DE19540105C1

DE19540105C1 - Compsn. contg. synthetic peptide(s) reactive with hepatitis C related antibodies

Info

Publication number: DE19540105C1
Application number: DE1995140105
Authority: DE
Inventors: Barbara Hosein; Chang Yi Wang
Original assignee: United Biomedical Inc
Current assignee: United Biomedical Inc
Priority date: 1995-09-19
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2015-10-28
Also published as: NL1005557A1; NL1005556C2; NL1005556A1; NL1002149C2; NL1005557C2

Abstract

A novel peptide compsn. comprises at least one linear or branched peptide (A) of formulae: P1-Y; P2-X; P4X2X; P8X4X2X; or P16X8X4X2X; Y = COOH or CONH2 at the peptide C terminus; X = residues of amino acids (aa), or analogues with 2 amino gps. and one COOH gp., each gp. able to form a peptide bond; P = peptide that is specifically immunoreactive with Hepatitis C Virus (HCV) antibodies and has any one of 11 sequences (given in the specification).

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptidzusammensetzungen, die sich spezifisch zur Diagnose von Hepatitis C Virus (HCV)-Infektionen eignen. Insbesondere betrifft die Erfindung synthetische Peptide, die mindestens eine antigene Determinante (Epitop) enthalten, die zum Nachweis von HCV-assoziierten Antikörpern in Patienten nach Immunoassay-Methoden wirksam sind, sowie verbesserte Peptidgemische zum Nachweis von HCV Antikörpern. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Peptidzusammensetzungen in Immunoassay-Kits zum Nachweis von HCV-Infektionen.The invention relates to new peptide compositions which are specific for the diagnosis of Hepatitis C virus (HCV) infections are suitable. In particular, the invention relates synthetic peptides that have at least one antigenic determinant (epitope) included for the detection of HCV-associated antibodies in patients after immunoassay methods are effective, as well as improved peptide mixtures for the detection of HCV antibodies. The invention further relates to the use of this Peptide compositions in immunoassay kits for the detection of HCV infections.

Durch HCV hervorgerufene Non-A, Non-B-Hepatitis (NANBH) ist die häufigste Form der Post-Transfusions-Hepatitis. Deshalb besteht ein dringender Bedarf nach empfindlichen und spezifischen diagnostischen Nachweisverfahren, um unter potentiellen Blutspendern und anderen Personen Träger des Virus identifizieren zu können, die die Krankheit übertragen könnten. Es sind deshalb genaue Nachweisverfahren erforderlich, um infiziertes Blut und Blutprodukte aus Spenderblut mit hoher Sicherheit aussondern zu können.HCV-induced non-A, non-B hepatitis (NANBH) is the most common Form of post-transfusion hepatitis. Therefore there is an urgent need according to sensitive and specific diagnostic detection methods in order to among potential blood donors and other people carriers of the virus identify who could transmit the disease. It is because of that exact detection procedures required to identify infected blood and blood products To be able to separate donor blood with a high degree of certainty.

Das ätiologische Agens HCV wurde von mehreren Gruppen kloniert und identifiziert; vgl. Houghton et al., EP-B 0 318 216, Okamoto et al. (1990) Jpn. J. Exp. Med. 60: 167, Houghton et al., EP-A 0 388 232, und Kato et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524; Arima et al. (1989a) Gastroenterologia Japonica 24: 540; Reyes et al. (1990) Science 247: 1335; Arima et al. (1989b) Gastroenterologia Japonica 24: 545; Maeno et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 2685.The etiological agent HCV was cloned by several groups and identified; see. Houghton et al., EP-B 0 318 216, Okamoto et al. (1990) Jpn. J. Exp. Med. 60: 167, Houghton et al., EP-A 0 388 232, and Kato et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524; Arima et al. (1989a) Gastroenterology Japonica 24: 540; Reyes et al. (1990) Science 247: 1335; Arima et al. (1989b) Gastroenterologia Japonica 24: 545; Maeno et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 2685.

Das HCV-Genom hat eine Länge von etwa 10 Kilobasen (kb) und kodiert für ein einziges Polyprotein, das zu Strukturproteinen und Nicht-Strukturproteinen prozessiert wird. Ausgehend vom Amino-Terminus schließt das Polyprotein die Kapsid- und Hüllproteine des Strukturbereichs und die NS-1- bis NS-5-Proteine des Nicht-Strukturbereichs ein.The HCV genome is about 10 kilobases (kb) long and encodes one the only polyprotein that leads to structural proteins and non-structural proteins is processed. Starting from the amino terminus, the polyprotein closes the Capsid and envelope proteins of the structural region and the NS-1 to NS-5 proteins of the non-structure area.

Viele der antigenen Bereiche von HCV sind identifiziert worden. Peptide und rekombinante Proteine aus diesen Bereichen zeigen einen unterschiedlichen Grad an Empfindlichkeit und Selektivität beim Nachweis und der Diagnose von HCV- Trägern. Es wurde über antigene Bereiche in jedem großen HCV-Protein berichtet. Einen Überblick über viele identifizierte antigene Bereiche und einige Peptide geeignet zum Nachweis von HCV gibt die Deutsche Patentanmeldung (09.01.1995) DE 195 00 394.2-41. Kürzlich ist über zusätzliche Peptide und/oder antigene Stellen im Kernprotein berichtet worden; Kern-Reste 1-84 und 9-177; US-PS 5,350,671 und im NS-3-Protein (PCT/US 94/07088; WO 93/09253; EP-A 0 388 232). Hosein et al. identifizierte ein NS-3 Konformationsepitop bei den Resten 1378-1459; vgl. PCT/US 94/07088. Anm.: Das hier verwendete Aminosäurenummerierungssystem entspricht dem für das HCV-1 Polyprotein verwendeten Nummerierungssystem.Many of the antigenic areas of HCV have been identified. Peptides and recombinant proteins from these areas show different degrees sensitivity and selectivity in the detection and diagnosis of HCV Carriers. It has been found to have antigenic areas in every major HCV protein reported. An overview of many identified antigenic areas and some The German patent application gives peptides suitable for the detection of HCV (09/01/1995) DE 195 00 394.2-41. Recently about additional peptides and / or antigenic sites in the core protein have been reported; Core residues 1-84 and 9-177; U.S. Patent 5,350,671 and in NS-3 protein (PCT / US 94/07088; WO 93/09253; EP-A 0 388 232). Hosein et al. identified an NS-3 conformation epitope in the Residues 1378-1459; see. PCT / US 94/07088. Note: The one used here Amino acid numbering system corresponds to that for the HCV-1 polyprotein numbering system used.

Zur Kartierung antigener Determinanten (Epitope) innerhalb bestimmter antigener Bereiche von HCV wurden serologische Analysen durchgeführt; vgl. Wang (1992), US-PS 5,106,726; PCT/US 93/08638, PCT/US 94/07088 und Deutsche Patentanmeldung DE 195 00 394.2-41. Bei diesen Kartierungsuntersuchungen wurden synthetische Peptide verwendet, um gut charakterisierte HCV-Serumproben zu untersuchen, und sie gestatteten die Identifizierung von besonders immunoreaktiven antigenen Bereichen von HCV sowie die Identifizierung einiger Peptidgemische, die für den Nachweis von HCV-Antikörpern geeignet sind. Jedoch weisen die Tests, die diese Peptide verwenden, nicht immer bekannte HCV-Antikörper-enthaltende Seren nach. Darüberhinaus geben solche Tests gelegentlich falsch-positive Ergebnisse für den HCV-Antikörper-Nachweis (verursachen nicht notwendiges Entfernen von Donorblut aus Blutbanken).For mapping antigenic determinants (epitopes) within certain antigenic Areas of HCV have been serologically analyzed; see. Wang (1992), U.S. Patent 5,106,726; PCT / US 93/08638, PCT / US 94/07088 and Germans Patent application DE 195 00 394.2-41. In these mapping studies synthetic peptides have been used to characterize well To examine HCV serum samples and they allowed the identification of particularly immunoreactive areas of HCV antigen as well Identification of some peptide mixtures required for the detection of HCV antibodies are suitable. However, the tests show these peptides use, not always known HCV antibody-containing sera. In addition, such tests occasionally give false positive results for HCV antibody detection (cause unnecessary removal of Donor blood from blood banks).

Die vorliegende Erfindung überwindet viele dieser Nachteile durch Identifizieren von neuen Peptidzusammensetzungen einschließlich neuer Peptide und Gemische von Peptiden.The present invention overcomes many of these disadvantages by identification of new peptide compositions including new peptides and mixtures of peptides.

Die Erfindung betrifft eine Peptidzusammensetzung umfassend mindestens ein lineares oder mindestens ein verzweigtes Peptid der allgemeinen FormelThe invention relates to a peptide composition comprising at least one linear or at least one branched peptide of the general formula

(Peptid)-Y
(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂X(Peptide) -Y
(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂X

in der Y eine COOH- oder CONH₂- Gruppe am Carboxy-Terminus des (Peptids) ist und X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäure-Analogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden. Erfindungsgemäß ist der Peptidrest (Peptid) spezifisch immunoreaktiv mit HCV-assoziierten Antikörpern und umfaßt eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe SEQ ID NOS: 37 bis 47 (vgl. die Tabellen 1, 3, 5 und 8) oder eines der Peptide der allgemeinen Formeln V-IX, die spezielle Substitutionen und/oder degenerierte Positionen enthalten, wie sie nachstehend in der Beschreibung erläutert sind. Bevorzugte Peptidgemische schließen die Gemische D und E ein.in the Y a COOH or CONH₂ group at the carboxy terminus of the (peptide) and X is the residue of an amino acid or an amino acid analog with two Amino groups and a carboxyl group, each group being able to to form a peptide bond. According to the invention, the peptide residue (peptide) specifically immunoreactive with HCV-associated antibodies and includes one Amino acid sequence selected from the group SEQ ID NOS: 37 to 47 (cf. Tables 1, 3, 5 and 8) or one of the peptides of the general formulas V-IX, which contain special substitutions and / or degenerate positions, such as they are explained in the description below. Preferred mixtures of peptides include mixtures D and E.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer wirksamen Menge einer der Peptidzusammensetzungen der Erfindung in einem Immunoassay, insbesondere in einem ELlSA-Verfahren oder einem passiven Hämagglutinations-Assay (PHA) oder in einem Kit zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV oder zur Diagnose von HCV-Infektionen. The invention further relates to the Using a effective amount of one of the peptide compositions of the invention in one Immunoassay, especially in an ELISA or a passive Hemagglutination assay (PHA) or in a kit for the detection of antibodies against HCV or for diagnosing HCV infections.

Fig. 1 zeigt die Immunoreaktivität einer Verdünnungsreihe eines menschlichen monoklonalen Antikörpers (B12.F8; Cerino (1993), J. Immunol. 151: 7005-7015), der spezifisch für das HCV-Kernprotein ist, mit () Peptidgemisch A (Beispiel 5), (⚫) Peptidgemisch E (Beispiel 5) und (○) einem kommerziell erhältlichen HCV- Antikörper-Nachweis-Kit (Ortho HCV 3.0; Ortho Diagnostic Systems, Inc.). Fig. 1 shows the immunoreactivity of a dilution series of human monoclonal antibody (B12.F8; Cerino (1993), J. Immunol 151: 7005-7015.), Which is specific for the HCV core protein (with () A peptide mixture Example 5 ), (⚫) peptide mixture E (Example 5) and (○) a commercially available HCV antibody detection kit (Ortho HCV 3.0; Ortho Diagnostic Systems, Inc.).

Fig. 2 zeigt die Immunoreaktivität einer Verdünnungsreihe eines menschlichen monokonalen Antikörpers (60H9[9]D 10E6; Cerino (1991), J. Immunol. 147: 2692-2696), der spezifisch für das HCV- NS-4 Protein ist mit () Peptidgemisch A (Beispiel 5), (⚫) Peptidgemisch E (Beispiel 5) und (○) einem kommerziell erhältlichen HCV-Antikörper-Nachweis-Kit (Ortho HCV 3.0). Fig. 2 shows the immunoreactivity of a dilution series of a human monokonalen antibody (60H9 [9] D 10E6; Cerino (1991), J. Immunol. 147: 2692-2696) specific for the HCV NS-4 protein is by () Peptide mixture A (example 5), (⚫) peptide mixture E (example 5) and (○) a commercially available HCV antibody detection kit (Ortho HCV 3.0).

Fig. 3 zeigt die Immunoreaktivität einer Verdünnungsreihe eines menschlichen monoklonalen Antikörpers (CM3.B6; Mondelli (1994), J. Virol. 68: 4829-4836), der spezifisch für das HCV-NS-3 Protein ist, mit () Peptidgemisch A (Beispiel 5), (⚫) Peptidgemisch E (Beispiel 5) und (○) und einem kommerziell erhältlichen HCV- Antikörper-Nachweis-Kit (Ortho HCV 3.0). Figure 3 shows the immunoreactivity of a dilution series of a human monoclonal antibody (CM3.B6; Mondelli (1994), J. Virol. 68: 4829-4836), which is specific for the HCV-NS-3 protein, with () peptide mixture A. (Example 5), (⚫) peptide mixture E (Example 5) and (○) and a commercially available HCV antibody detection kit (Ortho HCV 3.0 ).

Intensive serologische Analysen haben erfindungsgemäß zu einer Verfeinerung und zu einer weitergehenden Definierung immunoreaktiver Peptide geführt, die sich zum Nachweis von HCV-Antikörpern und zur Diagnose von HCV- Infektionen eignen. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß synthetische Peptide, die im Rahmen einer HCV-Prototypsequenz mehrfache Substitutionen durch natürliche (übliche) und nicht-natürliche (unübliche) Aminosäuren enthalten, äußerst wirksam zum Nachweis und zur Diagnose von HCV- Infektionen sind. Diese mehrfach substituierten Peptide können auch degenerierte Positionen mit Sequenzvariabilität enthalten, um hohe Selektivität und Empfindlichkeit für eine Vielzahl von HCV-Stämmen bereitzustellen. Die dementsprechend bevorzugten Peptide der Erfindung sind SEQ ID NOS: 37-47, die in den Tabellen 1, 3, 5 und 8 aufgeführt sind. Alle Peptide der Erfindung sind durch ihre SEQ ID NO: gekennzeichnet. According to the invention, intensive serological analyzes have led to a refinement and led to a further definition of immunoreactive peptides that for the detection of HCV antibodies and the diagnosis of HCV Infections. Surprisingly, it was found that synthetic Peptides that have multiple substitutions as part of an HCV prototype sequence through natural (usual) and non-natural (unusual) amino acids included, extremely effective for the detection and diagnosis of HCV Infections are. These multiply substituted peptides can also degenerate positions with sequence variability contain high selectivity and to provide sensitivity to a variety of HCV strains. The accordingly preferred peptides of the invention are SEQ ID NOS: 37-47, which are listed in Tables 1, 3, 5 and 8. All peptides of the invention are identified by their SEQ ID NO :.

Jedes dieser Peptide hat ein spezielles Muster von Substitutionen, Deletionen oder degenerierten Positionen in seinem Peptidrest relativ zu einer der fünf Prototypsequenzen, die nachstehend angegeben sind.Each of these peptides has a special pattern of substitutions, deletions or degenerate positions in its peptide residue relative to one of the five Prototype sequences given below.

Eine Position in einer Prototypsequenz, in der ein Aminosäurerest durch einen anderen Rest ersetzt wird, wird als "substituierte Position" bezeichnet. In ähnlicher Weise wird eine Position in einer Prototypsequenz, in der ein Aminosäurerest nicht vorliegt, als "deletierte Position" bezeichnet. Schließlich wird eine Position in einer Prototypsequenz, an der im Zuge der Peptidsynthese ein einziger Aminosäurerest durch ein Gemisch von zwei oder mehr Aminosäureresten ersetzt wurde (wie im Fall der nachstehenden Peptidbibliotheken) als "degenerierte Position" bezeichnet. A position in a prototype sequence in which an amino acid residue by one other residue is called the "substituted position". In Similarly, a position in a prototype sequence in which a Amino acid residue not present, referred to as the "deleted position". Finally becomes a position in a prototype sequence at which in the course of peptide synthesis a single amino acid residue by a mixture of two or more Amino acid residues has been replaced (as in the case of the following Peptide libraries) referred to as "degenerate position".

Die Peptide der Erfindung können linear oder verzweigt sein. Die Erfindung schließt Polymere, Konjugate und Gemische der Peptide ein.The peptides of the invention can be linear or branched. The invention includes polymers, conjugates and mixtures of the peptides.

Weiterhin enthalten einige der Peptide degenerierte Positionen, d. h. diese Peptide stellen "Bibliotheken" von Peptiden dar; vgl. WO 95/11998. ("Peptidbibliotheken" werden auch als "strukturierte synthetische Antigen- Bibliotheken" oder "SSAL" bezeichnet.) Bei Peptidbanken sind degenerierte Aminosäurepositionen diejenigen Positionen bekannter Sequenzvariabilität, wie sie infolge Stamm-abhängiger Unterschiede bei verschiedenen HCV-Isolaten gefunden werden. An den degenerierten Positionen befindet sich somit irgendeiner von zwei oder mehreren Aminosäureresten. Die für eine gegebene Position möglichen Reste werden an Hand bekannter Sequenzvariationen ermittelt, die an dieser Position innerhalb der Sequenz des Peptids auftreten. Das Verhältnis der bei der Synthese für eine bestimmte Position verwendeten Aminosäuren kann entweder durch die Frequenz repräsentiert werden, mit der die gegebenen Reste in den bekannten Varianten auftreten, oder durch eine einfache äquimolare Verteilung der möglichen Aminosäuren an dieser Position. Für die vorliegende Erfindung muß nicht jede Sequenzposition, die einer Virusstamm-abhängigen Variation unterliegen kann, berücksichtigt werden. Ein lineares Peptid der Erfindung kann von etwa 30 bis etwa 100 Aminosäurereste, vorzugsweise etwa 40 bis etwa 85 Aminosäurereste enthalten.Furthermore, some of the peptides contain degenerate positions, i.e. H. this Peptides represent "libraries" of peptides; see. WO 95/11998. ("Peptide libraries" are also called "structured synthetic antigen Libraries "or" SSAL ".) Peptide libraries are degenerate Amino acid positions are those positions of known sequence variability, such as it due to strain-dependent differences in different HCV isolates being found. So is at the degenerate positions any of two or more amino acid residues. The one for a given Position of possible residues are determined on the basis of known sequence variations, the this position occur within the sequence of the peptide. The Ratio of those used in synthesis for a particular position Amino acids can either be represented by the frequency at which the given residues occur in the known variants, or by one simple equimolar distribution of the possible amino acids at this position. For the present invention, not every sequence position that a Virus strain-dependent variation may be considered. On linear peptide of the invention can contain from about 30 to about 100 amino acid residues, preferably contain from about 40 to about 85 amino acid residues.

Die Peptide der Erfindung können auch einige weitere Aminosäuren, einschließlich nicht-natürlicher (unübliche) Aminosäuren aufweisen, die an die endständigen Aminosäuren gebunden sind. Beispielsweise kann die Sequenz KKK (Lysin-Lysin-Lysin) an den Amino-Terminus jedes der Peptide der Erfindung gebunden sein. Bei verzweigten Peptiden kann ein Rest M (Methionin) an den Carboxy-Terminus des Peptidrestes gebunden sein, d. h. zwischen den Peptidrest und der Verzweigung. Genauso können die Peptide einen Cysteinrest am Carboxy-Terminus tragen, um die Thiol-Gruppe des Cysteins zur Bildung einer kovalenten Bindung an eine elektrophile Gruppe auszunutzen, z. B. an eine N^α-Chloracetyl-modifizierte Aminosäure oder eine Maleinimid-derivatisierte α- oder ε-Aminogruppe eines Lysinrestes, der an den Amino-Terminus eines anderen Peptids gebunden ist. The peptides of the invention may also have some other amino acids, including non-natural (unusual) amino acids, that are bound to the terminal amino acids. For example, the sequence KKK (lysine-lysine-lysine) can be linked to the amino terminus of each of the peptides of the invention. In the case of branched peptides, a residue M (methionine) can be bound to the carboxy terminus of the peptide residue, ie between the peptide residue and the branch. Likewise, the peptides can carry a cysteine residue at the carboxy terminus to utilize the thiol group of the cysteine to form a covalent bond to an electrophilic group, e.g. B. an N ^α -chloroacetyl-modified amino acid or a maleimide-derivatized α- or ε-amino group of a lysine residue which is bound to the amino terminus of another peptide.

HCV unterliegt bekanntlich häufigen Mutationen. Es sind mehrere Varianten von Stämmen/Isolaten bekannt, z. B. PT, J, J1 und J4; vgl. Houghton (1989), Okamoto (1990), Houghton (1990) und Kato (1990), supra. Es ist zu erwarten, daß noch weitere Virusstammvarianten existieren; vgl. Bukh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8234-8238 (1993). Anpassungen der vorgeschriebenen Sequenzen an durch Stammvariationen entstehende konservative Substitutionen können durchgeführt werden, sofern das Muster der substituierten, deletierten oder degenerierten Positionen in einem gegebenen Peptid beibehalten wird. Auf diese Weise können die Peptide der Erfindung mittels Änderungen, die ihre Antigenität nicht beeinträchtigen, stammabhängige Variationen ausgleichen, die innerhalb verschiedener HCV-Isolate bestehen.As is known, HCV is subject to frequent mutations. There are several variants of Strains / isolates known, e.g. B. PT, J, J1 and J4; see. Houghton (1989), Okamoto (1990), Houghton (1990) and Kato (1990), supra. It is expected that further virus strain variants exist; see. Bukh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8234-8238 (1993). Adjustments to the prescribed Sequences of conservative substitutions resulting from strain variations can be performed provided the pattern of the substituted, deleted or maintained degenerate positions in a given peptide. On in this way the peptides of the invention can be modified by making changes to their Do not affect antigenicity, compensate for strain-dependent variations exist within different HCV isolates.

Somit wird durch die erfindungsgemäß durchführbaren Änderungen die Immunoreaktivität der Peptide der Erfindung mit HCV-Antikörpern beibehalten, das Muster der substituierten, deletierten oder degenerierten Position jedoch nicht beeinträchtigt. Die Änderungen können in Substitutionen, Insertionen, Deletionen oder Degenerationen an etwa 2 bis etwa 5 Positionen oder alternativ bei bis zu etwa 10% der Positionen in einem Peptid der Tabellen 1, 3, 5 und 8 bestehen. Darüber hinaus leiten sich die durchführbaren Änderungen von bekannten HCV-Stämmen ab.Thus, the changes that can be carried out according to the invention Maintain immunoreactivity of the peptides of the invention with HCV antibodies, the pattern of the substituted, deleted, or degenerate position, however not affected. The changes can be made in substitutions, insertions, Deletions or degenerations at about 2 to about 5 positions or alternatively at up to about 10% of the positions in a peptide of Tables 1, 3, 5 and 8 consist. In addition, the feasible changes are derived from known HCV strains.

Die Peptide der Erfindung werden synthetisiert und gegen eine Auswahl von HCV-Seren (HCV-Serumpanel) getestet, um, wie nachstehend beschrieben, die Immunoreaktivität der Peptide zu bestimmen.The peptides of the invention are synthesized and against a selection of HCV sera (HCV serum panel) tested to determine how Determine immunoreactivity of the peptides.

Die Peptide der Erfindung können auch zur Bildung von Konjugaten verwendet werden, d. h. die Peptide können direkt oder indirekt in an sich bekannter Weise an Trägerproteine, wie Rinderserumalbumin (BSA), menschliches Serumalbumin (HSA) oder an Erythrocyten oder Latexpartikel gebunden werden.The peptides of the invention can also be used to form conjugates become, d. H. the peptides can be directly or indirectly in a manner known per se on carrier proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA) or bound to erythrocytes or latex particles.

Der Ausdruck "natürliche" oder "übliche" Aminosäuren bezeichnet die 20 Aminosäuren, die üblicherweise in Proteinen gefunden werden, nämlich Alanin, Asparaginsäure, Asparagin, Arginin, Cystein, Glycin, Glutamin, Glutaminsäure, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin, Tryptophan und Valin. Der Ausdruck natürliche Aminosäuren schließt sowohl die D- als auch die L-Formen ein. The term "natural" or "common" amino acids denotes the 20th Amino acids commonly found in proteins, namely alanine, Aspartic acid, asparagine, arginine, cysteine, glycine, glutamine, glutamic acid, Histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, Threonine, tyrosine, tryptophan and valine. The expression natural amino acids includes both the D and L shapes.

Der Ausdruck "nicht-natürliche" oder "unübliche" Aminosäuren schließt sowohl die D- als auch die L-Form jeder anderen Aminosäure ein, unabhängig davon, ob sie innerhalb eines Proteins oder anderweitig in der Natur vorkommt, oder ob sie synthetisch hergestellt wird. Beispiele für nicht-natürliche Aminosäuren sind unter anderem β-Alanin, Ornithin, Norleucin, Norvalin, Hydroxyprolin, Thyroxin, gamma-Aminobuttersäure, Homoserin und Citrullin.The expression "non-natural" or "unusual" amino acids includes both the D as well as the L form of any other amino acid, regardless of whether it occurs within a protein or otherwise in nature, or whether it is synthetically produced. Examples of non-natural amino acids are among others β-alanine, ornithine, norleucine, norvaline, hydroxyproline, thyroxine, gamma-aminobutyric acid, homoserine and citrulline.

Die linearen Peptide der Erfindung haben die allgemeine FormelThe linear peptides of the invention have the general formula

[Peptid]-Y[Peptide] -Y

in der Y eine COOH- oder CONH₂- Gruppe darstellt. Die linearen Peptide schließen Gemische, Konjugate und Polymere ein. Die Peptide umfassen mindestens eine antigene Determinante, die spezifisch immunoreaktiv mit Antikörpern gegen HCV ist.in which Y represents a COOH or CONH₂ group. The linear peptides include mixtures, conjugates and polymers. The peptides include at least one antigenic determinant that is specifically immunoreactive with Antibodies to HCV is.

Die verzweigten Peptide der Erfindung haben eine der folgenden allgemeinen Formeln:The branched peptides of the invention have one of the following general ones Formulas:

(Peptid)₂X
(Peptid)₄X₂X
(Peptid)₈X₄X₂X
(Peptid)₁₆X₈X₄X₂X(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂X

in denen X der Rest einer Aminosäure oder eines Aminosäureanalogons mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe ist, wobei jede Gruppe in der Lage ist, eine Peptidbindung zu bilden. Vorzugsweise ist X ein Lysinrest oder der Rest eines Lysin-Analogons, wie Ornithin. Das Aminosäureanalogon kann eine α-Aminosäure, eine β-Aminosäure oder jede andere natürliche oder nicht-natürliche Aminosäure mit zwei Aminogruppen und einer Carboxylgruppe sein, die zur Bildung von Peptidbindungen verfügbar sind. Bevorzugte verzweigte Peptide der Erfindung sind Dimere, Tetramere und Octamere, insbesondere solche Peptide, die als Kernstruktur der Verzweigung ein Lysin aufweisen, d. h. bei denen der Rest X ein Lysinrest ist. Verzweigte Dimere und Octamere sind besonders bevorzugt.where X is the residue of an amino acid or an amino acid analogue with two Amino groups and a carboxyl group, each group being able to to form a peptide bond. X is preferably a lysine residue or the residue a lysine analogue, such as ornithine. The amino acid analog can be one α-amino acid, a β-amino acid or any other natural or non-natural Amino acid with two amino groups and a carboxyl group, which are used for Formation of peptide bonds are available. Preferred branched peptides of the Invention are dimers, tetramers and octamers, in particular such peptides, which have a lysine as the core structure of the branch, d. H. where the X is a lysine residue. Branched dimers and octamers are special prefers.

Der Peptidrest der linearen oder verzweigten Peptide kann hinsichtlich seiner Länge von etwa 30 bis etwa 100 Aminosäureresten variieren. Die bevorzugten Peptide der Erfindung enthalten etwa 30 bis etwa 60 Aminosäurereste. Die bevorzugten Peptide der Erfindung sind verzweigte oder lineare Peptide mit einer Sequenz von SEQ ID NOS: 37-47, dargestellt in den Tabellen 1, 3, 5 und 8.The peptide residue of the linear or branched peptides can with respect to its Length vary from about 30 to about 100 amino acid residues. The preferred Peptides of the invention contain from about 30 to about 60 amino acid residues. The preferred peptides of the invention are branched or linear peptides with a Sequence of SEQ ID NOS: 37-47, shown in Tables 1, 3, 5 and 8.

Die Erfindung betrifft auch Peptidzusammensetzungen mit einem oder mehreren der Peptide der Formeln V-IX.The invention also relates to peptide compositions with one or more the peptides of the formulas V-IX.

Peptide der Formel V sind solche, die im wesentlichen den Rahmen der 52 Aminosäuren-Prototypsequenz der Reste 1 bis 52 von SEQ ID NO: 3 beibehalten, die mit HCV-Kern-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgenden substituierten Positionen enthalten:
Position 8: Ornithin oder Lysin, Position 16: Ornithin oder Lysin, Position 24: Hydroxyprolin, Position 29: Norvalin, Position 37: Hydroxyprolin, Position 43: Norleucin und Position 45: Norvalin oder Leucin.Peptides of formula V are those which essentially maintain the framework of the 52 amino acid prototype sequence of residues 1 to 52 of SEQ ID NO: 3, which are immunoreactive with HCV core antibodies and which contain the following substituted positions:
Position 8: ornithine or lysine, position 16: ornithine or lysine, position 24: hydroxyproline, position 29: norvaline, position 37: hydroxyproline, position 43: norleucine and position 45: norvaline or leucine.

Die Peptide der Formel V können ferner eine oder mehrere der folgenden substituierten oder degenerierten Positionen enthalten:The peptides of formula V can also be one or more of the following substituted or degenerate positions contain:

Position 4: Pro : Gly im Verhältnis 9 : 1, Position 10: Thr : Asn im Verhältnis 7 : 3, Position 21: Norvalin, Position 30: Norvalin, Position 36: Valin oder Norleucin, Position 48: Thr : Pro im Verhältnis 9 : 1 und Position 52: Threonin oder Thr : Ala : Glu : Lys im Verhältnis 1 : 1 : 1 : 1.Position 4: Pro: Gly in the ratio 9: 1, position 10: Thr: Asn in the ratio 7: 3, position 21: norvaline, position 30: norvaline, position 36: valine or Norleucine, position 48: Thr: Pro in a ratio of 9: 1 and position 52: Threonine or Thr: Ala: Glu: Lys in a ratio of 1: 1: 1: 1.

Die Peptide der Formel VI sind solche Peptide, die im wesentlichen den Rahmen der 47 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO: 2 beibehalten, die mit HCV-NS-4-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgenden substituierten Positionen enthalten:The peptides of formula VI are those peptides that are essentially the framework the 47 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 2 retained with HCV NS-4 antibodies are immunoreactive and are substituted for the following Items include:

Position 1: Asparagin, Position 2: Glutamin, Position 3: Arginin, Position 4: Hydroxyprolin, Position 5: Serin oder Threonin, Position 12: Norvalin oder Isoleucin, Position 15: Ornithin, Position 22: Asparaginsäure, Position 27: Norvalin, Position 31: Asparaginsäure, Position 39: Asparagin und Position 45: Norvalin oder Valin.Position 1: asparagine, position 2: glutamine, position 3: arginine, position 4: hydroxyproline, position 5: serine or threonine, position 12: norvaline or isoleucine, position 15: ornithine, position 22: aspartic acid, Position 27: norvaline, position 31: aspartic acid, position 39: Asparagine and position 45: norvaline or valine.

Die Peptide der Formel VI können ferner eine oder mehrere der folgenden substituierten oder degenerierten Positionen enthalten:
Position 6: Ile : Val im Verhältnis 6 : 4, Position 7: Ile : Val : Ala im Verhältnis 6 : 2 : 2, Position 10: Arg : Lys im Verhältnis 8 : 2, Position 16: Glu : Ala im Verhältnis 8 : 2, Position 19: Asparaginsäure, Position 24: Ser : Ala im Verhältnis 4 : 6, Position 25: Gln : Ser im Verhältnis 4 : 6, Position 26: His : Lys : Arg im Verhältnis 8 : 1 : 1, Position 28: Pro : Ala im Verhältnis 8 : 2, Position 29: Tyr : Leu im Verhältnis 8 : 2, Position 30: Norleucin oder Norvalin, Position 32: Gln : Glu im Verhältnis 8 : 2, Position 34: Met : Gln im Verhältnis 8 : 2, Position 35: Met : Gln : Arg im Verhältnis 4 : 4 : 2, Position 36: Leu : Met : Ile im Verhältnis 8 : 1 : 1, Position 40: Phe : Leu im Verhältnis 8 : 2, Position 42: Gln : Ser im Verhältnis 8 : 2 und Position 44: Ala : Ile im Verhältnis 8 : 2.The peptides of formula VI may also contain one or more of the following substituted or degenerate positions:
Position 6: Ile: Val in a ratio of 6: 4, position 7: Ile: Val: Ala in a ratio of 6: 2: 2, position 10: Arg: Lys in a ratio of 8: 2, position 16: Glu: Ala in a ratio of 8: 2, position 19: aspartic acid, position 24: Ser: Ala in the ratio 4: 6, position 25: Gln: Ser in the ratio 4: 6, position 26: His: Lys: Arg in the ratio 8: 1: 1, position 28: Pro: Ala in the ratio 8: 2, position 29: Tyr: Leu in the ratio 8: 2, position 30: norleucine or norvaline, position 32: Gln: Glu in the ratio 8: 2, position 34: Met: Gln in the ratio 8: 2, position 35: Met: Gln: Arg in the ratio 4: 4: 2, position 36: Leu: Met: Ile in the ratio 8: 1: 1, position 40: Phe: Leu in the ratio 8: 2, position 42: Gln : Ser in the ratio 8: 2 and position 44: Ala: Ile in the ratio 8: 2.

Die Peptide der Formel VII sind solche Peptide, die im wesentlichen den Rahmen der 44 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO: 1 beibehalten, die mit HCV-NS-5-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgenden substituierten Positionen enthalten:The peptides of formula VII are those peptides that are essentially the framework the 44 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 1 retained with HCV NS-5 antibodies are immunoreactive and are substituted for the following Items include:

Position 2: Ornithin, Position 10: Norvalin, Position 17: Glutaminsäure, Position 23: Norvalin, Position 31: Hydroxyprolin und Position 37: Hydroxyprolin.Position 2: ornithine, position 10: norvaline, position 17: glutamic acid, Position 23: norvaline, position 31: hydroxyproline and position 37: Hydroxyproline.

Die Peptide der Formel VII können ferner einen oder mehrere der folgenden degenerierten Positionen enthalten:
Position 8: Pro : Leu : Val im Verhältnis 8 : 1 : 1, Position 12: Thr : Ser : Pro im Verhältnis 5 : 4 : 1, Position 15: Lys : Asp : Arg im Verhältnis 4 : 4 : 2, Position 19: Glu : Val : Gln im Verhältnis 5 : 4 : 1, Position 21: Pro : Ala im Verhältnis 9 : 1, Position 22: Val : Thr im Verhältnis 8 : 2, Position 24: His : Leu : Ala im Verhältnis 8 : 1 : 1, Position 27: Pro : Ala im Verhältnis 8 : 2, Position 30: Pro : Ser im Verhältnis 9 : 1, Position 32: Lys : Pro : Arg im Verhältnis 8 : 1 : 1, Position 33: Ser : Ala : Lys : Gln im Verhältnis 4 : 4 : 1 : 1, Position 34: Pro : Thr im Verhältnis 8 : 2, Position 36 : Val : Ile : Thr im Verhältnis 5 : 4 : 1, Position 41: Lys : Arg im Verhältnis 4 : 6, Position 42: Lys : Arg im Verhältnis 7 : 3 und Position 44: Thr : Ala im Verhältnis 9 : 1.The peptides of formula VII may also contain one or more of the following degenerate positions:
Position 8: Pro: Leu: Val in the ratio 8: 1: 1, position 12: Thr: Ser: Pro in the ratio 5: 4: 1, position 15: Lys: Asp: Arg in the ratio 4: 4: 2, position 19 : Glu: Val: Gln in the ratio 5: 4: 1, position 21: Pro: Ala in the ratio 9: 1, position 22: Val: Thr in the ratio 8: 2, position 24: His: Leu: Ala in the ratio 8: 1: 1, position 27: Pro: Ala in the ratio 8: 2, position 30: Pro: Ser in the ratio 9: 1, position 32: Lys: Pro: Arg in the ratio 8: 1: 1, position 33: Ser: Ala : Lys: Gln in the ratio 4: 4: 1: 1, position 34: Pro: Thr in the ratio 8: 2, position 36: Val: Ile: Thr in the ratio 5: 4: 1, position 41: Lys: Arg in the ratio 4: 6, position 42: Lys: Arg in the ratio 7: 3 and position 44: Thr: Ala in the ratio 9: 1.

Die Peptide der Formel VIII sind solche Peptide, die im wesentlichen den Rahmen der 40 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO 5 : 35 beibehalten, die mit HCV-NS-4-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgenden substituierten Positionen enthalten:
Position 8: Norleucin, Position 13: Ornithin, Position 20: Hydroxyprolin, Position 28: Arginin und Position 35: Ornithin.The peptides of formula VIII are those peptides which essentially maintain the framework of the 40 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO 5:35, which are immunoreactive with HCV NS-4 antibodies and which contain the following substituted positions:
Position 8: norleucine, position 13: ornithine, position 20: hydroxyproline, position 28: arginine and position 35: ornithine.

Peptide der Formel IX sind solche, die im wesentlichen den Rahmen der 55 Aminosäuren-Prototypsequenz von SEQ ID NO: 36 beibehalten, die mit HCV-NS- 5-Antikörpern immunoreaktiv sind und die folgenden substituierten Positionen enthalten:Peptides of the formula IX are those which essentially fall within the scope of 55 Preserve amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 36 that with HCV-NS 5 antibodies are immunoreactive and the following substituted positions contain:

Position 8: Ornithin, Position 16: Norvalin, Position 24: Asparagin, Position 32: Ornithin, Position 40: Norvalin und Position 48: Norleucin.Position 8: ornithine, position 16: norvaline, position 24: asparagine, Position 32: ornithine, position 40: norvaline and position 48: norleucine.

Die Peptide der Formeln V-IX können linear oder verzweigt sein und die Erfindung schließt Polymere, Konjugate und Gemische dieser Peptide entsprechend den hier beschriebenen Ausführungsformen ein.The peptides of the formulas V-IX can be linear or branched and the The invention includes polymers, conjugates and mixtures of these peptides according to the embodiments described here.

Der Ausdruck "HCV-NS-3-Antikörper" schließt einen Antikörper ein, oder ein Serum oder eine Plasmaprobe, die Antikörper enthält, die mit Peptid 4 (SEQ ID NO: 4) immunoreaktion sind oder daran binden. Der Ausdruck "HCV-Kernprotein- Antikörper" schließt einen Antikörper oder ein Serum oder eine Plasmaprobe ein, die Antikörper enthalten, die mit Peptid 3, z. B. VIIIE (SEQ ID NO: 3) immunoreaktiv sind oder daran binden. Der Ausdruck "HCV-NS-4-Antikörper" schließt einen Antikörper oder ein Serum oder eine Plasmaprobe ein, die Antikörper enthält, die mit Peptid 2, d. h. IIH (SEQ ID NO: 2) immunoreaktiv sind oder daran binden. Der Ausdruck "HCV-NS-5-Antikörper" schließt einen Antikörper oder ein Serum oder eine Plasmaprobe ein, die Antikörper enthält, die mit Peptid 1 (SEQ ID NO: 1) immunoreaktiv sind oder daran binden.The term "HCV NS-3 antibody" includes or includes an antibody Serum or a plasma sample containing antibodies raised with peptide 4 (SEQ ID NO: 4) are immunoreaction or bind to it. The expression "HCV core protein Antibody "includes an antibody, or a serum, or a plasma sample, which contain antibodies associated with peptide 3, e.g. B. VIIIE (SEQ ID NO: 3) are immunoreactive or bind to it. The Expression "HCV NS-4 Antibody" includes an antibody or a serum or a plasma sample that Contains antibodies that are associated with peptide 2, i.e. H. IIH (SEQ ID NO: 2) are immunoreactive or bind to it. The term "HCV NS-5 antibody" includes one Antibody or a serum or a plasma sample containing antibodies that with peptide 1 (SEQ ID NO: 1) are immunoreactive or bind to it.

Die Peptidzusammensetzungen der Erfindung können aus einem oder mehreren der erfindungsgemäßen Peptide zusammengesetzt sein. Vorzugsweise enthalten diese Zusammensetzungen 1 bis 10 Peptide und besonders bevorzugt 1 bis 4 Peptide und insbesondere bevorzugt 1 bis 6 Peptide.The peptide compositions of the invention can be one or more of the peptides according to the invention can be composed. Preferably included these compositions comprise 1 to 10 peptides and particularly preferably 1 to 4 Peptides and particularly preferably 1 to 6 peptides.

In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die erfindungsgemäßen Peptidzusammensetzungen die Peptide 37, 38, 39, 43, 45, 46 und 47 und besonders bevorzugt die Peptide 37, 43, 45, 46 und 47 ein.In a preferred embodiment, the inventive Peptide compositions peptides 37, 38, 39, 43, 45, 46 and 47 and peptides 37, 43, 45, 46 and 47 are particularly preferred.

Darüber hinaus enthalten die erfindungsgemäßen Peptidzusammensetzungen Gemische dieser Peptide. Das zur Diagnose von HCV oder zum Nachweis von HCV-Antikörpern wirksame Verhältnis von Peptiden in Peptidzusammensetzungen, die Gemische der erfindungsgemäßen Peptide enthalten, läßt sich ohne weiteres bestimmen. Im allgemeinen liegen diese Verhältnisse im Bereich von etwa 1 bis etwa 50, bezogen auf das Gewicht an Peptid. Bevorzugte Peptidzusammensetzungen zur Diagnose und zum Nachweis von HCV Infektionen sind Gemisch D, das die Peptide 19, 33, 38, 39, 46 und 47 enthält und Gemisch E, das die Peptide 19, 37, 43, 45, 46 und 47 enthält. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt das Gemisch E mit einem Gewichtsverhältnis 1,5 : 1 : 1 : 0,5 : 1 : 2 für die Peptide 43, 46, 37, 45, 47 und 19 dar.In addition, the peptide compositions according to the invention contain Mixtures of these peptides. That for the diagnosis of HCV or for the detection of HCV antibodies effective ratio of peptides in Peptide compositions, the mixtures of the peptides according to the invention contained, can be determined easily. Generally these are Ratios ranging from about 1 to about 50 by weight Peptide. Preferred peptide compositions for diagnosis and detection of HCV infections are mixture D which contains peptides 19, 33, 38, 39, 46 and 47 contains and mixture E, which contains the peptides 19, 37, 43, 45, 46 and 47. A preferred embodiment is the mixture E with a Weight ratio 1.5: 1: 1: 0.5: 1: 2 for peptides 43, 46, 37, 45, 47 and 19 represents.

Die Peptidzusammensetzungen, Peptide und Gemische, die vorstehend beschrieben sind, sind zum Nachweis von HCV-Antikörpern in Körperflüssigkeiten und zur Diagnose von HCV-Infektionen geeignet. Zur Bestimmung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Peptide zum Nachweis von HCV-Antikörpern werden die Peptide auf ihre Immunoreaktivität mit Proben getestet, die vorher durch Screening von Tausenden von Patienten- und Normalseren auf Immunoreaktivität mit HCV ausgewählt worden sind. Derartige HCV-spezifische Serumpanels sind im Handel erhältlich und Beispiele solcher Serumpanels und Verfahren zur Auswahl geeigneter Panels sind hier in den Beispielen angegeben. The peptide compositions, peptides and mixtures described above are described for the detection of HCV antibodies in Body fluids and suitable for diagnosing HCV infections. For Determination of the effectiveness of the peptides according to the invention for detection HCV antibodies are used to test the peptides for their immunoreactivity tested previously by screening thousands of patients and Normal sera on immunoreactivity with HCV have been selected. Such HCV-specific serum panels are commercially available and examples of such Serum panels and procedures for selecting suitable panels are here in the Examples given.

Die Strategie zur serologischen Bestätigung der Wirksamkeit hängt von den erwarteten Eigenschaften der zu untersuchenden antigenen Determinanten ab. Beispielsweise kann das Screening bei universellen immunodominanten Bereichen, wie dem gp41-Transmembranpeptid von HIV-1, mittels einer einzigen repräsentativen Serumprobe aus einem mit dem Virus infizierten Patienten erfolgen. Bei antigenen Bereichen, die nicht bei allen infizierten Patienten erkannt werden, oder für die Antikörper spät oder nur transient gebildet werden, müssen große Serumpanels zum Screening verwendet werden. Beide Screening- Verfahren können erfindungsgemäß verwendet werden, um die immunologische Analyse von HCV mittels der erfindungsgemäßen Peptide deutlich zu verbessern. Die letztgenannte Methode ist jedoch bei Untersuchungen auf überlegene Selektivität und Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Peptide besonders brauchbar.The strategy for serological confirmation of effectiveness depends on the expected properties of the antigenic determinants to be examined. For example, the screening of universal immunodominants Areas such as the HIV-1 gp41 transmembrane peptide using a single representative serum sample from a patient infected with the virus respectively. In antigenic areas, not in all infected patients are recognized, or for which antibodies are formed late or only transiently, large serum panels must be used for screening. Both screening Methods can be used according to the invention to determine the immunological Analysis of HCV clearly using the peptides according to the invention improve. The latter method, however, is based on investigations superior selectivity and sensitivity of the peptides according to the invention particularly useful.

Von den verwendeten Serumpanels hängt auch die Identifizierung antigener Determinanten ab. Je genauer das Panel eine Population repräsentiert, die höchstwahrscheinlich bezüglich einer Determinante seropositiv ist, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, daß die antigene Determinante identifiziert und sorgfältig kartiert werden kann. Zur Erweiterung des Reaktivitätsspektrums eines Assays, der bereits identifizierte antigene Determinanten oder Epitope umfaßt, sollte deshalb zum Screening eine große Zahl von Proben von Patienten verwendet werden, die möglicherweise infiziert sind, jedoch seronegativ bezüglich bekannter Antigene oder Epitope sind.The identification of antigenic substances also depends on the serum panels used Determinants. The more accurately the panel represents a population, the most likely to be seropositive with respect to a determinant, the greater is the probability that the antigenic determinant is identified and can be carefully mapped. To expand the reactivity spectrum of a Assays that include previously identified antigenic determinants or epitopes should therefore be used for screening a large number of samples from patients which may be infected but are seronegative with respect to known antigens or epitopes.

Das Verfahren der "serologischen Bestätigung" ist besonders schwierig, wenn die zu identifizierende antigene Determinante lediglich in einer Subpopulation einer infizierten Patientengruppe Antikörper auslöst. Sofern derartige antigene Bereiche Ziel des Nachweises werden, muß besonders auf synthetische Peptide geachtet werden, die sehr schwache Reaktivität zeigen.The process of "serological confirmation" is particularly difficult if the antigenic determinant to be identified is only in a subpopulation triggers antibodies in an infected patient group. If such antigens Areas of detection must be particularly focused on synthetic peptides be respected, which show very weak reactivity.

In dieser Hinsicht gestattet die niedrige Hintergrundabsorption von synthetischen Peptiden, insbesondere Peptiden mit nicht-natürlichen Aminosäuren, den genauen Nachweis schwacher Reaktivität. In einigen Fällen sind Absorptionen von 50 mA (mA = Milliabsorption) gegenüber Hintergrundablesung ausreichend signifikant und können im Wege sukzessiver Verbesserung der Aminosäuresequenz eines Peptids zur Identifizierung wichtiger antigener Determinanten führen. Bei ausreichender Laborroutine lassen sich auch dann konsistente und zuverlässige Ergebnisse erhalten, wenn man im Bereich von Absorptionen unterhalb von 200-300 mA arbeitet.In this regard, the low background absorption of synthetic peptides, especially peptides with non-natural ones Amino acids, the exact detection of weak reactivity. In some cases are absorptions of 50 mA (mA = milliabsorption) Background reading is sufficiently significant and can be done successively Improve the amino acid sequence of a peptide to identify important ones antigenic determinants. With a sufficient laboratory routine, Get consistent and reliable results even when you’re in Range of absorptions works below 200-300 mA.

Die Peptide lassen sich in an sich bekannter Weise herstellen, z. B. nach der Merrifield-Methode; vgl. J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154 und die Vielzahl der verfügbaren Verbesserungen dieser Technik, vgl. Synthetic Peptides: A User′s Guide, Grant, Ed. (1992), W.H. Freeman & Co., New York; Jones (1994) The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford.The peptides can be prepared in a manner known per se, e.g. B. after the Merrifield method; see. J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154 and die Many of the improvements available to this technique, cf. Synthetic Peptides: A User’s Guide, Grant, Ed. (1992), W.H. Freeman & Co., New York; Jones (1994) The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford.

Eine weitere Schwierigkeit, die sich bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide im Vergleich zu rekombinant exprimierten Proteinen auf ein Mindestmaß beschränken läßt, ist die hohe Zahl falsch-positiver Ergebnisse, die durch die Gegenwart von antigenem Material hervorgerufen wird, das zusammen mit dem von HCV abgeleiteten rekombinanten Proteinen aufgereinigt wird. Beispielsweise haben bestimmte normale Patienten Antikörper gegen Escherichia coli- oder Hefeproteine, die mit antigenem Material der Expressionssysteme kreuzreagieren, wie sie für diagnostische Tests auf der Basis rekombinanter Proteine verwendet werden. Seren solcher normaler Patienten können eine falsch-positive Reaktion in derartigen Immunoassays zeigen. Solche falschen Reaktionen sind bei den erfindungsgemäßen Immunoassays ausgeschlossen.Another difficulty that arises when using the invention Peptides to a minimum compared to recombinantly expressed proteins limits, is the high number of false positive results by the Presence of antigenic material that is associated with the is purified from HCV-derived recombinant proteins. For example certain normal patients have antibodies to Escherichia coli or Yeast proteins with antigenic material of the expression systems cross-react as used for diagnostic tests based on recombinant Proteins are used. Sera from such normal patients may have one show false positive response in such immunoassays. Such wrong Reactions are excluded in the immunoassays according to the invention.

Darüber hinaus werden die erfindungsgemäßen Peptidzusammensetzungen synthetisch hergestellt, so daß sich die Produktqualität leicht steuern läßt. Entsprechend ist die Reproduzierbarkeit der Versuchsergebnisse sichergestellt. Weiterhin sind für jeden Test nur sehr geringe Mengen Peptid erforderlich, und die Kosten zur Herstellung der Peptide sind relativ niedrig. Infolgedessen sind die Kosten für das Screening von Körperflüssigkeiten auf Antikörper gegen HCV und zur Diagnose von HCV-Infektionen relativ niedrig. Als weiterer Vorteil ist bei Verwendung von Peptidbibliotheken das breitere Reaktivitätsspektrum bezüglich einer größeren Anzahl von HCV-Stämmen zu nennen. Degenerierte Positionen der Peptidbibliotheken stellen ein "offenes" diagnostisches Werkzeug dar, das die Stamm-spezifischen Sequenzvariationen (und die daraus folgende Variation in der Antikörperspezifität), die sich aus der großen Anzahl von HCV-Stämmen ergibt, ausgleicht. Somit erhöhen Peptidbibliotheken die Fähigkeit der antigenen Peptide zur Reaktivität mit Antikörpern, die für einen breiteren Bereich von HCV- Varianten spezifisch sind.In addition, the peptide compositions according to the invention synthetically manufactured so that product quality can be easily controlled. Accordingly, the reproducibility of the test results is ensured. Furthermore, only very small amounts of peptide are required for each test, and the cost of making the peptides is relatively low. As a result, they are Cost of screening body fluids for antibodies to HCV and relatively low for diagnosing HCV infections. Another advantage is Use of peptide libraries regarding the broader reactivity spectrum to name a large number of HCV strains. Degenerate positions of the peptide libraries represent an "open" diagnostic tool that the strain-specific sequence variations (and the resulting variation in antibody specificity) resulting from the large number of HCV strains results, balances. Thus peptide libraries increase the ability of the antigens Peptides for reactivity with antibodies that target a wider range of HCV Variants are specific.

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidzusammensetzungen können zum Nachweis von HCV-Antikörpern und zur Diagnose von HCV-Infektionen als Testreagenzien in einem Enzym-gebundenen Immunoabsorptionsassay (enzym linked immunoadsorbent assay; ELISA), einem Enzym-Immunodotassay, einem passiven Hämagglutinations-Assay (z. B. ein PHA-Test), einem Antikörper-Peptid- Antikörper-Sandwich-Assay, einem Peptid-Antikörper-Peptid-Sandwich-Assay oder anderen bekannten Immunoassays verwendet werden. Bezüglich der erfindungsgemäßen Peptide kann jeder geeignete Immunoassay verwendet werden. Derartige Methoden sind bekannt und in zahlreichen Standardwerken beschrieben, z. B. Harlow et al., (1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Immunoassay ein ELISA unter Verwendung einer festen Phase, die mit den erfindungsgemäßen Peptidzusammensetzungen beschichtet ist. ELISA-Methoden sind bekannt. Eine andere bevorzugte Ausführungsform des Immunoassays ist ein PHA-Test.The peptides and peptide compositions according to the invention can be used for Detection of HCV antibodies and for the diagnosis of HCV infections as Test reagents in an enzyme-linked immunoabsorption assay (enzyme linked immunoadsorbent assay; ELISA), an enzyme immunodotassay, one passive hemagglutination assay (e.g. a PHA test), an antibody peptide Antibody sandwich assay, a peptide-antibody-peptide sandwich assay or other known immunoassays. Regarding the Peptides according to the invention can use any suitable immunoassay will. Such methods are known and in numerous standard works described, e.g. B. Harlow et al., (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. In a preferred one In one embodiment, the immunoassay is an ELISA using a fixed one Phase coated with the peptide compositions according to the invention is. ELISA methods are known. Another preferred embodiment of the immunoassay is a PHA test.

Die erfindungsgemäßen Immunoassays werden zum Screening von Körperflüssigkeiten und Geweben auf die Anwesenheit von HCV-reaktiven Antikörpern verwendet. Sie erleichtern dem Arzt die Diagnose von HCV- Infektionen. Beispiele für Körperflüssigkeiten, die untersucht werden können, sind Blut und Blutfraktionen, wie Plasma und Serum, Speichel oder irgendeine andere Flüssigkeit, die Antikörper gegen HCV enthalten kann.The immunoassays according to the invention are used for the screening of Body fluids and tissues are sensitive to the presence of HCV Antibodies used. They make it easier for the doctor to diagnose HCV Infections. Examples of body fluids that can be examined are blood and blood fractions, such as plasma and serum, saliva or any other liquid that may contain antibodies to HCV.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit zum Nachweis von HCV- Antikörpern oder zur Diagnose von HCV-Infektionen in Körperflüssigkeiten von Säugern, z. B. Serum, Gewebeextrakten, Gewebeflüssigkeiten, in vitro- Zellkulturüberständen und Zell-Lysaten. Das Kit kann aus mehreren Kompartimenten bestehen, wobei ein erster Behälter ein Peptid oder mehrere der Peptide, d. h. eine Peptidzusammensetzung der Erfindung, enthält.Another aspect of the invention is a kit for the detection of HCV Antibodies or to diagnose HCV infections in body fluids from Mammals, e.g. B. serum, tissue extracts, tissue fluids, in vitro Cell culture supernatants and cell lysates. The kit can consist of several Compartments exist, wherein a first container is a peptide or more of the Peptides, i.e. H. a peptide composition of the invention.

Vorzugsweise ist das Kit der Erfindung ein ELISA- oder ein PHA-Testkit zum Nachweis von HCV-Antikörpern oder zur Diagnose einer HCV-Infektion. Als ELISA-Testkit enthält das Kit: (a) einen Behälter (z. B. eine Platte mit 96 Vertiefungen, wie eine Mikrotiterplatte (96-Well-Platte)) mit einer festen Phase, die mit einer der erfindungsgemäßen Peptidzusammensetzungen beschichtet wurde, (b) eine negative Kontrollprobe, (c) eine positive Kontrollprobe, (d) ein Probenverdünnungsmittel und (e) Antikörper gegen menschliche IgG-Antikörper, wobei diese Antikörper mit einem Reportermolekül markiert sind. Wenn das Reportermolekül ein Enzym ist, dann kann das Kit auch ein Substrat für das Enzym enthalten.Preferably the kit of the invention is an ELISA or a PHA test kit for Detection of HCV antibodies or to diagnose HCV infection. As The ELISA test kit contains the kit: (a) a container (e.g. a plate with 96 Wells, such as a microtiter plate (96-well plate) with a solid phase, which are coated with one of the peptide compositions according to the invention , (b) a negative control, (c) a positive control, (d) a Sample diluents and (e) antibodies against human IgG antibodies, these antibodies being labeled with a reporter molecule. If that Reporter molecule is an enzyme, then the kit can also be a substrate for the Enzyme included.

Das Testkit wird beispielsweise wie folgt verwendet: Eine zu untersuchende Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit eines Säugers, die gegebenenfalls mit Probenverdünnungsmittel verdünnt wurde, wird für einen Zeitraum und unter solchen Bedingungen mit dem Peptid in dem Behälter in Kontakt gebracht, die ausreichen, damit möglicherweise vorhandene Antikörper binden können. Nach Abtrennung von nicht-gebundenem Material, z. B. durch Waschen mit steriler Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, wird der sekundäre Komplex mit markierten Antikörpern gegen menschliche IgG-Antikörper in Kontakt gebracht. Diese Antikörper binden an den sekundären Komplex unter Bildung eines tertiären Komplexes. Da die zweiten Antikörper mit einem Reportermolekül markiert sind, läßt sich bei Zugabe von Nachweismittel der tertiäre Komplex nachweisen. Das Reportermolekül kann ein Enzym, ein Radioisotop, ein Fluorophor, ein bioluminiszierendes Molekül, ein chemiluminiszierendes Molekül, Bioton, Avidin, Streptavidin oder dergleichen sein. Für den ELISA-Test ist das Reportermolekül vorzugsweise ein Enzym.The test kit is used, for example, as follows: One to be examined Sample, e.g. B. a body fluid of a mammal, optionally with Sample diluent has been diluted for a period of time and below such conditions in contact with the peptide in the container that are sufficient so that any antibodies that may be present can bind. After Separation of unbound material, e.g. B. by washing with sterile Phosphate-buffered saline, the secondary complex with labeled antibodies against human IgG antibodies. These antibodies bind to the secondary complex to form a tertiary complex. Because the second antibody with a reporter molecule are marked, the tertiary complex can be added when detection agent is added to prove. The reporter molecule can be an enzyme, a radioisotope Fluorophore, a bioluminescent molecule, a chemiluminescent molecule, Bioton, avidin, streptavidin or the like. This is for the ELISA test Reporter molecule preferably an enzyme.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung und sind nicht als einschränkend zu verstehen.The following examples serve to illustrate the invention and are not intended as to be understood restrictively.

example 1 ELISA test procedure

Die Näpfchen einer Mikrotiter-Platte (96-Well-Platte) wurden gesondert für 1 Stunde bei 37°C mit 5 µg/ml Peptid unter Verwendung von 100 µl pro Well in 10 mM NaHCO₃-Puffer, pH 9,5 beschichtet, sofern nichts anderes angegeben ist. Die Peptid-beschichteten Näpfchen wurden mit 250 µl einer 3 Gew.-%igen Gelatinelösung in PBS für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, um unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren. Anschließend wurde dreimal mit PBS gewaschen, das 0,05 Vol.-% TWEEN 20 enthält, und getrocknet. Die Testproben, die HCV-Antikörper-positive Patientenseren enthielten, wurden im Volumenverhältnis 1 : 20 mit PBS verdünnt, das 20 Vol.-% normales Ziegenserum, 1 Gew.-% Gelatine und 0,05 Vol.-% TWEEN 20 enthält. 100 µl der verdünnten Proben wurden in jedes der Näpfchen gegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert.The wells of a microtiter plate (96-well plate) were separated for 1 Hour at 37 ° C with 5 µg / ml peptide using 100 µl per well in 10 mM NaHCO₃ buffer, pH 9.5 coated, unless stated otherwise is. The peptide-coated wells were treated with 250 .mu.l of a 3 wt .-% Gelatin solution in PBS incubated for 1 hour at 37 ° C to unspecific To block protein binding sites. Then three times with PBS washed, which contains 0.05% by volume of TWEEN 20, and dried. The Test samples containing HCV antibody positive patient sera were taken in the Volume ratio 1:20 diluted with PBS, the 20 vol .-% normal Goat serum, 1 wt% gelatin and 0.05 vol% TWEEN 20 contains. 100 µl the diluted samples were placed in each of the wells and 30 minutes incubated at 37 ° C.

Sodann wurden die Näpfchen sechsmal mit 0,05 Vol.-%iger TWEEN 20-Lösung in PBS gewaschen, um nicht-gebundene Antikörper abzutrennen. Meerrettich- Peroxidase-konjugierte Ziege-Anti-Human-IgG-Antikörper wurden als sekundärer Antikörper-tracer verwendet, der an den HCV-Antikörper-Peptid-Antigenkomplex in den positiven Näpfchen bindet. 100 µl der Peroxidase-markierten Ziege-Anti- Human-IgG-Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 1800 in 1 Vol.-% normalem Ziegenserum, 0,05 Vol.-%iger TWEEN 20-Lösung in PBS wurden in jedes Näpfchen gegeben und weitere 15 Minuten bei 37°C inkubiert.The wells were then six times with 0.05% by volume TWEEN 20 solution washed in PBS to separate unbound antibodies. Horseradish- Peroxidase-conjugated goat anti-human IgG antibodies were considered secondary Antibody tracer used to bind to the HCV-antibody-peptide-antigen complex binds in the positive well. 100 µl of the peroxidase-labeled goat anti Human IgG antibody in a dilution of 1: 1800 in 1% by volume normal Goat serum, 0.05 vol% TWEEN 20 solution in PBS was added to each Wells were added and incubated for a further 15 minutes at 37 ° C.

Sodann wurden die Näpfchen sechsmal mit 0,05 Vol.-%iger TWEEN 20-Lösung in PBS gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen, und dann mit 100 µl des Substratgemisches behandelt, das 0,04 Gew.-% o-Phenylendiamin (OPD) und 0,12 Vol.-% Wasserstoffperoxid in einem Natriumzitratpuffer, pH 5,0, enthält. Dieses Substratgemisch wurde zum Nachweis der Peroxidasemarkierung verwendet, wobei sich ein farbiges Produkt bildet. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 µl 1,0 M H₂SO₄ abgebrochen und die Absorption bei 492 nm (A₄₉₂ nm) gemessen.The wells were then six times with 0.05% by volume TWEEN 20 solution washed in PBS to remove unbound antibody, and then washed with Treated 100 ul of the substrate mixture, the 0.04 wt .-% o-phenylenediamine (OPD) and 0.12 vol.% Hydrogen peroxide in a sodium citrate buffer, pH 5.0, contains. This mixture of substrates was used for the detection of Peroxidase labeling used, whereby a colored product forms. The Reactions were stopped by adding 100 µl of 1.0 M H₂SO₄ and the absorption at 492 nm (A₄₉₂ nm) measured.

Example 2 Immunoreactivity of nuclear protein-reactive peptides

Die Immunoreaktivität der Peptide 26 und 37 (Tabelle 1) wurde mit einer Gruppe bekannter HCV-Serenproben aus HCV-Panels 2, 3 und einer serologischen Konversionsprobe (serol 1-5) bestimmt, die Antikörper gegen das Kernprotein gemäß dem ELISA-Test nach Beispiel 1 unter Verwendung einer Peptidbeschichtung bei 1 µg/ml enthält. Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß das Peptid 37 viel stärker mit HCV-Kernprotein-Antikörpern reagiert als das Peptid 26.The immunoreactivity of peptides 26 and 37 (Table 1) was compared with one group known HCV serum samples from HCV panels 2, 3 and a serological one Conversion sample (serol 1-5) determines the antibodies against the core protein according to the ELISA test according to Example 1 using a Contains peptide coating at 1 µg / ml. The results in Table 2 show that peptide 37 reacts much more strongly with HCV core protein antibodies than that Peptide 26.

Example 3 Immunoreactivity of NS-4 reactive peptides

US-PS 5,105,726 (Tabelle 5) beschreibt eine seltene Serumprobe (NAB-2-2), die bevorzugt mit den fünf Amino-terminalen Resten des Peptids 2 (SGKPA) reagierte. Obwohl diese Sequenz Teil eines Epitops ist, das wichtig zum Nachweis von Proben mit NS-4-Reaktivität ist, zeigte Peptid 39 (Tabelle 3), das die Sequenz SGKPT enthält, nicht-spezifische Immunoreaktivität. Dies führte zur Identifizierung von fünf falsch-positiven Proben unter 1000 zufällig ausgewählten Blutspenderproben (Tabelle 4).U.S. Patent 5,105,726 (Table 5) describes a rare serum sample (NAB-2-2) that preferably with the five amino-terminal residues of peptide 2 (SGKPA) responded. Although this sequence is part of an epitope that is important for Detection of samples with NS-4 reactivity, peptide 39 (Table 3) showed that the sequence contains SGKPT, non-specific immunoreactivity. This led to Identification of five false positive samples under 1000 randomly selected blood donor samples (Table 4).

Es wurde festgestellt, daß die Sequenz SGKPT homolog ist zum hochkonservierten A-Bereich in Helikasen (Gorbalenya et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17: 4713-4730). Die HCV-Helikase (im NS-3-Bereich) hat die Sequenz SGKST, wobei die Aminosäuren G und K unter den HCV-Stämmen nicht variabel sind.The sequence SGKPT was found to be homologous to highly conserved A region in helicases (Gorbalenya et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17: 4713-4730). The HCV helicase (in the NS-3 range) has the sequence SGKST, whereby the amino acids G and K are not variable among the HCV strains are.

Entsprechend wurden mehrere Peptide synthetisiert (Peptide 42-44, Tabelle 3) und hinsichtlich der Immunoreaktivität mit tatsächlichen HCV-positiven Proben analysiert als auch auf das Fehlen von nicht-spezifischer Immunoreaktivität mit den falsch-positiven Proben, identifiziert mit Peptid 39. Die komplette Deletion dieser fünf Reste (Peptid 44) eliminierte die nicht-spezifische Kreuzreaktion in den falsch-positiven Proben, aber verringerte auch die Reaktivität mit der bekannten HCV-positiven Probe (Tabelle 4). Die Modifizierung dieser fünf Reste (Peptide 42 und 43, die jeweils eine Amino-terminale Sequenz von NQRpS haben) resultierte in Peptiden, die nicht mit falsch-positiven Proben immunoreaktiv sind, aber die starke Immunoreaktivität mit der bekannten HCV- positiven Probe NAB-2-2 (Tabelle 4) zeigten.Accordingly, several peptides were synthesized (peptides 42-44, Table 3) and for immunoreactivity with actual HCV positive samples analyzed as well as for the lack of non-specific immunoreactivity the false positive samples identified with peptide 39. The complete deletion of these five residues (peptide 44) eliminated the non-specific cross reaction in the false positive samples, but also decreased the reactivity with the known HCV-positive sample (Table 4). The modification of these five residues (Peptides 42 and 43, each having an amino-terminal sequence from NQRpS have resulted in peptides not using false positive samples are immunoreactive, but the strong immunoreactivity with the known HCV showed positive sample NAB-2-2 (Table 4).

Example 4 Immunoreactivity of NS-5 reactive peptides

Die Immunoreaktivität eines NS-5-reaktiven Peptids (Peptid 45, Tabelle 5) wurde mit einem Panel bekannter HCV-Seren aus HCV-Panel 3 im ELISA-Test gemäß Beispiel 1 bestimmt. Die Peptidbeschichtung betrug 2 µg/ml. Die Ergebnisse zeigen, daß Peptid 45 eine vergleichbare Immunoreaktivität wie Peptid 33 hat (Tabelle 6).The immunoreactivity of an NS-5 reactive peptide (peptide 45, Table 5) was determined with a panel of known HCV sera from HCV panel 3 according to the ELISA test Example 1 determined. The peptide coating was 2 µg / ml. The results show that peptide 45 has a comparable immunoreactivity as peptide 33 (Table 6).

Example 5 Detection of HCV antibodies by peptide mixtures

Das Peptidgemisch A mit den Peptiden 25, 29, 33 und 19, wobei das letztgenannte Peptid mit BSA konjugiert war, wurde in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 2 : 0,5 : 8 (µg/ml) zur Beschichtung verwendet. Dieses Gemisch wurde in einem ELISA-Test gemäß Beispiel 1 mit Peptidgemisch B verglichen, das die Peptide 25, 27-Octamer, 33 und 19 enthielt und in einem Gewichtsverhältnis von 2 : 2 : 0,5 : 8 (µg/ml) zur Beschichtung verwendet wurde, wobei das letztgenannte Peptid 19 mit BSA konjugiert war.The peptide mixture A with the peptides 25, 29, 33 and 19, wherein the the latter peptide conjugated to BSA was in a weight ratio of 2: 2: 0.5: 8 (µg / ml) used for coating. This mixture was in an ELISA test according to Example 1 with peptide mixture B, which the Peptides 25, 27-octamer, 33 and 19 contained and in a weight ratio of 2: 2: 0.5: 8 (µg / ml) was used for coating, the the latter peptide 19 was conjugated to BSA.

Peptid 19 wurde unter Verwendung von m-Maleinimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimidester (MBS) nach den Angaben des Herstellers (Pierce Chemical Co.) bzw. nach Kitagawa et al. (1976), J. Biochem. 79: 233-236 mit BSA konjugiert.Peptide 19 was synthesized using m-maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimide ester (MBS) according to the manufacturer (Pierce Chemical Co.) or according to Kitagawa et al. (1976) J. Biochem. 79: 233-236 with Conjugated BSA.

Zur Untersuchung der Empfindlichkeit und Spezifität der Gemische A und B wurden die Gemische mit einem speziell ausgewählten Serumpanel getestet, das Seren enthielt, die spezifische Immunoreaktivität bezüglich der Kernprotein-, NS- 3-, NS-4- oder NS-5-Bereiche von HCV zeigten. Dieses Panel wurde durch Screening von Seren gegen Peptid VIIIE (SEQ ID NO: 3) hergestellt, um Kernprotein-spezifische Seren zu identifizieren, gegen Peptid IIH (SEQ ID NO: 2), um NS-4-spezifische Seren zu identifizieren, gegen Pep11 (Wang, 1992, supra), um NS-5-spezifische Seren zu identifizieren, und gegen Peptid 4 (SEQ ID NO: 4), um NS-3-spezifische Seren zu identifizieren. Die auf diese Weise identifizierten Seren wurden dann mit normalen menschlichen Seren verdünnt, damit sie eine schwache bis mäßige Reaktivität gegenüber diesen gleichen Peptiden zeigten (d. h., damit sie eine Absorption bei 492 nm im Bereich von 0,3 bis 2,0 aufwiesen). Die verdünnten Proben stellten dann das spezielle Panel zur Untersuchung der Nachweisempfindlichkeit dar (Tabelle 7), das zum Testen der Gemisch A und B verwendet wurde. Die Gemische A und B hatten vergleichbare Empfindlichkeiten (Tabelle 7, oberer Panel).To investigate the sensitivity and specificity of mixtures A and B the mixtures were tested with a specially selected serum panel, the Sera containing specific immunoreactivity to nuclear protein, NS 3, NS-4 or NS-5 areas of HCV showed. This panel was created by Screening of sera against peptide VIIIE (SEQ ID NO: 3) Identify core protein-specific sera against peptide IIH (SEQ ID NO: 2), to identify NS-4 specific sera against Pep11 (Wang, 1992, supra), to identify NS-5 specific sera and against peptide 4 (SEQ ID NO: 4), to identify NS-3 specific sera. The identified in this way Sera were then diluted with normal human sera to make one showed weak to moderate reactivity to these same peptides (i.e., to have an absorption at 492 nm in the range 0.3 to 2.0 had). The diluted samples then provided the special panel Investigation of detection sensitivity (Table 7), which is used to test the Mixture A and B was used. Mixtures A and B had comparable ones Sensitivities (Table 7, top panel).

Das Gemisch D enthielt die Peptide 19, 33, 38, 39, 46 und 47, wobei das Peptid 19 mit BSA konjugiert war. Die Peptide 39, 46, 38, 33 und 47 wurden in einem Gewichtsverhältnis von 1,5 : 1 : 1 : 0,5 : 1 (µg/ml) für 16 Stunden bei Raumtemperatur, wie in Beispiel 1 beschrieben, auf ELISA-Platten aufgebracht. Die Peptid-Beschichtungslösung wurde von den Näpfchen abgesaugt und durch 100 µl des Peptid 19-BSA-Konjugats einer Konzentration von 2,0 µg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,2, für 1 Stunde bei 370 ersetzt. Die Gemisch D-Tests wurden gemäß Beispiel 1 durchgeführt.Mixture D contained peptides 19, 33, 38, 39, 46 and 47, the Peptide 19 was conjugated to BSA. Peptides 39, 46, 38, 33 and 47 were in a weight ratio of 1.5: 1: 1: 0.5: 1 (µg / ml) for 16 hours Room temperature, as described in Example 1, applied to ELISA plates. The peptide coating solution was aspirated from the well and through 100 µl of the peptide 19-BSA conjugate at a concentration of 2.0 µg / ml in Phosphate buffered saline, pH 7.2, replaced for 1 hour at 370. The Mix D tests were carried out according to Example 1.

Gemisch E enthielt die Peptide 19, 37, 43, 45, 46 und 47. Gemisch E wurde in gleicher Weise auf ELISA-Platten aufgetragen wie Gemisch D unter Verwendung der Peptide 43, 46, 37, 45 und 47 bei einem Gewichtsverhältnis von 1,5 : 1 : 1 : 0,5 : 1 (µg/ml). Die Gemisch E-Tests wurden mit 25 µg/ml Peptid 51 im Probenverdünnungsmittel durchgeführt.Mix E contained peptides 19, 37, 43, 45, 46 and 47. Mix E was in applied to ELISA plates in the same way as mixture D using of peptides 43, 46, 37, 45 and 47 at a weight ratio of 1.5: 1: 1: 0.5: 1 (µg / ml). The Mix E tests were performed with 25 µg / ml peptide 51 im Sample diluent performed.

Die Gemische D und E wurden an dem gleichen Panel wie die Gemische A und B getestet. Die Ergebnisse im unteren Teil von Tabelle 7 zeigen, daß die Gemische D und E im ganzen eine vergleichbare Nachweisempfindlichkeit hatten, wie die Gemische A und B. Bei zwei Proben, Kernprotein 2 und Kernprotein 3, zeigten die Gemische D und E eine höhere Empfindlichkeit für diese Antikörper, als die Gemische A und B.Mixtures D and E were on the same panel as Mixtures A and B tested. The results in the lower part of Table 7 show that the mixtures D and E as a whole had a sensitivity comparable to that of Mixtures A and B. In two samples, core protein 2 and core protein 3, showed mixtures D and E are more sensitive to these antibodies than Mixtures A and B.

Example 6 Mixtures of peptides

Gemisch A (Beispiel 5) und Gemisch E (Beispiel 5) wurden bezüglich der Nachweisempfindlichkeit mit einer Verdünnungsreihe menschlicher monoklonaler Antikörper getestet, die spezifisch waren für a) das Kernprotein von HCV, B12.F8 (Cerino (1993), J. Immunol. 151: 7005-7015) b) das NS-4-Protein von HCV, 60H9[9]D10E6 (Cerino (1991), J. Immunol. 147: 2692-2696) und c) das NS-3-Protein-Konformationsepitop, CM3.B6 (Mondelli (1994), J. Virol. 68: 4829- 4836). Dieselbe Verdünnungsreihe wurde parallel dazu mit einem bekannten Anti-HCV-Testkit (Ortho HCV 3.0) getestet, das aus einem Gemisch rekombinanter Proteine aus der Region des Kernproteins und der NS-3-, NS-4- und NS-5-Proteine zusammengesetzt ist. Die analytische Empfindlichkeit beim Nachweis der gegen die drei oben genannten Bereiche gerichteten Antikörper gegen sämtliche drei Bereiche war bei Verwendung von Peptidgemisch A und E zwei- bis achtmal höher als beim Gemisch der rekombinanten Proteine des bekannten Kits, vgl. Fig. 1-3. Zusätzlich zeigte Gemisch E höhere Empfindlichkeit zum Nachweis von HCV-Antikörpern als Gemisch A.Mixture A (Example 5) and Mixture E (Example 5) were tested for detection sensitivity with a dilution series of human monoclonal antibodies which were specific for a) the core protein of HCV, B12.F8 (Cerino (1993), J. Immunol. 151 : 7005-7015) b) the NS-4 protein from HCV, 60H9 [9] D10E6 (Cerino (1991), J. Immunol. 147: 2692-2696) and c) the NS-3 protein conformation epitope, CM3 B6 (Mondelli (1994) J. Virol. 68: 4829-4836). The same dilution series was tested in parallel with a known anti-HCV test kit (Ortho HCV 3.0), which is composed of a mixture of recombinant proteins from the region of the core protein and the NS-3, NS-4 and NS-5 proteins . The analytical sensitivity in the detection of the antibodies directed against the three areas mentioned above against all three areas was two to eight times higher when using peptide mixtures A and E than when mixing the recombinant proteins of the known kit, cf. Fig. 1-3. In addition, mixture E showed higher sensitivity to the detection of HCV antibodies than mixture A.

Example 7 Quantification of test efficiency in patient and donor populations

Insgesamt 1034 Proben, die in der PCR-Analyse (Wang et al., 1992, Gastroenterology 103: 609) oder nach dem Chiron RIBA® HCV 2.0 Strip Immunoblot Assay (Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NJ) HCV-positiv waren, wurden bezüglich des Gemisches A im ELISA gemäß Beispielen 1 und 5 getestet. Diese Proben wurden von NANBH-Patienten mit chronischer oder akuter Hepatitis, Blutern, Patienten, die mehrmals Transfusionen erhalten hatten, HCV-infizierten Patienten, die Serokonversion zeigten, und Blutspendern, die als mit HCV-infiziert identifiziert worden waren, erhalten. Sämtliche 1034 als positiv bestätigte Proben waren in diesem Test positiv mit dem Gemisch A bei einem mittleren Signal-Hintergrund-Verhältnis von 10.A total of 1034 samples used in the PCR analysis (Wang et al., 1992, Gastroenterology 103: 609) or according to the Chiron RIBA® HCV 2.0 Strip Immunoblot assay (Ortho Diagnostic Systems, Inc., Raritan, NJ) HCV positive with regard to mixture A in the ELISA according to Examples 1 and 5 tested. These samples were from NANBH patients with chronic or acute hepatitis, hemophiliacs, patients who have received transfusions several times, HCV-infected patients who showed seroconversion and blood donors who considered infected with HCV. All 1034 as positive confirmed samples were positive with mixture A at one in this test average signal-background ratio of 10.

Eine Sammlung von 3154 zufällig ausgewählten Blutspenderproben wurde in gleicher Weise im ELISA mit dem Peptidgemisch A getestet. Die Spezifität des Tests in der Blutspenderpopulation war größer als 99,5%. Das mittlere Signal- Hintergrund-Verhältnis der Proben betrug 0,3. Somit lieferten die als positiv bestätigten Proben ein mittleres Signal-Hintergrund-Verhältnis, das 33mal höher war, als das mit den zufällig ausgewählten Blutspenderproben erhaltene Verhältnis.A collection of 3154 randomly selected blood donor samples was collected in tested in the same way in the ELISA with the peptide mixture A. The specificity of the Tests in the blood donor population was greater than 99.5%. The middle signal Background ratio of the samples was 0.3. So they delivered as positive Samples confirmed a medium signal to background ratio that was 33 times higher was when that was obtained with the randomly selected blood donor samples Relationship.

Eine Sammlung von 1395 zufällig ausgewählten Blutspenderproben wurde mit dem Gemisch E, wie in Beispiel 5 beschrieben, getestet. Die anfängliche Reaktionsrate war 0,4%, was einer Testspezifität von 99,6% entspricht. Die anfänglich reaktiven Proben wurden nachgetestet und alle als negativ bestimmt (außer geringfügig für 3 von 4 Proben). Das Ergebnis von 100%iger Test- Spezifität zeigt die hohe Spezifität dieses Testformats in einer Spenderpopulation. A collection of 1395 randomly selected blood donor samples was included the mixture E, as described in Example 5, tested. The initial Response rate was 0.4%, which corresponds to a test specificity of 99.6%. The initially reactive samples were re-tested and all were determined to be negative (except marginally for 3 out of 4 samples). The result of 100% test Specificity shows the high specificity of this test format in one Donor population.

Example 8 Immunoreactivity of another NS-4 reactive peptide

Die Immunoreaktivität der Peptide 35 (aka V, SEQ ID NO: 35) und 46 (Tabelle 8) wurde mit einem Panel bekannter HCV-Seren aus dem HCV-Panel 3 bestimmt, die Antikörper gegen das NS-4-Protein im ELISA-Test nach Beispiel 1 zeigten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Das Peptid 46 zeigte eine Reaktivität vergleichbar der des Prototyp-HCV-1-Stamm-Peptids 35. The immunoreactivity of peptides 35 (aka V, SEQ ID NO: 35) and 46 (Table 8) was determined using a panel of known HCV sera from HCV panel 3 , and the antibodies against the NS-4 protein in the ELISA test according to example 1. The results are shown in Table 9. Peptide 46 showed a reactivity comparable to that of prototype HCV-1 strain peptide 35.

Example 9

Die Gemische A, D und E wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, mit drei HCV- positiv bestätigten Serumproben (durch PCR und/oder RIBA) getestet. Gemisch A gab falsch-negative Signale mit diesen drei Proben, wohingegen sowohl Gemisch D als auch Gemisch E stark positive Signale ergaben, wie in Tabelle 10 gezeigt.Mixtures A, D and E were, as described in Example 5, with three HCV positive serum samples tested (by PCR and / or RIBA). mixture A gave false negative signals with these three samples, whereas both Mix D and Mix E gave strong positive signals, as in Table 10 shown.

Probe T14916 wurde als eine seltene Probe ausgewählt, die im PCR-Test als HCV-positiv bestätigt worden war und die zeigt, daß sie Antikörper enthält, die mit NS-3- und NS-5-Proteinen, aber nicht mit dem Kernprotein oder NS-4- Proteinen reagiert. Die Verbesserung in der Durchführung für die Probe T14916 ist auf das Hinzufügen des Peptids 47 (ein NS-5-reaktives Peptid) zu den Gemischen D und E zurückzuführen. Wenn das Peptid 47 und sein Prototyp Peptid 36 (auch bekannt als pep12 in der EP-A 0 468 527) allein auf der Probe T14916 getestet wurden, war die Absorption bei 1,146 bzw. 1,089 bei 492 nm.Sample T14916 was selected as a rare sample that was identified in the PCR test HCV positive and which shows that it contains antibodies that with NS-3 and NS-5 proteins, but not with the core protein or NS-4- Proteins reacted. The improvement in implementation for the sample T14916 is on the addition of peptide 47 (an NS-5 reactive peptide) to the Mixtures D and E attributed. If the peptide 47 and its prototype Peptide 36 (also known as pep12 in EP-A 0 468 527) on the sample alone T14916 were tested, the absorption was at 1.146 and 1.089 at 492 nm.

Tabelle 2 Table 2

Immunoreaktivität der Kern-reaktiven Peptide Immunoreactivity of the core reactive peptides

Tabelle 4 Table 4

Elimierung der Falsch-Positiven mit NS-4 reaktiven Peptiden Elimination of false positives with NS-4 reactive peptides

Tabelle 6 Table 6

Immunoreaktivität der NS-5-reaktiven Peptide Immunoreactivity of the NS-5 reactive peptides

Tabelle 7 Table 7

Nachweisempfindlichkeit und Spezifität von Peptidgemischen Detection sensitivity and specificity of peptide mixtures

Tabelle 9 Table 9

Immunoreaktivität der NS-4 reaktiven Peptide bezogen auf Peptid 35 (V) Immunoreactivity of the NS-4 reactive peptides based on peptide 35 (V)

Tabelle 10 Table 10

Gemischea Mixture

Für das nachfolgende Sequenzprotokoll werden für die nicht- natürlichen (unüblichen) Aminosäuren folgende Abkürzungen verwendet:For the following sequence listing, for the non- abbreviations following natural (unusual) amino acids used:

Norvalin: Nva
Norleucin: Nle
Ornithin: Orn
Hydroxyprolin: Hyp Norvalin: Nva
Norleucine: Nle
Ornithine: Orn
Hydroxyproline: Hyp

Sequenzprotokoll Sequence listing

Claims

1. A peptide composition comprising at least one linear or branched peptide of the general formula (peptide) -Y
(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂Xin the Y is a COOH or CONH₂ group at the carboxy terminus of the (peptide) and X is the residue of an amino acid or an amino acid analog having two amino groups and one carboxyl group, each group capable of one Form peptide bond and wherein the peptide group (peptide) is specifically immunoreactive with hepatitis C virus (HCV) antibodies and the peptide group has an amino acid sequence selected from the group SEQ ID NO: 37-47, where SEQ ID NO: 37-47 Are part of this claim.

2. Peptide composition according to claim 1, wherein one or more of the peptides with are conjugated to a carrier.

3. A peptide composition comprising at least one linear or a branched peptide of the general formula (peptide) -Y
(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂X in which Y is a COOH or CONH₂ group at the carboxy terminus of (peptide) and X is the residue of an amino acid or an amino acid analogue with two amino groups and one carboxyl group, each group being able to form a peptide bond, and the peptide group (peptide) is specifically immunoreactive with hepatitis C virus (HCV) antibodies, the peptide group comprising a peptide which corresponds to the 52 amino acid prototype sequence of residues 1 to 52 of SEQ ID NO: 3 which is immunoreactive with HCV core protein antibodies and which contains the following substituted positions:
Position 8: ornithine or lysine, position 16: ornithine or lysine, position 24: hydroxyproline, position 29: norvaline, position 37: hydroxyproline, position 43: norleucine and position 45: norvaline or leucine,
wherein the 52 amino acid prototype sequence of residues 1 to 52 of SEQ ID NO: 3 forms part of this claim.

4. The peptide composition of claim 3, wherein the peptide group further contains one or more of the following substituted or degenerate positions:
Position 4: Pro: Gly in a ratio of 9: 1, position 10: Thr: Asn in a ratio of 7: 3, position 21: Norvalin, position 30: Norvalin, position 36: Valin or Norleucine, position 48: Thr: Pro in a ratio of 9 : 1 and position 52: threonine or Thr: Ala: Glu: Lys in a ratio of 1: 1: 1: 1.

5. A peptide composition comprising at least one linear or a branched peptide of the general formula (peptide) -Y
(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂X in which Y is a COOH or CONR₂ group at the carboxy terminus of (peptide) and X is the residue of an amino acid or an amino acid analogue with two amino groups and one carboxyl group, each group being able to form a peptide bond and the peptide group (peptide) is specifically immunoreactive with hepatitis C virus (HCV) antibodies, the peptide group comprising a peptide corresponding to the 47 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 2, which NS-4 antibodies is immunoreactive and contains the following substituted positions:
Position 1: asparagine, position 2: glutamine, position 3: arginine, position 4: hydroxyproline, position 5: serine or threonine, position 12: norvaline or isoleucine, position 15: ornithine, position 22: aspartic acid, position 27: norvaline, position 31: aspartic acid, position 39: asparagine and position 45: norvaline or valine,
wherein the 47 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 2 forms part of this claim.

6. The peptide composition of claim 5, wherein the peptide group further contains one or more of the following substituted or degenerate positions:
Position 6: Ile: Val in a ratio of 6: 4, position 7: Ile: Val: Ala in a ratio of 6: 2: 2, position 10: Arg: Lys in a ratio of 8: 2, position 16: Glu: Ala in a ratio of 8: 2, position 19: aspartic acid, position 24: Ser: Ala in the ratio 4: 6, position 25: Gln: Ser in the ratio 4: 6, position 26: His: Lys: Arg in the ratio 8: 1: 1, position 28: Pro: Ala in the ratio 8: 2, position 29: Tyr: Leu in the ratio 8: 2, position 30: norleucine or norvaline, position 32: Gln: Glu in the ratio 8: 2, position 34: Met: Gln in the ratio 8: 2, position 35: Met: Gln: Arg in the ratio 4: 4: 2, position 36: Leu: Met: Ile in the ratio 8: 1: 1, position 40: Phe: Leu in the ratio 8: 2, position 42: Gln : Ser in the ratio 8: 2 and position 44: Ala: Ile in the ratio 8: 2.

7. A peptide composition comprising at least one linear or a branched peptide of the general formula (peptide) -Y
(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂X in which Y is a COOH or CONH₂ group at the carboxy terminus of (peptide), and X is the residue of an amino acid or an amino acid analog having two amino groups and one carboxyl group, each group being able to form a peptide bond, and the peptide group (peptide) is specifically immunoreactive with hepatitis C virus (HCV) antibodies, the peptide group comprising a peptide corresponding to the 44 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 1, which is associated with HCV- NS-5 antibodies is immunoreactive and contains the following substituting positions:
Position 2: ornithine, position 10: norvaline, position 17: glutamic acid, position 23: norvaline, position 31: hydroxyproline and position 37: hydroxyproline,
wherein the 44 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 1 forms part of this claim.

8. The peptide composition of claim 7, wherein the peptide group further contains one or more of the following substituted or degenerate positions:
Position 8: Pro: Leu: Val in the ratio 8: 1: 1, position 12: Thr: Ser: Pro in the ratio 5: 4: 1, position 15: Lys: Asp: Arg in the ratio 4: 4: 2, position 19 : Glu: Val: Gln in the ratio 5: 4: 1, position 21: Pro: Ma in the ratio 9: 1, position 22: Val: Thr in the ratio 8: 2, position 24: His: Leu: Ala in the ratio 8: 1: 1, position 27: Pro: Ala in the ratio 8: 2, position 30: Pro: Ser in the ratio 9: 1, position 32: Lys: Pro: Arg in the ratio 8: 1: 1, position 33: Ser: Ala : Lys: Gln in the ratio 4: 4: 1: 1, position 34: Pro: Thr in the ratio 8: 2, position 36: Val: Ile: Thr in the ratio 5: 4: 1, position 41: Lys: Arg in the ratio 4: 6, position 42: Lys: Arg in the ratio 7: 3 and position 44: Thr: Ala in the ratio 9: 1.

9. A peptide composition comprising at least one linear or a branched peptide of the general formula (peptide) -Y
(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂X in which Y is a COOH or CONH₂ group at the carboxy terminus of (peptide) and X is the residue of an amino acid or an amino acid analogue with two amino groups and one carboxyl group, each group being able to form a peptide bond, and the peptide group (peptide) is specifically immunoreactive with hepatitis C virus (HCV) antibodies, the peptide group comprising a peptide that corresponds to the 40 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 35, that with HCV- NS-4 antibodies is immunoreactive and contains the following substituted positions:
Position 8: norleucine, position 13: ornithine, position 20: hydroxyproline, position 28: arginine and position 35: ornithine,
the 40 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 35 forming part of this claim.

10. A peptide composition comprising at least one linear or a branched peptide of the general formula (peptide) -Y
(Peptide) ₂X
(Peptide) ₄X₂X
(Peptide) ₈X₄X₂X
(Peptide) ₁₆X₈X₄X₂X in which Y is a COOH or CONH₂ group at the carboxy terminus of (peptide), and X is the residue of an amino acid or an amino acid analog having two amino groups and one carboxyl group, each group being able to form a peptide bond, and the peptide group (peptide) is specifically immunoreactive with hepatitis C virus (HCV) antibodies, the peptide group comprising a peptide corresponding to the 55 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 36, which NS-5 antibodies is immunoreactive and contains the following substituted positions:
Position 8: ornithine, position 16: norvaline, position 24: asparagine, position 32: ornithine, position 40: norvaline and position 48: norleucine,
wherein the 55 amino acid prototype sequence of SEQ ID NO: 36 forms part of this claim.

11. A peptide composition comprising mixture D which contains the peptides (SEQ ID NO) 19, 33, 38, 39, 46 and 47, or mixture E containing the peptides (SEQ ID NO) 19, 37, 43, 45, 46 and 47, with SEQ ID NO: 19, 33, 37, 38, 39, 43, 45, 46, and 47 components of this Are demanding.

12. Use of a peptide composition according to any one of claims 1 to 11 for Detection of HCV antibodies or for diagnosis of HCV infection in serum, tissue, a tissue extract or body fluid in an immunoassay.

13. Use according to claim 12, characterized in that the immunoassay ELISA test, a sandwich assay or a PHA assay.

14. Use a kit to detect or diagnose HCV antibodies HCV infection, comprising a first container containing a peptide composition after a of claims 1 to 11 contains.

15. Use according to claim 14, wherein the kit is an ELISA test kit, a sandwich assay Kit or a PHA assay kit.

16. Use according to claim 15 comprising

(a) a container with a solid phase coated by coating with the peptide composition according to any one of claims 1 to 11,
(b) a negative control sample,
(c) a positive control sample,
(d) a sample diluent and
(e) Antibodies to human IgG antibody, which antibodies are labeled with a reporter molecule.