DE1956481A1

DE1956481A1 - Method for the determination of lipoproteins

Info

Publication number: DE1956481A1
Application number: DE19691956481
Authority: DE
Inventors: Gustafson Anders Emil
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1968-11-11
Filing date: 1969-11-10
Publication date: 1970-06-11
Also published as: SE326057B; FR2023010A1

Description

"Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteiden" "Procedure for the determination of lipoproteins "

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteiden in Serum oder anderen Flüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zu verschiedenen Proben dieses Serums bzw. einer anderen Flüssigkeit eine Anzahl von verschiedenen Mengen ednes neutralen Polymers, wie Polyvinylpyrrolidon, zugibt, wobei die Mengen des Polymers so gewählt werden, daß die verschiedenen Lipoproteidfraktionen entsprechend ihrem Molekulargewicht und ihrer Dichte aggregiert werden. Günstigerweise werden 10 bis 18 % eines Metallsalzes zugegeben, um die Aggregation zu erleichtern. Die verschiedenen aggregathaltigen Lösungen werden dann zentrifugiert, günstigerweise in Kapillarröhrchen und die getrennten Aggregate werden visuell oder instrumenten gemessen, um die Menge der einzelnen Lipoproteidfraktionen in der Serumprobe zu bestimmen. Das Ver-The invention relates to a method for the determination of lipoproteins in serum or other liquids, which is characterized in that a number of different amounts of neutral polymer, such as polyvinylpyrrolidone, are added to different samples of this serum or another liquid, the amounts of the Polymers are chosen so that the different lipoprotein fractions are aggregated according to their molecular weight and density. It is advantageous to add 10 to 18% of a metal salt in order to facilitate the aggregation. The various aggregate-containing solutions are then centrifuged, conveniently in capillary tubes, and the separated aggregates are measured visually or by instruments in order to determine the amount of the individual lipoprotein fractions in the serum sample. The Ver-

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fahren kann unter anderem verwendet werden, um die Gefahr einer Arteriosklerose vorherzusagen.driving can, among other things, be used to reduce the danger predict arteriosclerosis.

Die vorliegende Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Lipoproteiden in wäßrigen Flüssigkeiten, das unter anderem dazu verwendet werden kann, um die Gefahr einer Arteriosklerose- vorherzusagen. Das Verfahren ist schnell und kann in einem Labor mit geringen technischen Hilfsmitteln durchgeführt werden. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß es möglich ist, die φ für das Verfahren benötigten Materialien in fertigen Analysenpackungen bereitzustellen, in denen die für das Verfahren benötigten Mengen dieser Materialien jeweils einzeln abgepackt sind.The present invention "relates to a method of determination of lipoproteins in aqueous liquids, which, among other things, can be used to reduce the risk atherosclerosis- predict. The procedure is fast and can be carried out in a laboratory with few technical aids. Another advantage of the method consists in the fact that it is possible to manufacture the materials required for the method in Provide analysis packs in which the quantities of these materials required for the process, each individually are packed.

Es ist bekannt, daß der Herzinfarkt bei Personen auftritt, in deren.Serum sich eine erhöhte Menge an Fett oder Lipoiden befindet. Diese Lipoide bestehen in erster Linie aus Cholesterin und Triglyceriden und treten immer in Verbindung mit Protein als sog. Lipoproteide auf.Heart attacks are known to occur in people their serum contains an increased amount of fat or lipoids. These lipoids are primarily made up of cholesterol and triglycerides and always occur in connection with protein as so-called lipoproteins.

Die in diesem Zusammenhang interessanten Lipoproteide besitzen eine Struktur, die der von Mizellen entspricht. W Sie bestehen aus sphärischen Teilchen mit einem Kern aus verschiedenen Mengen von Cholesterin und Triglycerid, der von Protein umgeben ist. Diese Lipoproteide bestehen im wesentlichen aus drei verschiedenen willkürlich bezeichneten Fraktionen und zwar Chylomikronen (EM); Pre-ß-lipoproteide (Pre-ß) oder Lipoproteide sehr geringer Dichte und ß-Lipoproteide (ß) oder Lipoproteide geringer Dichte. Die Chylomikronen,von denen angenommen wird, daß sie, soweit es die Arteriosklerose betrifft, harmlos sind, haben einer; Durchmesser von mehr als 900 Ä und einen hohen Gehalt anThe lipoproteins of interest in this context have a structure that corresponds to that of micelles. W They consist of spherical particles with a core of various amounts of cholesterol and triglyceride surrounded by protein. These lipoproteins essentially consist of three different arbitrarily named fractions, namely chylomicrons (EM); Pre-ß-lipoproteide (Pre-ß) or very low density lipoproteide and ß-lipoproteide (ß) or low density lipoproteide. The chylomicrons, which are believed to be harmless as far as arteriosclerosis is concerned, have one; A diameter of more than 900 Å and a high content of

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Triglycerid. Ihre Dichte ist die geringste der angegebenen Lipoproteide, d.h. ungefähr 0,95- Die Schale "besteht aus sog. A-Protein.Triglyceride. Their density is the lowest of those specified Lipoproteide, i.e. about 0.95- The shell "is made of so-called A protein.

Die/ß-Iiipoproteide haben eine große Menge Lipoid, das aus nahezu gleichen Teilen von Cholesterin und Triglycerid besteht und eine Schale sowohl aus A-als auch aus B-Protein. Diese Substanzen haben eine Größe von 250 bis 900 & und eine Dichte von ungefähr 1.Es wird angenommen, daß der Cholesterin Gehalt in den Fre-ß-lipoproteiden eine frühe Arteriosklerose verursacht.The / ß-Iiipoproteide have a large amount of lipoid that is made up consists of almost equal parts of cholesterol and triglyceride and a shell of both A and B protein. These substances range in size from 250 to 900 & and a Density of about 1. It is assumed that the cholesterol content in the Fre-ß-lipoproteiden causes early arteriosclerosis caused.

Die ß-Lipoproteide besitzen eine Dichte von ungefähr "1,05 und eine Größe von ungefähr 190 bis 250 Ä. Die Schale besteht aus B-Protein und ein großer Teil des Lipoids besteht im wesentlichen aus Cholesterin. Es wird angenommen, daß die ß-Lipoproteide für die Blutgefäße ebenfalls gefährlich sind.The β-lipoproteins have a density of approximately "1.05 and a size of about 190 to 250 Å. The shell is made made up of B protein and a large part of the lipoid consists essentially of cholesterol. It is believed that the ß-lipoproteins are also dangerous for the blood vessels.

Durch die Untersuchung der Anwesenheit der beiden zuletzt genannten Lipoproteide, d.h. Pre-ß-lipoproteiden und ß-Lipoproteiden im Serum und Bestimmung ihres Gehaltes kann, man bis zu einem gewissen Grad die Gefahr eines frühen Herzinfarktes voraussagen. Es wurden für diese Bestimmung verschiedene Verfahren vorgeschlagen, wie Unterschiede in der Löslichkeit, Ultrazentrifugation, spezielle immunochmische Reaktionen und elektrophoretische Erscheinungen. Liese Verfahren erfordern jedoch eine komplizierte Laborausstattung und sind sehr zeitraubend.By investigating the presence of the two last called lipoproteins, i.e. pre-ß-lipoproteins and ß-lipoproteins in the serum and determining its content can, to a certain extent, run the risk of early heart attack predict. Various methods have been proposed for this determination, such as differences in the Solubility, ultracentrifugation, special immunochromic Reactions and electrophoretic phenomena. However, these methods require complicated laboratory equipment and are very time consuming.

Eine Trennung unter Ausnutzung der Unterschiede in der Löslichkeit der Lipoproteide führt nicht zu exakten Ergebnissen und es besteht die Gefahr, daß die sehr empfindlichen und labilen Lipoproteide durch die Behandlung mit Lösungsmitteln zerstörtA separation taking advantage of the differences in solubility the lipoproteins does not give exact results and there is a risk that the very sensitive and unstable Lipoproteins destroyed by treatment with solvents

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werden können. Das Prinzip der Ultrazentrifugation beruht auf der Dichte der verschiedenen Lipoproteide. Das ist ein sehr zeitraubendes Verfahren, da eine Zentrifugation oft einige Tage erfordert und kann in einem Labor mit einer einfachen Ausstattung nicht durchgeführt werden. Das immunologische Verfahren erfordert die zeitraubende und teure Herstellung des Antiserums und erlaubt keine Fraktionierung eier drei Arten von Lipoproteidxn.can be. The principle of ultracentrifugation is based on the density of the various lipoproteins. Centrifugation is a very time-consuming process often requires a few days and cannot be carried out in a laboratory with simple equipment. That immunological procedures require the time consuming and expensive preparation of the antiserum and do not allow any Fractionation of three types of lipoproteinxn.

Die Trennung mit Hilfe der Elektrophorese, die auf einer Ladung auf der Schale des Proteins der verschiedenen Lipoproteide beruht, ergibt keine präzise quantitative Bestimmung. Wie gesagt, besteht diese Schale aus A- und B-Proteinen. Die Chylomikronen können wegen ihres großen Durchmessers nicht wandern, während die ß-Lipoproteide und die Pre-ß-lipoproteide mit verschiedenen Geschwindigkeiten wandern, da ihre Schalen B-Protein bzw. A- und B-Protein enthalten. Diese verschiedenen Lipoproteide werden nach der Wanderung auf dem Elektrophorese-Papier mit Hilfe von Farbstoffen identifiziert, die eine Affinität zu Lipöiden besitzen. Das Verfahren der Papierelektrophorese erfordert ungefähr 20 h und dieses Verfahren kann nur öpiu verwendet werden, zu zeigen, daß Lipoproteide in dem Serum vorhanden sind. D.h. dieses Verfahren kann nicht zur quantitativen Bestimmung der verschiedenen Lipoproteide verwendet werden.Separation by means of electrophoresis, which is based on a charge on the shell of the protein of the various lipoproteins, does not give a precise quantitative determination. As I said, this shell consists of A and B proteins. The chylomicrons cannot migrate because of their large diameter, while the ß-lipoproteide and the pre-ß-lipoproteide migrate at different speeds because their shells contain B protein or A and B protein. These different lipoproteins are identified after the migration on the electrophoresis paper with the help of dyes that have an affinity for lipoids. The paper electrophoresis procedure requires approximately 20 hours and this procedure can only be used to show that lipoproteins are present in the serum. This means that this method cannot be used for the quantitative determination of the various lipoproteins.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird Jedoch eine exakte quantitative Bestimmung der Menge und der Art der in dem Serum enthaltenen Lipoproteide in sehr kurzer Zeit und mit leicht verfügbaren Reagenzien und einfachen Vorrichtungen erhalten.With the method according to the invention, however, one exact quantitative determination of the amount and type of lipoproteins contained in the serum in a very short time and obtained with readily available reagents and simple devices.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Tatsache, daßThe inventive method is based on the fact that

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Lipoproteide an bestimmte polymere Materialien, wie Polyvinylpyrrolidon (PTP) aggregiert werden. Diese Aggregation ist kumulativ und quantitativ und hängt von der Konzentration des Polymer und des einzelnen Lipoproteids ab₍und die so erhaltenen Aggregate können leicht von dem übrigen Serum abgetrennt werden. Der Gehalt an einem spezifischen Lipoproteid in der Probe kann so nach einer einfachen Operation direkt abgelesen werden, ohne daß das Aggregat zerstört werden muß.Lipoproteins are aggregated to certain polymeric materials, such as polyvinylpyrrolidone (PTP). This aggregation is cumulative and quantitative and depends on the concentration of the polymer and the individual lipoprotein ₍ and the aggregates obtained in this way can easily be separated from the rest of the serum. The content of a specific lipoprotein in the sample can thus be read off directly after a simple operation without the unit having to be destroyed.

Als Polymer kann jedes beliebige lineare neutrale Polymer mit einem Molekulargewicht von mehr als 30 000 verwendet werden. Geeignete Polymere sind z.B. PVP, Dextran, PoIyäthylenglykol, Polypropylenglykol und Heparin. PVP ist das bevorzugte Material und mit diesem Material werden ausgezeichnete Ergebnisse erzielt.Any linear, neutral polymer having a molecular weight greater than 30,000 can be used as the polymer will. Suitable polymers are e.g. PVP, dextran, polyethylene glycol, Polypropylene glycol and heparin. PVP is the preferred material and this material is excellent Results achieved.

Es ist günstig, wenn das Polymer zusammen mit einem Metallsalz und günstigerweise einem Alkalihalogenid, wie Lithiumchlorid, Lithiumbromid, Natriumchlorid, Natriumbromid oder Kaliumchlorid verwendet wird. Aus Gründen der Wirtschaftlichkeit oder leichten Verfügbarkeit wird vorzugsweise Natriumchlorid verwendet. Es hat sich als vorteilhaft er- ' wiesen, den Salzgehalt bei zunehmender Polymerkonzentration zu erhöhen, iür praktische Zwecke ist ein Salzgehalt von ungefähr 10 bis 18 % geeignet, wenn eines der angegebenen Polymere verwendet wird. Bei einer Konzentration von beispielsweise 14 % Natriumchlorid werden die angegebenen Lipoproteide in der ganzen Breite aggregiert.It is favorable if the polymer is used together with a metal salt and favorably an alkali halide such as lithium chloride, lithium bromide, sodium chloride, sodium bromide or potassium chloride. Sodium chloride is preferably used for reasons of economy or ready availability. It has proven advantageous to increase the salt content with increasing polymer concentration; for practical purposes a salt content of approximately 10 to 18% is suitable if one of the specified polymers is used. At a concentration of, for example, 14 % sodium chloride, the specified lipoproteins are aggregated over the entire width.

Es hat sich nun überraschenderweise gezeigt, daß man bei Verwendung von verschiedenen Konzentrationen des gleichen Polymers mit verschiedenen Serum-oder anderen Flüssigkeitsproben die drei verschiedenen Lipoproteid-Fraktionen quanti- It has now been shown, surprisingly, that when using different concentrations of the same Polymer with different serum or other fluid samples the three different lipoprotein fractions quanti-

- 6 009824/13S7 - 6 009824 / 13S7

- 6 tativ und selektiv aggregieren kann.- 6 can aggregate tatively and selectively.

Wenn man 1 bis 5 °/° des Polymers (Gewicht pro Volumen Polymer im Serum) und günstigerweise 2 bis 4 % zu frischem Serum hinzugibt, werden die Chylomikronen, d.h. die Lipoproteide mit einer Teilchengröße von mehr als S(K) S quantitativ aggregiert, während die anderen Lipoproteide nicht beeinflußt werden. Wenn die Polymerkonzentration auf 5 bis 9 % erhöht wird, werden alle Lipoproteide mit einer Teilchengröße von mehr als 250 Ä aggregiert, d.h., die Pre-ß-lipoproteide und die Chylomikronen. Bei Polymerkonz ent ratio nen von mehr als 9 % werden auch die ß-Lipoproteide aggregiert. Eine solche Aggregation tritt bei Konzentrationen bis zu 20 % und mehr auf. Me letzte Polymerkonzentration kann in dem vorgeschlagenen Bereich variiert werden, obwohl es sich gezeigt hat, daß 12 bis 13 % PVP die ß-Lipoproteide quantitativ aggregieren können und daß das der bevorzugte Konzentsationsbereioh ist», »'ie. Qben gesagt, hat es sich gezeigt, daß die Verwendung von 10 bis 18 % eines Metallsalzes mit dem Polymer geeignet ist, eine Aggregation des gesamten Lipoproteidspektrums herbeizuführen.If one 1 to 5 / added are ° ° of the polymer (weight per volume of polymer in the serum) and conveniently 2 to 4% to fresh serum, the chylomicrons which lipoproteins ie having a particle size of more than S (K) S quantitatively aggregated while the other lipoproteins are not affected. When the polymer concentration is increased to 5 to 9%, all lipoproteins with a particle size greater than 250 Å are aggregated, that is, the pre-ß-lipoproteins and the chylomicrons. At polymer concentrations of more than 9%, the ß-lipoproteins are also aggregated. Such aggregation occurs at concentrations up to 20 % and more. The final polymer concentration can be varied within the suggested range, although it has been shown that 12 to 13% PVP can quantitatively aggregate the β-lipoproteins and that this is the preferred concentration range. Said above, it has been found that the use of 10 to 18 % of a metal salt with the polymer is suitable for bringing about aggregation of the entire spectrum of lipoproteins.

In bis zu 2 bis 3 h tritt bei Zimmertemperatur quantitative Aggregation ein. Es hat sich auch gezeigt, daß die Aggregation schneller eintritt bei leicht erhöhten Temperaturen. Eine komplette Aggregation tritt z.B. bei 37°C in 20 bis 30 min ein.Quantitative occurs in up to 2 to 3 h at room temperature Aggregation one. It has also been shown that aggregation occurs more quickly at slightly elevated temperatures. Complete aggregation occurs e.g. at 37 ° C in 20 to 30 min.

Es hat sich als günstig erwiesen, für das erfindungsgemäße Verfahren frisches Serum zu verwenden. Wenn das Serum alt ist, d.h. älter als ungefähr 2 Tage, werden die Teilchen kleiner und folglich erfordern diese Teilchen eine höhere Konzentration an Polymer für eine quantitative Abscheidung.It has proven to be beneficial for the inventive Procedure to use fresh serum. When the serum is old, i.e. older than about 2 days, the particles become smaller and consequently these particles require a higher concentration of polymer for quantitative deposition.

009824/1357009824/1357

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

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Um diesen Effekt zu vermeiden, kann man einen Inhibitor für die Enzyme zusetzen, die die Verkleinerung verursachen. Ein wichtiges Enzym dieser Gruppe ist Acyltransf.erase, die z.B. mit Methylmaleamid gehemmt werden kann. Um eine solche Hemmung zu erreichen, wird Methylmaleamid in einer Konzentration von 0,05 m zugesetzt.To avoid this effect, one can use an inhibitor clog for the enzymes that cause the shrinkage. An important enzyme in this group is acyltransf.erase, which e.g. can be inhibited with methylmaleamide. To achieve such an inhibition, methylmaleamide is used in one concentration 0.05 m added.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden 2 bis 4 Proben des gleichen Serums verwendet. Zu diesen ,When carrying out the method according to the invention 2 to 4 samples of the same serum are used. To this ,

Proben wird jeweils Polymer, günstigerweise in Lösung, bis " zu der gewünschten Konzentration zugegeben, um die Chylomikronen, Pre-ß-lipoproteide und ß-Lipoproteide kumulativ und quantitativ zu aggregieren. Die Proben werden dann solange stehengelassen, wie zu einer vollständigen Aggregation erforderlich ist. Anschließend werden die Aggregate in Behälter gegeben, die zur Zentrifugation geeignet sind, wie Kapillarröhrchen und in einer Laborzentrifuge zentrifugiert, um eine Trennung des Aggregats von dem Serum oder der anderen Flüssigkeit zu erreichen. Es ist günstig , wenn die Probe während der Zentrifugation nicht erhitzt wird. Daher soll diese Operation bei Zimmertemperatur oder niedrigeren Temperaturen durchgeführt μ werden, so daß die Lipoproteide nicht zerstört werden.Polymer is added to each sample, advantageously in solution, up to the desired concentration in order to aggregate the chylomicrons, pre-ß-lipoproteide and ß-lipoprotein cumulatively and quantitatively. The samples are then left to stand for as long as is necessary for complete aggregation The aggregates are then placed in containers suitable for centrifugation, such as capillary tubes, and centrifuged in a laboratory centrifuge to separate the aggregate from the serum or other liquid. It is advantageous if the sample is not heated during centrifugation is. Therefore, this operation is carried out at room temperature or lower temperatures are μ, so that the lipoproteins are not destroyed.

Es hat sich gezeigt, daß das abgetrennte Polymer-Lipoproteidaggregat kumulativ proportional ist der Menge und Art des Lipoproteids in dem Serum, So kann die relative Menge der verschiedenen Lipoproteid-Fraktionen in dem Serum einfach aus der Höhe des Aggregats in der Säule oder Kapillare abgelesen oder wie folgt berechnet werden: Die Höhe des Aggregats in der Kapillare wird zuerst mit einem Verdünnungsfaktor, der gleich ist der Gesamtmenge der Probe, dividiert durch die Menge des Serums in der Probe,und dann mit einem Kapillarfaktor korrigiert. Der Kapillarfaktor ist 1, wenn die KapillareIt has been shown that the separated polymer-lipoprotein aggregate cumulatively proportional to the amount and type of lipoprotein in the serum, so the relative amount can of the various lipoprotein fractions in the serum read from the height of the aggregate in the column or capillary or calculated as follows: The height of the aggregate in the capillary is first used with a dilution factor which is equal to the total amount of the sample divided by the Amount of serum in the sample, and then corrected with a capillary factor. The capillary factor is 1 if the capillary

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100 mm mit der Probe gefüllt ist, d.h. ein Maß für das Polymer-Lipoproteid wird in Vol.-% erhalten. Bei einer anderen Füllhöhe der Kapillare ist der Kapillarfaktor gleich 100 dividiert durch die Höhe der Probe der Kapillare. Die so korrigierte Höhe der Probe wird dann mit einem Lipoproteid-Faktor multipliziert, wobei ein direkter Wert für den Vo1.-%-Gehalt an Lipoproteid erhalten wird. Der Lipoproteid-Faktor ist 1/4 für Chylomikronen, 1/7 für Pre-ß-lipoproteide und 1/9 für ß-Lipoproteide. Die folgenden Formeln illustrieren die Berechnung:100 mm is filled with the sample, i.e. a measure for the Polymer lipoprotein is obtained in% by volume. At a other filling height of the capillary, the capillary factor is equal to 100 divided by the height of the sample of the capillary. The corrected height of the sample is then multiplied by a lipoprotein factor, being a direct value for the Vo1 .-% - content of lipoprotein is obtained. Of the Lipoproteid factor is 1/4 for chylomicrons, 1/7 for pre-ß-lipoproteide and 1/9 for ß-lipoproteide. the the following formulas illustrate the calculation:

Korrigierte Höhe Gesamtvolumen = tatsächliche Höhe χ der Probe χ 100Corrected height total volume = actual height χ of the sample χ 100

Volumen des Höhe der Probe Serums in der in der Probe KapillareVolume of the level of the sample serum in the capillary in the sample

Vol.-% Chylomikronen = korrigierte Höhe KM χ 1/4· Vol.-% Pre-ß-lipoproteid = (korrigierte Höhe KM + x're-ß -Vol .-% chylomicrons = corrected height KM χ 1/4 Vol .-% Pre-ß-lipoproteid = (corrected height KM + x're-ß -

korrigierte Höhe KM) χ 1/7corrected height KM) χ 1/7

Vol.-% ß-Lipoproteid = (korrigierte Höhe KM + pre-ß + ß -Vol .-% ß-lipoprotein = (corrected height KM + pre-ß + ß -

korrigierte Höhe KM + Pre-ß) χ 1/9.corrected height KM + Pre-ß) χ 1/9.

in
Dia Höhe des Aggregats/der Kapillare kann direkt oder £,„13. mit Hilfe eines feststehenden Mikrometers abgelesen werden. Im letzteren Falle ist es möglich, mit einer Genauigkeit von bis zu 0,01 mm abzulesen. Man kann auch eine noch extaktere Meßmethode anwenden, indem man ein Instrument mit einer Vergrößerungslinse und Haarlinien für präzise Ablesungen verwendet. Mit einem derartigen Instrument ist es auch möglich, mit einer Genauigkeit von mindestens 0,01 mm abzulesen.in
The height of the aggregate / capillary can be direct or £, “13. can be read using a fixed micrometer. In the latter case it is possible to read with an accuracy of up to 0.01 mm. An even more precise method of measurement can be used by using an instrument with a magnifying lens and hairlines for precise readings. With such an instrument it is also possible to read with an accuracy of at least 0.01 mm.

Der Patient, dessen Serum auf das Lipoproteidprofil untersucht werden soll, sollte ungefähr 12 h bevor ihm eine Blut-The patient whose serum is examined for the lipoprotein profile should be about 12 hours before a blood test

- 9 0 0 9 8 2/,/ 1357- 9 0 0 9 8 2 /, / 1357

BAD ORHSiNALBAD ORHSiNAL

probe abgenommen wird nichts essen, um jede Anormalität in dem Chylomikronengehalt, wie sie z.B. nach einem fetten Essen auftritt, zu vermeiden. In der folgenden Tabelle sind ungefähre normale Lipoproteidwerte für gesunde Patienten angegeben. Wenn die Menge der Pre-ß-lipoproteide und/oder ß-Lipoproteide über diesen Werten liegt, besteht die Gefahr eines Herzinfarkts.sample taken will not eat anything to eliminate any abnormality in the chylomicron content, such as occurs after a fatty meal, to avoid. In the following table are approximate normal lipoprotein levels for healthy patients specified. If the amount of pre-ß-lipoproteide and / or ß-lipoproteide is above these values, the Risk of a heart attack.

Chylomikron Pre-ß- ß-LipoproteidChylomicron pre-ß-ß-lipoprotein

lipoproteid Λ lipoproteid Λ

Lipoproteid in mg % 100 I50 400Lipoprotein in mg% 100 I50 400

Höhe des abzentrifu-Height of centrifuge

gierten Lipoproteid-yawed lipoprotein

aggregats bei 60 mmaggregate at 60 mm

Kapillarhöhe 0 0-0,5 1,5Capillary height 0 0-0.5 1.5

Erfindungsgemäß kann man so in einer sehr kurzen Zeit und mit einfachen Vorrichtungen und einfachen Verfahrensschritten die Iiipoproteide quantitativ bestimmen und so die Gefahr eines Herzinfarkts vorhersagen. Der Vorteil eines derartigen Verfahrens besteht darin, daß ärztliche Stationen und Ärzte in privater Praxis diesen Test mit ihrer vorhandenen begrenzten Ausstattung gleich durchführen können.According to the invention, the ipoproteins can thus be determined quantitatively in a very short time and with simple devices and simple process steps, and so on predict the risk of a heart attack. The advantage of such a procedure is that medical Wards and doctors in private practice carry out this test with their limited equipment can.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann eine genauere Bestimmung der Pre-ß-lipoproteide erreicht werden, indem man zwei getrennte Proben in einer Weise behandelt, daß die Aggregation von Pre-ß-lipoproteiden von zwei verschiedenen Größenbereichen erreicht wird. Es ist gesagt worden, daß die Pre-ß-lipoproteide eine Teilchengröße von 250 bis 9OO α besitzen. Wenn man eine Probe mit einer Polymerkonzentration von 5 bis 7 % behandelt, werden die Pre-ß-According to one embodiment of the invention, a more accurate determination of pre-ß-lipoproteins can be achieved by treating two separate samples in a manner that aggregation of pre-ß-lipoproteins of two different size ranges is achieved. The pre-β-lipoproteins have been said to have a particle size of 250 to 900 α. If a sample is treated with a polymer concentration of 5 to 7 % , the pre-ß-

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009824/1357009824/1357

mo cmmo cm

- ίο -- ίο -

lipoproteide mit einer Teilchengröße im Bereich von 400 bis 900 A aggregiert, während die Behandlung einer zweiten Probe mit einer Polymerkonzentration von ungefähr 7 bis 9 % auch zu einer Aggregation der Pre-ß-lipoproteide in dem Größenbereich von 250 bis 400 2. führt,. Die Berechnung wird dann analog wie oben angegeben durchgeführt. Der Lipoproteid-Faktor beträgt 1/6 für die größeren Pre-ß-lipoproteide und 1/8 für die kleineren. Es hat sich in der Praxis gezeigt, daß diese weitere Aufspaltung der Pre-ß-lipoproteide nützlich ist, bestimmte abnorme Lipoproteid-Bedingungen bei Patienten zu diagnostizieren.lipoproteide aggregates with a particle size in the range from 400 to 900 Å, while the treatment of a second sample with a polymer concentration of approximately 7 to 9% also leads to an aggregation of the pre-ß-lipoproteide in the size range from 250 to 400 2 . The calculation is then carried out in the same way as stated above. The lipoproteid factor is 1/6 for the larger pre-ß-lipoproteide and 1/8 for the smaller ones. It has been found in practice that this further breakdown of the pre-β-lipoprotein is useful in diagnosing certain abnormal lipoprotein conditions in patients.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, in denen sich alle %-Angaben auf Gewicht pro Volumen beziehen.The invention is illustrated by the following examples, in which all percentages are based on weight per Relate volume.

Beispielexample Ά.Ά.

Einem Patienten, der 12 h nichts gegessen hatte, wurde eine Blutprobe entnommen. Das Serum dieser Probe wurde in drei Teile von je 2 ml ausgeteilt. 1 ml einer wäßrigen 14%igen Natriumchloridlösung mit einer Konzentration von PVP, wie sie für die einzelnen Proben in Tabelle I angegeben ist, wurde zu diesen Teilen hinzugegeben. Nach 2 h bei Zimmertemperatur wurden diese Testlösungen in Kapillarröhrchen gegeben, die durch Kapillarwirkung bis zu einer Höhe von 60 mm gefüllt wurden. Die Kapillaren wurden dann verschlossen und 40 min mit 4 000 Upm zentrifugiert (G-Nummer ungefähr 3 500 bis 4 500). Die Kapillarröhrchen wurden dann herausgenommen und die Höhe jedes abgetrennten Polymer-Lipoproteid-Aggregats wurde mib Hilfe eines kalibrierten Mikroskops gemessen. Die gemessenen und berechneten Werte der Lipoproteid-Konzenbrationen sind in Tabelle I angegeben.A blood sample was drawn from a patient who had not eaten for 12 hours. The serum of this sample was divided into three parts of 2 ml each. 1 ml of an aqueous 14% sodium chloride solution with a concentration PVP as indicated for each sample in Table I was added to these portions. After 2 hours at room temperature, these test solutions became placed in capillary tubes filled by capillary action to a height of 60 mm. The capillaries were then capped and centrifuged at 4,000 rpm for 40 minutes (G number approximately 3,500 to 4,500). the Capillary tubes were then taken out and the height of each separated polymer-lipoprotein aggregate was determined mib measured using a calibrated microscope. the measured and calculated values of the lipoprotein concentrations are given in Table I.

- 11 -- 11 -

0.0-9 8 2 Λ / 1 3 B70.0-9 8 2 Λ / 1 3 B7

- 11 Beispiel 2 - 11 Example 2

Methylmaleamid von einer Konzentration von 0,5m wurde zu einer Blutprobe von einem Patienten zugegeben, bei dem, wie die Untersuchung, zeigte, eine gewisse Gefahr eines Herzinfarktes bestand. Das Serum dieser Blutprobe wurde in drei 2 ml große Anteile aufgeteilt, zu denen jeweils 1 ml einer 17%igen wäßrigen LiBr-Lösung, die die in Tabelle I angegebenen PVP-Konzentrationen enthielt, zugegeben wurde. xJie .treiben wurden 20 min in einem 57 ^υ C wra men Wasserbad stehengelassen, anschließend abgekühlt und in Kapillarröhrchen gefüllt, wobei diese Röhrchen bis zu einer Höhe von 100 mm gefüllt" und 20 min bei 8 000 Upm in einer Kühlvorrichtung zentrifugiert wurde. Die Höhe des Aggregats in jedem Röhrchen wurde mit einem kalibrierten Mikroskop abgelesen. Die Lipoproteid-Konzentrationen und die gemessenen Werte sind in Tabelle I angegeben.Methylmaleamide at a concentration of 0.5m was added to a blood sample from a patient who, as the investigation showed, was at some risk of heart attack. The serum of this blood sample was divided into three 2 ml portions, to each of which 1 ml of a 17% strength aqueous LiBr solution containing the PVP concentrations given in Table I was added. The drift was left to stand for 20 min in a 57 ^½ C water bath, then cooled and filled into capillary tubes, these tubes being filled to a height of 100 mm and centrifuged for 20 min at 8,000 rpm in a cooling device the aggregate in each tube was read with a calibrated microscope and the lipoprotein concentrations and measured values are given in Table I.

Das in den Beispielen 1 und 2 verwendete PVP-Polymer besaß ein Molekulargewicht von bis zu 80 000 und eine Polymerlänge von ungefähr 800 bis 1 200 £ (Plasdone K-29-32 der General Aniline and Film Oorporationi.The PVP polymer used in Examples 1 and 2 had a molecular weight of up to 80,000 and a polymer length of about 800 to 1,200 pounds (Plasdone K-29-32 der General Aniline and Film Corporationi.

Example 5

Bei einer Routine-Untersuchung eines Patienten wurde eine Blutprobe entnommen, deren Serum in drei Teile von jeweils 4 ml aufgeteilt wurde, zu denen jeweils 2 ml einer wäßrigen 13%igen Natriumchloridlösung zugegeben wurde, die in den in Tabelle I angegebenen Konzentrationen Dextran enthielt (Dextran T 70, Pharmacia, Schweden - mittleres Molekulargewicht 71 000). Entsprechend dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren wurden Informationen über das Lipoproteidprofil des Patienten nach 4-5 min erhalten. DieseDuring a routine examination of a patient, a blood sample was taken, the serum of which was divided into three parts 4 ml each was divided, to each of which 2 ml of an aqueous 13% sodium chloride solution was added which contained dextran in the concentrations given in Table I (Dextran T 70, Pharmacia, Sweden - medium Molecular weight 71,000). According to the example 2 procedures given provided information on the lipoprotein profile of the patient received after 4-5 min. These

- 12 D0982 4/135 7-- 12 D0982 4/135 7-

BADBATH

Werte sind in Tabelle I angegeben. Beispiel 4 Values are given in Table I. Example 4

Das Verfahren des Beispiels 3 wurde wiederholt, wobei ein anderes Serum und Dextran 80 (Pharmacia, Schweden) anstelle von Dextran T 70, in wäßriger 14-%iger Natriumchloridlösung verwendet wurde. Dextran 80 besitzt ein mittleres Molekulargewicht von 75 000. Die erhaltenen Werte sind in Tabelle I angegeben.The procedure of Example 3 was repeated, wherein another serum and dextran 80 (Pharmacia, Sweden) instead of dextran T 70, in aqueous 14% sodium chloride solution was used. Dextran 80 has an average molecular weight of 75,000. The obtained Values are given in Table I.

TABLE I:

- 13 -- 13 -

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009824/-1357009824 / -1357

PlTEKTJiliSPIiÜCHEPlTEKTJiliSPIiÜCHE

Claims

PATENT CLAIMS:

Method for the quantitative determination of lipoproteins in aqueous test liquids, characterized in that separate portions of this test liquid with individual amounts of a linear neutral polymer with a molecular weight of over 30,000 are added, the samples are allowed to form aggregates from the lipoproteins and the polymer, these Separates aggregates from the test liquid and determines the amount of the aggregate in each portion of the test liquid, the amounts of the polymer being chosen so that a weight-per-volume ratio of the polymer in the test liquid of a) 1 to 5 % to determine the Chylomicrons and b) 5 to 20 % for the determination of the chylomicrons, pre-ß-lipoproteide and "ff-Eipoproteide" arises.

2) Method according to claim 1, characterized in that the amount b) is divided into individual amounts of polymer, with amounts of polymer of c) 5 to 9 % for determining the chylomicrons and pre-ß-lipoproteide and d) 9 to 20 % to determine the chylomicrons, pre-ßlipoproteins and ß-lipoproteins.

3) Method according to claim 2, characterized in that g e k en η records that the amount b) is divided into individual polymer fractions, namely e) 5 to 7% for loading

— 2 —- 2 -

00982A/135700982A / 1357

Mood of the chylomicrons and pre-ß-lipoproteide with a diameter of about 400 to 900 lbs and f) 7 to 9% for the determination of chylomicrons and pre-lipoproteins with a diameter of 250 to 900 pounds.

4) Method according to claim 1 to 3 $ characterized in that a metal salt to the test liquid is added to increase aggregation.

5) Method according to claim 4, characterized ι that the metal salt is a Jälkalihalogenid and the concentration is 10 to 18 wt .-%.

6), - method according to claim 5 »characterized in that the alkali halide sodium chloride is.

7) Method according to claim 1 to 6, characterized in that the polymer is polyvinylpyrrolidone

8) Method according to claim 1 to 7 »characterized in that the test liquid and the unit centrifuged to achieve separation.

9) Method according to claim 8, characterized in that the centrifugation in a capillary tube is carried out and the height of the aggregate is read directly in this capillary tube.

62aXIV

0 0 9 8 2 Λ / 1 3 & 70 0 9 8 2 Λ / 1 3 & 7