DE19548301C1 - Inhibiting signal mols. involved in plant-microbial pathogen interaction - Google Patents

Inhibiting signal mols. involved in plant-microbial pathogen interaction

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Abstract

Inhibition of signal mol. (A) of pathogens in plant-microbe interactions uses binding or catalytic antibodies (Ab) or Ab-like proteins. Also claimed is pathogen-resistant transgenic plant contg. the genetic information (B) for producing Ab or Ab-like proteins directed against (A) or their structural features.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inhibition von Signalmolekülen, die zwischen ein- und/oder vielzelligen Organismen ausgetauscht werden, speziell von Signalmolekülen von Pathogenen durch bindende oder katalytische Antikörper, d. h. von Signalmolekülen in Pflanze-Bakterien-Interaktionen oder anderen Wirt-Pathogen-Interaktionen. Unter Interaktionen zwischen zwei Organismen wird dabei sowohl die Wechselwirkung als auch die Kommunikation untereinander verstanden.The invention relates to a method for inhibiting Signal molecules between single and / or multicellular Organisms are exchanged, especially by signaling molecules Pathogens from binding or catalytic antibodies, i.e. H. of signaling molecules in plant-bacterial interactions or other host-pathogen interactions. Under interactions the interaction between two organisms as well as the communication between them.

Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Landwirtschaft, insbesondere die Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten, aber auch die Human- und Veterinärmedizin.Field of application of the invention is agriculture, especially the control of plant diseases, but also human and veterinary medicine.

Weltweit geht Jahr für Jahr ein großer Teil der Ernte durch Pflanzenkrankheiten verloren. Die Verluste insbesondere durch bakterielle Erkrankungen, u. a. von Kartoffeln, Mais, Reis und Getreide, sind erheblich. Sie betrugen z. B. im Jahre 1980 bei Infektionen von Kartoffeln durch das Bakterium Erwinia carotova weltweit ca. 100 Mio $. Die dadurch bedingten Ausfälle liegen im mittleren Europa bei ca. 1-3%, in tropischen und subtropischen Klimazonen bei 30-100%.Worldwide, a large part of the harvest goes through year after year Plant diseases lost. The losses in particular through bacterial diseases, u. a. of potatoes, corn, rice and Cereals are substantial. They were e.g. B. in 1980 Infections of potatoes by the Erwinia carotova bacterium approximately $ 100 million worldwide. The resulting failures are in the Central Europe around 1-3%, in tropical and subtropical Climate zones at 30-100%.

Die von Bakterien ausgelösten Pflanzenkrankheiten sind meist durch klassische Züchtung nicht bekämpfbar, da es fast keine Resistenzmerkmale gibt. Insbesondere gilt dies für die Kartoffel sowie viele Gemüsearten oder z. B. Reis.The plant diseases caused by bacteria are mostly not combatable by classic breeding, since there is almost none Resistance characteristics exist. This applies in particular to the potato as well as many types of vegetables or z. B. Rice.

Für die Entstehung von bakteriell bedingten Pflanzenkrankheiten ist folgender Ablauf nachgewiesen: Pflanzeninfizierende Bakterien dringen in Verwundungsstellen im Pflanzengewebe ein und vermehren sich dort, bevor sie Krankheitssymptome hervorrufen. Im Fall des Bakteriums Erwinia corotovora ist gezeigt worden, daß die zellwandabbauenden Enzyme, die letztendlich für die Ausbildung der Krankheitssymptome verantwortlich sind, generell nur auf niedrigem Niveau hergestellt werden. Ebenso wird vom Bakterium ein Molekül der Substanzklasse Homoserinlacton (HSL) produziert. Das HSL dient dem Bakterium als Signalmolekül, um die aktuelle Dichte der Bakterienpopulation im Habitat zu erfassen. Nur wenn ausreichend hohe Bakterienzahlen vorhanden sind und eine Grenzkonzentration des HSL erreicht wird, so wird die Kaskade der zellwandabbauenden Enzyme schlagartig sehr stark induziert und das Pflanzengewebe dadurch massiv abgebaut. Dem HSL aus Erwinia carotovora sehr eng verwandte Substanzen mit gleicher Grundstruktur sind mittlerweile in einer Reihe anderer Bakterien nachgewiesen worden. Eine Verhinderung der Ansammlung dieses Moleküls in den Zellzwischenräumen der Pflanzen wird zur Unterbindung der Pathogenität des Bakteriums und der Ausbildung von Krankheitssymptomen führen.For the emergence of bacterial plant diseases the following process has been demonstrated: Plant infectious Bacteria invade wound sites in plant tissue and multiply there before showing symptoms of illness cause. In the case of the Erwinia corotovora bacterium have been shown that the cell wall degrading enzymes that ultimately for the development of the disease symptoms are generally responsible only at a low level getting produced. Likewise, a molecule of the bacterium  Substance class homoserine lactone (HSL) produced. The HSL serves the bacterium as a signaling molecule to determine the current density of the Bacterial population in the habitat. Only if sufficient high bacterial numbers are present and a limit concentration of the HSL is reached, the cascade of abruptly induced cell wall degrading enzymes and this massively degrades the plant tissue. The Erwinia HSL carotovora very closely related substances with the same The basic structure is now in a number of other bacteria has been demonstrated. A prevention of the accumulation of this Molecule in the cells between the plants becomes Eliminating the pathogenicity of the bacteria and the training of disease symptoms.

Antibakterielle Resistenzstrategien mit gentechnischen Methoden sind bisher noch wenig untersucht. Insgesamt läßt sich feststellen, daß eine erfolgreiche spezifische Bekämpfung von bestimmten bakteriell bedingten Pflanzenkrankheiten bis heute noch nicht gelungen ist. Bisher konnte nur eine Unspezifische, generell gegen Bakterien gerichtete Resistenz durch gentechnische Veränderung von Pflanzen erreicht werden. Diese Resistenz wird durch Lyse der eingedrungenen Bakterien bewirkt.Antibacterial resistance strategies using genetic engineering methods have so far been little investigated. Overall, find that successful specific control of certain bacterial plant diseases until today has not yet succeeded. So far, only an unspecific, generally resistance to bacteria genetic modification of plants can be achieved. This Resistance is brought about by lysis of the invading bacteria.

Ziel der Erfindung ist die Inhibition von Signalmolekülen in Interaktionen zwischen zwei Organismen, speziell in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zur Bekämpfung von bakteriellen Pflanzenkrankheiten. Die Erfindung hat u. a. die Aufgabe, Signalmoleküle in Pflanzen, die für die Induktion der Pathogenitätsfaktoren von phytopathogenen Bakterien verant­ wortlich sind, durch bindende oder katalytische Antikörper zu inhibieren.The aim of the invention is the inhibition of signal molecules in Interactions between two organisms, especially in Plant-pathogen interactions to combat bacterial Plant diseases. The invention has u. a. the task, Signaling molecules in plants that are used for the induction of Pathogenicity factors of phytopathogenic bacteria responsible are literal, by binding or catalytic antibodies inhibit.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Der Grundgedanke besteht darin, Signalmoleküle, die zwischen ein- und vielzelligen Organismen ausgetauscht werden, speziell Signalmoleküle von Pathogenen, durch bindende oder katalytische Antikörper zu inhibieren. Im Falle von Pflanze/Mikroorganismus-Interaktionen wird die genetische Information von bindenden oder katalytischen Antikörpern gegen Signalmoleküle oder deren wesentliche Strukturmerkmale in Pflanzenteile transformiert, danach werden transgene Pflanzen mit Pathogenresistenz gezüchtet. Ein bevorzugtes Signalmolekül in solchen Interaktionen ist HSL. Es genügt auch, Antikörper gegen wesentliche Strukturmerkmale des HSL bzw. gegen den zugrundeliegenden Homoserinlactonring einzusetzen.The invention is implemented according to the claims. Of the The basic idea is to have signaling molecules that are exchanged between single and multicellular organisms, specifically signaling molecules from pathogens, through binding or to inhibit catalytic antibodies. In case of Plant / microorganism interactions will genetic information from binding or catalytic  Antibodies to signaling molecules or their essentials Structural features are transformed into parts of plants, afterwards grown transgenic plants with pathogen resistance. On preferred signal molecule in such interactions is HSL. It it is also sufficient to use antibodies against essential structural features of the HSL or against the underlying homoserine lactone ring to use.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Inhibierung durch Antikörper-ähnliche Proteine, d. h. Proteine, bei denen hypervariable Regionen (CDRs), die die Spezifität eines Antikörpers ausmachen, auf ein anderes, stabiles Proteingrundgerüst übertragen worden sind.The invention also relates to inhibition by Antibody-like proteins, i.e. H. Proteins where hypervariable regions (CDRs) that reflect the specificity of a Make out antibody to another, stable Protein scaffolding have been transferred.

Zum Umfang der Erfindung gehören auch pathogenresistente transgene Pflanzen, die nach Transformation der Zellen mit dem genetischen Material gezüchtet worden sind.The scope of the invention also includes pathogen-resistant transgenic plants, which after transformation of the cells with the genetic material has been grown.

Das Verfahren zur Züchtung der pathogenresistenten transgenen Pflanzen erfolgt in folgenden Schritten:The process of growing the pathogen-resistant transgenic Planting is done in the following steps:

  • 1. Herstellung von Anti-HSL-Antikörpern1. Production of anti-HSL antibodies
  • 2. Isolierung der genetischen Informationen für Anti-HSL-Antikörper2. Isolation of genetic information for Anti-HSL antibodies
  • 3. Gentransfer in Pflanzenzellen3. Gene transfer in plant cells
  • 4. Züchtung der Pflanze.4. Breeding the plant.

Dieses Verfahren wird im folgenden näher erläutert:This process is explained in more detail below:

Antikörper werden durch Selektion aus durch Fusion hergestellten Hybridomakulturen von immunisierten Mäusen bzw. durch Selektion in Phage Display Verfahren isoliert. Die Selektion bindender Antikörper erfolgt mit dem Antigen (dem zu inhibierenden Signalmolekül) und wird auf höchste Affinität zum Antigen ausgelegt. Katalytische Antikörper werden durch Selektion mit aus der Degradationsreaktion (z. B. Ringöffnungsreaktion für Homoserinlacton) abgeleiteten Übergangszustand-analogen organischen Molekülen als Antigen isoliert. Hierbei erfolgt die Selektion auf möglichst effektiven Abbau des Antigens. Antibodies are produced by selection from fusion Hybridoma cultures of immunized mice or by selection isolated in phage display process. The selection is more binding Antibody occurs with the antigen (the one to be inhibited Signal molecule) and becomes highly affinity for the antigen designed. Catalytic antibodies are selected by using from the degradation reaction (e.g. ring opening reaction for Homoserine lactone) derived transition state analog organic molecules isolated as antigen. This is where the Selection for the most effective degradation of the antigen.  

Aus den Hybridomen wird durch Isolierung der Gesamt- und daraus der mRNA und deren Umschreiben in cDNA die korrespondierende DNA-Sequenz für die monoklonalen Antikörper erhalten. Aus dem Phage Display Verfahren steht direkt das selektierte Antikörper-Gen in Form eines einkettigen Antikörpers durch Ausschneiden aus dem Phagenplasmid zur Verfügung.The hybridomas are isolated by isolating the whole and from it the corresponding mRNA and its rewriting in cDNA Obtained DNA sequence for the monoclonal antibodies. From the The selected antibody gene is directly available in the phage display method in the form of a single-chain antibody by cutting it out the phage plasmid.

Die Gene für vollständige monoklonale Antikörper bzw. das Gen für einen einkettigen Antikörper werden unter der Kontrolle eines (bzw. zweier) in Pflanzen aktiver Promotoren in einen Pflanzentransformationsvektor kloniert. Um den Transport des Antikörpers in der transgenen Pflanze in die Interzellularräume zu ermöglichen, wird an das 5′-Ende jeweils eine DNA, die für ein Signalpeptid codiert, angehängt. Diese kann aus der Maus selbst oder aus einem anderen Organismus stammen. Der fertige Vektor enthält alle in die Pflanzen zu transferierende DNA-Sequenzen. Daraus werden die notwendigen Gene in Pflanzen transferiert. Alternativ können die beiden Gene eines monoklonalen Antikörpers auch getrennt in zwei Pflanzentransformationsvektoren eingebaut, getrennt in Pflanzen transferiert und später durch Kreuzung zusammengeführt werden.The genes for complete monoclonal antibodies or the gene for a single chain antibody will be under control one (or two) promoters active in plants into one Cloned plant transformation vector. To transport the Antibody in the transgenic plant in the intercellular spaces To allow, is at the 5'-end a DNA that is for encoded a signal peptide. This can be done from the mouse themselves or from another organism. The finished one Vector contains all to be transferred to the plants DNA sequences. This turns the necessary genes into plants transferred. Alternatively, the two genes can be one monoclonal antibody also separated into two Plant transformation vectors built in, separated into plants transferred and later merged by crossing.

Die Transformation von Pflanzen kann mit allen geeigneten Verfahren (z. B. mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens oder durch direkten Gentransfer oder mit Hilfe der Partikelkanone) durchgeführt werden.The transformation of plants can be done with any suitable Method (e.g. using Agrobacterium tumefaciens or by direct gene transfer or with the help of the particle gun) be performed.

Der Einbau der Antikörper-Gene in der transgenen Pflanze wird durch geeigneten Restriktionsverdau der isolierten genomischen Pflanzen-DNA und nachfolgende Southern Hybridisierung analysiert und nachgewiesen. Die Transkription der Gene in mRNA wird vom Northern Blot nachgewiesen. Die Translation der Gene in aktives Protein wird durch Western Blot und durch verschieden aufgebaute ELISA-Tests untersucht und nachgewiesen. Das Vorhandensein des Proteins und dessen biologische Aktivität kann dadurch bewiesen werden. The incorporation of the antibody genes into the transgenic plant will by suitable restriction digestion of the isolated genomic Plant DNA and subsequent Southern hybridization analyzed and proven. The transcription of the genes in mRNA is from Northern blot detected. The translation of the genes into active Protein is made up by Western blot and by different types ELISA tests examined and verified. The presence of the Proteins and their biological activity can be proven will.  

Der biologische Effekt des in der Pflanze exprimierten Antikörpers wird auf molekularer und phytopathologischer Ebene nachgewiesen. Die Bindung bzw. der katalytische Abbau des Signalmoleküls kann in einem in vitro System (Inkubation von Pathogen mit dem gereinigten Antikörper) durch Nachweis der verbleibenden freien Konzentration von Signalmolekül bewiesen werden. Darüberhinaus kann der Nachweis durch die Inhibition der biologischen Funktion des Signalmoleküls in einem in vivo Experiment erfolgen.The biological effect of that expressed in the plant Antibody becomes molecular and phytopathological proven. The binding or catalytic degradation of the Signal molecule can in an in vitro system (incubation of Pathogen with the purified antibody) by detection of the proven free concentration of signaling molecule will. In addition, the detection by inhibiting the biological function of the signaling molecule in an in vivo Experiment.

Die selben Experimente werden mit aus der transgenen Pflanze extrahiertem Antikörper durchgeführt, um die Gleichartigkeit der Wirkungsweise zu belegen.The same experiments are carried out with the transgenic plant extracted antibody performed to ensure the uniformity of the Evidence of effectiveness.

Als abschließender Beweis für die Funktionalität der Antikörper in der Pflanze wird die gesteigerte Resistenz der transgenen Pflanze nach Infektion mit dem Pathogen nachgewiesen. Dazu werden geeignete Pflanzenexplantate oder ganze Pflanzen mit dem Pathogen infiziert und der Krankheitsverlauf nachverfolgt. Im Vergleich zur Kontrollpflanze, die den Antikörper nicht herstellt, muß eine reduzierte Anfälligkeit festgestellt werden.As final proof of the functionality of the antibodies in the plant the increased resistance of the transgenic Plant detected after infection with the pathogen. To suitable plant explants or whole plants with the Pathogen infected and the course of the disease followed. in the Comparison to the control plant that does not have the antibody manufactures, a reduced susceptibility must be determined.

Dadurch wird erstmalig ermöglicht, in die Signalkette zwischen Pflanzenwirt und pathogenem Bakterium einzugreifen. Die bindenden oder katalytischen Antikörper werden in den neu gezüchteten transgenen Pflanzen während des Wachstums exprimiert und in deren Interzellularräume transportiert. Eine Anwendung kann für alle Pflanzenkrankheiten erfolgen, insbesondere bei denen, bei denen HSL eine Signalmolekülrolle spielt. Das ist u. a. bei Pflanzeninfektionen durch Bakterien der Gattungen Erwinia, Pseudomonas und Xanthomonas der Fall.This enables for the first time in the Signal chain between plant host and pathogenic bacterium intervene. The binding or catalytic antibodies will in the newly grown transgenic plants during growth expressed and transported in their intercellular spaces. A Can be used for all plant diseases especially those where HSL plays a signaling molecule role plays. That is u. a. for bacterial plant infections of the genera Erwinia, Pseudomonas and Xanthomonas the case.

Die Bakterien werden dabei nicht abgetötet, aber eine Pathogenität unterbunden und damit die Vermehrung mangels Nährstoffen sehr stark eingeschränkt, so daß keine Krankheitssymptome mehr auftreten können.The bacteria are not killed, but one is Pathogenicity prevented and thus the multiplication for lack Very limited nutrients, so none Disease symptoms may appear more.

Claims (9)

1. Inhibition von Signalmolekülen von Pathogenen in Pflanze/Mikroorganismus-Interaktionen durch bindende oder katalytische Antikörper bzw. durch Antikörper-ähnliche Proteine.1. Inhibition of signaling molecules by pathogens in Plant / microorganism interactions through binding or catalytic antibodies or by antibody-like proteins. 2. Inhibition von Signalmolekülen in Pflanze/Mikroorganismus-Interaktionen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Information von bindenden oder katalytischen Antikörpern gegen Signalmoleküle oder deren wesentliche Strukturmerkmale in Pflanzenzellen transformiert wird und auf der Basis dieser Zellen transgene Pflanzen gezüchtet werden.2. Inhibition of signaling molecules in plant / microorganism interactions according to claim 1, characterized in that the genetic information from binding or catalytic Antibodies to signaling molecules or their essentials Structural features in plant cells are transformed and based on transgenic plants are grown based on these cells. 3. Inhibition des Signalmoleküls HSL in Pflanze/Mikroorganismus-Interaktionen nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Information von bindenden oder katalytischen Antikörpern gegen HSL oder dessen wesentliche Strukturmerkmale in Pflanzenzellen transformiert wird und auf der Basis dieser Zellen transgene Pflanzen gezüchtet werden.3. Inhibition of the signaling molecule HSL in plant / microorganism interactions according to claim 1 to 2, characterized in that the genetic information of binding or catalytic Antibodies against HSL or its essential structural features is transformed in plant cells and based on this Cells transgenic plants are grown. 4. Inhibition des Signalmoleküls HSL in Pflanze/Mikroorganismus-Interaktionen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Information von bindenden oder katalytischen Antikörpern gegen den Homoserinlactonring oder dessen Derivate in Pflanzenzellen transformiert wird und auf der Basis dieser Zellen transgene Pflanzen gezüchtet werden.4. Inhibition of the signaling molecule HSL in plant / microorganism interactions according to claim 1 to 3, characterized in that the genetic information of binding or catalytic Antibodies against the homoserine lactone ring or its derivatives is transformed in plant cells and based on this Cells transgenic plants are grown. 5. Pathogenresistente transgene Pflanzen, enthaltend die genetische Information von bindenden oder katalytischen Antikörpern oder von Antikörper-ähnlichen Proteinen gegen bei der Interaktion der Pflanze mit Mikroorganismen entstehende Signalmoleküle oder deren wesentliche Strukturmerkmale.5. Pathogen-resistant transgenic plants containing the genetic information from binding or catalytic Antibodies or of antibody-like proteins against the interaction of the plant with microorganisms Signal molecules or their essential structural features. 6. Pathogenresistente transgene Pflanzen nach Anspruch 5, enthaltend die genetische Information von bindenden oder katalytischen Antikörpern oder von Antikörper-ähnlichen Proteinen gegen bei der Interaktion der Pflanze mit Mikroorganismen entstehendes HSL oder dessen wesentliche Strukturmerkmale.6. pathogen-resistant transgenic plants according to claim 5, containing the genetic information of binding or catalytic antibodies or antibody-like  Proteins against when the plant interacts with Microorganisms arising HSL or its essential Structural features. 7. Pathogenresistente transgene Pflanzen nach Anspruch 5 und 6, enthaltend die genetische Information von bindenden oder katalytischen Antikörpern oder von Antikörper-ähnlichen Proteinen gegen bei der Interaktion der Pflanze mit Mikroorganismen entstehende Homoserinlactonring-Derivate.7. pathogen-resistant transgenic plants according to claim 5 and 6, containing the genetic information of binding or catalytic antibodies or antibody-like Proteins against when the plant interacts with Microorganisms resulting homoserine lactone ring derivatives. 8. Verfahren zur Züchtung von pathogenresistenten transgenen Pflanzen, gekennzeichnet durch folgende Schritte:
  • - Herstellung von bindenden oder katalytischen Antikörpern oder von Antikörper-ähnlichen Proteinen gegen Signalmoleküle von Pflanze/Mikroorganismus-Inter­ aktionen oder deren wesentliche Strukturmerkmale,
  • - Isolierung der genetischen Information für diese Antikörper,
  • - Transfer dieser Information in Pflanzen und
  • - Züchtung der Pflanze bis zur Erbbeständigkeit.
8. Process for the cultivation of pathogen-resistant transgenic plants, characterized by the following steps:
  • Production of binding or catalytic antibodies or of antibody-like proteins against signal molecules of plant / microorganism interactions or their essential structural features,
  • Isolation of the genetic information for these antibodies,
  • - Transfer this information into plants and
  • - Cultivation of the plant until hereditary stability.
9. Anwendung von bindenden oder katalytischen Antikörpern oder von Antikörper-ähnlichen Proteinen, die gegen die Expression von Pathogenitätsfaktoren regulierende Moleküle gerichtet sind, in Wirt-Pathogen-Interaktionen bei Pflanzen.9. Application of binding or catalytic antibodies or of antibody-like proteins that act against the expression of Molecules regulating pathogenicity are addressed in Host-pathogen interactions in plants.
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