DE1959169A1 - Insoluble enzymatic reactive material - Google Patents

Insoluble enzymatic reactive material

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Abstract

Enzyme, pref. a decarboxylase, oxydase or dehydrogenase, and an enzyme co-factor, pref. pyridoxal-5-phosphate, flavine-adenine-dinucleotide, nicotinamide-adenine-dinucleotide or a metal ion, are separately linked to a polymer matrix, pref. a polyacrylamide gel physically enclosing the enzyme. The co-factor is pref. linked to a second enzyme, pref. glutamate-decarboxylase, xanthine-oxydase or glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase. Product is pref. used as spheres or cylinders for packing columns through which substrate soln. pref. sterilised with anti-microbiological agents such as solvents, antibiotics or poisons, but partic. butanol, is able to flow.

Description

Beschreibung zu der Patentanmeldung Unlösliches enzymatisch reaktives Material Die Erfindung bezieht sich auf Enzyme und betrifft unlöslich gemachte Enzyme und enzymatische Reaktionen mit diesen unlöslich gemachten Enzymen.Description of the patent application Insoluble, enzymatically reactive Material The invention relates to enzymes and to insolubilized enzymes and enzymatic reactions with these insolubilized enzymes.

Es wurde vorgeschlagen,Enzyme auf oder in wasserunlösliche Polymere zu binden, um "unlösliche" Enzyme zu bilden und diese "unlöslichen" Enzyme in verschiedenen biochemischen Reaktionen zu verwenden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß bestimmte Enzyme1 besonders solche, die leichtdissoziiert werden, schnell ihre Aktivität verlieren, wenn sie auf diese Weise behandelt werden.It has been suggested to use enzymes on or in water-insoluble polymers to bind to form "insoluble" enzymes and these "insoluble" enzymes in various to use biochemical reactions. However, it has been shown that certain Enzymes1 especially those that are easily dissociated, quickly lose their activity, when treated that way.

Es hat sich gezeigt, daß viele dieser Enzyme von der Art sind, daß ihre Aktivität von der Anwesenheit eines Co-Faktors abhängt. Dieser Co-Faktor kann nur lose mit dem Enzym assoziiert sein, und kann unter den verwendeten Reaktionsbedingungen von dem System entfernt werden, wodurch die Enzymaktivität verloren geht.Many of these enzymes have been shown to be of the type that their activity depends on the presence of a cofactor. This co-factor can can only be loosely associated with the enzyme and under the reaction conditions used removed from the system, thereby losing enzyme activity.

Gemäß der vorliegenden 13rfindunU enthält ein unlösliches enzymatisch reaktives Material eine polymere Matrix, an die ein Enzym und ein Co-Faktor fur das Enzym gebunden sind, wobei das Enzym und der Co-Faktor getrennt an die polymere Matrix gebunden sind.According to the present invention, an insoluble one contains enzymatic reactive material is a polymeric matrix to which an enzyme and a cofactor for the enzyme are bound, the enzyme and the cofactor being attached separately to the polymer Matrix are bound.

Die Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion, in der ein unlösliches enzymatisch reaktives Material verwendet wird, das eirepolymere Matrix enthält, an die getrennt ein Enzym und ein Co-Faktor für das Enzym gebunden sind.The invention also encompasses a method of performing an enzymatic Reaction using an insoluble enzymatically reactive material The egg polymer matrix contains an enzyme and a cofactor for separately the enzyme are bound.

Die polymere Matrix kann ein nat-lirliches oder synthetisches polymeres Material enthalten, besonders ein hydrophiles Material wie z.B. ein Polyacrylamid oder ein Polymer mit freien Hydroxylgruppen, wie Cellulose, Cellulosederivate, Starke, Dextran und vernetzte Dextrane, z.B. "Sephadex" (Warenzeichen), Proteine wie Wolle, oder Polyvinylalkohol. Andere polymere Materialen, die verwendet werden können, umfassen Nylon,'Polyester wie Polyäthylenzterephthalat , Celluloseacetat und substituierte vernetzte Polystyrole, wie chlormethyliertes Polystyrol.The polymeric matrix can be a natural or synthetic polymer Contain material, particularly a hydrophilic material such as a polyacrylamide or a polymer with free hydroxyl groups, such as cellulose, cellulose derivatives, starch, Dextran and cross-linked dextrans, e.g. "Sephadex" (trademark), proteins such as wool, or polyvinyl alcohol. Other polymeric materials that can be used include nylon, polyesters such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate and substituted crosslinked polystyrenes such as chloromethylated polystyrene.

Die Matrix kann die Form von Perlen oder einer Folie oder eines Stoffes wie eines Gewebes oder jede andere geeignete gegossene oder durch Strangpressen erhaltene "'ort annehmen. Günstigerweise wird die Matrix in Form eines Gels hergestellt, besonders eines Polyacrylamidgels. Um dem Gel eine ausreichende mechanische Stabilität zu verleihen, kann es auf oder in einem geeigneten Träger gebildet werden. Das Gel kann z.. in einer Plastikröhre gebildet werden, die dann aufgeschnitten wird, wobei kleine Zylinder entstehen, die an ihren Enden offen sind, um einen Kontakt zwischen dem Gel und dem Reaktionsmedium zu erlauben.The matrix can be in the form of beads or a foil or fabric such as a fabric or any other suitable cast or extrusion The matrix is advantageously produced in the form of a gel, especially a polyacrylamide gel. To give the gel sufficient mechanical stability to lend, it can be on or in a suitable Carrier formed will. The gel can be formed in a plastic tube, which is then cut open small cylinders are created which are open at their ends in order to make a contact to allow between the gel and the reaction medium.

Enzyme, die entsprechend der Erfindung unlöslich gemacht werden können, umfassen gereinigte oder rolle Enzyme, Enzymgemische und Ensymsisteme, die in tierischen, pflanzlichen oder mikrobiologischen Geweben vorhanden oder daraus isoliert worden sind und umfassen ganze Zellen, intakte intracellulare Teilchen und rohe Extrakte dieser Gewebe, Beispiele für Enzyme, deren Aktivität von der Anwesenheit eines Co-Paktors abhängt, umfassen Decarboxylasen, wie Lysin-decarboxylase und Arginin-decarboxylases Oxydesen wie d-Aminosäureoxydase und Dehydrogenasen wie Alkohol-dehydrogenase und Lactatdehydrogenase.Enzymes that can be made insoluble according to the invention, include purified or role enzymes, enzyme mixtures and ensymsistems found in animal, plant or microbiological tissues present or isolated from them are and include whole cells, intact intracellular particles, and crude extracts these tissues, examples of enzymes whose activity depends on the presence of a co-pactor include decarboxylases, such as lysine decarboxylase and arginine decarboxylases Oxideses such as d-amino acid oxidase and dehydrogenases such as alcohol dehydrogenase and Lactate dehydrogenase.

Der Co-Faktor kann ein Co-Enzym sein, das ein organisches Molekül einer etwas komplizierten Struktur ist, das in der Reaktion selbst eine gewisse Rolle spielt, z.B. als Trager für einige chemische Gruppen, oder ein Aktivator einer einfachen chemischen Natur, der auf gewisse Weise das Enzym selbst in einen katalytisch aktiven Zustand bringt Beispiel der ersten Gruppe von Co-Faktoren umfassen Pyridoxal-5-phosphat, Flavin-Adenin-Dinucleotid und Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotiu und der zweiten Klasse anorganische lonen, besonders Metallionen.The cofactor can be a coenzyme, which is an organic molecule of a somewhat complex structure, there is a certain in the reaction itself Plays a role, e.g. as a carrier for some chemical groups, or an activator of a simple chemical nature, which in some way turns the enzyme itself into a catalytic one active state brings example of the first group of co-factors include pyridoxal-5-phosphate, Flavin adenine dinucleotide and nicotinic acid amide adenine dinucleotide and the second Class of inorganic ions, especially metal ions.

Das Enzym kann an die polymere tuatrix auf mechanische, physikalische oder chemische Weise gebunden sein. So kann des Enzym wenn die Matrix ein Gel ist, mechanisch in den Zwischenräumen des Gels auf Grund der Porengröße eingeschlossen oder es kann durch elektrostatische Kräfte, wie Waserstoffbindungen physikalisch festgehalten werden. Das enzym kann auch durch direkte kovalente Bindung-an die polymere Matrix gebunden sein oder mit Hilfe einer brückenbildenden Gruppe. Es ist normalerweise notwendig, daß das Enzym so an die Matrix gebunden ist, daß es während der anschließenden Reaktion nicht abgelöst wird. Wenn das Enzym in ein Polyacrylamidgel eingeschlossen werden soll, besteht eine besonders geeignete Methode ãarin,das Enzym und ein Vernetzungsmittel zu dem Acrylamidmonomer zuzugeben und das Monomer dann zu polymerisieren.The enzyme can be attached to the polymer tuatrix in a mechanical, physical manner or chemically bound. So if the matrix is a gel, the enzyme can mechanically enclosed in the interstices of the gel due to the pore size or it can be due to electrostatic forces, such as hydrogen bonds physically be held. The enzyme can also be covalently bonded to the polymer matrix be bound or with the help of a bridging group. It is normally necessary that the enzyme is bound to the matrix in such a way that it is during the subsequent reaction is not replaced. When the enzyme is in a polyacrylamide gel is to be included, there is a particularly suitable method ãarin, the enzyme and adding a crosslinking agent to the acrylamide monomer, and then the monomer to polymerize.

Der Co-Faktor kann ebenfalls auf mechanische, physikalische oder chemische Weise an die Polymermatrix gebunden span. Der Co-Faktor kann direkt durch eine elektrostatische oder kovalente Bindung an die Polymermatrix gebunden sein, oder er kann an ein anderes Molekül von hohem oder niederem Molekulargewicht oder eine ganze Zelle Subzellular-Fraktion oder Organell gebunden sein, das entweder auf mechanische oder physikalische oder chemische Weise an die polymere Matrix gebunden sein kann. Wenn der Co-Faktor ein organisches Molekül von komplizierter Struktur ist, hates sich gezeigt, daß es besonders günstig ist, den Co-Faktor an einem zweiten Enzym gebunden zu verwenden. Normalerweise nimmt das zweite Enzym an der biochemischen Reaktion nicht anders teil, als daß es den Co-Faktor freisetzt. Das zweite Enzym kann an die polymere Ijatrix auf jede der vorher erwähnten Methodengebunden sein, sie soll aber nicht so sein, daß der Co-Faktor desaktiviert wird. Bei dem zweiten Enzym soll es sich um ein solches handeln, an das der Co-Faktor fest gebunden ist, und von dem er während der folgenden Reaktion nicht abgelöst wird. Beispiele für geeignete zweite Enzyme umfassen Glutamatdecarboxylase (Co-Faktor Pyridoxal-5-phosphat), Xanthinoxydase (Co-aktor Flavin-Adenin-Dinucleotid), und Glyceraldehyde-3-phosphat-dehydrogenase (Co-Faktor Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucl£-otid).The cofactor can also be mechanical, physical, or chemical Way bound to the polymer matrix span. The cofactor can be directly through an electrostatic or covalent bond to the polymer matrix, or it can be to another High or low molecular weight molecule or a whole cell subcellular fraction or be bound by either mechanical or physical or organelle can be chemically bonded to the polymeric matrix. When the co-factor is a is an organic molecule of complex structure, it has been shown to be special it is beneficial to use the cofactor bound to a second enzyme. Normally the second enzyme does not take part in the biochemical reaction other than that it releases the cofactor. The second enzyme can be attached to the polymeric matrix on each of the aforementioned methods, but it should not be such that the Co-factor is deactivated. The second enzyme should be one to which the cofactor is tightly bound, and from which it will be used during the subsequent reaction is not replaced. Examples of suitable second enzymes include glutamate decarboxylase (Cofactor pyridoxal-5-phosphate), xanthine oxidase (cofactor flavin-adenine-dinucleotide), and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (co-factor nicotinic acid amide-adenine-dinucléotide).

Die enzymatisch reaktiven Materialien dieser Erfindung sind besonders geeignet, zur kontinuierlichen Durchführung von biochemischen Reaktionen bei denen ein geeignetes Substrat über oder -durch das Material fließt. Die Polymermatrix kann s.B. die Form von Perlen oder Zylindern haben, die in eine Säule gepackt werden können, und durch diese kann ein geeignetes Substrat hindurchfließen. Wahlweise kann das Substrat auch durch dieMatrix hindurchfließen, die die Forra einer porösen Folie haben kann. Die enzymatisch reaktiven Materialien können für eine große Vielzahl von enzymatisch katalysierten Reaktionen verwendet werden und sind oft geeignet zur Verwendung für Verfahren, für die bisher lösliche Enzyme verwendet wurden. Um während der Durchführung dieser kontinuierlichen biochemischen Reaktionen sterile Bedingungen aufrecht zu erhalten, hat es sich gelegentlich als günstig erwiesen, kleine Mengen eines antimikrobiologischen Mittels zu dem Substrat zuzusetzen. Geeignete antimikrobiologische Mittel umfassen Lösungsmittel-, Antibiotika und Gifte, und ausgezeichnete Ergebnisse wurden z.B. bei Verwendung von butanol erhalten.The enzymatically reactive materials of this invention are particular suitable for the continuous implementation of biochemical reactions in which a suitable substrate flows over or through the material. The polymer matrix can s.B. are in the form of pearls or cylinders packed in a column can, and through this a suitable substrate can flow therethrough. Optional the substrate can also flow through the matrix, which has the shape of a porous Foil can have. The enzymatically reactive materials can be used for a wide variety can be used by enzymatically catalyzed reactions and are often suitable for use in processes for which soluble enzymes have heretofore been used. Around sterile while performing these continuous biochemical reactions To maintain conditions, it has occasionally proven beneficial to add small amounts of an antimicrobial agent to the substrate. Suitable Antimicrobial agents include solvents, antibiotics and poisons, and excellent results have been obtained using, for example, butanol.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.The invention is illustrated in more detail by the following examples.

Beispiel 1 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Anwendung eines enzymatisch reaktiven Materials1das tysin-decarboxylase enthält und bei dem EColi Glutamat-decarboxylase als zweites Enzym verwendet wird.Example 1 This example describes the manufacture and use of an enzymatically reactive material 1 which contains tysine decarboxylase and in which EColi glutamate decarboxylase is used as the second enzyme.

Acrylamid Monomer, das homogen verteilte Lysin-dearboxylase und L'floli Glutamat-decarboxylase enthält, wird unter Verwendung von N,N' -Methylen-bis-acrylamid als Vernetzungsmittel in einer PVC-Röhre polymerisiert. Die Röhre wird dann in 3 mm lange Zylinder von 3 mm Durchmesser geschnitten. 90 g dieser Zylinder werden in ein Reaktionsgefäß gepackt. Eine 1%ige Gewicht/Gewicht Lösung von L-Lysin in Wasser, die 0,5% Butanol enthält, läßt man mit einer Geschwindigkeit von 1 cm9/min durch das Reaktionsgefäß hindurchfließen. Der pH-Wert der Lösung wird auf 6,0 und die Temperatur auf 20°C gehalten. Am Ende von 69 Tagen kann kein Nachlassen der Lysin-decarboxylaseaktivität beobachtet werden und die Umwandlung von B-Lysin beträgt 15%.Acrylamide monomer, the homogeneously distributed lysine dearboxylase and L'floli Containing glutamate decarboxylase is made using N, N'-methylene-bis-acrylamide polymerized as a crosslinking agent in a PVC tube. The tube is then in 3 mm long cylinder of 3 mm diameter cut. 90 g of this cylinder will be packed in a reaction vessel. A 1% Weight / weight solution L-lysine in water containing 0.5% butanol is left at one rate flow through the reaction vessel at a rate of 1 cm9 / min. The pH of the solution becomes kept at 6.0 and the temperature at 20 ° C. At the end of 69 days, there can be no slacking off the lysine decarboxylase activity and the conversion of B-lysine is 15%.

Bei einem Vergleichsversuch bei dem die Glutamat-decarboxylase weggelassen worden ist, verschwindet die Lysin-decarboxylaseaktivität nach 48 Stunden, was zeigt, daß die Enzymaktivität erhalten bleibt, selbst wenn das Enzym und der Co-Paktor getrennt an die polymcre Matrix gebunden sind.In a comparative experiment in which the glutamate decarboxylase was omitted has been, the lysine decarboxylase activity disappears after 48 hours, which shows that the enzyme activity is retained even if the enzyme and the co-factor are bound separately to the polymer matrix.

Beispiel 2 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Anwendung eines enzymatisch reaktiven Materials, das Arginin-decarboxylase enthält und bei dem E.Coli Glutamat-decarboxylase als zweites Enzym verwendet wird. Zylinder von Polyacrylamidgel das Arginin-decarboxylase und Glutamat-decarboxylase enthält, werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. 90 g der Zylinder werden in ein Reaktionsgefäß gepackt. Eine 1% Gewicht/Gewicht lösung von L-Arginin in Wasser fließt durch das Reaktionsgefäß mit einer Geschwindigkeit von 1 cm3/min hindurch. Der pH-Jert der Lösung wird auf 5,0 und die Temperatur auf 200C gehalten.Example 2 This example describes the preparation and use an enzymatically reactive material containing arginine decarboxylase and in E. Coli glutamate decarboxylase is used as a second enzyme. Cylinder of Polyacrylamide gel containing arginine decarboxylase and glutamate decarboxylase prepared as described in Example 1. 90 g of the cylinder are placed in a reaction vessel packed. A 1% w / w solution of L-arginine in water flows through the Reaction vessel through at a rate of 1 cm3 / min. The pH value of the Solution is kept at 5.0 and the temperature at 200C.

Am Ende von 30 Tagen kann kein Verlust der Arginin-decarboxylaseaktivität festgestellt werden und die Umwandlung von L-Arginin beträgt 10%.At the end of 30 days there can be no loss of arginine decarboxylase activity and the conversion of L-arginine is 10%.

B e i s p i e l 3 Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Anwendung eines enzymatisch reaktiven Materials, das Alkohol-dehydrogenase enthält und bei. dem Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase als zweites Enzym verwendet wird.EXAMPLE 3 This example describes the manufacture and use an enzymatically reactive material containing alcohol dehydrogenase and at. the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is used as the second enzyme.

Zylinder von olyacrylamidgel das Alkohol-dehydrogenase Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase und Xanthionoxydase enthalt, werden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt.Cylinders of olyacrylamide gel containing alcohol dehydrogenase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and xanthione oxidase are prepared as described in Example 1.

Die Xanthinoxydase wird als Teil eines Systems zur Reoxydierung der Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase mitverwendet (der andere Teil ist o-Chlorphenol-indo-2, 6-dichlorphenol, das zu der Substratlösung zugegeben wird 20 g der Zylinder werden in ein Reaktionsgefäß gepackt.The xanthine oxidase is used as part of a system for the reoxidation of the Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is also used (the other part is o-chlorophenol-indo-2, 6-dichlorophenol, which is added to the substrate solution, will be 20 g of the cylinder packed in a reaction vessel.

Eine 1%ige Gewicht/Gewicht Lösung von Äthylalkohol in Wasser die 0,002 Gew.-,J o-Chlophenol-indo-2, 6-dichlorphenol enthält, fließt mit einer Geschwindigkeit von 1 cm3/min durch das Reaktionsgefäß. Der pH-Wert der Lösung ist 7,0 und die Temperatur wird auf 20°C gehalten. Am Ende von 24 Tragen kann kein Verlust der Alkohol-dehydrogenaseaktivität beobachtet werden und die Umwandlung v-on Äthylalkohol beträgt 0,01%. Vergleichbare Ergebnisse werden erhalten, wenn Lactat-dehydrogenase anstelle der Alkohol-dehydrogenase verwendet wird.A 1% w / w solution of ethyl alcohol in water which is 0.002 Wt .-, J o-Chlophenol-indo-2,6-dichlorophenol contains, flows at one rate of 1 cm3 / min through the reaction vessel. The pH of the solution is 7.0 and the temperature is kept at 20 ° C. At the end of 24 wear there can be no loss of alcohol dehydrogenase activity can be observed and the conversion of ethyl alcohol is 0.01%. Comparable Results are obtained when lactate dehydrogenase is used instead of alcohol dehydrogenase is used.

-Vat ent ansprüche - -Vat claims -

Claims (9)

P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Unlösliches enzymatisch reaktives Material, das eine polymere Matrix enthält, an die ein Enzym gebunden ist, dadurch g e k e n ii z e i c h n e t, daß die polymere Matrix einen Co-Faktor für das Enzym enthalt und das Enzym und der Co-Faktor getrennt an die polymere Matrix gebunden sind. P a t e n t a n s p r ü c h e 1. Insoluble, enzymatically reactive Material containing a polymeric matrix to which an enzyme is bound thereby it is not noted that the polymeric matrix is a cofactor for the enzyme and the enzyme and the cofactor are bound separately to the polymeric matrix are. 2. Enzymatisch reaktives Material nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß die polymere Matrix die in Form eines Gels vorliegt und das Enzym physikalisch in das Gel eingeschlossen ist.2. Enzymatically reactive material according to claim 1, characterized in that g e k e It is noted that the polymeric matrix is in the form of a gel and the enzyme is physically entrapped in the gel. 3. Enzymatisch reaktives Material nach Anspruch 2, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß das Gel Polyacrylamid enthält.3. Enzymatically reactive material according to claim 2, characterized in that g e k e Note that the gel contains polyacrylamide. 4. Enzymatisch reaktives Material nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß das Enzym eine Decarboxylase,eine Oxydase oder eine Behydrogenase ist.4. Enzymatically reactive material according to claim 1 to 3, characterized in that g It is not noted that the enzyme is a decarboxylase, an oxidase or a Is behydrogenase. 5. Enzymatisch reaktives Material nach Anspruch 1 bis 4, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß der Co-Faktor Pyridoxal-5-phosphat, Flavin-Adenin-Dinucleotid, Nicotinsäureamid-Ldenin-Dinucleotid oder ein Metallion, ist.5. Enzymatically reactive material according to claim 1 to 4, characterized in g it is not stated that the cofactor pyridoxal-5-phosphate, flavin-adenine-dinucleotide, Nicotinic acid amide-ldenine dinucleotide or a metal ion. 6. Enzymatisch reaktives Material nach Anspruch 1 bis 5, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, daß der Co-Faktor an ein zweites Enzym gebunden ist, das physikalisch in das Gel eingeschlossen ist.6. Enzymatically reactive material according to claim 1 to 5, characterized in that g it is not indicated that the cofactor is bound to a second enzyme, which is physically included in the gel. 7 Enzymatisch reaktives Material nach Anspruch 6, dadurch g e k e n n z e i c n n e t, daß daszveite Enzym Glutamat-decarboxylase, Xanthin-oxydase oder Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase ist.7 enzymatically reactive material according to claim 6, characterized g e k e Note that the second enzyme, glutamate decarboxylase, xanthine oxidase or Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is. 8. Verwendung des enzymatisch reaktiven Materials nach Anspruch 1 bis 7, in Form von Kugeln oder Zylindern, zur Füllung einer Säule durch die das Substrat hindurchfließen kann. 8. Use of the enzymatically reactive material according to claim 1 to 7, in the form of spheres or cylinders, to fill a column through which the Substrate can flow through. 9. Verwendung des enzymatisch reaktiven Materials nach Anspruch 1 bis 7, zur Durchführung biochemischer Reaktionen, wobei der Substratlösung ein antimikrobiologisches Mittel zugesetzt werden kann. 9. Use of the enzymatically reactive material according to claim 1 to 7, for performing biochemical reactions, the substrate solution being an antimicrobiological Means can be added.
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