DE19549875B4

DE19549875B4 - Use of magnetic particles for the isolation of nucleic acids

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Publication number: DE19549875B4
Application number: DE19549875.5A
Authority: DE
Inventors: Dr. Dipl.-Biol. Kleiber Joerg; Dr. Dipl.-Chem. Walter Thomas; Dr. Dipl.-Chem. Harttig Herbert
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1995-06-08
Filing date: 1995-06-08
Publication date: 2016-12-08
Anticipated expiration: 2015-06-09

Abstract

Magnetische Partikel mit einer äußeren Glasoberfläche, die im wesentlichen porenfrei ist oder Poren eines Durchmessers von weniger als 10 nm aufweist sowie ferromagnetische Partikel mit einer Glasoberfläche sind bevorzugt einsetzbar bei der Isolierung von biologischen Materialien aus Proben. Sie gewähren eine rasche und zuverlässige Reinigung.Magnetic particles having an outer glass surface that is substantially nonporous or having pores of diameter less than 10 nm, and ferromagnetic particles having a glass surface are preferably useful in isolating biological materials from samples. They provide a quick and reliable cleaning.

Description

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von magnetischen Partikeln mit einer Glasoberfläche zur Isolierung von Nukleinsäuren.The invention relates to the use of magnetic particles with a glass surface for the isolation of nucleic acids.

Manche biologischen Materialien, insbesondere Nukleinsäuren, stellen im Hinblick auf ihre Isolierung aus der natürlichen Umgebung besondere Anforderungen. Zum einen sind sie oft in sehr geringen Konzentrationen vorhanden und zum anderen befinden sie sich oft in Nachbarschaft vieler anderer fester und gelöster Substanzen, die ihre Isolierung, beziehungsweise Bestimmung, beeinträchtigen.Some biological materials, especially nucleic acids, place special demands on their isolation from the natural environment. On the one hand, they are often present in very low concentrations and, on the other hand, they are often in the vicinity of many other solid and dissolved substances which impair their isolation or determination.

In jüngerer Zeit hat es daher nicht an Versuchen gefehlt, Verfahren und Materialien zur Isolierung von Nukleinsäuren aus ihrer natürlichen Umgebung vorzuschlagen. Aus Proc. Natl. Acad. USA 76, 615–619 (1979) ist die Bindung von Nukleinsäuren aus Agarosegelen in Gegenwart von Natriumjodid in gemahlenem Flintglas beschrieben.More recently, there has been no lack of attempts to propose methods and materials for isolating nucleic acids from their natural environment. From Proc. Natl. Acad. USA 76, 615-619 (1979) describes the binding of nucleic acids from agarose gels in the presence of sodium iodide in ground flint glass.

In Anal. Biochem. 121, 382–387 (1982) ist die Reinigung von Plasmid DNA aus Bakterien an Glasstaub in Gegenwart von Natriumperchlorat beschrieben.In anal. Biochem. 121, 382-387 (1982) describes the purification of plasmid DNA from bacteria on glass dust in the presence of sodium perchlorate.

In DE-A 37 34 442 ist die Isolierung von einzelsträngiger M13 Phagen-DNA an Glasfaserfiltern durch Ausfällung der Phagenpartikel mit Hilfe von Essigsäure und Lyse der Phagenpartikel mit Perchlorat beschrieben. Die an die Glasfaserfilter gebundenen Nukleinsäuren werden nach Waschen mit einem methanolhaltigen Puffer in Tris/EDTA-Puffer eluiert.In DE-A 37 34 442 describes the isolation of single-stranded M13 phage DNA on glass fiber filters by precipitation of the phage particles with the aid of acetic acid and lysis of the phage particles with perchlorate. The nucleic acids bound to the glass fiber filters are eluted after washing with a methanol-containing buffer in Tris / EDTA buffer.

In Anal. Biochem. 175, 196–201 (1988) ist ein ähnliches Verfahren zur Reinigung von DNA aus Lambdaphagen beschrieben.In anal. Biochem. 175, 196-201 (1988) describes a similar method for purifying DNA from lambda phage.

Den bisher genannten Verfahren des Standes der Technik ist die selektive Bindung von Nukleinsäuren an Glasoberflächen in chaotropen Salzlösungen gemeinsam, wobei die Nukleinsäure von Verunreinigungen wie Agarose, Proteinen oder Zelltrümmern abgetrennt wird. Zur Separierung der Glaspartikel von den Verunreinigungen wird nach dem Stand der Technik entweder Zentrifugation von Partikeln oder Durchsaugen von Flüssigkeiten durch Glasfaserfilter verwendet. Hierbei handelt es sich jedoch um einen limitierenden Schritt, der die Verarbeitung großer Probenzahlen stark behindert.The previously mentioned prior art methods share the selective binding of nucleic acids to glass surfaces in chaotropic saline solutions, whereby the nucleic acid is separated from contaminants such as agarose, proteins or cell debris. In order to separate the glass particles from the impurities, either centrifugation of particles or aspiration of liquids through glass fiber filters is used in the prior art. However, this is a limiting step that severely hinders the processing of large numbers of samples.

In Anal. Biochem. 201, 166–169 (1992) bzw. PCT GB 91/00212 ist die Verwendung von Magnetpartikeln zur Immobilisierung von Nukleinsäuren nach Ausfällung durch Zugabe von Salz und Ethanol beschrieben. Hierbei findet eine Agglutination der Nukleinsäuren unter Einschluß der Magnetpartikel statt. Das Agglutinat wird von dem ursprünglichen Lösungsmittel durch Anlegen eines Magnetfeldes und Waschen getrennt. Nach einem Waschschritt werden die Nukleinsäuren in einem Trispuffer gelöst. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß die Ausfällung nicht selektiv für Nukleinsäuren ist, sondern eine Vielzahl von festen und gelösten Stoffe mitagglutiniert werden. So ist es durch dieses Verfahren nicht möglich, eventuell vorhandene Inhibitoren für bestimmte enzymatische Reaktionen in ausreichendem Maße zu entfernen.In anal. Biochem. 201, 166-169 (1992) and PCT, respectively GB 91/00212 the use of magnetic particles for the immobilization of nucleic acids after precipitation by addition of salt and ethanol is described. In this case, agglutination of the nucleic acids takes place, including the magnetic particles. The agglutinate is separated from the original solvent by applying a magnetic field and washing. After a washing step, the nucleic acids are dissolved in a Tris buffer. However, this method has the disadvantage that the precipitate is not selective for nucleic acids, but a plurality of solid and dissolved substances are mitagglutiniert. Thus, it is not possible by this method to sufficiently remove any inhibitors present for certain enzymatic reactions.

In US-A-4,233,169 ist ein poröses Glas beschrieben, das Magnetpartikel eingelagert enthält.In US-A-4,233,169 is described a porous glass containing magnetic particles embedded.

DE 36 03 061 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines weichmagnetischen Verbundwerkstoffes mit geringen Wirbelstromverlusten auf der Basis eines weichmagnetischen, metallischen Werkstoffs und einen danach hergestellten Verbundwerkstoff. DE 36 03 061 A1 discloses a method of making a soft magnetic composite having low eddy current losses based on a soft magnetic metallic material and a composite material produced thereafter.

DE 21 06 613 A offenbart eine permutterartige Pigmentmasse bestehend im wesentlichen aus überzogenen Glimmerschuppen, wobei der Überzug eine durchscheinende Schicht mit einer Dicke von etwa 20 bis 250 Millimikron aus Metalloxidteilchen, die praktisch alle kleiner als 0,1 Mikron sind, ist und wobei die mit Metalloxid überzogenen Glimmerschuppen derart mit einem Silikat behandelt sind, dass die Kieselsäureschicht etwa 3,5 bis 25% des gesamten Pigmentgewichtes ausmacht. DE 21 06 613 A discloses a permuttering pigment composition consisting essentially of coated mica flakes, the coating being a translucent layer about 20 to 250 millimicrons thick of metal oxide particles, which are virtually all smaller than 0.1 microns, and wherein the metal oxide coated mica flakes are such a silicate are treated so that the silica layer about 3.5 to 25% of the total pigment weight.

EP 0 343 934 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von magnetisch anziehbaren Partikeln zur Verwendung bei biologischen Trennungen. Die Partikel umfassen einen Kern mit einem magnetischen Material, der in einen Metalloxidüberzug eingeschlossen ist. EP 0 343 934 relates to a process for the preparation of magnetically attractable particles for use in biological separations. The particles comprise a core with a magnetic material encased in a metal oxide coating.

GB 2 116 206 A offenbart einen Mikrocarrier zur ankerabhängigen Zellkultivierung umfassend ein kugelförmiges Substrat polymeren Materials und einen dünnen Überzug aus Silikatglass. GB 2 116 206 A discloses a microcarrier for anchor-dependent cell culture comprising a spherical substrate of polymeric material and a thin coating of silicate glass.

DE 43 07 262 A1 beschreibt polymere Siliciumdioxidverindungen in Form von Kieselgelen, Kieselsolen und gefällten oder pyrogenen Siliciumdioxid durch Einbinden magnetischer Materialien in deren Matrix. DE 43 07 262 A1 describes polymeric silica bonds in the form of silica gels, silica sols and precipitated or fumed silica by incorporating magnetic materials into their matrix.

Auf dem Markt befindet sich derzeit auch sogenanntes magnetisches, poröses Glas, welches Magnetpartikelchen in einer porösen, partikulären Glasmatrix enthält, und wobei die Oberfläche von einer streptavidinhaltigen Schicht überzogen ist. Dieses Produkt kann zur Isolierung von biologischen Materialien, zum Beispiel Proteinen oder Nukleinsäuren verwendet werden, wenn diese in einem aufwendigen Vorbereitungsschritt so modifiziert werden, daß diese kovalent an Biotin gebunden sind.So-called magnetic, porous glass which contains magnetic particles in a porous, particulate glass matrix is currently also on the market, and the surface is covered by a streptavidin-containing layer. This product can be used to isolate biological materials, for example proteins or nucleic acids, when modified in a complex preparation step such that they are covalently bound to biotin.

Aufgabe der Erfindung war es, bessere Materialien zur Isolierung von biologischen Materialien, nämlich Nukleinsäuren, bereitzustellen.The object of the invention was to provide better materials for the isolation of biological materials, namely nucleic acids.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von magnetischen Partikeln zur Isolierung von Nukleinsäuren, wobei die Partikel eine äußere Glasoberfläche, die im wesentlichen porenfrei ist oder Poren eines Durchmessers von weniger als 10 nm aufweist, eine Korngröße von weniger als 100 μm und einen inneren Kern haben, der von einer äußeren Glasoberfläche umschlossen ist.The invention relates to the use of magnetic particles for isolating nucleic acids, wherein the particles have an outer glass surface which is substantially free of pores or has pores of a diameter of less than 10 nm, a particle size of less than 100 microns and an inner core, which is enclosed by an outer glass surface.

Als Partikel bezeichnet der Fachmann feste Materialien mit einem geringen Durchmesser. Manchmal bezeichnet man solche Partikel auch als Pigmente. Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind besonders Partikel geeignet, die eine durchschnittliche Korngröße von weniger als 100 μm haben. Besonders bevorzugt weisen sie eine durchschnittliche Korngröße von zwischen 10 und 50 μm auf. Bevorzugt ist die Korngrößenverteilung relativ homogen, insbesondere liegen nahezu keine Teilchen < 10 μm oder > 50 μm vor.As a person skilled in the art refers to solid materials with a small diameter. Sometimes such particles are also called pigments. Particles which have an average particle size of less than 100 μm are particularly suitable for the purposes of the present invention. With particular preference, they have an average particle size of between 10 and 50 μm. The particle size distribution is preferably relatively homogeneous, in particular almost no particles <10 μm or> 50 μm are present.

Als magnetisch werden Materialien bezeichnet, die durch einen Magnet angezogen werden können, d. h. beispielsweise ferromagnetische oder superparamagnetische Materialien. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung sind ferromagnetische Materialien, insbesondere wenn sie noch nicht vormagnetisiert wurden. Unter Vormagnetisierung ist in diesem Zusammenhang das Inkontaktbringen mit einem Magneten zu verstehen, wodurch die Remanenz erhöht wird. Besonders bevorzugt sind ferromagnetische Materialien, wie z. B. Magnetit (Fe₃O₄) oder Fe₂O₃.Magnetic refers to materials that can be attracted by a magnet, ie, for example, ferromagnetic or superparamagnetic materials. Particularly preferred according to the invention are ferromagnetic materials, especially if they have not been premagnetized. Under biasing in this context is to be understood as bringing into contact with a magnet, whereby the remanence is increased. Particularly preferred are ferromagnetic materials such. As magnetite (Fe ₃ O ₄₎ or Fe ₂ O _3.

Unter einer äußeren Oberfläche eines Partikels wird die zusammenhängende Oberfläche verstanden, von der in Richtung auf die Umgebung des Partikels Senkrechte gebildet werden können, die dasselbe Partikel nicht noch einmal schneiden.An outer surface of a particle is understood to be the coherent surface from which perpendiculars can be formed in the direction of the surroundings of the particle, which do not intersect the same particle again.

Unter eine Pore wird eine Ausnehmung in der äußeren Oberfläche des Partikels verstanden, bei denen die Oberfläche soweit in das Partikel hineinreicht, daß eine in der Ausnehmung auf der Oberfläche gebildete gedachte Senkrechte in Richtung auf die nächstliegende Umgebung des Partikels das Partikel mindestens 1 mal schneidet. Poren reichen außerdem tiefer als ein Radius der Pore in das Partikel hinein.A pore is understood to mean a recess in the outer surface of the particle, in which the surface reaches into the particle far enough that an imaginary vertical formed in the recess on the surface intersects the particle at least once in the direction of the closest surrounding of the particle. Pores also reach deeper into the particle than a radius of the pore.

Unter einem Glas im Sinne der vorliegenden Erfindung wird ein siliciumhaltiges amorphes Material verstanden. Das Glas kann weitere Materialien enthaltenen, z. B.
B₂O₃ (0–30%),
Ae₂O₃ (0–20%),
CaO (0–20%),
BaO (0–10%),
K₂O (0–20%),
N₂O (0–20%),
MgO (0–18%),
Pb₂O₃ (0–15%).For the purposes of the present invention, a glass is understood as meaning a silicon-containing amorphous material. The glass may contain other materials, eg. B.
B ₂ O ₃ (0-30%),
Ae ₂ O ₃ (0-20%),
CaO (0-20%),
BaO (0-10%),
K ₂ O (0-20%),
N ₂ O (0-20%),
MgO (0-18%),
Pb ₂ O ₃ (0-15%).

In geringerem Umfang von 0–5% können auch eine Vielzahl anderer Oxide, wie z. B. Mn₂O₃, TiO₂, As₂O₃, Fe₂O₃, CuO, CoO usw. enthalten sein. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung sind Gläser, die durch den sogenannten Gel-Solprozeß und anschließendes Trocknen und Verdichten der gebildeten Schicht gebildet werden. Dieser Prozeß ist in seinen Grundzügen bekannt und wurde z. B. in C. J. Brinker, G. W. Scherer ”Sol Gel science – The physics and chemistry of Sol Gel Processing”, Academic Press Inc. 1990 und Sol-Gel Optics, Processing and Applications Lisa C. Klein Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, Seite 450 ff. beschrieben. Er wurde allerdings bisher noch nicht für magnetische Partikel beschrieben. Daß hiermit magnetische Partikel erzeugt werden können, die bei der Isolierung von biologischen Materialien, insbesondere Nukleinsäuren, ganz überraschende Eigenschaften haben, war nicht zu erwarten. Im Gel-Sol-Prozeß werden Alkoxide von netzwerksbildenden Komponenten, z. B. SiO₂, B₂O₃, Al₂O₃, TiO₂, ZrO₂, GeO₂ zusammen mit Oxiden und Salzen anderer Komponenten, z. B. in alkoholischer Lösung, vorgelegt und hydrolysiert. In der Gleichung ist die Herstellung von einem Natriumboroaluminiumsilikatglas aufgeführt.To a lesser extent from 0-5% can also be a variety of other oxides such. As Mn ₂ O ₃ , TiO ₂ , As ₂ O ₃ , Fe ₂ O ₃ , CuO, CoO, etc. may be included. Particularly preferred for the purposes of the invention are glasses which are formed by the so-called gel sol process and subsequent drying and densification of the layer formed. This process is known in its basic features and was z. In CJ Brinker, GW Scherer "Sol Gel Science - The Physics and Chemistry of Sol Gel Processing", Academic Press Inc. 1990 and Sol-Gel Optics, Processing and Applications Lisa C. Klein Ed. Kluwer Academic Publishers 1994, page 450 et seq. However, it has not yet been described for magnetic particles. That this magnetic particles can be generated, which have quite surprising properties in the isolation of biological materials, in particular nucleic acids, was not expected. In the gel-sol process alkoxides of network-forming components, eg. As SiO ₂ , B ₂ O ₃ , Al ₂ O ₃ , TiO ₂ , ZrO ₂ , GeO ₂ together with Oxides and salts of other components, eg. B. in alcoholic solution, submitted and hydrolyzed. In the equation, the preparation of a sodium boroaluminum silicate glass is listed.

Durch die Zugabe von Wasser wird der Hydrolyseprozeß der Ausgangskomponenten in Gang gesetzt. Die Reaktion verläuft relativ rasch, da die Alkaliionen katalytisch auf die Hydrolysegeschwindigkeit des Kieselsäureesters einwirken. Nach Ablauf der Gelbildung kann das entstehende Gel getrocknet und durch einen thermischen Prozeß zu einem Glas verdichtet werden.The addition of water initiates the hydrolysis process of the starting components. The reaction proceeds relatively rapidly, since the alkali metal ions act catalytically on the rate of hydrolysis of the silicic acid ester. After gelation, the resulting gel can be dried and compacted by a thermal process into a glass.

Unter einer porenfreien Oberfläche wird eine Oberfläche verstanden, die zu weniger als 5%, bevorzugt weniger als 2%, besonders bevorzugt weniger als 0.1%, mit Poren der oben stehenden Definition durchsetzt ist. Sollten Poren vorhanden sein, so haben diese einen Durchmesser von weniger als 10, besonders bevorzugt 1 nm.A pore-free surface is understood as meaning a surface which is interspersed with pores of the above definition to less than 5%, preferably less than 2%, particularly preferably less than 0.1%. If pores are present, they have a diameter of less than 10, more preferably 1 nm.

Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung sind Partikel, die einen Kern aus Glimmer und darauf immobilisierten Magnetitpartikeln enthalten, wobei der so gebildete Verbundstoff von der Glasschicht umschlossen ist. Sowohl der Kern als auch die Magnetitpartikel sind kristallin und nicht porös. Die Räume auf der Oberfläche des Glimmers, welche nicht von den Magnetitpartikeln besetzt ist, sind von einer dickeren Glasschicht überzogen als die Spitzen der Magnetitpartikel, so daß sich eine im wesentlichen nicht-poröse Glasoberfläche ergibt.Particularly preferred for the purposes of the invention are particles which contain a core of mica and magnetite particles immobilized thereon, the composite formed in this way being enclosed by the glass layer. Both the core and the magnetite particles are crystalline and non-porous. The spaces on the surface of the mica, which is not occupied by the magnetite particles, are covered by a thicker layer of glass than the tips of the magnetite particles, thus resulting in a substantially non-porous glass surface.

Die Nichtporosität der magnetischen Partikel bezieht sich nur auf die äußere Oberfläche, nicht auf das Innere des Partikels, so daß das Partikel in seinem Inneren porös sein kann, wenn die Oberfläche nur von porenfreiem Glas oder einer Glasoberfläche mit Poren eines Durchmessers von weniger als 10 nm umschlossen ist.The non-porosity of the magnetic particles refers only to the outer surface, not to the interior of the particle, so that the particle may be porous in its interior if the surface is only of non-porous glass or a glass surface having pores of a diameter of less than 10 nm is enclosed.

Überraschenderweise sind die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel besonders vorteilhaft zur Isolierung biologischer Materialien aus Proben geeignet. Insbesondere werden lange Nukleinsäuren sehr wenig oder gar nicht zerstört, wenn sie daran immobilisiert werden. Das Material des Kerns ist darüber hinaus eine natürliche Ressource und somit ökologisch wenig bedenklich. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Partikel ist darüber hinaus sehr wenig aufwendig und kostengünstig.Surprisingly, the magnetic particles according to the invention are particularly advantageously suitable for the isolation of biological materials from samples. In particular, long nucleic acids are very little or not destroyed when immobilized on it. In addition, the material of the core is a natural resource and therefore of little environmental concern. The preparation of the particles of the invention is also very inexpensive and inexpensive.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von ferromagnetischen Partikeln mit einer Glasoberfläche. Im Stand der Technik sind superparamagnetische Partikel beschrieben. Es hat sich mm herausgestellt, daß ferromagnetische Partikel, wenn sie mit einer Glasoberfläche überzogen sind, erhebliche Vorteile bei der Isolierung von biologischen Materialien aufweisen.Likewise provided by the invention is the use of ferromagnetic particles with a glass surface. The prior art describes superparamagnetic particles. It has been found that ferromagnetic particles, when coated with a glass surface, have significant advantages in the isolation of biological materials.

Solange die ferromagnetischen Partikel noch keinem Magnetfeld ausgesetzt waren, sedimentieren sie ausschließlich unter Einfluß der Schwerkraft. Sie sind durch Schütteln einfach und schnell wieder zu suspendieren. Der Vorgang der Abscheidung ohne Magnetfeldeinfluß verläuft dabei bevorzugt langsamer als die Immobilisierung biologischer Materialien an ihrer Oberfläche. Dies gilt insbesondere für Nukleinsäuren. Die ferromagnetischen Partikel können auf einfache Weise mittels eines Magneten an einer bestimmten Stelle der Probenflüssigkeit gesammelt werden, um die Flüssigkeit von den Partikeln und somit den immobilisierten biologischen Materialien zu trennen.As long as the ferromagnetic particles were not exposed to any magnetic field, they sediment exclusively under the influence of gravity. They are easy and quick to resuspend by shaking. The process of deposition without Magnetfeldeinfluß runs preferably slower than the immobilization of biological materials on their surface. This applies in particular to nucleic acids. The ferromagnetic particles can easily by means of a magnet at a certain point of the Sample liquid can be collected to separate the liquid from the particles and thus the immobilized biological materials.

Die Glasoberfläche der erfindungsgemäßen ferromagnetischen Partikel kann porenfrei sein oder aber Poren enthalten. Aus den oben genannten Gründen für die erfindungsgemäßen magnetischen Partikel ist es erforderlich, daß die äußere Oberfläche auch der ferromagnetischen Partikel porenfrei ist oder Poren eines Durchmessers von weniger als 10 nm aufweist. Auch die erfindungsgemäßen ferromagnetischen Partikel haben bevorzugt eine Korngröße zwischen 10 und 50 μm. Besonders bevorzugt sind Partikel, bei denen eventuell in der Oberfläche vorhandene Poren einen Durchmesser von weniger als 10, besonders bevorzugt 1 nm haben. Ein Beispiel für einen erfindungsgemäßen ferromagnetischen Partikel ist der oben genannte Verbundstoff aus Glimmer- und Magnetitpartikeln, umschlossen von einer Glasschicht.The glass surface of the ferromagnetic particles according to the invention may be non-porous or contain pores. For the above-mentioned reasons for the magnetic particles according to the invention, it is necessary that the outer surface of the ferromagnetic particles is non-porous or has pores of a diameter of less than 10 nm. Also, the ferromagnetic particles according to the invention preferably have a particle size between 10 and 50 microns. Particularly preferred are particles in which any pores present in the surface have a diameter of less than 10, more preferably 1 nm. An example of a ferromagnetic particle according to the invention is the above-mentioned composite of mica and magnetite particles enclosed by a glass layer.

Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zur Isolierung eines biologischen Materials durch

– Inkontaktbringen einer Probe, die das biologische Material in einer Flüssigkeit enhält, mit den erfindungsgemäßen magnetischen Partikeln oder den erfindungsgemäßen ferromagnetischen Partikeln unter Bedingungen, bei denen das biologische Material an die Partikeloberfläche bindet, und
– Abtrennung des biologischen Materials von der Flüssigkeit.

Also described is a method for isolating a biological material by

Contacting a sample containing the biological material in a liquid with the magnetic particles of the invention or the ferromagnetic particles of the invention under conditions in which the biological material binds to the particle surface, and
- Separation of the biological material from the liquid.

Unter biologischen Materialien werden Materialien auf partikulärer oder molekularer Basis verstanden. Hierzu gehören insbesondere Zellen, z. B. Viren und Bakterien aber auch humane und tierische isolierte Zellen, wie Leukozyten, sowie immunologisch aktive nieder- und hochmolekulare chemische Verbindungen, wie Haptene, Antigene, Antikörper und Nukleinsäuren. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Nukleinsäuren, z. B. DNA oder RNA.By biological materials is meant materials on a particulate or molecular basis. These include in particular cells, z. As viruses and bacteria but also human and animal isolated cells, such as leukocytes, as well as immunologically active low and high molecular weight chemical compounds, such as haptens, antigens, antibodies and nucleic acids. Preferred according to the invention are nucleic acids, eg. B. DNA or RNA.

Proben im Sinne der Erfindung sind beispielsweise klinische Proben, wie Blut, Serum, Mundspülflüssigkeit, Urin, Zerebralflüssigkeit, Sputum, Stuhl, Punktate und Knochenmarkproben. Die Probe kann auch aus dem Bereich der Umweltanalytik, der Lebensmittelanaly tik oder der molekularbiologischen Forschung, z. B. aus Bakterienkulturen, Phagenlysaten und Produkten von Amplifikationsverfahren, z. B. PCR, stammen.For the purposes of the invention, samples are, for example, clinical samples, such as blood, serum, mouthwash, urine, cerebral fluid, sputum, stool, punctates and bone marrow samples. The sample can also be used in the field of environmental analysis, food analysis or molecular biology research, eg. B. from bacterial cultures, phage lysates and products of amplification, z. B. PCR come.

Erfindungsgemäß haben die magnetischen Partikel einen inneren Kern, auf den die äußere Glasoberfläche aufgebracht ist. Bei dem Kern kann es sich um einen Verbundstoff, jedoch auch um einfache Eisenkerne handeln. Der Kern kann auch aus einer kristallinen oder keramischen oder glasartigen Struktur bestehen, in die Eisenoxid eingelagert ist.According to the invention, the magnetic particles have an inner core to which the outer glass surface is applied. The core may be a composite but may also be simple iron cores. The core may also consist of a crystalline or ceramic or glassy structure in which iron oxide is incorporated.

Mit dem geschilderten Verfahren kann natives oder modifiziertes biologisches Material isoliert werden. Unter nativem biologischem Material wird Material verstanden, dessen Struk tur gegenüber den natürlich vorkommenden biologischen Materialien nicht irreversibel verändert wurde. Dies schließt jedoch nicht die Modifizierung anderer Bestandteile der Probe aus. Sollen beispielsweise Zellen isoliert werden, so kann zwar das die Zellen umgebende Medium modifiziert sein, nicht jedoch die Zellen als solche. Sollen Nukleinsäuren isoliert werden, so sollen auch diese in der nativen Form, d. h. nicht denaturiert, geschnitten oder durch Ankoppelung reaktiver Gruppen modifiziert sein. Der Begriff natives biologisches Material umfaßt daher insbesondere biotinylierte Nukleinsäuren nicht. Beispiele für native biologische Materialien sind Phagen-DNA oder zelluläre Nukleinsäuren aus Blut.With the described method, native or modified biological material can be isolated. By native biological material is meant material whose structure was not irreversibly changed in relation to naturally occurring biological materials. However, this does not exclude the modification of other constituents of the sample. For example, if cells are to be isolated, then the medium surrounding the cells may be modified, but not the cells as such. If nucleic acids are to be isolated, then they should also be in the native form, i. H. not denatured, cut or modified by coupling of reactive groups. The term native biological material therefore does not particularly include biotinylated nucleic acids. Examples of native biological materials are phage DNA or cellular nucleic acids from blood.

Modifizierte biologische Materialien umfassen Materialien, die nicht in der Natur vorkommen, z. B. Nukleinsäuren, die durch Anheftung reaktiver, nachweisbarer oder zur Immobilisierung befähigenden Gruppen modifiziert sind, z. B. biotinylierte Nukleinsäuren.Modified biological materials include materials that are not found in nature, e.g. B. Nucleic acids modified by attachment of reactive, detectable or immobilizing groups, e.g. B. biotinylated nucleic acids.

In bestimmten Fällen kann die Probe ohne Vorbehandlung in einem Isolierungsverfahren eingesetzt werden. In vielen Fällen sollte die Probe jedoch durch eine geeignete Methode aufgeschlossen und das in der Probe enthaltende biologische Material freigesetzt werden. Verfahren zum Aufschluß von Proben sind dem Fachmann bekannt und können chemischer, enzymatischer oder physikalischer Natur sein. Auch eine Kombination dieser Verfahren ist möglich. Beispielhaft genannt sei Lyse durch Ultraschall, Hochdruck oder durch Scherung, durch Alkali, Detergenzien oder chaotrope Salzlösungen, oder durch Einwirkung von Proteinasen oder Lipasen. Speziell im Hinblick auf die Aufschlußverfahren zum Erhalt von Nukleinsäuren wird auf Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY und Ausubel et al.: Current Protocols in Molecular Biology 1987, J. Viley and Sons, NY, verwiesen.In certain cases, the sample may be used without pretreatment in an isolation process. In many cases, however, the sample should be disrupted by a suitable method and the biological material contained in the sample released. Methods for digesting samples are known in the art and may be chemical, enzymatic or physical. A combination of these methods is possible. Examples include lysis by ultrasound, high pressure or shear, by alkali, detergents or chaotropic salt solutions, or by the action of proteinases or lipases. Particular reference is made to Sambrook et al .: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Addition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, and Ausubel et al .: Current Protocols in Molecular Biology, 1987, for the digestion procedures for obtaining nucleic acids , J. Viley and Sons, NY.

Die Probe kann neben dem zu isolierenden biologischen Material weitere Bestandteile, z. B. Zelltrümmer, Proteine, Salze und weitere nicht zu isolierende Stoffe in einer Flüssigkeit enthalten. Diese Probe, die bevorzugt das biologische Material in nativer Form enthält, wird unter Bedingungen, bei denen das gewünschte biologische Material an die Partikeloberfläche bindet, mit den Partikeln in Kontakt gebracht. Die Bedingungen hierfür hängen von der Art des biologischen Materials ab, sind jedoch prinzipiell bekannt. Sie richten sich auch nach der Art der Bindung, über die das biologische Material an die Oberfläche gebunden wird. Sollen beispielsweise immunologische Wechselwirkungen für die Bindung ausgenutzt werden, so müssen Bedingungen gewählt werden, die für die Bildung von Immunkomplexen geeignet sind. Für Nukleinsäuren ist im Fall der modifizierten Nukleinsäuren eine Bindung über die Gruppen der Nukleinsäuren möglich, die die Modifizierung darstellen, z. B. Biotin über die Bindung an mit Streptavidin beschichtete Oberflächen. Insbesondere bei Nukleinsäuren ist jedoch der Fall der direkten Bindung von Nukleinsäuren an Glas bevorzugt, unter anderem deshalb, weil sich eine Modifizierung der Nukleinsäuren erübrigt und schon native Nukleinsäuren gebunden werden können. Die Bindung nativer Nukleinsäuren an Glaspartikel kann analog zu Verfahren des Standes der Technik erfolgen. Bevorzugt erfolgt sie in Gegenwart chaotroper Salze, wobei die Konzentration dieser Salze zwischen 2 und 8 mol/l beträgt, bevorzugt 4 bis 6 mol/l. Bei chaotropen Salzen handelt es sich z. B. um Natriumjodit, Natriumperchlorat, Guanidininiumthiocyanat, Guanidiniumisothiocyanat oder Guanidiniumhydrochlorit, ist jedoch nicht auf diese Verbindungen beschränkt. In addition to the biological material to be isolated, the sample may contain further constituents, eg. As cell debris, proteins, salts and other non-insulating substances in a liquid. This sample, which preferably contains the biological material in native form, is contacted with the particles under conditions in which the desired biological material binds to the particle surface. The conditions for this depend on the type of biological material, but are known in principle. They also depend on the type of bond that binds the biological material to the surface. If, for example, immunological interactions are to be exploited for the binding, conditions must be selected which are suitable for the formation of immune complexes. For nucleic acids, in the case of the modified nucleic acids, binding via the groups of the nucleic acids is possible, which represent the modification, eg. Biotin via binding to streptavidin-coated surfaces. Particularly in the case of nucleic acids, however, the case of direct binding of nucleic acids to glass is preferred, inter alia because modification of the nucleic acids is unnecessary and even native nucleic acids can be bound. The binding of native nucleic acids to glass particles can be carried out analogously to methods of the prior art. It preferably takes place in the presence of chaotropic salts, the concentration of these salts being between 2 and 8 mol / l, preferably 4 to 6 mol / l. Chaotropic salts are, for. For example, sodium iodite, sodium perchlorate, guanidinium thiocyanate, guanidinium isothiocyanate or guanidinium hydrochloride, but is not limited to these compounds.

Zum Inkontaktbringen der Probe mit den Partikeln wird die Probe mit den Partikeln vermischt und für eine für die Bindung ausreichende Zeit inkubiert. Die Länge der Inkubation ist dem Fachmann in der Regel aus der Behandlung mit nicht-magnetischen Partikeln bekannt, eine Optimierung ist durch Durchführung einer Bestimmung der Menge an immobilisiertem biologischem Material an der Oberfläche zu verschiedenen Zeitpunkten möglich. Für Nukleinsäuren können Inkubationszeiten zwischen 1 und 30 Minuten zweckmäßig sein.To contact the sample with the particles, the sample is mixed with the particles and incubated for a time sufficient for binding. The length of the incubation is generally known to the person skilled in the art from the treatment with non-magnetic particles, an optimization is possible by carrying out a determination of the amount of immobilized biological material on the surface at different times. For nucleic acids, incubation times between 1 and 30 minutes may be appropriate.

Je nach Größe und Art der magnetischen Partikel findet schon während der Inkubationszeit eine Separation der Partikel von der Flüssigkeit statt oder erhält sich die Suspension über längere Zeit. Wenn die Partikel eine sehr kleine Korngröße aufweisen und superparamagnetisch sind, erhält sich die Suspension über einen längeren Zeitraum. Handelt es sich um Partikel mit einer größeren Korngröße, so findet bereits während der Inkubation eine langsame Separation der Partikel von der Flüssigkeit statt. Insbesondere wenn es sich um ferromagnetische Partikel handelt, bilden sich solche Aggregate. Für den bevorzugten Fall, daß die ferromagnetischen Partikel nicht vormagnetisiert sind, ist eine besonders schonende Separation gewährleistet.Depending on the size and type of the magnetic particles, a separation of the particles from the liquid takes place during the incubation period, or the suspension is maintained for a longer time. If the particles have a very small particle size and are superparamagnetic, the suspension is maintained over a longer period of time. In the case of particles having a larger particle size, a slow separation of the particles from the liquid already takes place during the incubation. In particular, when it comes to ferromagnetic particles, such aggregates form. For the preferred case that the ferromagnetic particles are not biased, a particularly gentle separation is ensured.

Die Immobilisierung findet bevorzugt nicht durch Ausfällung durch Erniedrigung der Löslichkeit der zu immobilisierten Materialien statt. Stattdessen beruht die Immobilisierung auf biospezifischen Wechselwirkungen (Fang-Moleküle) oder Adsorption. Dies vermeidet weitgehend unspezifische Einschlüsse von Verunreinigungen.Immobilization preferably does not occur by precipitation by lowering the solubility of the materials to be immobilized. Instead, immobilization is based on biospecific interactions (capture molecules) or adsorption. This largely avoids nonspecific inclusions of contaminants.

Nach der Inkubation erfolgt die Abtrennung des biologischen Materials von der Flüssigkeit. Dies wird allgemein durch die Separation des an die magnetischen Partikel gebundenen Materials mit Hilfe eines Magnetfeldes erreicht. Beispielsweise können die Magnetpartikel an die Wand des Gefäßes, in welchem die Inkubation stattgefunden hatte, gezogen werden. Daraufhin kann die Flüssigkeit mit den Inhaltsstoffen der Probe, die nicht an die magnetischen Partikel gebunden wurden, entfernt werden. Diese Entfernung hängt von der Art des Gefäßes ab, in dem die Inkubation stattgefunden hat. Geeignete Verfahrensschritte sind Abpipettieren oder Absaugen der Flüssigkeit.After incubation, the separation of the biological material from the liquid. This is generally achieved by the separation of the material bound to the magnetic particles by means of a magnetic field. For example, the magnetic particles may be drawn to the wall of the vessel in which the incubation had taken place. Thereafter, the liquid may be removed with the ingredients of the sample that have not been bound to the magnetic particles. This distance depends on the type of vessel in which the incubation took place. Suitable process steps are pipetting off or aspirating the liquid.

Danach können die magnetischen Partikel gewünschtenfalls ein- oder mehrmal mit einer Waschlösung gereinigt werden. Die Waschlösung wird so gewählt, daß eine Ablösung des biologischen Materials von der Partikeloberfläche möglichst nicht stattfindet, jedoch nicht zu isolierende Verunreinigungen möglichst gut weggewaschen werden. Dieser Waschschritt findet bevorzugt durch Inkubation der Waschlösung mit den Partikeln statt, wobei bevorzugt eine Resuspension der Partikel vorgenommen wird, z. B. durch Schütteln oder Anlegung eines nicht mit dem ersten Magnetfeld identischen Magnetfeldes. Die verunreinigte Waschlösung wird bevorzugt genauso entfernt wie die Probe in dem oben genannten Schritt zur Bindung des biologischen Materials.Thereafter, if desired, the magnetic particles may be cleaned one or more times with a washing solution. The washing solution is chosen so that a detachment of the biological material from the particle surface does not take place as possible, but not to be isolated impurities are washed away as well as possible. This washing step preferably takes place by incubation of the washing solution with the particles, wherein preferably a resuspension of the particles is carried out, for. B. by shaking or applying a non-identical with the first magnetic field. The contaminated wash solution is preferably removed as well as the sample in the above-mentioned biological material binding step.

Im Anschluß an den letzten Waschschritt kann ein kurzer Trocknungsschritt der magnetischen Partikel im Vakuum oder durch Durchsaugen von Luft vorgenommen werden, wobei auch eine Vorbehandlung mit Aceton möglich ist.Following the last washing step, a short drying step of the magnetic particles can be carried out in vacuo or by sucking air, whereby pretreatment with acetone is also possible.

Das so gereinigte biologische Material kann, falls gewünscht, von den magnetischen Partikeln entfernt werden. Auch dieser Schritt richtet sich nach der Art der Bindung des biologischen Materials an die magnetischen Partikel. Für den Fall, daß es sich bei dem biologischen Material um native Nukleinsäuren und bei den magnetischen Partikeln um glasüberzogene Partikel handelt, kann die Nukleinsäure mittels eines Elutionspuffers mit niedrigem Salzgehalt von den erfindungsgemäßen Partikeln entfernt werden. Solche Puffer sind aus DE 3724442 und Analytical Biochemistry 175, 196–201 (1988) bekannt. Als Elu tionspuffer mit niedrigem Salzgehalt werden insbesondere Puffer mit einem Gehalt von weniger als 0,2 mol/l eingesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält der Elutionspuffer Tris. In einer anderen besonderen Ausführungsform handelt es sich bei dem Elutionspuffer um entmineralisiertes Wasser.The thus purified biological material may be removed from the magnetic particles if desired. This step also depends on the type of binding of the biological material to the magnetic particles. In the event that the biological material is native nucleic acids and the magnetic particles are glass-coated particles, the nucleic acid can be removed from the particles of the invention by means of a low salt elution buffer. Such buffers are out DE 3724442 and Analytical Biochemistry 175, 196-201 (1988). In particular, buffers having a content of less than 0.2 mol / l are used as the elution buffer with a low salt content. In a particularly preferred embodiment, the elution buffer contains Tris. In another particular embodiment, the elution buffer is demineralized water.

In einer weiteren Ausführungsform kann das beschriebene Reinigungs- und Isolierungsverfahren im Anschluß an eine immunomagnetische Separation von Zellen (z. B. virale Partikel oder prokariontische bzw. eukariontische Zellen) aus einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe erfolgen. Hierzu wird die Probe mit magnetischen Beads, an welche ein Antikörper gegen ein Antigen auf der Zelle immobilisiert ist, z. B. unter Schütteln inkubiert. Solche Beads können erfindungsgemäße Partikel sein, aber auch käufliche (z. B. MACS Microbeads der Firma Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, BRD). Nach Anlegen eines Magnetfeldes erfolgen ein oder mehrere Waschschritte mit einer salzhaltigen Waschlösung. Man erhält Partikel, an welche die gewünschten Zellen gebunden sind. Schließlich werden die gebundenen Zellen in einem salzhaltigen Puffer resuspendiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser salzhaltige Puffer eine chaotrope Salzlösung, so daß die in der Zelle vorhandenen Nukleinsäuren aus den Zellen freigesetzt werden.In a further embodiment, the described purification and isolation process may be carried out following an immunomagnetic separation of cells (eg viral particles or prokaryotic or eukaryotic cells) from a body fluid or a tissue. For this purpose, the sample with magnetic beads to which an antibody to an antigen is immobilized on the cell, for. B. incubated with shaking. Such beads may be particles according to the invention, but also commercially available (for example MACS microbeads from Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, FRG). After applying a magnetic field, one or more washing steps are carried out with a salt-containing washing solution. Particles are obtained to which the desired cells are bound. Finally, the bound cells are resuspended in a saline buffer. In a preferred embodiment, this saline buffer is a chaotropic saline solution so that the nucleic acids present in the cell are released from the cells.

Durch Kombination der oben beschriebenen Isolierung von Zellen mit der ebenfalls beschriebenen Isolierung von Nukleinsäuen, bevorzugt in ihrer nativen Form, an den erfindungsgemäßen magnetischen Partikeln, ergibt sich ein besonders vorteilhaftes Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus zellhaltigen Proben. Vorteil dieser Ausführungsform ist die mögliche Einfachheit (Single-Tube-Methode), hohe Sensitivität (besonders wichtig in der medizinischen Mikrobiologie und Onkologie) und die leichte Automatisierbarkeit.By combining the above-described isolation of cells with the likewise described isolation of nucleic acids, preferably in their native form, on the magnetic particles according to the invention, a particularly advantageous method results for the isolation of nucleic acids from cell-containing samples. Advantage of this embodiment is the possible simplicity (single-tube method), high sensitivity (particularly important in medical microbiology and oncology) and easy automation.

Die als Folge der beschriebenen Verfahren isolierten biologischen Materialien können nun in beliebiger Weise weiter verwendet werden. Beispielsweise können sie als Substrat für verschiedene enzymatische Reaktionen verwendet werden. Im Falle der Nukleinsäuren seien als Beispiel die Sequenzierung, die radioaktive oder nicht-radioaktive Markierung, die Amplifikation einer oder mehrerer in ihr enthaltender Sequenzen, die Transkription, die Hybridisierung mit markierten Sondennukleinsäuren, die Translation oder die Ligation genannt. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Abtrennung des biolo gischen Materials von der Flüssigkeit sehr einfach ist. Im Stand der Technik wurde zur Separierung von Glaspartikeln von Verunreinigungen entweder ein Zentrifugationsschritt angewandt, oder im Falle der Bindung des biologischen Materials an Glasfiberfilter die Flüssigkeit durch diese Flüssigkeit gesaugt. Hierbei handelt es sich um einen limitierenden Schritt, der die Verarbeitung von großen Probenzahlen behindert.The biological materials isolated as a result of the described methods can now be used in any manner. For example, they can be used as a substrate for various enzymatic reactions. Examples of nucleic acids which may be mentioned are sequencing, radioactive or non-radioactive labeling, amplification of one or more sequences contained therein, transcription, hybridization with labeled probe nucleic acids, translation or ligation. An advantage of the method according to the invention is that the separation of the biological material from the liquid is very simple. In the prior art either a centrifugation step was used to separate glass particles from impurities, or in the case of binding of the biological material to glass fiber filters, the liquid was drawn through this liquid. This is a limiting step that hinders the processing of large numbers of samples.

Mit den erfindungsgemäßen Partikeln ist eine effektivere Abtrennung der biologischen Materialien von Verunreinigungen möglich. Insbesondere können Inhibitoren für bestimmte enzymatische Reaktionen erfindungsgemäß in besonders gutem Umfang entfernt werden.With the particles according to the invention a more effective separation of the biological materials from impurities is possible. In particular, according to the invention, inhibitors for certain enzymatic reactions can be removed to a particularly good extent.

In 1 ist eine Isolierung von Nukleinsäuren aus einer zellhaltigen Probe schematisch dargestellt. Die Probe (Specimen), welche Zellen enthält, wird probenspezifisch so vorbehandelt, daß die Zellen, in denen die Nukleinsäuren nachgewiesen werden sollen, in geeigneter Form vorliegen. Hierzu gehört z. B. bei Proben, welchen Körperflüssigkeiten entnommen wurden, die Zugabe von Reagenzien, z. B. zur Verflüssigung von zähflüssigen Proben, z. B. Speichelproben. Der so vorbereiteten Probe wird in einem Gefäß ein an eine Festphase, bevorzugt an eine Perle (Bead) gebundener Antikörper zugegeben, welcher die Zelle erkennen und binden kann. Als geeignete Partner für den Antikörper haben sich beispielsweise Antigene auf der Zelloberfläche erwiesen. Die Spezifität des Antikörpers kann sich nach der Spezifität der zu lösenden Analyseaufgabe richten. Wenn es sich bei der Festphase um die Wand des Gefäßes handelt, werden die Zellen direkt an die Wand gebunden. Für den Fall, daß es sich bei den Festphasen um eine Perle handelt, werden diese durch geeignete Separationsmethoden von der Flüssigkeit separiert. Dies kann beispielsweise durch Filtration geschehen. Im Falle von magnetischen Perlen ist eine Abtrennung durch Anlegen eines Magnetfeldes an die Außenwand des Gefäßes möglich. Die separierten Zellen werden mit einer Flüssigkeit gewaschen, um Verunreinigungen, welche den Nachweis stören würden, mit dem die Zellen umgebenden Medium zu entfernen. Bevorzugt werden Bedingungen eingesetzt, bei denen die Zellen weder von der Festphase gelöst noch zerstört werden. Anschließend findet die Zerstörung der Zellen statt die sogenannte Lyse. Eine Möglichkeit ist durch die Behandlung der Zellen mit chaotropen Salzen gegeben. Andere Möglichkeiten sind die Einwirkung von Proteinasen und Detergenzien.In 1 an isolation of nucleic acids from a cell-containing sample is shown schematically. The specimen containing cells is pretreated in a sample-specific manner so that the cells in which the nucleic acids are to be detected are suitably present. This includes z. For example, in samples taken from body fluids, the addition of reagents, e.g. As for the liquefaction of viscous samples, for. B. saliva samples. The sample prepared in this way is added in a vessel to an antibody bound to a solid phase, preferably to a bead, which can recognize and bind the cell. For example, antigens on the cell surface have been found to be suitable partners for the antibody. The specificity of the antibody may depend on the specificity of the analytical task to be solved. If the solid phase is the wall of the vessel, the cells are bound directly to the wall. In the event that it is a solid in the solid phases, they are separated by suitable separation methods of the liquid. This can be done for example by filtration. In the case of magnetic beads, separation is possible by applying a magnetic field to the outer wall of the vessel. The separated cells are washed with a liquid to remove contaminants that would interfere with detection with the medium surrounding the cells. Conditions are preferably used in which the cells are neither dissolved nor destroyed by the solid phase. Subsequently, the destruction of the cells takes place the so-called lysis. One possibility is given by treating the cells with chaotropic salts. Other options are the action of proteinases and detergents.

Zu der Lysemischung werden in der bevorzugten Ausführungsform die erfindungsgemäßen Partikel zugegeben. Nach einer geeigneten Einwirkungszeit, die über die Beladung der Oberfläche mit Nukleinsäuren optimiert werden kann, werden die Partikel von der sie umgebenden Flüssigkeit, die weitere und nicht nachzuweisende Zellbestandteile enthält, getrennt. Dies geschieht wiederum bevorzugt durch Anlegen eines magnetischen Feldes mittels eines Magneten an der Gefäßwand.In the preferred embodiment, the particles according to the invention are added to the lysis mixture. After a suitable exposure time, via the loading of the surface with nucleic acids can be optimized, the particles are separated from the surrounding liquid containing other and non-detected cell components. This in turn is preferably done by applying a magnetic field by means of a magnet on the vessel wall.

Um eventuell noch anhaftende Verunreinigungen zu entfernen, wird bevorzugt mit einer Flüssigkeit gewaschen, die so ausgewählt wird, daß die zu bestimmenden Nukleinsäuren sich nicht von der Glasoberfläche ablösen. Zur Entfernung der Nukleinsäuren von der Glasoberfläche wird ein sogenannter Elutionspuffer zugegeben, der Reagenzbedingungen aufweist, unter denen sich die Nukleinsäuren von der Glasoberfläche lösen. Dies sind insbesondere Niedrigsalzbedingungen. Je nach beabsichtigter Weiterbehandlung der Nukleinsäuren kann die Flüssigkeit nun von den Partikeln getrennt und weiterbearbeitet werden. Es ist bevorzugt, diese Abtrennung bei anliegendem Magnetfeld vorzunehmen, so daß die Partikel separiert vorliegen.In order to remove any adhering impurities, it is preferred to wash with a liquid which is selected such that the nucleic acids to be determined do not detach from the glass surface. To remove the nucleic acids from the glass surface, a so-called elution buffer is added which has reagent conditions under which the nucleic acids detach from the glass surface. These are especially low salt conditions. Depending on the intended further treatment of the nucleic acids, the liquid can now be separated from the particles and further processed. It is preferred to carry out this separation in the applied magnetic field, so that the particles are present separated.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.The following examples illustrate the invention in more detail.

Beispiel 1example 1

Herstellung der erfindungsgemäßen magnetischen PartikelProduction of the magnetic particles according to the invention

Es wurden 6 verschiedene Sole verwendet. Die Herstellung der Sole wurde nach folgenden Schemata durchgeführt:6 different brine were used. The preparation of the brine was carried out according to the following schemes:

Sol 1 (SiO₂:B₂O₃ = 7:3):Sol 1 (SiO ₂ : B ₂ O ₃ = 7: 3):

Die Synthese wurde in einem 250 ml Rundkolben unter ständigem Rühren durchgeführt.
86,6 ml Tetraethylorthosilicat
+7 ml wasserfreies unvergälltes Ethanol
+14,1 ml 0,15 M HClThe synthesis was carried out in a 250 ml round bottom flask with constant stirring.
86.6 ml of tetraethyl orthosilicate
+7 ml of anhydrous undegelled ethanol
+14.1 ml of 0.15 M HCl

Es entsteht ein zweiphasiges Gemisch, welches bei Raumtemperatur solange gerührt wird, bis es einphasig wird. Danach erfolgt tropfenweise die Zugabe von
+37,8 ml Trimethylborat.
Anschließend wird das Sol Stunden bei 50°C gehalten. Danach erfolgt die Zugabe von
+14,1 ml 0,15 M HClThe result is a two-phase mixture, which is stirred at room temperature until it is single-phase. This is followed by the dropwise addition of
+37.8 ml trimethyl borate.
Subsequently, the sol is kept at 50 ° C for hours. Thereafter, the addition of
+14.1 ml of 0.15 M HCl

Sol 2 (SiO₂:B₂O₃ = 4:1):Sol 2 (SiO ₂ : B ₂ O ₃ = 4: 1):

Die Synthese wurde in einem 250 ml Rundkolben unter ständigem Rühren durchgeführt.
100,5 ml Tetraethylorthosilicat
+7 ml wasserfreies unvergälltes Ethanol
+16,3 mol 0,15 M HClThe synthesis was carried out in a 250 ml round bottom flask with constant stirring.
100.5 ml of tetraethyl orthosilicate
+7 ml of anhydrous undegelled ethanol
+16.3 moles of 0.15 M HCl

Es entsteht ein zweiphasiges Gemisch, welches bei Raumtemperatur solange gerührt wird, bis es einphasig wird. Danach erfolgt tropfenweise die Zugabe von + 25,6 ml Trimethylborat.
Anschließend wird das Sol 2 Stunden bei 50°C gehalten. Danach erfolgt die Zugabe von
+16,3 ml 0,15 M HClThe result is a two-phase mixture, which is stirred at room temperature until it is single-phase. This is followed by the dropwise addition of + 25.6 ml of trimethylborate.
Subsequently, the sol is kept at 50 ° C for 2 hours. Thereafter, the addition of
+16.3 mL of 0.15 M HCl

Sol 3 (SiO₂:B₂O₃ = 85:15):Sol 3 (SiO ₂ : B ₂ O ₃ = 85:15):

Die Synthese wurde in einem 250 ml Rundkolben unter ständigem Rühren durchgeführt.
107,8 ml Tetraethylorthosilicat
+7 ml wasserfreies unvergälltes Ethanol
+17,5 ml 0,15 M HCl The synthesis was carried out in a 250 ml round bottom flask with constant stirring.
107.8 ml of tetraethyl orthosilicate
+7 ml of anhydrous undegelled ethanol
+17.5 ml of 0.15 M HCl

Es entsteht ein zweiphasiges Gemisch, welches bei Raumtemperatur solange gerührt wird, bis es einphasig wird. Danach erfolgt tropfenweise die Zugabe von +19,4 ml Trimethylborat.
Anschließend wird das Sol 2 Stunden bei 50°C gehalten. Danach erfolgt die Zugabe von
+17,5 ml 0,15 M HClThe result is a two-phase mixture, which is stirred at room temperature until it is single-phase. This is followed by the dropwise addition of +19.4 ml of trimethylborate.
Subsequently, the sol is kept at 50 ° C for 2 hours. Thereafter, the addition of
+17.5 ml of 0.15 M HCl

Sol 4 (SiO₂:B₂O₃ = 4:1; 2 Mol% P₂O₅):Sol 4 (SiO ₂ : B ₂ O ₃ = 4: 1; 2 mol% P ₂ O ₅ ):

Die Synthese wurde in einem 250 ml Rundkolben unter ständigem Rühren durchgeführt.
100,5 ml Tetraethylorthosilicat
+7 ml wasserfreies unvergälltes Ethanol
+16,3 ml 0,15 M HClThe synthesis was carried out in a 250 ml round bottom flask with constant stirring.
100.5 ml of tetraethyl orthosilicate
+7 ml of anhydrous undegelled ethanol
+16.3 mL of 0.15 M HCl

Es entsteht ein zweiphasiges Gemisch, welches bei Raumtemperatur solange gerührt wird, bis es einphasig wird. Danach erfolgt tropfenweise die Zugabe von
+25,6 ml Trimethylborat
Anschließend wird das Sol Stunden bei 50°C gehalten. Danach erfolgt die Zugabe von
+16,3 ml 0,15 M HCl
+1,63 g P₂O₅ The result is a two-phase mixture, which is stirred at room temperature until it is single-phase. This is followed by the dropwise addition of
+25.6 ml trimethyl borate
Subsequently, the sol is kept at 50 ° C for hours. Thereafter, the addition of
+16.3 mL of 0.15 M HCl
+1.63 g P ₂ O ₅

Sol 5 (SiO₂:B₂O₃ = 4:1 Mol% Al₂O₃):Sol 5 (SiO ₂ : B ₂ O ₃ = 4: 1 mol% Al ₂ O ₃ ):

Es entsteht ein zweiphasiges Gemisch, welches bei Raumtemperatur solange gerührt wird, bis es einphasig wird. Danach erfolgt tropfenweise die Zugabe von
+25,6 ml Trimethylborat.
Anschließend wird das Sol 2 Stunden bei 50°C gehalten. Danach erfolgt die Zugabe von
+16,3 ml 0,15 M HCl
+3,06 g AlCl₃ The result is a two-phase mixture, which is stirred at room temperature until it is single-phase. This is followed by the dropwise addition of
+25.6 ml trimethyl borate.
Subsequently, the sol is kept at 50 ° C for 2 hours. Thereafter, the addition of
+16.3 mL of 0.15 M HCl
+3.06 g AlCl ₃

Sol 6 (SiO₂:B₂O₃ = 4:1 Mol% ZrO₂):Sol 6 (SiO ₂ : B ₂ O ₃ = 4: 1 mol% ZrO ₂ ):

Es entsteht ein zweiphasiges Gemisch, welches bei Raumtemperatur solange gerührt wird, bis es einphasig wird. Danach erfolgt tropfenweise die Zugabe von
+25,6 ml Trimethylborat
+5,15 ml Zirkon(IV)-proylat, 70 Gew.% Lsg in 1-Propanol
Anschließend wird das Sol 2 Stunden bei 50°C gehalten. Danach erfolgt die Zugabe von
+16,3 ml 0,15 M HClThe result is a two-phase mixture, which is stirred at room temperature until it is single-phase. This is followed by the dropwise addition of
+25.6 ml trimethyl borate
+5.15 ml of zirconium (IV) -proylate, 70% by weight of solution in 1-propanol
Subsequently, the sol is kept at 50 ° C for 2 hours. Thereafter, the addition of
+16.3 mL of 0.15 M HCl

Nach weiteren 2 Stunden bei 50°C wurde in jeweils 150 ml der Sole 22,5 g Iriodin 600 (Black Mica) eingerührt und anschließend mit einem Sprühtrockner (Büchi 190, Mini Spray Dryer) beschichtet. Die Düsentemperatur des Sprühtrockners betrug 134°C.After a further 2 hours at 50 ° C., 22.5 g Iriodin 600 (Black Mica) were stirred into 150 ml each of the brine and then coated with a spray dryer (Büchi 190, Mini Spray Dryer). The nozzle temperature of the spray dryer was 134 ° C.

Das durch den Sprühtrockenprozeß erhaltene Pulver wurde anschließend einer Temperaturbehandlung unter Stickstoffatmosphäre (90 l/h) unterzogen. Die Aufheizgeschwindigkeit betrug hierbei 1 k/min und die Haltezeit betrug 2 Stunden bei der erreichten Maximaltemperatur. Diese Temperatur lag bei der Beschichtung mit Sol 1 bei 750°C, bei der Beschichtung mit Sol 2 bei 860°C und bei den übrigen Beschichtungen bei 800°C. Nach dem Sinterprozeß wurde der Ofen abgeschaltet und das Pulver auf Raumtemperatur abgekühlt.The powder obtained by the spray-drying process was then subjected to a temperature treatment under a nitrogen atmosphere (90 l / h). The heating rate was 1 k / min and the holding time was 2 hours at the maximum temperature reached. This temperature was 750 ° C. for the coating with Sol 1, 860 ° C. for the coating with Sol 2 and 800 ° C. for the other coatings. After the sintering process, the furnace was turned off and the powder cooled to room temperature.

Claims

Use of magnetic particles for isolating nucleic acids, said particles having an outer glass surface which is pore-free or has pores of a diameter of less than 10 nm, a particle size of less than 100 μm and an inner core enclosed by an outer glass surface ,

Use according to claim 1, characterized in that the particles are ferromagnetic particles.

Use according to claim 1 or 2, characterized in that the particles have a particle size of between 10 and 50 microns.

Use according to one of claims 1 to 3, characterized in that any pores present in the surface have a diameter of less than 1 nm.

Use according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the inner core is an iron core.

Use according to any one of claims 2 to 5, characterized in that the ferromagnetic material is magnetite (Fe ₃ O ₄ ) or Fe ₂ O ₃ .

Use according to one of claims 1 to 6, characterized in that the particles are produced by a gel-sol process.

Use according to one of claims 1 to 7, characterized in that the particles have a glass coating without capture molecules.

Use according to any one of claims 1 to 8, characterized in that the particles are designed for direct binding native nucleic acids to the glass surface.