DE19610321C2 - Method and arrangement for the coulometric determination of a substrate in a solution - Google Patents

Method and arrangement for the coulometric determination of a substrate in a solution

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Description

Die Erfindung betrifft einen Sensor zur selektiven Bestimmung von Substraten diverser Enzyme. Die bei der enzymatischen Reaktion entstehenden oder verbrauchten elektroaktiven Stoffe werden coulometrisch detektiert.The invention relates to a sensor for selective determination of substrates of various enzymes. The enzymatic Reacting or consumed electroactive substances are detected coulometrically.

Das heutzutage am häufigsten angewendete Prinzip zum Aufbau eines Enzymsensors besteht aus einer amperometrischen oder potentiometrischen Elektrode, die entweder mit einer Enzymmembran oder einem Enzymreaktor als Teil eines Fließsystems gekoppelt ist. Ein Teil des in der Probe enthaltenen Analyten reagiert enzymkatalysiert zu oder unter Verbrauch von elektroaktiven Sekundäranalyten, die an den Elektroden umgesetzt werden (Amperometrie) oder dort ein Potential aufbauen (Potentiometrie). Allgemeine Ausführungen hierzu sind beispielsweise zu finden in "Sensors: a comprehensive survey" Vol. 3, Göpel, W., Hesse, J. und Zemel, J. N. (Hrsg.), (1991), VCH, Weinheim. Bei derartigen Anordnungen wird nur ein Teil des Analyten in ein Signal umgewandelt (Relativbestimmung). Die Signalstärke wird hierbei unerwünscht durch Diffusion, Konvektion, Temperatur, Ablagerungen sowie dem Zustand des Enzyms beeinflußt. Wenn Enzymsensoren als Teil eines Fließ-Injektions-Analysensystems betrieben werden, muß darüberhinaus die Fließgeschwindigkeit konstant gehalten werden. Derartige Systeme sind nicht nur apparativ aufwendig, sondern oft auch störanfällig und in der Handhabung problematisch.The most common principle of construction today an enzyme sensor consists of an amperometric or potentiometric electrode, either with a Enzyme membrane or an enzyme reactor as part of a Flow system is coupled. Part of that in the sample contained analyte reacts catalyzed to or under Consumption of electroactive secondary analytes on the Electrodes are implemented (amperometry) or there Build up potential (potentiometry). General remarks this can be found, for example, in "Sensors: a comprehensive survey "Vol. 3, Göpel, W., Hesse, J. and Zemel, J. N. (ed.), (1991), VCH, Weinheim. With such Arrangements are only part of the analyte in a signal converted (relative determination). The signal strength is undesirable due to diffusion, convection, temperature, Deposits and the state of the enzyme are affected. If Enzyme sensors as part of a flow injection analysis system the flow rate must also be operated be kept constant. Such systems are not only expensive in terms of equipment, but often also prone to failure and in the Handling problematic.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein möglichst einfaches Verfahren sowie einen mehrfach verwendbaren Enzymsensor zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, mit geringem apparativen Aufwand und unter Ausschluß der oben erwähnten Einflüsse auf die Sensorantwort einen Analyten in wässeriger Lösung zu quantifizieren.The object of the invention is to make the process as simple as possible as well as a reusable enzyme sensor places that make it possible with little equipment and excluding the above-mentioned influences on the Sensor response to an analyte in aqueous solution quantify.

Die Lösung dieser Aufgabe liefert ein erfindungsgemäßes Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Hauptanspruchs. Ein Verfahren gemäß einer alternativen Lösungsvariante im Rahmen der Erfindung ist in Anspruch 2 beschrieben. Apparativ wird das Problem durch einen Enzymsensor gelöst, der aus einem coulometrischen Transducer (Meßzelle für den Sekundäranalyten), einem kapillarförmigen Enzymreaktor und einer Fördereinrichtung, wie z. B. eine motorgetriebenen Kolbenspritze zum Transport der Probenflüssigkeit durch die Anordnung besteht. Es muß nicht unbedingt ein kapillarförmiger Enzymreaktor sein. Eine Variante, welche ebensogut funktioniert, kann beispielsweise ein dünner Hohlzylinder sein. Selbst mit einem gewöhnlichen Schüttbettreaktor läßt sich ein derartiger Sensor konstruieren, auch wenn diese Lösung suboptimal ist. Allgemein formuliert liegt eine geeignete Lösung dann vor, wenn der Enzymreaktor sowohl ein möglichst hohes (enzymbedeckte) Oberflächen/Volumenverhältnis als auch ein möglichst kleines Totvolumen aufweist. In diesem Sinne ist eine Kapillare also nur eine von mehreren möglichen Lösungen. In den weiteren Unteransprüchen sind bevorzugte Ausführungsformen einer erfindungsgemäßen Anordnung zur coulometrischen Bestimmung eines Substrats in einer Lösung (Metabolismussensor) beschrieben. Insbesondere finden sich darin bauliche Varianten zur Verkürzung der Meßdauer, zur weiteren Vereinfachung des Aufbaus und zur Beseitigung von interferierenden Substanzen.A solution according to the invention provides this object Process with the characterizing features of the main claim. A method according to an alternative solution variant in The scope of the invention is described in claim 2. Apparative the problem is solved by an enzyme sensor that consists of a coulometric transducer (measuring cell for the secondary analyte), a capillary enzyme reactor and one Conveyor such. B. a motor-driven Piston syringe for transporting the sample liquid through the Arrangement exists. It doesn't necessarily have to be a capillary Be an enzyme reactor. A variant, which just as well works, can for example be a thin hollow cylinder. Even with an ordinary fluid bed reactor, one can  construct such a sensor, even if this solution is suboptimal. Generally speaking, there is a suitable one Solution before when the enzyme reactor is both a possible high (enzyme covered) surface / volume ratio as well has the smallest possible dead volume. With that in mind a capillary is only one of several possible solutions. In the further subclaims are preferred Embodiments of an arrangement according to the invention coulometric determination of a substrate in a solution (Metabolism sensor). In particular, there are therein structural variants for shortening the measuring time, for further simplify construction and eliminate interfering substances.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert:In the following the invention with reference to the drawing explains:

Fig. 1 zeigt das Schema eines erfindungsgemäßen Sensors einschließlich Motorantrieb, Rechnersteuerung, Ausgabeeinheit und Stromquelle. Fig. 1 shows the scheme of a sensor according to the invention including motor drive, computer control, output unit and power source.

Fig. 2 illustriert beispielhaft den Aufbau von Motorantrieb, coulometrischer Meßzelle und Enzymreaktor. Fig. 2 illustrates an example of the structure of the motor drive, coulometric measuring cell and enzyme reactor.

Fig. 3 zeigt den Längsschnitt einer erfindungsgemäßen coulometrischen Meßzelle. Fig. 3 shows the longitudinal section of a coulometric measurement cell according to the invention.

Fig. 4 ist ein Schaltbild eines Teils einer zur Steuerung des Motorantriebs verwendbaren Elektronik. FIG. 4 is a circuit diagram of part of electronics that can be used to control the motor drive.

Fig. 5a zeigt den zeitlichen Stromverlauf einer beschriebenen Meßzelle (scharfe Peaks, ohne Enzymreaktor) im Vergleich mit einer konventionellen Clarkschen O2-Elektrode (durchgezogene Linie) beim Vermessen einer wässerigen Lösung mit variierendem Sauerstoffgehalt. Fig. 5a shows the time-current curve of a measuring cell as described (sharp peaks without enzyme reactor) in comparison with a conventional Clark's O 2 electrode (solid line) when measuring an aqueous solution with varying oxygen content.

Fig. 5b zeigt die Korrelation der in Fig. 5a mit der erfindungsgemäßen Meßzelle gemessenen Ladungen mit dem Meßstrom der Clarkschen Elektrode. FIG. 5b shows the correlation of the charges measured in FIG. 5a with the measuring cell according to the invention with the measuring current of the Clark electrode.

Fig. 6 stellt eine Kalibrationsgerade dar, die beim Messen von wäßrigen Linolsäurelösungen mit einem erfindungsgemäßen Enzymsensor unter Verwendung des Enzyms Lipoxygenase in Verbindung mit einem sauerstoffsensitiven Transducer erhalten wurde. FIG. 6 shows a calibration line which was obtained when measuring aqueous linoleic acid solutions with an enzyme sensor according to the invention using the enzyme lipoxygenase in conjunction with an oxygen-sensitive transducer.

Fig. 7 zeigt eine Weiterbildung der coulometrischen Meßzelle mit dreigeteilter Arbeitselektrode zur Verkürzung der Meßdauer. Fig. 7 shows a further development of the coulometric measuring cell with three-part working electrode in order to shorten the measurement period.

Die Abbildungen im Einzelnen: The images in detail:  

Der schematische Aufbau des Systems in Fig. 1 zeigt eine Kolbenspritze (2) mit rechnergesteuertem (5) Motorantrieb (1), die über eine Kanüle mit der sekundäranalytsensitiven coulometrischen Meßzelle (3) verbunden ist. Der Meßzelle vorgeschaltet ist ein kapillarförmiger Enzymreaktor (4) mit immobilisiertem, den Analyten spezifisch umsetzendem Enzym. Zur Messung wird wäßrige Probenlösung aus dem Probenbehälter (8) langsam durch den Enzymreaktor gezogen, bis sämtliche sich dort noch befindenden Flüssigkeitsreste herausgespült worden sind. Dann wird der Motorantrieb gestoppt, bis nach wenigen Minuten der Analyt unter Erzeugung oder Verbrauch von Sekundäranalyt enzymatisch bis zum thermodynamischen Gleichgewicht umgesetzt worden ist.The schematic structure of the system in FIG. 1 shows a plunger syringe ( 2 ) with a computer-controlled ( 5 ) motor drive ( 1 ), which is connected via a cannula to the secondary analysis-sensitive coulometric measuring cell ( 3 ). A capillary-shaped enzyme reactor ( 4 ) with immobilized enzyme which specifically converts the analyte is connected upstream of the measuring cell. For the measurement, aqueous sample solution is slowly drawn out of the sample container ( 8 ) through the enzyme reactor until all the liquid residues still there have been rinsed out. The motor drive is then stopped until after a few minutes the analyte has been enzymatically converted to thermodynamic equilibrium with the generation or consumption of secondary analyte.

Im zweiten Schritt wird die abreagierte Probe aus dem Enzymreaktor (4) in die coulometrische Meßzelle (3) gezogen, wo der gesamte in der Zelle befindliche Sekundäranalyt elektrochemisch abgebaut wird. Den dabei fließenden, exponentiell abfallenden Strom integriert man über die Zeit, bis er wieder ein konstantes Niveau erreicht hat. Die so ermittelte Ladung Q ist gemäß
In the second step, the reacted sample is drawn from the enzyme reactor ( 4 ) into the coulometric measuring cell ( 3 ), where the entire secondary analyte in the cell is broken down electrochemically. The flowing, exponentially falling current is integrated over time until it has reached a constant level again. The charge Q determined in this way is according to

C = Q/V z F (1)
C = Q / V z F (1)

der Sekundäranalytkonzentration C proportional, wobei V das Volumen der coulometrischen Meßzelle, z die elektrochemische Wertigkeit des Sekundäranalyten und F die Faradaykonstante ist. Ein Potentiostat (6) dient hierbei nicht nur als Stromquelle für die elektrochemische Reaktion, sondern im Zusammenspiel mit einer die Integration ausführenden Schaltung - hier beispielsweise durch einen Computer (5) realisiert - auch zur Ermittlung des Meßwerts. Eine Ausgabeeinheit (7) erlaubt den Zugriff auf den ermittelten Wert.proportional to the secondary analyte concentration C, where V is the volume of the coulometric measuring cell, z is the electrochemical value of the secondary analyte and F is the Faraday constant. A potentiostat ( 6 ) not only serves as a current source for the electrochemical reaction, but also in conjunction with a circuit that carries out the integration - here implemented, for example, by a computer ( 5 ) - also for determining the measured value. An output unit ( 7 ) allows access to the determined value.

Eine beispielhafte Ausführung des in Fig. 1 skizzierten Prinzips in Seitenansicht zeigt Fig. 2. Hierbei bedeuten (11): Linearer Schrittantrieb, Standard, Motor 4-phasig (RS Components Gmbh, Mörfelden Walldorf); (12): Präzisionsspritze, 100 µl (Hamilton); (13): Coulometrische Meßzelle, wie in Fig. 3 näher beschrieben (In diesem Beispiel speziell für Sauerstoff); (14): Stahlkanüle; (15): Kapillare aus Quarzglas, Innendurchmesser 0,32 mm, Länge 150 bis 200 mm (SGE, Weiterstadt). An der Innenwand der Kapillare wird auf folgende Art und Weise das Enzym Lipoxygenase immobilisiert:An exemplary embodiment of the principle outlined in FIG. 1 is shown in side view in FIG. 2. Here, ( 11 ) mean: linear stepper drive, standard, 4-phase motor (RS Components GmbH, Mörfelden Walldorf); ( 12 ): precision syringe, 100 µl (Hamilton); ( 13 ): Coulometric measuring cell, as described in more detail in FIG. 3 (in this example especially for oxygen); ( 14 ): steel cannula; ( 15 ): Capillary made of quartz glass, inner diameter 0.32 mm, length 150 to 200 mm (SBU, Weiterstadt). The enzyme lipoxygenase is immobilized on the inner wall of the capillary in the following way:

Die Kapillare füllt man zunächst mit 10% Salpetersäure (HNO3) und erhitzt über Nacht auf 80-95°C. Es wird dann mit dest. Wasser säurefrei gespült und ca 15 min. bei Raumtemperatur zur Trocknung Luft hindurchgesaugt. Durch diese Prozedur werden die Silanolgruppen der Glasoberfläche freigelegt. Außerdem verbleibt eine gewisse Menge adsorbiertes Wasser an der Glasoberfläche. Die Kapillare wird nun mit einer Mischung aus 4 Vol.% Wasser und 96 Vol.% 3-Aminopropyltriethoxysilan gefüllt. Man läßt ca. 1 Stunde bei 105°C reagieren, wobei das 3-Aminopropyltriethoxysilan hydrolysiert und die Silanolgruppen z. T. auf der Glasoberfläche wieder kondensieren. Zur Vervollständigung der Reaktion wird nach dem Entfernen des 3-Aminopropyltriethoxysilans bei 105°C noch 2 Stunden ein Wasserdampf/Luftgemisch durch die Kapillare gezogen. Auf der Innenwand der Kapillare befindet sich jetzt eine Schicht primärer Aminogruppen, welche durch Behandlung mit Cyanurchlorid aktiviert werden. Hierzu füllt man die Kapillare mit einer Lösung von 3% Cyanurchlorid und 3% Tribenzylamin in Toluol und läßt 4 Stunden bei 50°C reagieren. Anschließend wird die Reaktionsmischung entfernt und mit je 10 ml Toluol und Hexan gespült. Trocknung erfolgt über 30 min. bei 50°C. Zur Immobilisierung des Enzyms wird eine 5% Lösung von Lipoxygenase in 0,2 M K-Boratpuffer pH 9 in die kurz vorher aktivierte Kapillare gesaugt und 4 h bei RT sowie weitere 20 h bei 4°C dort belassen. Die Kapillare wird dann mit 0,2 M K-Boratpuffer mit 0,2% Tween gespült und ggf. in K-Boratpuffer gelagert. (16) stellt den Ständer mit den Probengefäßen dar. (17) und (18) sind Kontakte, die auf einen mit der Schubstange des Schrittantriebs verschraubten Blechstreifen montiert sind. Wenn die Spritze voll ist, bekommt (17) Kontakt mit der Masse der Apparatur. Im Zusammenspiel mit der Steuerelektronik wird dann der Entleerungsvorgang eingeleitet, der beendet ist, wenn (18) Kontakt mit der Masse bekommt. (19) bezeichnet eine Halteplatte für die Kolbenspritze, die über die Gewindestangen (10) mit dem Motorgehäuse verschraubt ist. Der gesamte Aufbau wird in einer Halterung schräg nach oben zeigend montiert, damit sich evtl. mitangesaugte Luftblasen im oberen Teil der Spritze sammeln und beim nächsten Entleeren aus der Apparatur gedrückt werden können.The capillary is first filled with 10% nitric acid (HNO 3 ) and heated to 80-95 ° C overnight. It is then dest. Water rinsed acid-free and about 15 min. sucked air through to dry at room temperature. This procedure exposes the silanol groups on the glass surface. In addition, a certain amount of adsorbed water remains on the glass surface. The capillary is now filled with a mixture of 4% by volume of water and 96% by volume of 3-aminopropyltriethoxysilane. The mixture is allowed to react at 105 ° C. for about 1 hour, the 3-aminopropyltriethoxysilane hydrolyzing and the silanol groups, for. Condense again on the glass surface. To complete the reaction, a water vapor / air mixture is drawn through the capillary for 2 hours after the 3-aminopropyltriethoxysilane has been removed at 105 ° C. On the inner wall of the capillary there is now a layer of primary amino groups, which are activated by treatment with cyanuric chloride. For this purpose, the capillary is filled with a solution of 3% cyanuric chloride and 3% tribenzylamine in toluene and allowed to react at 50 ° C for 4 hours. The reaction mixture is then removed and rinsed with 10 ml of toluene and hexane. Drying takes 30 minutes. at 50 ° C. To immobilize the enzyme, a 5% solution of lipoxygenase in 0.2 M K-borate buffer pH 9 is sucked into the capillary activated shortly before and left there for 4 h at RT and for a further 20 h at 4 ° C. The capillary is then rinsed with 0.2 M K-borate buffer with 0.2% Tween and, if necessary, stored in K-borate buffer. ( 16 ) represents the stand with the sample vessels. ( 17 ) and ( 18 ) are contacts that are mounted on a metal strip screwed to the push rod of the stepper drive. When the syringe is full, ( 17 ) contacts the mass of the apparatus. In cooperation with the control electronics, the emptying process is initiated, which ends when ( 18 ) comes into contact with the mass. ( 19 ) denotes a holding plate for the piston syringe, which is screwed to the motor housing via the threaded rods ( 10 ). The entire assembly is mounted in a holder, pointing diagonally upwards, so that any air bubbles that may have been sucked in collect in the upper part of the syringe and can be pressed out of the apparatus the next time it is emptied.

Fig. 3 zeigt einen schematischen Längsschnitt einer für die Bestimmung von Sauerstoff verwendbaren Meßzelle. Die äußere Hülle (21) der Meßzelle läßt sich beispielsweise herstellen, indem von einem Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 5 mm und einer Wandstärke von ca. 1 mm ein 1,5 cm langes Stück an einem Ende bis auf ein Loch von 1 bis 2 mm. Durchmesser zugeschmolzen wird. Durch Eintauchen in eine Glanzgoldlösung (50% Uni-Glanzgold 12%, 50% Nr. 35 Goldverdünnung; beides von Rüger und Günzel Schmelzfarben Gmbh, Neu-Isenburg), nachfolgendes Trocknen und Brennen bei 690°C läßt sich die zugeschmolzene Hälfte der Glashülse innen und außen mit einem leitfähigen Goldfilm überziehen. Fig. 3 shows a schematic longitudinal section of a usable for the determination of oxygen measuring cell. The outer shell ( 21 ) of the measuring cell can be produced, for example, by using a glass tube with an inner diameter of 5 mm and a wall thickness of approx. 1 mm to make a 1.5 cm long piece at one end except for a hole of 1 to 2 mm . Diameter is melted. By immersing in a bright gold solution (50% plain gold 12%, 50% No. 35 gold thinner; both from Rüger and Günzel Schmelzfarben GmbH, Neu-Isenburg), followed by drying and firing at 690 ° C, the sealed half of the glass sleeve can be inside and coat it on the outside with a conductive gold film.

Ein poröser Elektrodenkörper (22) ist folgendermaßen herzustellen:
Anmischen einer Brennpaste:
A porous electrode body ( 22 ) can be produced as follows:
Mixing a fuel paste:

Einige Gramm handelsübliches Natronkalkglas (es lassen sich auch andere Glassorten verwenden wobei dann bei anderen Temperaturen gebrannt werden muß) werden in einem Porzellanmörser zu mittelfeinem Pulver zerrieben. Dieses Pulver mischt man mit jeweils 10 Gewichts-% Speisestärke und Methylan TT Tapetenkleister (Henkel), sowie 5% Kaliumchlorid und fügt soviel Was er hinzu, bis ein zäher Brei entstanden ist. Nach zwei Stunden Quellzeit wird die Masse mit soviel Wasser versetzt, daß sie sich gut verarbeiten läßt.A few grams of commercial soda lime glass (can be use other types of glass with others  Temperatures must be burned) in one Porcelain mortar grinded into medium-fine powder. This powder is mixed with 10% by weight of cornstarch and methylane TT wallpaper paste (Henkel), as well as 5% potassium chloride and adds so much what he added until a tough porridge developed. To the mass with so much water becomes two hours of swelling time offset that it can be processed well.

Die Herstellung der Rohlinge erfolgt durch manuelle Formgebung der Brennpaste um eingefettete Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 0,1 bis 0,3 mm. Die dabei entstehenden Körper sollen die Form von Zylindern haben, welche an den Enden konisch zulaufen. Bei einer Länge von ungefähr einem Zentimeter beträgt ihr Außendurchmesser 2 bis 4 mm. Nach 20 minütiger Trocknung bei 105°C werden die Kapillaren vorsichtig herausgezogen, die Temperatur innerhalb einer halben Stunde auf 740°C gesteigert und weitere 15 bis 30 min. auf diesem Niveau belassen. Der Brennvorgang muß überwacht werden und ist abzubrechen, wenn das Glaspulver gerade zu schmelzen beginnt. Die zusammengesinterten porösen Träger können jetzt mit 1/1 verdünnter Glanzplatinlösung (Nr. 15/A/S Glanzplatin verdünnt mit Nr. 35 Gold-Verdünnung, von Rüger und Günzel Schmelzfarben Gmbh, Neu-Isenburg) getränkt werden. Durch kurzes Erhitzen auf 150°C trocknet die Farbe ein und läßt sich sodann bei 690°C einbrennen. Diese Prozedur wird solange wiederholt, bis an der Elektrodenoberfläche Leitfähigkeit festgestellt werden kann.The blanks are produced by manually shaping the fuel paste around greased glass capillaries with an outer diameter of 0.1 to 0.3 mm. The resulting bodies should have the shape of cylinders that taper at the ends. With a length of approximately one centimeter, their outer diameter is 2 to 4 mm. After drying for 20 minutes at 105 ° C, the capillaries are carefully pulled out, the temperature is raised to 740 ° C within half an hour and a further 15 to 30 min. leave at this level. The firing process must be monitored and must be stopped when the glass powder is just beginning to melt. The sintered porous supports can now be soaked with 1/1 diluted gloss platinum solution (No. 15 / A / S gloss platinum diluted with No. 35 gold thinner, from Rüger and Günzel Schmelzfarben GmbH, Neu-Isenburg). The paint dries by briefly heating to 150 ° C and can then be baked at 690 ° C. This procedure is repeated until conductivity can be determined on the electrode surface.

In die poröse Arbeitselektrode wird an einem Ende ein 3 cm langes Stück, Innendurchmesser 0.53 mm und am anderen Ende ein 0,5 cm langes Stück, Glaskapillare Innendurchmesser 0,32 mm mit Epoxidkleber eingeklebt. Ein ca. 0,1 mm dünner Kupferdraht (210), durch Graphitpaste (Leit-C nach Göcke, von Neubauer Chemikalien, Münster) mit dem Elektrodenkörper leitend verbunden, sorgt nach erfolgter Lackisolierung für elektrischen Kontakt nach außen.A 3 cm long piece, inner diameter 0.53 mm and at the other end a 0.5 cm long piece, glass capillary inner diameter 0.32 mm is glued into the porous working electrode with epoxy adhesive. An approximately 0.1 mm thin copper wire ( 210 ), conductively connected to the electrode body by graphite paste (Leit-C according to Gocks, from Neubauer Chemicals, Münster), ensures electrical contact to the outside after the lacquer insulation has been made.

Der Elektrodeninnenraum (27) wird nun mit einer Silikonmembran beschichtet, damit selektiv nur Gase aus der Probenlösung zur Elektrode gelangen können. Da während der Beschichtung der Elektrodeninnenwand nichts von dem verwendeten Membrancocktail in die Poren der Elektrode eindringen soll, müssen diese verschlossen werden. Dazu mischt man z. B. in einer einseitig zugeschmolzenenen Pasteurpipette einen polymerisierbaren Elektrolyten aus 700 µl 30% Acryl-/Bisacrylamidlösung (Acryl- /Bisacrylamidlösung, 30% T, 2,67% C, von Serva, Heidelberg), 80 µl 1 M KCl-Lösung, 2 µl N,N,N,N-Tetramethylethylendiamin sowie 5 µl 10% frisch bereiteter Ammoniumperoxodisulfatlösung. In diese gerade polymerisierende Mischung wird die Elektrode eingebracht und durch Anlegen von Wasserstrahlvakuum entgast. Durch nachfolgendes Belüften füllen sich die Poren mit dem kurz darauf gelartig erstarrenden Elektrolyten. Während des Auspolymerisierens müssen die Kapillaren und der Innenraum der Elektrode mit einem Platzhalter freigehalten werden, der nach erfolgtem Gelieren wieder entfernt wird. Dies kann beispielsweise ein passender Nylonfaden sein.The interior of the electrode ( 27 ) is now coated with a silicone membrane so that only gases from the sample solution can selectively reach the electrode. Since nothing of the membrane cocktail used should penetrate into the pores of the electrode during the coating of the inner electrode wall, these must be closed. To do this, mix z. B. in a melted-down Pasteur pipette, a polymerizable electrolyte made of 700 µl 30% acrylic / bisacrylamide solution (acrylic / bisacrylamide solution, 30% T, 2.67% C, from Serva, Heidelberg), 80 µl 1 M KCl solution, 2 µl N, N, N, N-tetramethylethylenediamine and 5 µl 10% freshly prepared ammonium peroxodisulfate solution. The electrode is introduced into this polymerizing mixture and degassed by applying a water jet vacuum. Subsequent venting fills the pores with the electrolyte that solidifies in a gel shortly thereafter. During the polymerisation, the capillaries and the interior of the electrode must be kept free with a placeholder, which is removed again after gelation has taken place. This can be a suitable nylon thread, for example.

Als Vorbereitung auf die nachfolgende Beschichtung ist es nötig, die Elektrode zunächst von innen mittels 2 stündigem Durchsaugen von Luft zu trocknen. Der Membrancocktail, bereitet aus 90 µl Silopren K 1000 und 10 µl Silopren Crosslinker (beides von Fluka, Buchs) kann sodann durch Einsaugen und Verreiben mit einem dünnen Nylonfaden auf die Innenwand aufgebracht werden. Diese Prozedur darf nicht länger als 2 Minuten dauern. Während des 30 minütigen Polymerisierens ist es wichtig, einen stärkeren Luftstrom durch die Anordnung zu drücken. Dadurch läßt sich einerseits der Fließkanal freihalten, als auch durch Ausblasen von überschüssigem Membrancocktail für eine nicht zu große Membrandicke sorgen. Nachdem man das kurze Kapillarstück an der Oberseite des Elektrodenkörpers in die Stahlkanüle (∅ 0.9 mm) (26) einer Injektionsspritze eingeklebt hat, wird die derart vorbereitete Arbeitselektrode in die vergoldete Glashülse eingebracht und diese oben und unten mit Epoxidharz (29) versiegelt, wobei man auf der nicht vergoldeten Seite noch ein kurzes Stück Kapillare (Innen ∅ 0,53 mm) mit einklebt. Durch diese Öffnung kann nach dem Aushärten des Harzes 0,1 M KCl-Elektrolytlösung in den Elektrolytraum (28) der Zelle injiziert werden. Ein danach in diese Kapillare gesteckter mit Silberchlorid bedeckter Silberdraht (25) mit 0.5 mm Durchmesser verschließt den Elektrolytraum nach außen und dient gleichzeitig als Referenzelektrode. Zur Inbetriebnahme werden Referenzelektrode, Ableitdraht der Arbeitselektrode (210) und die als Hilfselektrode dienende vergoldete Hälfte (23) der äußeren Glashülle (21) mit den entsprechenden Anschlüssen eines Potentiostaten (z. B. Elektrochemischer Detektor EP 30 von Biometra, Göttingen) kontaktiert. Die Arbeitselektrode wird gegenüber der Referenzelektrode auf ein Potential von -0,7 V eingestellt. Nach 10 stündiger Äquilibrierung ist die Elektrode meßbereit. Sie läßt sich sowohl allein zur Messung von Gelöstsauerstoff, als auch in Kombination mit einem beschriebenen kapillarförmigen Enzymreaktor (24), der einfach in die untere Kapillare der Meßzelle eingesteckt wird, als Teil eines Enzymsensors betreiben.In preparation for the subsequent coating, it is necessary to first dry the electrode from the inside by sucking in air for 2 hours. The membrane cocktail, prepared from 90 µl Silopren K 1000 and 10 µl Silopren Crosslinker (both from Fluka, Buchs) can then be applied to the inner wall by suction and rubbing in with a thin nylon thread. This procedure should not take longer than 2 minutes. During the 30 minute polymerization, it is important to force a stronger air flow through the assembly. This allows the flow channel to be kept clear on the one hand, and to ensure that the membrane thickness is not too great by blowing out excess membrane cocktail. After the short capillary piece on the top of the electrode body has been glued into the steel cannula (∅ 0.9 mm) ( 26 ) of an injection syringe, the working electrode prepared in this way is inserted into the gold-plated glass sleeve and sealed at the top and bottom with epoxy resin ( 29 ) A short piece of capillary (inside ∅ 0.53 mm) is also glued onto the non-gold-plated side. After the resin has hardened, 0.1 M KCl electrolyte solution can be injected into the electrolyte space ( 28 ) of the cell through this opening. A silver wire ( 25 ) with a diameter of 0.5 mm, which is then inserted into this capillary and covered with silver chloride, seals the electrolyte space from the outside and at the same time serves as a reference electrode. For commissioning, the reference electrode, the lead wire of the working electrode ( 210 ) and the gold-plated half ( 23 ) of the outer glass envelope ( 21 ) serving as the auxiliary electrode are contacted with the corresponding connections of a potentiostat (e.g. electrochemical detector EP 30 from Biometra, Göttingen). The working electrode is set to a potential of -0.7 V compared to the reference electrode. After 10 hours of equilibration, the electrode is ready for measurement. It can be used as part of an enzyme sensor both for measuring dissolved oxygen and in combination with a described capillary-shaped enzyme reactor ( 24 ) which is simply inserted into the lower capillary of the measuring cell.

Die elektronische Regulierung des Schrittmotors erfolgt über die unipolare 4 Phasen Ansteuerplatine 332-098 von RS mit externer Oszillatorsteuerung. Zur Einstellung zweckmäßiger Grund- und Betriebsdrehzahlen (siehe auch von RS hierzu erhältliches Datenblatt) wird der Kondensator C 12 mit 0,1 µF bestückt und der Widerstand R 26 durch eine Reihenschaltung aus einem 10 KΩ und einem regelbaren 1 MΩ Widerstand ersetzt. Die Widerstände VR 1 und VR 2 führt man gemäß den Herstellerempfehlungen regulierbar mit Einstellbereichen zwischen 0 und 1 MΩ resp. 0 und 1 KΩ aus.The stepper motor is electronically regulated via the unipolar 4-phase control board 332-098 from RS with external oscillator control. More appropriate for setting Basic and operating speeds (see also RS available data sheet) becomes the capacitor C 12 with 0.1 µF equipped and the resistor R 26 by a series connection a 10 KΩ and an adjustable 1 MΩ resistor. The Resistors VR 1 and VR 2 are performed according to the  Manufacturer recommendations adjustable with setting ranges between 0 and 1 MΩ resp. 0 and 1 KΩ off.

Die logische Verknüpfung zwischen Oszillatorsteuerung und der Relaiskarte des Computers sowie dem Voll- und Leerschalter an der Antriebsmechanik der Spritze zeigt Fig. 4. Mit dieser einfachen Relaiskonfiguration ist es möglich,
The logical link between the oscillator control and the relay card of the computer and the full and empty switch on the drive mechanism of the syringe is shown in Fig. 4. With this simple relay configuration it is possible to

  • - den Spritzenantrieb an und auszuschalten,- switch the syringe drive on and off,
  • - zischen drei einstellbaren Geschwindigkeiten zu wählen,- choose between three adjustable speeds,
  • - die Spritze sowohl automatisch wenn sie voll ist, oder zu jeder anderen Zeit zu entleeren.- the syringe both automatically when it is full or closed to drain any other time.

Sämtliche Funktionen können sowohl manuell, als auch von einem Rechner ausgelöst werden. Hierzu ist ein Computer notwendig, der über mindestens drei ansteuerbare Relaisausgänge verfügt. Wenn Relais 1 geschlossen wird, beginnt der Motor mit einer eingestellten Grunddrehzahl derart zu laufen, daß langsam Flüssigkeit in die Spritze gesaugt wird. Schließt man außerdem Relais 3, erhöht sich die Drehzahl auf eine eingestellte Betriebsdrehzahl. Durch Schließen von Relais 2 wird der Entleerungsvorgang ausgelöst. Unabhängig hiervon geschieht dies auch, wenn sich der Vollschalter in der Antriebsmechanik (17 in Fig. 2) schließt.All functions can be triggered manually or by a computer. This requires a computer that has at least three controllable relay outputs. When relay 1 is closed, the motor starts running at a set base speed such that liquid is slowly drawn into the syringe. If you also close relay 3 , the speed increases to a set operating speed. The draining process is triggered by closing relay 2 . Irrespective of this, this also happens when the full switch in the drive mechanism ( 17 in FIG. 2) closes.

Die Spannungsversorgung erfolgt extern über ein 12 V Netzgerät.Power is supplied externally via a 12 V power supply.

Ein Meßvorgang mit dieser Konfiguration besteht aus folgenden Schritten:
A measurement process with this configuration consists of the following steps:

  • - Entleerung der Spritze.- emptying the syringe.
  • - Spülen/Füllen des Enzymreaktors mit Analytlösung. Dazu wird das 2-3-fache Volumen des Enzymreaktors mit einer Geschwindigkeit von ca. 0,5 µl/s durch die Anordnung gezogen.- Rinse / fill the enzyme reactor with analyte solution. This will 2-3 times the volume of the enzyme reactor with one Speed of approx. 0.5 µl / s through the arrangement drawn.
  • - Enzymatische Reaktion. Während dieses 4-5 min Zeitintervalls wird außerdem sämtlicher in der coulometrischen Zelle befindliche Sauerstoff elektrolysiert.- Enzymatic reaction. During this 4-5 min Time interval is also all in the coulometric Oxygen in the cell is electrolyzed.
  • - Einsaugen von ca. 10 µl umgesetzter Analytlösung durch die coulometrische Zelle mit einer Geschwindigkeit von 10 µl/s.- Suck approx. 10 µl of reacted analyte solution through the coulometric cell at a speed of 10 µl / s.
  • - Elektrolytischer Abbau des Sauerstoffs im Innenraum der Zelle, Bestimmung der geflossenen Ladung und Errechnung der Analytkonzentration.- Electrolytic breakdown of oxygen in the interior of the Cell, determination of the charge flow and calculation of the Analyte concentration.

Selbstverständlich kann der Sensor auch ohne Enzymreaktor direkt zur Bestimmung von Gelöstsauerstoff eingesetzt werden. Zur Messung sind dann nur die letzten beiden Schritte notwendig.Of course, the sensor can also be used without an enzyme reactor can be used directly for the determination of dissolved oxygen. Then only the last two steps are for the measurement necessary.

Der in Fig. 5a gezeigte Signalverlauf demonstriert den Meßstrom, wie er mit einer erfindungsgemäßen Meßzelle ohne Enzymreaktor erhalten werden kann, im Vergleich mit einer handelsüblichen Clarkschen Elektrode. Man erkennt deutlich, daß die nach dem Ansaugen exponentiell abfallenden Signale mit dem Strom der Clarkschen Elektrode korrelieren. In Fig. 5b sind diese beiden Signale gegeneinander aufgetragen. Der Korrelationskoeffizient beträgt für 10 Messungen 0,997. Die mittlere Standardabweichung einer Messung wurde zu 2-3 Promille bestimmt.The signal curve shown in FIG. 5a demonstrates the measuring current as it can be obtained with a measuring cell according to the invention without an enzyme reactor, in comparison with a commercially available Clark electrode. It can be clearly seen that the exponentially decaying signals correlate with the current of the Clark electrode. These two signals are plotted against one another in FIG. 5b. The correlation coefficient for 10 measurements is 0.997. The mean standard deviation of a measurement was determined to be 2-3 parts per thousand.

Die in diesem Beispiel genutzte Reaktion ist die vom Enzym Lipoxygenase katalysierte Dioxygenierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit cis-cis-1,4- Pentadiensystem. Bei dieser Umsetzung wird eine zur Fettsäure äquimolare Menge Sauerstoff verbraucht. Dementsprechend reicht der Konzentrationsbereich, innerhalb dessen eine Bestimmung möglich ist, maximal bis zum Gehalt der verwendeten Lösung an Gelöstsauerstoff. Für an gewöhnlicher Luft unter Atmosphärendruck gelagertes Wasser beträgt dieser Gehalt 0,3 mmol/l. Der lineare Meßbereich einer in Fig. 6 dargestellten Kalibrationsmessung für Linolsäurelösungen in 0,2 M Kaliumboratpuffer pH 9 mit einem vollständig montierten erfindungsgemäßen Enzymsensor erstreckt sich notwendigerweise bis ca 0,3 mM Linolsäure.The reaction used in this example is the oxygenation of polyunsaturated fatty acids with cis-cis-1,4-pentadiene system catalyzed by the enzyme lipoxygenase. This reaction consumes an amount of oxygen equimolar to the fatty acid. Accordingly, the concentration range within which a determination is possible does not exceed the dissolved oxygen content of the solution used. For water stored in ordinary air at atmospheric pressure, this content is 0.3 mmol / l. The linear measuring range of a calibration measurement shown in FIG. 6 for linoleic acid solutions in 0.2 M potassium borate buffer pH 9 with a fully assembled enzyme sensor according to the invention necessarily extends to about 0.3 mM linoleic acid.

Verwendet man statt Lipoxygenase eine andere Oxidase, lassen sich auch andere enzymatisch oxidierbare Substrate mit hoher Spezifität bestimmen. Genauso können Mikroorganismen anstelle der Oxidasen eingesetzt werden. So läßt sich dann beispielsweise der Gehalt an Stoffen bestimmen, die von den Mikroorganismen unter Sauerstoffverbrauch umgesetzt werden. Verändert man die coulometrische Meßzelle baulich derart, daß die Silikonmembran weggelassen wird und ein anderes Potential an der Arbeitselektrode anliegt, kann man auch andere Sekundäranalyten, wie z. B. H202 bestimmen. Damit eröffnet sich die Möglichkeit des Einsatzes von vielen anderen Redoxenzymen als Enzymkomponente. Die durch das Entfallen der Silikonmembran auftretende Querempfindlichkeit gegenüber anderen elektroaktiven Stoffen in der Probenmatrix läßt sich eliminieren, wenn vor dem Enzymreaktor eine Durchflußelektrolysezelle montiert wird, die störende Stoffe elektrochemisch abbaut (vgl. hierzu: Okawa, Y. et al., Sensors and Actuators, B, (1993) 14, 541-542).If a different oxidase is used instead of lipoxygenase, other enzymatically oxidizable substrates with high specificity can also be determined. Microorganisms can also be used instead of the oxidases. For example, the content of substances that are converted by the microorganisms while consuming oxygen can then be determined. If you change the structural design of the coulometric measuring cell in such a way that the silicone membrane is omitted and a different potential is applied to the working electrode, other secondary analytes such as e.g. B. Determine H 2 0 2 . This opens up the possibility of using many other redox enzymes as an enzyme component. The cross-sensitivity to other electroactive substances in the sample matrix due to the elimination of the silicone membrane can be eliminated if a flow-through electrolysis cell is installed in front of the enzyme reactor, which electrochemically degrades interfering substances (see: Okawa, Y. et al., Sensors and Actuators, B, (1993) 14, 541-542).

Bei einer weiteren baulichen Variante wird ein sekundäranalyterzeugendes Enzym direkt in der coulometrischen Meßzelle immobilisiert. Der Meßvorgang vereinfacht sich dadurch zu einem Schritt; allerdings entfällt dann auch der austauschbare Enzymreaktor.In another structural variant, a secondary analyte generating enzyme directly in the coulometric Immobilized measuring cell. This simplifies the measuring process to one step; however, the interchangeable enzyme reactor.

Die Abbauzeit für den Sekundäranalyten in der coulometrischen Zelle, d. h. die benötigte Meßzeit, ist stark von der Zeit abhängig, die benötigt wird, um einen ausreichend flachen, weit in die Zu- und Abströmkapillaren reichenden Diffusionsgradienten aufzubauen. Erst wenn der Diffusionsgradient in unmittelbarer Nachbarschaft des Elektrodenbereiches so klein ist, daß die noch in die coulometrische Zelle diffundierende Menge Sekundäranalyt vernachlässigt werden kann, beendet man die Integration des Meßstroms. Diese Zeitdauer läßt sich drastisch verkürzen, wenn statt der in Fig. 3 skizzierten Elektrode eine dreigeteilte Konstruktion, wie in Fig. 7 gezeigt, verwendet wird. Dabei dienen die Teile (72a), welche über eine separate Stromzuführung (711) das gleiche Potential erhalten, wie die Arbeitselektrode, zum Abfangen von aus den Kapillaren in Richtung Elektrode diffundierenden Sekundäranalyten. Zur Messung wird lediglich der mittlere Abschnitt (72b) verwendet, der von (72a) isoliert ist. Da bei einer derartigen Anordnung die Abbauzeit nur noch von der radialen Diffusion des umzusetzenden Stoffes innerhalb (72b) bestimmt wird, sinkt die erforderliche Meßzeit deutlich.The breakdown time for the secondary analyte in the coulometric cell, ie the measurement time required, is heavily dependent on the time required to build up a sufficiently flat diffusion gradient that extends far into the inflow and outflow capillaries. Only when the diffusion gradient in the immediate vicinity of the electrode area is so small that the quantity of secondary analyte still diffusing into the coulometric cell can the integration of the measuring current be terminated. This time period can be drastically shortened if, instead of the electrode sketched in FIG. 3, a three-part construction, as shown in FIG. 7, is used. The parts ( 72 a), which receive the same potential as the working electrode via a separate power supply ( 711 ), serve to intercept secondary analytes diffusing from the capillaries in the direction of the electrode. Only the middle section ( 72 b), which is isolated from ( 72 a), is used for the measurement. Since in such an arrangement the degradation time is only determined by the radial diffusion of the substance to be reacted within ( 72 b), the required measuring time is significantly reduced.

Weitere verbesserte Versionen der coulometrischen Zelle sind möglich, wenn andere Elektrodenmaterialien und andere Elektrolyten verwendet werden. So wird eine Spannungsquelle (Potentiostat) und damit auch die Referenzelektrode beispielsweise überflüssig, wenn zur Bestimmung des Sekundäranalyten Sauerstoff als Anodenmaterial ein unedles Metall, wie z. B. Zink und als Kathodenmaterial z. B. Graphit in einem alkalischen Elektrolyten verwendet wird. Durch Oxidation des Zinks wird das erforderliche Potential von selbst aufgebaut.Other improved versions of the coulometric cell are possible if other electrode materials and others Electrolytes are used. So becomes a voltage source (Potentiostat) and thus also the reference electrode for example superfluous if to determine the Secondary analyte oxygen as an anode material is a base Metal such as B. zinc and as cathode material z. B. Graphite is used in an alkaline electrolyte. By Oxidation of the zinc becomes the required potential by itself built up.

Claims (9)

1. Verfahren zum coulometrischen Betrieb einer Elektrodenanordnung, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst eine Probenlösung mittels einer Fördereinrichtung durch einen Enzymreaktor fördert, dann die Fördereinrichtung anhält, bis der Analyt in der Probenlösung unter Erzeugung oder Verbrauch eines Sekundäranalyten vollständig umgesetzt worden ist, dann die umgesetzte Probenlösung mittels der Fördereinrichtung aus dem Enzymreaktor in die Elektrodenanordnung zieht, die Fördereinrichtung anhält, den Sekundäranalyten elektrochemisch umsetzt und die dabei fließende Ladung ermittelt.1. A method for the coulometric operation of an electrode arrangement, characterized in that first a sample solution is conveyed by a conveyor through an enzyme reactor, then the conveyor stops until the analyte in the sample solution has been completely converted to produce or consume a secondary analyte, then the converted one Pulls the sample solution from the enzyme reactor into the electrode arrangement by means of the delivery device, stops the delivery device, electrochemically converts the secondary analyte and determines the charge flowing in the process. 2. Verfahren zum coulometrischen Betrieb einer Elektrodenanordnung, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probenlösung mittels einer Fördereinrichtung in eine mit immobilisiertem Enzym versehene Elektrodenanordnung fördert, die Fördereinrichtung anhält, den in der Probenlösung enthaltenen Analyten enzymkatalysiert vollständig umsetzt, einen hierbei erzeugten Sekundäranalyten elektrochemisch abbaut und die dabei fließende Ladung ermittelt.2. Method for the coulometric operation of a Electrode arrangement, characterized in that one Sample solution using a conveyor in a promotes electrode arrangement provided with immobilized enzyme, the conveyor stops in the sample solution contained analytes completely enzyme-catalyzed, a secondary analyte generated here electrochemically degrades and determines the flowing charge. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fördereinrichtung eine motorisch gesteuerte Kolbenspritze, eine Pumpe oder dergleichen ist.3. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that the conveyor is a motor controlled plunger syringe, a pump or the like. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß elektrochemisch aktive Substanzen vor Eintritt in den Enzymreaktor durch einen elektrochemischen Filter entfernt werden.4. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized that electrochemically active substances before Entry into the enzyme reactor through an electrochemical Filters are removed. 5. Elektrodenanordnung zur coulometrischen Bestimmung eines elektrochemisch umsetzbaren Analyten in einer Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode röhrenförmig ist und einen inneren Durchmesser von 0,1 bis 1 mm besitzt, die Arbeitselektrode aus einem porösen leitfähigem Material besteht, dessen Poren mit Elektrolytlösung gefüllt sind, die Arbeitselektrode sowie besagte Elektrolytlösung von der Analysenlösung im Inneren der röhrenförmigen Arbeitselektrode durch eine Schicht oder Membran getrennt sind, die für den zu bestimmenden Analyten durchlässig ist.5. Electrode arrangement for the coulometric determination of a electrochemically convertible analytes in a liquid, characterized in that the working electrode is tubular and has an inner diameter of 0.1 to 1 mm, the working electrode consists of a porous conductive material, the pores with Electrolyte solution are filled, the working electrode as well said electrolyte solution from the analytical solution inside the tubular working electrode through a layer or Membrane are separated, which are for the analyte to be determined is permeable. 6. Elektrodenanordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode aus porösem gesintertem Glas gefertigt und mit einer leitfähigen Edelmetallschicht beschichtet ist.6. Electrode arrangement according to claim 5, characterized in that the working electrode made of porous sintered glass manufactured and with a conductive precious metal layer is coated. 7. Elektrodenanordnung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode aus porösem Graphit besteht. 7. Electrode arrangement according to claim 5, characterized in that the working electrode is made of porous graphite.   8. Elektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 5 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode axial in mindestens drei Teile unterteilt ist und zur Ermittlung der Ladung die äußeren Teile nicht verwendet werden.8. Electrode arrangement according to one of claims 5 to 7 thereby characterized in that the working electrode axially in at least is divided into three parts and to determine the charge outer parts are not used. 9. Elektrodenanordnung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrodenmaterial der Elektroden so gewählt ist, daß sich das zum Abbau des elektrochemisch umsetzbaren Analyten erforderliche Potential an der Arbeitselektrode von selbst aufbaut und eine externe Spannungsquelle entfällt.9. Electrode arrangement according to one of claims 5 to 8, characterized in that the electrode material of Electrodes are chosen so that the degradation of the potential required for electrochemically convertible analytes builds up on the working electrode itself and an external one No voltage source.
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