testmethoden bestimmt. Die Resultate sind Abb. 2 zu entnehmen. Es zeigte sich, daß etwa 12 Stunden nach der Enfusion des Präparates, zu einem Zeitpunkt, wo noch ein meßbarer Plasmaspiegel an von Willebrand Faktor-Ristocetincofaktoraktivität nachweisbar war, die FVEEE-Plasmakonzentration auf das 2,8fache angestiegen war. Durch externe Zuführung von Faktor VEEE stieg der FVEEE-Spiegel unmittelbar nach der Enfusion um ca. 0,4 E/ml Plasma an. Dies entsprach einer theoretischen Wiederfindungsrate von 94% des infundierten Faktors VEEE.Analogously to example 2, a 91 kg female, homozygous, vWF-deficient pig became a human, plasmatic FVIH / vWF concentrate, HAE-MATE HS 1000 (from Behring), given in a dosage of 34 RCoF U / kg body weight. This preparation is a factor Concentrate containing VEH and von Willebrand factor. Accordingly, with the gift of the von Willebrand factor administered a dose of 17 EE FVEEE / kg body weight to the pig. Immediately before the infusion and 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours, 6 hours, 9 hours, 12 hours, 24 hours and 32 hours after blood samples were taken from the infusion, citrated plasma was prepared and von Willebrand factor antigen, Ristocetin cofactor activity and factor VEEE were determined by the test methods described in Example 2. The results are shown in Fig. 2. It was found that about 12 hours after the drug had been infused, at a point in time where a measurable plasma level of von Willebrand factor ristocetin cofactor activity was still detectable, the FVEEE plasma concentration increased 2.8-fold was. The FVEEE level rose by approximately 0.4 immediately after the infusion due to the external addition of factor VEEE U / ml plasma. This corresponded to a theoretical recovery rate of 94% of the infused factor VEEE.
Für das vWF-Antigen wurde eine biologische Halbwertszeit von 7,5 Stunden errechnet. Damit zeigte sich eine deutlich kürzere biologische Halbwertszeit des humanen, plasmatischen von Willebrand Faktors im Vergleich zum rekombinanten von Willebrand Faktor aus Beispiel 2.A biological half-life was established for the vWF antigen calculated from 7.5 hours. This showed a significantly shorter biological half-life of the human, plasmatic von Willebrand factor in comparison to the recombinant von Willebrand factor from example 2.
Analog zu Beispiel 3 wurde die Multimerenstruktur des von Willebrand Faktors in den Schweineplasmaproben analysiert. Die schnellere Elimination aus der Zirkulation als die des rekombinanten von Willebrand Faktors konnte auch hier nachgewiesen werden und war mit den in der Abb. 2 angegebenen Antigenkonzentrationen vergleichbar. Das Präparat zeigte die für von Willebrand Faktor typische Triplett-Struktur, die auf eine proteolytische Degradation zurückzuführen ist.Analogously to Example 3, the multimeric structure of the von Willebrand factor was analyzed in the pig plasma samples. The faster elimination from the circulation than that of the recombinant von Willebrand factor could also be achieved can be detected here and was comparable to the antigen concentrations given in Fig. 2. The Specimen showed the triplet structure typical of von Willebrand factor, which is due to proteolytic degradation.
BEESPEEL 5BEESPEEL 5
Vergleich der in vivo-Aktivität eines plasmatischen von Willebrand Faktor/Faktor VEEE-Konzentrates und eines rekombinanten von Willebrand Faktors in einer temporär von Willebrand Faktor-defizienten MausComparison of the in vivo activity of a plasmatic from Willebrand factor / factor VEEE concentrate and a recombinant von Willebrand factor in a temporarily von Willebrand factor-deficient mouse
Weibliche NMRE-Mäuse (ca. 20-30 g) werden verwendet und durch Gabe von 65 mg/kg Pentobarbital narkotisiert. Anschließend wird die Blutungscharakteristik mit einer modifizierten Methode nach Novak et al., Brit. J. Ha ematol. 69: 371-378, 1988, durch definierte Verletzung der Schwanzspitze bestimmt. Das aus der arterio-venösen Verletzung der Schwanzspitze austretende Blut wird auf Filtern (Pipetman P5000-Schutzfilter, Gilson) so gesammelt, daß das Blut direkt den Filter tropfen kann, ohne von diesem durch Kapillarwirkung aufgesogen zu werden, um zu verhindern, daß ein sich formierendes Blutgerinnsel zerstört wird. Die Filtereinheiten werden alle 2 Minuten gewechselt und das austretende Blut in Fraktionen gesammelt. Die Blutsammlung wird 16 Minuten fortgesetzt. Danach wird, sofern die Blutung nicht zum Stillstand gekommen ist, die Wunde verödet. Die Qualifizierung der Blutungscharakteristik erfolgt durch Extraktion des in Fraktionen auf den Filtern gesammelten Blutes jeweils mit 5 ml 0,04%iger Ammoniumhydroxidlösung über 5 Stunden. Dabei lysieren die Erythrozyten, die mit dem Blut im Filter gesammelt sind. Durch eine 10-minütige Ultraschallbehandlung (Sonorex RKlOO, Bandelin electronic, Berlin) wird das Haemoglobin extrahiert und quantitativ photometrisch bei 416 nm gegen eine Eichkurve bestimmt. Eine solche kann ermittelt werden indem Mausblutvolumina zwischen 10 μΐ - 1 ml auf die Filter pipettiert werden, diese wie oben beschrieben extrahiert werden und das entsprechende Haemoglobin photometrisch bei 416 nm bestimmt wird. Entsprechend lassen sich lineare Eichkurven erstellen, die eine direkte Umrechnung der Haemoglobinkonzentration auf die Blutmenge pro Filter ermöglichen. Die Blutungscharakteristik wird ermittelt, indem graphisch die einzelnen Blutfraktionen additiv gegen die Zeit aufgetragen werden. Der Blutungsverlauf einer gesunden Maus ist unter diesen Bedingungen dadurch charakterisiert, daß in einem Beobachtungszeitraum zwischen 6 min und Versuchsende kein weiteres Blut aus der künstlich herbeigeführten Verletzung austritt, also die Blutung bereits zuvor zum Stillstand gekommen ist. En der Graphik zeichnet sich ein derartiger Verlauf durch Parallelität zur x-Achse aus (siehe Abb. 3).Female NMRE mice (approx. 20-30 g) are used and anesthetized by administration of 65 mg / kg pentobarbital. The bleeding characteristics are then determined using a modified method according to Novak et al., Brit. J. Haematol. 69: 371-378, 1988, determined by defined trauma to the tip of the tail. That from the arterio-venous injury Blood escaping from the tip of the tail is collected on filters (Pipetman P5000 protective filter, Gilson) in such a way that the blood can drip directly into the filter without being sucked up by it by capillary action, in order to prevent that a forming blood clot is destroyed. The filter units are changed every 2 minutes and the exiting blood collected in fractions. Blood collection continues for 16 minutes. After that, if the bleeding has not stopped, the wound is deserted. Qualification of the bleeding characteristic takes place by extracting the blood collected in fractions on the filters with 5 ml of 0.04% ammonium hydroxide solution over 5 hours. The erythrocytes that are collected with the blood in the filter are lyzed. A 10-minute ultrasound treatment (Sonorex RKlOO, Bandelin electronic, Berlin) removes the hemoglobin extracted and quantitatively photometrically at 416 nm against a calibration curve is determined. Such can be determined by placing mouse blood volumes between 10 μl - 1 ml on the filter are pipetted, these are extracted as described above and the corresponding hemoglobin photometrically is determined at 416 nm. Correspondingly, linear calibration curves can be created, which are a direct conversion of the hemoglobin concentration to allow the amount of blood per filter. The bleeding characteristics are determined by graphically the individual blood fractions are plotted additively against time. The course of bleeding in a healthy one Under these conditions, the mouse is characterized in that in an observation period between 6 min and at the end of the experiment, no further blood escapes from the artificially caused injury, i.e. the bleeding has already occurred has come to a standstill. In the graphic, such a course is characterized by parallelism to the x-axis (see Fig. 3).
Mäuse werden nun mit einem anti-von Willebrand Faktor- Enhibitor in einer Dosis von 10 ml/kg Körpergewicht vorbehandelt. Das anti-von Willebrand Faktor-Enhibitorplasma wird durch Emmunisierung einer ca. 50 kg schweren 1,5 Jahre alten Ziege mit einem von Willebrand Faktor-Präparat wie folgt gewonnen:Mice are now treated with an anti-von Willebrand factor inhibitor in a dose of 10 ml / kg body weight pretreated. The anti-von Willebrand factor inhibitor plasma is produced by emmunizing an approximately 50 kg 1.5 year old goat obtained with a von Willebrand factor preparation as follows:
1 g Kryopräzipitat wird in 35 ml einer Tris/Lysin-gepufferten NaCl-Lösung (85 mM) gelöst. Proteine des Prothrombinkomplexes werden durch Adsorption an AIOH3 und BaSC>4 entfernt. Dazu wird die von Willebrand Faktor/Faktor VEEI enthaltende Lösung mit 0,1 Gew.-% AlOH3 1 Stunde bei 22°C inkubiert. Anschließend wird der AlOH3-Proteinkomplex durch Zentrifugation abgetrennt. Der gewonnene Überstand wird weiters mit 0,1 Gew.-% BaSO4 unter Rühren inkubiert und derBaSOzrProteinkomplex neuerlich durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wird anschließend auf pH 6,8 eingestellt und durch Chromatographie über Q-Sepharose® FF (Pharmacia) gereinigt. Der von Willebrand Faktor-Komplex wird an das in einer Säule ge-1 g of cryoprecipitate is dissolved in 35 ml of a Tris / lysine-buffered NaCl solution (85 mM). Prothrombin complex proteins are removed by adsorption on AIOH3 and BaSC> 4. For this purpose, the solution containing von Willebrand factor / factor VEEI is incubated with 0.1% by weight AlOH 3 for 1 hour at 22 ° C. The AlOH 3 protein complex is then separated off by centrifugation. The supernatant obtained is further incubated with 0.1% by weight BaSO4 with stirring and the BaSOz protein complex is again separated off by centrifugation. The supernatant is then adjusted to pH 6.8 and purified by chromatography over Q-Sepharose® FF (Pharmacia). The von Willebrand factor complex is linked to that in a column
packte Gel adsorbiert; nicht-bindende Proteine werden durch Waschen mit 4 Säulen Volumina des Startpuffers entfernt. Die Elution der Proteinfraktion wird mit einem Puffer (50 mM Tris/HCl, 500 mM NaCl, pH 6,8) durchgeführt. Das gewonnene Eluat wird mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 6,8, auf eine Konzentration von 175 mM NaCl verdünnt und anschließend durch Gelfiltration auf Sepharose® CL6B (Pharmacia) weiter gereinigt. Die Gelfiltration wird mit einem linearen Fluß von 5,7 cm/h in einer Säule mit 26 mm Durchmesser und einer Betthöhe von 82 cm durchgeführt. Die Proteinfraktion des Ausschlußvolumens wird bei 280 nm UV-spektroskopisch detektiert. Der Protein-Peak des Ausschlußvolumens wird durch Ultrafiltration, mit einem Ultrafilter mit einer Retentionsmasse von 30.000 D konzentriert. Ein so hergestellter von Willebrand Faktor/Faktor VIII-Komplex hat eine spezifische Aktivität von 173 Ristocetin-Cofaktoreinheiten (E RCoF) vWF/mg Protein (bestimmt mittels Proteinbestimmung nach Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976. Die Präparation ist frei an Gerinnungsfaktoren Π, VII, IX, X, XI und XII. packed gel adsorbed; non-binding proteins are removed by washing with 4 column volumes of the starting buffer. The protein fraction is eluted with a buffer (50 mM Tris / HCl, 500 mM NaCl, pH 6.8). The The eluate obtained is treated with 50 mM Tris / HCl buffer, pH 6.8, diluted to a concentration of 175 mM NaCl and then by gel filtration on Sepharose® CL6B (Pharmacia) further cleaned. The gel filtration is carried out with a linear flow of 5.7 cm / h in a column of 26 mm diameter and a bed height of 82 cm. The protein fraction of the void volume is measured at 280 nm Detected by UV spectroscopy. The protein peak of the void volume is concentrated by ultrafiltration with an ultrafilter with a retention mass of 30,000 D. A von Willebrand factor / factor VIII complex prepared in this way has a specific activity of 173 ristocetin cofactor units (E RCoF) vWF / mg protein (determined by means of protein determination according to Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-254, 1976. The preparation is free from coagulation factors Π, VII, IX, X, XI and XII.
Mäuse werden nun mit dem anti-von Willebrand Faktor-Inhibtiorplasma nach dem Schema aus Abb. 4 vorbehandelt. Eine Maus mit derart indizierter temporärer von Willebrand-Defizienz zeigt bei Infusion von physiologischer Kochsalzlösung in der nachfolgenden Schwanzspitzenblutungscharakteristik eine stetige Blutung vom Beginn des Meßzeitraumes bis zum Abschluß des Experimentes (siehe Abb. 4). In diesem Modell des von Willebrand/Jürgens-Syndroms werden nun ein Präparat, enthaltend plasmatischen von Willebrand Faktor, sowie ein erfindungsgemäßes Präparat auf ihre Wirkung untersucht. Dabei werden in beiden Fällen 100 E vWF Ristocetincofaktoraktivität (RCoF)/kg jeweils als Bolus gegeben. Die Blutungscharakteristik ist der Abb. 4 zu entnehmen. Überraschenderweise zeigt sich, daß ein gemäß Beispiel 1 hergestelltes von Willebrand Faktor-Präparat in diesem Ansatz die Blutungscharakteristik der von Willebrand-defizienten Maus auf die einer gesunden Maus korrigiert, während das plasmatischen von Willebrand Faktor-Präparat (IMMUNATE® STIM4, Immuno) in derselben Dosierung zwar eine deutliche Reduktion der Blutungsintensitat bewirkt, aber zu keinem Blutungsstillstand wie das erfindungsgemäße Präparat führt. Nach Gabe des rekombinanten von Willebrand Faktor-Präparates und durchgeführter Bestimmung der Blutungscharakteristik wurde den Tieren eine Blutprobe durch Herzpunktion entnommen. Aus ex vivo Plasmaproben wurde die Mulitmerenzusammensetzung des infundierten vWF bestimmt. Es zeigte sich, daß die Singulettstruktur auch nach Infusion über den gesamten Messzeitraum erhalten blieb.Mice are now inhibited with the anti-von Willebrand factor inhibitor plasma pretreated according to the scheme in Fig. 4. A mouse with temporary von Willebrand deficiency indexed in this way shows after infusion of physiological saline in the following tail tip bleeding characteristics a steady bleeding from the beginning of the measurement period to the end of the experiment (see Fig. 4). In This model of the von Willebrand / Jurgens syndrome will now be a preparation containing plasmatic von Willebrand Factor, as well as a preparation according to the invention examined for their effect. In both cases, 100 E vWF ristocetin cofactor activity (RCoF) / kg given as a bolus. The bleeding characteristics are shown in Fig. 4 remove. Surprisingly, it is found that a von Willebrand factor preparation prepared according to Example 1 in the bleeding characteristics of von Willebrand-deficient ones Mouse corrected to that of a healthy mouse, while the plasmatic von Willebrand factor preparation (IMMUNATE® STIM4, Immuno) in the same dosage a significant reduction in bleeding intensity causes, but does not lead to a bleeding arrest like the preparation according to the invention. After administration of the recombinant von Willebrand factor preparation and the determination of the bleeding characteristics was carried out for the animals Blood sample taken by cardiac puncture. From ex vivo plasma samples, the multiple composition of the infused vWF determined. It was found that the singlet structure was maintained even after infusion over the entire measurement period.
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