DE19535973A1

DE19535973A1 - Medicament containing helodermin fragment

Info

Publication number: DE19535973A1
Application number: DE1995135973
Authority: DE
Inventors: Ernst Dr Jaeger; Sigrid Bauer; Sami I Prof Dr Said
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1995-09-27
Filing date: 1995-09-27
Publication date: 1997-04-10

Abstract

Novel medicament contains a 20-34 residue amino acid peptide (I), having at least 50, preferably 70 and especially 90%, homology to the amino acid sequence (A), His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-Ser-Lys-Leu-Leu-Ala-Lys-Leu-Al a-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Ile-Leu-Gly (A).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, die pharmakologisch aktiv sind. Bereits 1970 wurde aus Schweinedarm ein Hormon/Neurotransmitter isoliert, der als "Vasoactive Intestinal Peptide" (VIP) bezeichnet wurde. Dieses Peptid weist eine Vielzahl von physiologischen Wirkungen auf. Es wurde erkannt, daß VIP in den Atemwegen als Bronchodilator und als entzündungshemmender Schutzfaktor wirken kann. Da bei Asthma bronchiale die Verengung und Entzündung der Bronchien auf einen Mangel an lokal wirksamen körpereigenen VIP zurückgeführt werden kann, bot sich die exogene Zufuhr an VIP, insbesondere durch Inhalation oder als Spray zur Behandlung dieser Erkrankungen an.The present invention relates to peptides which are pharmacologically active. Already in 1970 was out Pig intestine isolates a hormone / neurotransmitter that acts as "Vasoactive Intestinal Peptide" (VIP) was designated. This peptide has a variety of physiological Effects on. It has been recognized that VIP in the airways is considered Bronchodilator and as an anti-inflammatory protective factor can work. Because with bronchial asthma the narrowing and Inflammation of the bronchi due to a lack of locally effective body 's VIP can be brought back, the offered itself exogenous supply to VIP, especially by inhalation or as Spray to treat these diseases.

Es stellte sich jedoch heraus, daß das vasoaktive intestinale Peptid gegenüber lokal wirkenden proteolytischen Enzymen, wie insbesondere Tryptase oder Chymase, kaum stabil ist. Das VIP wird daher sehr rasch im Körper abgebaut und eignet sich aus diesem Grund kaum für eine therapeutische Anwendung.However, it turned out that the vasoactive intestinal Peptide against locally acting proteolytic enzymes, such as especially tryptase or chymase, is hardly stable. The VIP is therefore broken down very quickly in the body and is suitable therefore hardly for therapeutic use.

Aus dem Gift von Heloderma suspectum wurde ein Peptid mit 35 Aminosäuren isoliert, das eine Aktivität aufweist, die der von VIP ähnlich ist. Die Stabilität dieser Verbindung wurde vor allem dem carboxyterminalen Bereich mit einer Pro-Pro- Pro-Amidsequenz zugeordnet (Li et al., Biomedical Research, Vol. 14, (1993) S. 61-69).A peptide was made from the poison from Heloderma suspectum 35 amino acids isolated, which has an activity that the from VIP is similar. The stability of this connection was especially the carboxy-terminal area with a pro-pro Pro amide sequence assigned (Li et al., Biomedical Research, Vol. 14, (1993) pp. 61-69).

Von Li et al. (a.a.O.) wurden synthetische Helodermin-Analoga chemisch hergestellt, bei denen der C-terminale Bereich verkürzt wurde. Es wurde festgestellt, daß eine Verkürzung am C-Terminus des Moleküls dazu führte, daß die Wirkung auf die Gefäße, insbesondere die vasodilatorische Wirkung, durch diese Verkürzung reduziert wurde. Daraus wurde geschlossen, daß der C-terminale Teil des Helodermins, insbesondere bei den Positionen 31 bis 35, für die Langzeitwirkung dieses Peptids essentiell ist.By Li et al. (op. cit.) became synthetic helodermin analogues chemically made in which the C-terminal region was shortened. It was found that a shortening on C-terminus of the molecule caused the effect on the Vessels, especially the vasodilatory effect this shortening has been reduced. It was concluded that the C-terminal part of the helodermin, especially in positions 31 to 35, for the long-term effect of this Peptide is essential.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun völlig überraschend herausgefunden, daß verkürzte Helodermin- Fragmente eine lang anhaltende Relaxation der Trachea bewirken. Diese Langzeitaktivität bleibt erhalten, wenn und möglicherweise vielleicht gerade weil das Peptid am Carboxylende verkürzt wird.In the context of the present invention has now been completely surprisingly found that shortened helodermin Fragments long-lasting relaxation of the trachea cause. This long-term activity is retained if and maybe just because the peptide on Carboxyl end is shortened.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die Peptide umfassen mit einer Aminosäuresequenz, die eine Homologie von wenigstens 50% zu der AminosäuresequenzThe present invention relates to pharmaceuticals that Peptides have an amino acid sequence that includes a Homology of at least 50% to the amino acid sequence

His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-Ser-Lys-Leu-Leu-Ala- Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Ile-Leu-Gly,His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-Ser-Lys-Leu-Leu-Ala- Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Ile-Leu-Gly,

aufweist, wobei das Peptid mehr als 20 und weniger als 35 Aminosäuren aufweist.which peptide is more than 20 and less than Has 35 amino acids.

Bevorzugt beträgt die Homologie zu der oben angegebenen Sequenz wenigstens 70% und besonders bevorzugt wenigstens 90%. The homology to that given above is preferred Sequence at least 70% and particularly preferably at least 90%.

Unter dem Begriff Homologie wird die Ähnlichkeit der Peptide verstanden. Dieser Wert gibt an, wie viele Aminosäuren identisch in zwei zu vergleichenden Peptiden vorhanden sind. Wenn also beispielsweise bei einem Peptid von 10 Aminosäuren acht identisch und zwei unterschiedlich sind, beträgt die Homologie 80%.The term homology describes the similarity of the peptides Roger that. This value indicates how many amino acids are identical in two peptides to be compared. So if, for example, a peptide of 10 amino acids eight are identical and two are different Homology 80%.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden, daß das Helodermin-Peptid am Carboxyterminus um bis zu sieben Aminosäuren verkürzt werden kann. Die erfindungsgemäßen Peptide weisen daher mehr als 20 und weniger als 35 Aminosäuren, bevorzugt 24 bis 28 Aminosäuren auf.In the context of the present invention, it was found that the helodermin peptide at the carboxy terminus by up to seven Amino acids can be shortened. The invention Peptides therefore have more than 20 and less than 35 amino acids, preferably 24 to 28 amino acids.

Es hat sich herausgestellt, daß solche Peptide bevorzugt eingesetzt werden können, die folgende Formel aufweisen:It has been found that such peptides are preferred can be used which have the following formula:

His-Ser-Asp-As₁-As₂-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-As₃-Lys-Leu-Leu-As₄- Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-As₅-As₆-As₇-As₈,His-Ser-Asp-As₁-As₂-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-As₃-Lys-Leu-Leu-As₄- Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-As₅-As₆-As₇-As₈,

wobei die mit As bezeichneten Reste Aminosäuren darstellen und As₁ die Bedeutung Gly oder Ala haben kann, As₂ die Bedeutung Ile oder Val haben kann, As₃ die Bedeutung Ser oder Thr haben kann, As₄ die Bedeutung Ala oder Gly haben kann, As₅ die Bedeutungen Ser, Ala oder Val haben kann, As₆ die Bedeutungen, Ile, Ala oder Val haben kann, As₇ die Bedeutungen Leu, Ala oder Val haben kann und As₈ die Bedeutungen Gly, Ala oder Val haben kann.where the residues labeled As represent amino acids and As₁ can have the meaning Gly or Ala, As₂ the May have meaning Ile or Val, As₃ the meaning Ser or Thr can have As₄ can mean Ala or Gly, As₅ can have the meanings Ser, Ala or Val, As₆ the Can have meanings, Ile, Ala or Val, As₇ die Can have meanings Leu, Ala or Val and As₈ the Can have meanings Gly, Ala or Val.

Ganz besonders bevorzugt weisen die erfindungsgemäßen Arzneimittel ein Peptid mit der FormelThe present invention very particularly preferably Medicinal a peptide with the formula

L-Histidyl-L-seryl-L-asparagyl-L-alanyl-L-isoleucyl-L- phenylalanyl-L-threonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-tyrosyl- L-seryl-L-lysyl-L-leucyl-L-leucyl-L-alanyl-L-lysyl-L-leucyl- L-alanyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-lysyl-L-tyrosyl-L-leucy l-L- alanyl-L-seryl-L-isoleucyl-L-leucyl-glycinL-histidyl-L-seryl-L-asparagyl-L-alanyl-L-isoleucyl-L- phenylalanyl-L-threonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-tyrosyl L-seryl-L-lysyl-L-leucyl-L-leucyl-L-alanyl-L-lysyl-L-leucyl- L-alanyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-lysyl-L-tyrosyl-L-leucy l-L- alanyl-L-seryl-L-isoleucyl-L-leucyl-glycine

auf. on.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, daß ein Teil am N-Terminus für die Beibehaltung der Aktivität essentiell ist. Bevorzugt weisen daher die erfindungsgemäßen Peptide die TeilsequenzIn the context of the present invention, it has been found that that part at the N-terminus for maintaining activity is essential. Therefore, the invention preferably Peptides the partial sequence

His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-ThrHis-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr

auf.on.

Weiterhin wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, daß die erfindungsgemäß verwendeten Peptide am N- Terminus eine zusätzliche Aminosäure aufweisen können, wobei jedoch das Peptid nicht mehr als 34 Aminosäuren umfaßt. Diese zusätzliche Aminosäure am N-Terminus hat bevorzugt die Bedeutung Ala.Furthermore, within the scope of the present invention found that the peptides used according to the invention on the N- Terminus can have an additional amino acid, where however, the peptide comprises no more than 34 amino acids. This additional amino acid at the N-terminus is preferred Meaning of Ala.

Außerdem wurde im Rahmen der Erfindung gefunden, daß die erfindungsgemäßen Peptide am N-Terminus modifiziert, insbesondere acetyliert sein können.In addition, it was found within the scope of the invention that the peptides according to the invention modified at the N-terminus, in particular can be acetylated.

Hinsichtlich des C-Terminus wurde herausgefunden, daß die erfindungsgemäßen Peptide am C-Terminus statt der freien Carboxylgruppe eine Carboxamidgruppe aufweisen können.With regard to the C-terminus, it was found that the Peptides according to the invention at the C-terminus instead of the free ones Carboxyl group may have a carboxamide group.

In den erfindungsgemäßen Arzneimitteln können die Peptide in einer pharmazeutisch annehmbaren Form vorliegen. Das Peptid kann dabei in der Form eines Salzes vorliegen, wobei das Gegenion pharmazeutisch annehmbar sein muß. Beispiele hierfür wären das Acetat, Citrat oder Chlorid.In the pharmaceuticals according to the invention, the peptides can be in in a pharmaceutically acceptable form. The peptide can be in the form of a salt, the Counterion must be pharmaceutically acceptable. Examples of this would that be acetate, citrate or chloride.

Die Darstellung der Peptide gelingt mit Hilfe der an sich bekannten Festphasensynthese und ist auch in größerem Umfang durchführbar. Die weiteren Einzelheiten bezüglich der synthetischen Darstellung sind in Beispiel 1 näher erläutert. The representation of the peptides succeeds with the help of known solid phase synthesis and is also on a larger scale feasible. The further details regarding the Synthetic representation are explained in more detail in Example 1.

Alternativ hierzu können die erfindungsgemäß verwendeten Peptide auch mit Hilfe gentechnologischer Mittel hergestellt werden. Hierzu ist es erforderlich, eine Nucleotidsequenz zu synthetisieren, die für das gewünschte erfindungsgemäße Peptid kodiert. Diese Nucleotidsequenz wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut und in einen Wirtsorganismus eingeführt. Bei dem Wirtsorganismus kann es sich um Bakterien, Hefen oder verschiedene Zellkulturen handeln, wobei im vorliegenden Fall Bakterien aufgrund der leichten Handhabbarkeit bevorzugt sind. Die Expression der erfindungsgemäßen Peptide kann als Fusionsprotein erfolgen und, wobei der Fusionsanteil nach der Expression von dem gewünschten Peptid durch an sich bekannte Maßnahmen abgetrennt wird.Alternatively, those used according to the invention can be used Peptides are also produced using genetic engineering means will. For this it is necessary to add a nucleotide sequence synthesize that for the desired invention Encoded peptide. This nucleotide sequence is divided into one appropriate expression vector built into a Host organism introduced. With the host organism it can bacteria, yeasts or different cell cultures act, in the present case bacteria due to easy manageability are preferred. The expression of the Peptides according to the invention can be carried out as a fusion protein and, the fusion fraction after expression of the desired peptide by measures known per se is separated.

Die erfindungsgemäßen Arzneimittel liegen bevorzugt in einer topisch anwendbaren Formulierung vor. Besonders bevorzugt handelt es sich hierbei um einen Spray oder ein Aerosol. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel eignen sich gut zur Behandlung einer Erkrankung der Atemwege, wobei das oder die pharmakologisch aktive Peptid bzw. Peptide in Form eines Inhalationssprays verabreicht werden können.The medicaments according to the invention are preferably in one topically applicable formulation. Particularly preferred it is a spray or an aerosol. The Medicaments according to the invention are well suited for treatment a respiratory disease, which or that pharmacologically active peptide or peptides in the form of a Inhalation sprays can be administered.

Die erfindungsgemäß verwendeten Peptide können zur Behandlung von verschiedenartigen Krankheiten des Lungenbereiches eingesetzt werden. Bevorzugt werden die Peptide zur Behandlung von Bronchialasthma, zur Behandlung einer Lungenentzündung, zur Behandlung von Krebserkrankungen der Lunge oder zur Behandlung einer Erkrankung, die durch einen Mangel des Hormons/Neurotransmitters VIP (Vasoactive Intestinal Peptide) hervorgerufen wird, verwendet.The peptides used according to the invention can be used for treatment of various diseases of the lung area be used. The peptides are preferably used for Treatment of bronchial asthma, used to treat a Pneumonia, used to treat cancer of the Lung or to treat a condition caused by a Deficiency of the hormone / neurotransmitter VIP (Vasoactive Intestinal peptides) is used.

Das ursprünglich aus dem Gift des "Gila monster" Heloderma suspectum isolierte Pentatriacontapeptid-amid Helodermin bewirkt eine lang anhaltende Relaxation der Trachea, was zunächst auf das Vorliegen der enzymatisch schwer angreifbaren C-terminalen Sequenz -Pro-Pro-Pro-amid zurückgeführt wurde. Überraschenderweise wurde aber nun gefunden, daß die für eine Asthma-Therapie erforderliche Langzeit-Aktivität auch erhalten bleibt, wenn die Peptidkette am Carboxylende um 7 Aminosäure-Reste verkürzt wird. Das synthetisch in reiner Form hergestellte Oktacosapeptidamid mit der Bezeichnung Helodermin-(1-28)-amid und der AminosäuresequenzOriginally from the poison of the "Gila monster" Heloderma suspectum isolated pentatriacontapeptide amide helodermin causes long-lasting relaxation of the trachea, what initially on the presence of enzymatically difficult vulnerable C-terminal sequence -Pro-Pro-Pro-amid was returned. Surprisingly, however, now found that required for asthma therapy Long-term activity is also retained when the peptide chain is shortened by 7 amino acid residues at the carboxyl end. The synthetically produced in pure form Octacosapeptidamid with the designation helodermin- (1-28) -amide and the Amino acid sequence

H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr- Ser-Lys-Leu-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser- Ile-Leu-Gly-NH₂H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr- Ser-Lys-Leu-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser- Ile-Leu-Gly-NH₂

weist in vitro praktisch dieselbe Trachea- Relaxation wie VIP auf und ist dabei so langanhaltend wirksam wie der Naturstoff Helodermin. Die beobachtete Langzeit- Wirkung von verkürzten Helodermin-Fragmenten kann nun möglicherweise auf die Tryptase-resistente Sequenz 12-15, d.i. -Lys-Leu-Leu-Ala- zurückgeführt werden, die die bevorzugten Tryptase-Spaltstellen Arg¹², Arg¹⁴ und Lys¹⁵ des VIP nicht mehr enthält.shows practically the same trachea in vitro Relaxation like VIP on and is so long-lasting like the natural product helodermin. The observed long-term Effect of shortened helodermin fragments can now possibly on the tryptase-resistant sequence 12-15, d.i. -Lys-Leu-Leu-Ala- who are the preferred tryptase cleavage sites Arg¹², Arg¹⁴ and Lys¹⁵ des VIP no longer contains.

Ein weiterer bedeutender Vorteil der erfindungsgemäß eingesetzten Peptide ist, daß die Synthese wegen des Fehlens der "problematischen" Aminosäuren Arginin und Methionin wesentlich einfacher und billiger durchzuführen ist als die von VIP und VIP-ähnlichen Substanzen. Außerdem ist die chemisch sehr instabile (Gefahr der Desamidierung bei Synthese, Aufarbeitung und Lagerung), aber für die Wirkung essentielle VIP-Dipeptidsequenz -Asp⁸-Asn⁹- durch die weniger empfindliche Sequenz -Gln⁸-Gln⁹- ersetzt. Ein weiterer Vorteil ist das Fehlen der Asparagin-Reste in den VIP- Positionen 24 und 28, wodurch der schrittweise Aufbau der Peptidkette bei Anwendung der Festphasen-Methode weit weniger durch Assoziation der wachsenden Peptidkette gestört ist.Another significant advantage of the invention Peptides used is that the synthesis because of the lack the "problematic" amino acids arginine and methionine is much easier and cheaper to carry out than that of VIP and VIP-like substances. Besides, that is chemically very unstable (risk of deamidation Synthesis, processing and storage), but for the effect essential VIP dipeptide sequence -Asp⁸-Asn⁹- by the less sensitive sequence -Gln⁸-Gln⁹- replaced. Another Advantage is the lack of asparagine residues in the VIP Positions 24 and 28, which leads to the gradual build-up of the Peptide chain using the solid phase method far less is disrupted by association of the growing peptide chain.

Die chemische Synthese von Helodermin-Fragment-(1-28)-amid wurde mittels der Fmoc-Festphasen-Methode zur Peptidsynthese (Sheppard-Verfahren) unter Verwendung der üblichen Schutzgruppen-Kombination mit optimierten Methoden an einem speziellen Rink-Amid-MBHA-Harz durchgeführt. Nach üblicher acidolytischer Entfernung von Harz und Schutzgruppen wurde das Helodermin-Fragment in einem speziell entwickelten chromatographischen Prozeß in vier Stufen gereinigt und mit den üblichen Methoden der Peptidchemie (Aminosäureanalyse, Massenspektrometrie, HPLC-Test) analytisch charakterisiert.Chemical synthesis of helodermin fragment (1-28) amide was using the Fmoc solid phase method for peptide synthesis (Sheppard method) using the usual Protection group combination with optimized methods on one special Rink-Amid-MBHA resin. After usual acidolytic removal of resin and protecting groups has been used the helodermin fragment in a specially developed chromatographic process in four stages and cleaned with the usual methods of peptide chemistry (amino acid analysis, Mass spectrometry, HPLC test) characterized analytically.

Die biologischen Eigenschaften der Helodermin-Fragmente wurden im Vergleich zu denen der Naturstoffe Helodermin und VIP in vitro wie folgt getestet: Isolierte Streifen der Trachea des Meerschweinchens wurden mit einer Lösung von Methacholin zur Kontraktion gebracht; danach wurde die mit verschiedenen Konzentrationen der zu testenden Substanzen erzielte prozentuale Relaxation gemessen und die Dauer dieser Wirkung bestimmt. Die durch in vivo Messung der Bronchodilations-Wirkung in einem Tiermodell (anästhesierte Meerschweinchen) durch intratracheale Druckmessung und Ermittlung der Luftströmungsrate erhaltenen Werte belegen die überraschende Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen.The biological properties of the helodermin fragments were compared to those of the natural substances helodermin and VIP tested in vitro as follows: Isolated strips of Trachea of the guinea pig was treated with a solution of Brought methacholine to contraction; after that the was different concentrations of the substances to be tested achieved percentage relaxation measured and the duration of this Effect determined. The by in vivo measurement of the Bronchodilation effect in an animal model (anesthetized Guinea pigs) by intratracheal pressure measurement and Determination of the air flow rate obtained confirm the values surprising effect of the used according to the invention Links.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert.The present invention is illustrated by the following Examples explained in more detail.

example 1 Chemical synthesis of the octacosapeptide amide

H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-Ser-Lys-Leu-Leu- Ala-Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Ile-Leu-Gly-NH₂ = Helodermin-Fragment-(i-28)-amid (1).H-His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-Ser-Lys-Leu-Leu- Ala-Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Ile-Leu-Gly-NH₂ = Helodermin fragment (i-28) amide (1).

A. Construction of the all-round protected peptide chain on one insoluble polymeric carrier

Das mit in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen versehene lineare Peptid-amid 1 wird nach dem bekannten Prinzip der von B. Merrifield begründeten Festphasensynthese unter Anwendung der sog. FMOC-Strategie (Fmoc- = 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-) an einem für die Synthese von Peptidamiden geeigneten Polystyrol-Harz wie folgt synthetisiert:The one with protective groups customary in peptide chemistry linear peptide amide 1 is based on the known principle of B. Merrifield established solid phase synthesis using the so-called FMOC strategy (Fmoc- = 9-fluorenylmethoxycarbonyl-) on a suitable for the synthesis of peptide amides Polystyrene resin synthesized as follows:

In einem modifizierten, heizbaren Schüttelgefäß eines halbautomatischen Peptid-Synthesizers, Modell Labortec SP 640 (Fa. Bachem AG, Bubendorf, Schweiz), läßt man 1.5 g Fmoc- Rink-Amid-MBHA-Polystyrol-Harz (Beladung 0.4 mMol/g; Fa. Novabiochem, Läufelfingen, Schweiz, Kat-Nr. 01-64-0037) in einem Lösungsmittelgemisch aus N-Methyl pyrrolidon/Dichlormethan, d.i. NMP/DCM = 8 : 2 (v/v) 30 Min. lang unter Schütteln quellen. Nach Abspaltung der Fmoc-Gruppe vom Harz mit zwei Portionen 20%-igem Piperidin in NMP (3 Min. und 12 Min.) und mehrmaligem Auswaschen des Harzes mit NMP und DCM werden 388 mg (1.2 mMol) Fmoc-Glycin-N- carboxyanhydrid (Fmoc-Gly-NCA; alle Fmoc-Aminosäure-Derivate von der Fa. Propeptide, Frankreich), und 324 mg (1.8 mMol) N- Hydroxybenzotriazol (HaBt) in 40 ml NMP zugegeben. Man läßt 90 Min. unter Schütteln bei 50°C reagieren. Danach wird die Reaktionslösung abgesaugt und das Harz mit NMP und DCM (je zwei Portionen à 40 ml) gewaschen. Eine Nachkupplung mit denselben Kupplungsreagentien wird in NMP/DcM = 8 : 2 (v/v) weitere 90 Min bei Raumtemperatur durchgeführt und erneut ausgewaschen.In a modified, heatable shaker semi-automatic peptide synthesizer, model Labortec SP 640 (Bachem AG, Bubendorf, Switzerland), 1.5 g Fmoc- Rink amide MBHA polystyrene resin (loading 0.4 mmol / g; Novabiochem, Läufelfingen, Switzerland, cat. No. 01-64-0037) in a mixed solvent of N-methyl pyrrolidone / dichloromethane, d.i. NMP / DCM = 8: 2 (v / v) 30 min. swell for a long time with shaking. After the Fmoc group was split off of the resin with two portions of 20% piperidine in NMP (3 min. And 12 min.) And washing out the resin several times with NMP and DCM, 388 mg (1.2 mmol) of Fmoc-glycine-N- carboxyanhydride (Fmoc-Gly-NCA; all Fmoc-amino acid derivatives from Propeptide, France), and 324 mg (1.8 mmol) N- Hydroxybenzotriazole (HaBt) added in 40 ml NMP. You leave React for 90 minutes while shaking at 50 ° C. After that the Aspirated reaction solution and the resin with NMP and DCM (each two 40 ml portions). A clutch with the same coupling reagents are used in NMP / DcM = 8: 2 (v / v) performed another 90 min at room temperature and again washed out.

Alle weiteren Aminosäuren werden mit demselben beschriebenen Synthesezyklus und den gleichen Molverhältnissen nach jeweiliger Fmoc-Abspaltung schrittweise aufgekuppelt. Dabei werden folgende Aminosäure-Derivate (je 1.2 mMol) verwendet: 405 mg Fmoc-Ala-NCA, 525 mg Fmoc-Asp(OtBu)-NCA, 456 mg Fmoc- Ile-NCA, 456 mg Fmoc-Leu-NCA, 594 mg Fmoc-Lys(Boc)-NCA, 492 mg Fmoc-Ser(tBu)-NCA, 508 mg Fmoc-Thr(tBu)-NCA und 529 mg Fmoc-Tyr(tBu)-NCA. 1116 mg (1.8 mMol) Fmoc-His(Trt)-OH bzw. 1253 mg (1.8 mMol) Fmoc-Gln(Mtt)-OH werden mit je 486 mg (2.7 mMol) HOBt und 412 mg (2.0 mMol) Dicyclo hexylcarbodiimid (DCCI) in NMP/DCM = 8 : 2 (v/v) zweimal je 180 Min. bei RT zur Reaktion gebracht. Die Vollständigkeit aller Kupplungsreaktionen wird mit dem üblichen Ninhydrin- Test (Kaiser Test) kontrolliert.All other amino acids are described with the same Synthesis cycle and the same molar ratios respective Fmoc splitting up step by step. Here The following amino acid derivatives (1.2 mmol each) are used: 405 mg Fmoc-Ala-NCA, 525 mg Fmoc-Asp (OtBu) -NCA, 456 mg Fmoc- Ile-NCA, 456 mg Fmoc-Leu-NCA, 594 mg Fmoc-Lys (Boc) -NCA, 492 mg Fmoc-Ser (tBu) -NCA, 508 mg Fmoc-Thr (tBu) -NCA and 529 mg Fmoc-Tyr (tBu) -NCA. 1116 mg (1.8 mmol) Fmoc-His (Trt) -OH or 1253 mg (1.8 mmol) of Fmoc-Gln (Mtt) -OH are mixed with 486 mg each (2.7 mmol) HOBt and 412 mg (2.0 mmol) dicyclo hexylcarbodiimide (DCCI) in NMP / DCM = 8: 2 (v / v) twice each Reacted for 180 min at RT. The completeness all coupling reactions are carried out with the usual ninhydrin Test (Kaiser Test) controlled.

B. Elimination of synthetic resin and protective groups

Nach dem Ankuppeln der letzten N-terminalen Aminosäure, d.i. Fmoc-His(Trt), wird die Fmoc-Gruppe wie üblich mit 20%-igem Piperidin entfernt. Nach mehrmaligem gründlichem Waschen des verbleibenden Peptid-Harzes mit NMP und zuletzt mit DCM schüttelt man 60 Min. mit 40 ml Trifluoressigsäure/Wasser (TFA/H₂O = 95 : 5, v/v), trennt das unlösliche Harz durch Filtration ab und wäscht mit 40 ml DCM nach. Zu der TFA/H₂O/DCM-Lösung des rohen, ungeschützten Peptid-amids 1 gibt man noch 40 ml Toluol und entfernt danach alle Lösungsmittel i.Vak, zuletzt kurz bei 50°C Das verbleibende Öl digeriert man mit 80 ml tert.-Butyl-methylether und gibt dann 40 ml Petroleumbenzin (40-60°C) zu. Der dabei gebildete flockige Niederschlag wird abfiltriert und gründlich mit Diethylether und Petroleumbenzin gewaschen. Danach wird er in 100 ml 2%-iger Essigsäure gelöst und die Lösung durch ein 0.22 µ Membranfilter filtriert. Aus dem Filtrat werden 1504 mg rohes 1 durch Lyophilisieren isoliert.After coupling the last N-terminal amino acid, i.e. Fmoc-His (Trt), the Fmoc group as usual with 20% Piperidine removed. After washing the remaining peptide-resin with NMP and finally with DCM shake for 60 min with 40 ml of trifluoroacetic acid / water (TFA / H₂O = 95: 5, v / v), separates the insoluble resin Filtration and washes with 40 ml DCM. To the TFA / H₂O / DCM solution of the crude, unprotected peptide amide 1 40 ml of toluene are added and then all are removed Solvent in vacuo, lastly briefly at 50 ° C The remaining Oil is digested with 80 ml of tert-butyl methyl ether and added then add 40 ml of petroleum spirit (40-60 ° C). The one educated flaky precipitate is filtered off and thoroughly with Washed diethyl ether and petroleum ether. After that he gets in 100 ml of 2% acetic acid dissolved and the solution by 0.22 µ membrane filter filtered. Become from the filtrate 1504 mg of crude 1 isolated by lyophilization.

C. Purification of helodermin fragment (1-28) amide a) Gel chromatography on Sephadex G-25 sf

Eine Chromatographiesäule von 130 cm Länge und 2 cm Durchmesser füllt man wie üblich mit in 2%-iger Essigsäure gequollenem Sephadex G-25 superfein (Fa. Pharmacia, Freiburg). Darauf bringt man eine filtrierte Lösung von 200 mg des rohen 1 (siehe oben unter B) in 20 ml 2%-iger Essigsäure und eluiert mit demselben Lösungsmittel bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/Min. Das Eluat fängt man in Fraktionen von 5 ml in den Zellen eines Fraktionssammlers auf (Fa. Abimed, Langenfeld), wobei die Peptidverteilung durch kontinuierliche Registrierung der Extinktion der Lösung bei 226 nm und 254 nm (LKB-Pharmacia-Uvicord S-II) ermittelt wird. Nach Vereinigen der Fraktionen 22 bis 30 isoliert man das Peptidmaterial durch Lyophilisieren und erhält 141 mg vorgereinigtes 1.A chromatography column 130 cm long and 2 cm Diameter is filled with 2% acetic acid as usual swollen Sephadex G-25 super fine (Pharmacia, Freiburg). Then bring a filtered solution of 200 mg of the crude 1 (see above under B) in 20 ml of 2% Acetic acid and eluted with the same solvent at one Flow rate of 1 ml / min. The eluate is caught in Fractions of 5 ml in the cells of a fraction collector (Fa. Abimed, Langenfeld), the peptide distribution by continuous registration of the absorbance of the solution 226 nm and 254 nm (LKB-Pharmacia-Uvicord S-II) determined becomes. After the fractions 22 to 30 are combined, they are isolated the peptide material by lyophilization and receives 141 mg pre-cleaned 1.

b) high pressure liquid chromatography (HPLC) on a 10 µ C₁₈ reversed phase column

An einer mit 10 µ Nucleosil-100-C₁₈ PPN (Fa. Machery & Nagel, Düren) gefüllten präparativen HPLC-Säule von 25 cm Länge und 2 cm Durchmesser werden je 30 mg vorgereinigtes 1 (aus a) mit einem Zweikomponenten Hochdruck-Gradienten (HPLC-Apparatur der Fa. Abimed) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 10 ml/Min. wie üblich chromatographiert. Lösungsmittel A: 0.1%-ige wäßrige Trifluoressigsäure, Lösungsmittel B: Acetonitril mit 0.08% Trifluoressigsäure. Nach 15 Min. isokratischer Elution mit 66% A und 34% B wird der Anteil von B in weiteren 5 Minuten linear von 34% auf 42% erhöht, wobei die Peptidverteilung durch kontinuierliche Registrierung der Extinktion des Eluates bei 230 nm ermittelt wird. Aus der bei etwa 36 bis 40 Min. eluierten Lösung wird der Hautanteil des Acetonitrils i.Vak. abdestilliert. Durch Lyophilisieren der aus 10 getrennten Chromatographieläufen erhaltenen Restlösung werden 105 mg gereinigtes 1 als Trifluoracetat isoliert. Dieses Peptidmaterial wird durch Wiederholung der unter a) beschriebenen Gelchromatographie nachgereinigt und dabei in das Acetat übergeführt. Man erhält letztlich 85 mg reines, wasserhaltiges Essigsäuresalz von 1 mit der Zusammensetzung L-Histidyl-L-seryl-L-asparagyl-L- alanyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-glutaminyl-L- glutaminyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-lysyl-L-leucyl-L-leucyl-L- alanyl-L-lysyl-L-leucyl-L-alanyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L- lysyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-al anyl-L-seryl-L-isoleucyl-L- leucyl-glycin-amid · x Acetat = Helodermin-Fragment-(1-28)- amid. On a with 10 μ Nucleosil-100-C₁₈ PPN (Machery & Nagel, Düren) filled preparative HPLC column of 25 cm in length and 2 cm in diameter, each with 30 mg of pre-cleaned 1 (from a) a two-component high-pressure gradient (HPLC apparatus from Abimed) at a flow rate of 10 ml / min. chromatographed as usual. Solvent A: 0.1% aqueous trifluoroacetic acid, solvent B: Acetonitrile with 0.08% trifluoroacetic acid. After 15 min. The share is isocratic elution with 66% A and 34% B. from B increased linearly from 34% to 42% in a further 5 minutes, where the peptide distribution by continuous Registration of the absorbance of the eluate determined at 230 nm becomes. The solution eluted at about 36 to 40 minutes the skin portion of the acetonitrile in vac. distilled off. By Lyophilize the from 10 separate chromatography runs obtained residual solution are 105 mg of purified 1 as Trifluoroacetate isolated. This peptide material is made by Repetition of the gel chromatography described under a) subsequently cleaned and thereby converted into the acetate. You get ultimately 85 mg of pure, water-containing acetic acid salt of 1 with the composition L-histidyl-L-seryl-L-asparagyl-L- alanyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-glutaminyl-L- glutaminyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-lysyl-L-leucyl-L-leucyl-L- alanyl-L-lysyl-L-leucyl-L-alanyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L- lysyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-al anyl-L-seryl-L-isoleucyl-L- leucyl-glycine amidex acetate = helodermin fragment- (1-28) - amid.

Analytical characterization

1) Analytische HPLC an einer 5 µ Nucleosil-100-C₁₈ PPN Säule von 140 mm × 4 mm (Machery & Nagel) mit dem bei b) genannten Lösungsmittelsystem. Reinheitsgrad des Peptidanteils: ca. 95% (abhängig vom Grad der Vollständigkeit der präparativen Kupplungsreaktionen bei der Synthese).1) Analytical HPLC on one 5 µ Nucleosil-100-C₁₈ PPN column of 140 mm × 4 mm (Machery & Nagel) with the solvent system mentioned in b). Degree of purity of the peptide portion: approx. 95% (depending on the degree the completeness of the preparative coupling reactions synthesis).

2) Quantitative Aminosäureanalyse an einem LC 6001 Flüssigkeits-Chromatographen (Fa. Biotronik, Frankfurt/M) nach saurer Totalhydrolyse mit 6 n HCl (24 Stdn. bei 110°C) zur Bestätigung der Aminosäurezusammensetzung und zur Ermittlung des Peptidgehaltes der Lösung: Gefunden (berechnet): Asp 0.98 (1), Thr 1.01 (1), Ser 2.86 (3), Glu 3.05 (3), Gly 1.05 (1), Ala 3.93 (4), Ile 1.75 (2), Leu 5.66 (6), Tyr 2.00 (2), Phe 0.92 (1), His 1.02 (1), Lys 3.06 (3); Peptidgehalt: 82%.2) Quantitative amino acid analysis on one LC 6001 liquid chromatograph (Biotronik, Frankfurt / M) after acidic total hydrolysis with 6N HCl (24 hrs. at 110 ° C) to confirm the amino acid composition and to determine the peptide content of the solution: found (calculated): Asp 0.98 (1), Thr 1.01 (1), Ser 2.86 (3), Glu 3.05 (3), Gly 1.05 (1), Ala 3.93 (4), Ile 1.75 (2), Leu 5.66 (6), Tyr 2.00 (2), Phe 0.92 (1), His 1.02 (1), Lys 3.06 (3); Peptide content: 82%.

3) "Fast atom bombardment"-Massenspektrometrie (FAB-MS) an einem MAT 900 Massenspektrometer (Fa. Finnigan MAT, Bremen) zur Bestätigung der monoisotopischen Molmasse. Gefunden für [M+H]⁺: 3.119.9; berechnet: 3.119.8.3) Fast atom bombardment mass spectrometry (FAB-MS) a MAT 900 mass spectrometer (Finnigan MAT, Bremen) to confirm the monoisotopic molecular weight. Found for [M + H] ⁺: 3,119.9; calculated: 3.119.8.

c) Fine cleaning

Zur Erzielung eines höchsten Reinheitsgrades kann eine Feinreinigung durch Ionenaustauschchromatographie an CM- Sephadex C-25 mit Ammoniumacetat-Puffern (0.05 M, pH 6.5 bis 1.0 M, pH 6.5) sowie eine zweite präparative HPLC an einer 5 µ Nucleosil-100-C₁₈ PPN Säule im System 0.5%ige wäßrige Phosphorsäure/Acetonitril mit anschließender Entsalzung (nach Neutralisation mit NH₃) an Sephadex G-25 sf angewendet werden.To achieve the highest degree of purity, a Fine purification by ion exchange chromatography on CM Sephadex C-25 with ammonium acetate buffers (0.05 M, pH 6.5 to 1.0 M, pH 6.5) and a second preparative HPLC on one 5 µ Nucleosil-100-C₁₈ PPN column in the system 0.5% aqueous Phosphoric acid / acetonitrile with subsequent desalination (after Neutralization with NH₃) applied to Sephadex G-25 sf will.

Claims

1. Medicament, characterized in that it comprises a peptide with an amino acid sequence which has a homology of at least 50% to the amino acid sequence His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-Ser-Lys- Leu-Leu-Ala-Lys-Leu-Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-Ser-Ile-Leu-Gly, the peptide comprising more than 20 amino acids and less than 35 amino acids.

2. Medicament according to claim 1, characterized in that the peptide has a homology to that specified in claim 1 Sequence of at least 70%.

3. Medicament according to claim 2, characterized in that the peptide has a homology to that specified in claim 1 Sequence of at least 90%.

4. Medicament according to claim 1, characterized in that the peptide has the following amino acid sequence: His-Ser-Asp-As₁-As₂-Phe-Thr-Gln-Gln-Tyr-As₃-Lys-Leu-Leu-As₄- Lys-Leu -Ala-Leu-Gln-Lys-Tyr-Leu-Ala-As₅-As₆-As₇-As₈, where the residues designated As represent amino acids and As _{1 can have} the meaning Gly or Ala, As₂ can have the meaning Ile or Val , As₃ can have the meaning Ser or Thr, As₄ can have the meaning Ala or Gly, As₅ can have the meaning Ser, Ala or Val, As₆ can have the meaning, Ile, Ala or Val, As _{7 has} the meaning Leu, Ala or Val can have and As _{8 can have} the meanings Gly, Ala or Val.

5. Medicament according to one of the preceding claims, characterized in that the peptide has the formula L-histidyl-L-seryl-L-asparagyl-L-alanyl-L-isoleucyl-L- phenylalanyl-L-threonyl-L-glutaminyl-L-glutaminyl-L-tyrosyl L-seryl-L-lysyl-L-leucyl-L-leucyl-L-alanyl-L-lysyl-L-leucyl- L-alanyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-lysyl-L-tyrosyl-L-leucy l-L- alanyl-L-seryl-L-isoleucyl-L-leucyl-glycine.

6. Medicament according to one of claims 1 to 3, characterized characterized in that the peptide has the partial sequence His-Ser-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr.

7. Medicament according to one of the preceding claims, characterized in that the peptide at the N-terminus has additional amino acid, but the peptide comprises no more than 34 amino acids.

8. Medicament according to claim 7, characterized in that the additional amino acid at the N-terminus means Ala Has.

9. Medicament according to one of the preceding claims, characterized in that the N-terminus of the peptide modified, especially acetylated.

10. Medicament according to one of the preceding claims, characterized in that the peptide takes place at the C-terminus the free carboxyl group has a carboxamide group.

11. Medicament according to one of the preceding claims, characterized in that the peptide in the form of a pharmaceutically acceptable salt is present.

12. Medicament according to one of the preceding claims, characterized in that it is in a topically applicable There is wording.

13. Medicament according to claim 12, characterized in that it is a spray or an aerosol.

14. Medicament according to one of the preceding claims, characterized in that it is a drug for Treatment of a respiratory disease.

15. Use of a in the medicaments according to claim 1 to 14 peptides present for the treatment of Bronchial asthma.

16. Use of a in the medicaments according to claim 1 to 14 peptides present to treat a Lung infection.

17. Use of a in the medicaments according to claim 1 to 14 peptides present for the treatment of Cancer of the lungs.

18. Use of a in the medicaments according to claim 1 up to 14 peptides available to treat a disease, caused by a lack of the hormone / neurotransmitter VIP (Vasoactive Intestinal Peptide).