DE19528544A1

DE19528544A1 - cDNA sequence and amino acid sequence derived therefrom of the precursor protein of human GCAP II / uroguanylin and amino acid sequence of the fragment circulating in human blood

Info

Publication number: DE19528544A1
Application number: DE1995128544
Authority: DE
Inventors: Wolf-Georg Prof Dr M Forssmann
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-08-03
Filing date: 1995-08-03
Publication date: 1997-02-06
Also published as: WO1997006258A2; WO1997006258A3; AU6789296A

Abstract

The invention concerns a peptide from human blood, designated GCAP-II (guanylate cyclase activating peptide), the structure of which has been elucidated for the use of the substance as a drug for diagnostic, medical and industrial purposes. The isolation of the GCAP-II peptide proves its existence. The removal of certain amino acids from GCAP-II reduces its biological effectiveness. The GCAP-II circulating in human blood is identical to the synthetic GCAP-II reference substance, but not to other peptides or its fragments. The molecular formula of GCAP-II has been found using mass spectrometry. A different biological activity and differences in the three-dimensional peptide structure of GCAP-II compared with other GCAP-II fragments show that this GCAP-II fragment is a high-quality natural peptide belonging to a family with a peptide group which is suitable for use in treating numerous conditions which progress hand in hand with electrolyte-transport disorders in cells as well as for use in treating, in particular, diseases of endocrine organs. In addition, GCAP-II can be used industrially as the natural raw extract, or in purified form, for research into new cell functions. These discoveries concerning the structure of the cDNA and gene structure of GCAP-II can be used for future diagnostic and therapeutic concepts based on the invention.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Eiweißstoffes in reiner oder partiell aufgereinigter Form aus menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten, der die Fähigkeit besitzt, den transepithelialen Transport von Elektrolyten und Wasser zu steuern. Dieser Stoff ist dadurch gekennzeichnet, daß er insbesondere aus Hemofiltrat oder Hemodialysat, das aus menschlichem und tierischem Blut abfiltriert wird, gewonnen werden kann. Der Stoff ist als Guanylatcyclase Activating Peptide II (GCAP-II) bezeichnet und kann zum Zwecke (1) der Analyse von Erkrankungen, (2) zur medizinischen und gewerblichen Verwendung als Medikament benutzt werden. The invention relates to a method for obtaining a protein in pure or partial purified form from human and animal body fluids, which has the ability to control the transepithelial transport of electrolytes and water. This stuff is through characterized in that it consists in particular of hemofiltrate or hemodialysate, which is derived from human and animal blood is filtered, can be obtained. The substance is called guanylate cyclase Activating Peptide II (GCAP-II) and can be used for the purpose of (1) the analysis of Diseases, (2) used for medical and commercial use as a drug will.

Der Stoff GCAP-II wurde erstmals aus dem Hemofiltrat Nierenkranker nach Ultrafiltration am Hemodialyseapparat gewonnen und über einen Biotest der Stimulation der Guanylatcyclase-C von Darmzellen (T84-Zellinie) funktionell charakterisiert. Zur Darstellung des GCAP-II wurde ein patentiertes Verfahren (Forssmann, 1988; Offenlegungsschrift DE 36 33 707 A1) verfeinert, welches zuvor für Gewinnung von Eiweißstoffen aus Hemofiltrat erfunden wurde. Aus den mit diesem Verfahren gewonnenen Molekülen von einem Molekulargewicht unter 20 kDalton, die bei veno-ve nöser oder arterio-venöser Shuntverbindung abfiltriert werden, können die Fraktionen enthaltend das GCAP-II überraschenderweise durch einen Funktionstest erkannt werden. Das bisher bekannte Verfahren wurde also benutzt, um die Rohpeptidextrakte zu gewinnen, mit denen überraschenderweise bei der Anwendung an T84-Kolonkarzinomzellen in Zellkultur ein starker Effekt bemerkt wurde, indem die Generierung des Second Messengers cGMP unter dem Einfluß dieser Substanz überraschend stark aktiviert wurde. Es wurde weiter festgestellt, daß bei speziellen weiteren Aufreinigungsverfahren diese biologische Aktivität konzentriert werden konnte, bis schließlich ein einheitlicher Eiweißstoff identifiziert und in seiner Struktur aufgeklärt wurde. Der Wert dieser Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß dieser Stoff aus dem bisher als wertlos betrachteten Hemofiltrat aufgereinigt werden kann, um als wirtschaftlich verwertbare Substanz benutzt zu werden. Der genannte Stoff GCAP-II ist weiter dadurch gekennzeichnet, daß er durch chemische Synthese und durch gentechnologische Produktion gewonnen werden kann und überraschenderweise für zahlreiche weitere Belange genutzt werden kann, u. a. für die Analyse im menschlichen Blut als pathognomonisches Diagnosemerkmal von Erkrankungen des Magen-Darm- und Urogenitaltraktes sowie des Respirationstraktes, cardiovasculären Systems und des Nervenapparates.The substance GCAP-II was first developed from the hemofiltrate of kidney patients after ultrafiltration on Hemodialysis apparatus and obtained via a bioassay of stimulation of guanylate cyclase-C by Intestinal cells (T84 cell line) functionally characterized. To display the GCAP-II, a patented process (Forssmann, 1988; published application DE 36 33 707 A1) refined which was previously invented for the extraction of proteins from hemofiltrate. From the one with this Process obtained molecules of a molecular weight below 20 kDalton, which in veno-ve the fractions can be filtered off, or the arterio-venous shunt compound can be filtered off the GCAP-II is surprisingly recognized by a function test. The previously known The method was therefore used to obtain the crude peptide extracts with which Surprisingly, a strong one when used on T84 colon carcinoma cells in cell culture Effect was noticed by the generation of the Second Messenger cGMP under the influence this substance was surprisingly strongly activated. It was further found that in the case of special further purification processes this biological activity could be concentrated until Finally, a uniform protein substance was identified and its structure was elucidated. Of the Value of this invention is characterized in that this substance from the previously considered worthless considered hemofiltrate can be purified to as an economically usable substance to be used. Said substance GCAP-II is further characterized in that it is characterized by chemical synthesis and can be obtained through genetic engineering production and can surprisingly be used for numerous other purposes, including a. for analysis in human blood as a pathognomonic diagnostic feature of gastrointestinal disorders and urogenital tract as well as the respiratory tract, cardiovascular system and the Nervous system.

Die vorliegende Erfindung betrifft also ein neues Peptid, das GCAP-II (Guanylatcyclase Activating Peptide II), seine Herstellung, dieses enthaltende Arzneimittel sowie dieses enthaltende Aufbereitungen und seine Verwendung dafür. Sie betrifft weiterhin die cDNA des Vorläuferproteins und die sich daraus ergebenden Anwendungen, nämlich die biotechnologische Herstellung und die Konstruktion von Sonden für gendiagnostische Zwecke.The present invention thus relates to a new peptide, the GCAP-II (guanylate cyclase Activating Peptide II), its preparation, this medicinal product and this containing preparations and its use therefor. It continues to affect the cDNA of the Precursor protein and the resulting applications, namely the biotechnological Manufacture and design of probes for genetic diagnostic purposes.

In jüngster Zeit hat sich immer mehr gezeigt, daß Stoffe für die Regulation der Funktion des Magendarmtraktes diagnostisch und therapeutisch von großem Interesse sind und daß wahrscheinlich noch eine große Zahl unbekannter Faktoren existieren, die von klinisch verwertbarer Bedeutung sind. Dazu könnten auch Faktoren gehören, die sowohl bei der Behandlung von Verdauungs-, Kreislauf- und Atemwegserkrankungen als auch bei der Hormonsubstitution bei vielen Erkrankungen durch regelmäßige Gabe über einen langen Zeitraum, gegebenenfalls lebenslang, verabreicht werden könnten, um diese Krankheitsvorgänge im positiven Sinne zu steuern. In recent times it has become increasingly clear that substances for regulating the function of the Gastrointestinal tract are of great interest diagnostically and therapeutically and that There are probably still a large number of unknown factors that exist from clinical are usable meaning. This could also include factors that affect both Treatment of digestive, circulatory and respiratory diseases as well Hormone replacement in many diseases by regular administration over a long period of time, if necessary, lifelong, could be administered to improve these disease processes To control the senses.

In einigen Arbeiten (Guarino, Cohen, Thompson, Dharmsathaphorn and Giannella, Am.J.Physiol. 253: G775-G780, 1987) wurde nun nachgewiesen, daß bestimmte Zellinien aus Epithelien (z. B. T84 Zellen des Dickdarm, menschliche Coloncarcinomzellen) des Magendarmtraktes durch ein bereits bekanntes Peptid, das aus Bakterien abgegeben wird (hitzestabile Enterotoxine) über Membranrezeptoren spezifisch beeinflußt werden.In some works (Guarino, Cohen, Thompson, Dharmsathaphorn and Giannella, Am.J. Physiol. 253: G775-G780, 1987) has now been demonstrated that certain cell lines from epithelia (e.g. T84 cells of the colon, human colon carcinoma cells) of the gastrointestinal tract by already known peptide that is released from bacteria (heat-stable enterotoxins) via Membrane receptors are specifically influenced.

Bei der Suche nach der Existenz weiterer auf diese Weise charakterisierbarer Wirkstoffe wurde überraschenderweise das GCAP-II als biologisch aktives Molekül im menschlichen Plasma gesunder und kranker Menschen gefunden. Damit wurde ein Molekül entdeckt, dessen Struktur bisher unbekannt war und dessen Bildungsstätte im Körper noch ungeklärt ist. Die therapeutische und wirtschaftliche Verwendung wurde geprüft und das GCAP-II wurde überraschenderweise als wichtiges zirkulierendes Peptid des menschlichen Blutes erkannt. Außerdem wurde erstmals die komplette cDNA des GCAP-II-Vorläufers kloniert und sequenziert. Daraus konnte die Aminosäuresequenz des Vorläuferproteins abgeleitet werden.In the search for the existence of others that can be characterized in this way Surprisingly, the active ingredient GCAP-II became biologically active Molecule found in human plasma of healthy and sick people. A molecule was thus discovered, the structure of which was previously unknown and whose educational institution in the body is still unclear. The therapeutic and Economic use has been tested and the GCAP-II has been tested Surprisingly, as an important circulating peptide in human blood recognized. In addition, the complete cDNA of the GCAP-II precursor became the first cloned and sequenced. The amino acid sequence of the Precursor protein can be derived.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit:
Ein Blutpeptid GCAP-II mit der AminosäurensequenzThe present invention thus relates to:
A blood peptide GCAP-II with the amino acid sequence

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg -Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - LeuPhe - Lys - Thr - Leu - Arg -Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - Leu

sowie seine natürlichen und pharmakologisch verträglichen Derivate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphorylierte und glycosylierte GCAP-II Derivate und weitere Fragmente des Peptides. Durch Massenspektrometrie konnte ein Molekulargewicht von 2597,7 Dalton festgestellt werden (Beispiel 1). Die ermittelte Aminosäuresequenz für GCAP-II entspricht der von der cDNA abgeleiteten Aminosäuresequenz von Position 89 bis Position 112 (COOH- Terminus).and its natural and pharmacologically acceptable derivatives, especially amidated, acetylated, phosphorylated and glycosylated GCAP-II derivatives and other fragments of Peptides. By mass spectrometry a molecular weight of 2597.7 daltons are found (Example 1). The amino acid sequence determined for GCAP-II corresponds to that amino acid sequence derived from the cDNA from position 89 to position 112 (COOH- Term).

Damit ist weiter Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Peptid, das GCAP-II, bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als ein gut zugängliches Arzneimittel mit biologisch und therapeutischer Aktivität eines natürlichen Analogons des im Blut vorkommenden Stoffes verwandt werden kann.It is therefore a further object of the present invention to develop a new peptide, the GCAP-II, to provide, which is characterized in that it as having an easily accessible drug biological and therapeutic activity of a natural analogue of what occurs in the blood Substance can be used.

Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Herstellungsverfahrens für dieses GCAP-II sowie die Anwendung des GCAP-II als Arzneimittel für verschiedene therapeutische und diagnostische Indikationen. Dazu kann das CAP-II als hochreiner Stoff oder - wenn für die bestimmte Verwendung ausreichend - innerhalb eines teilweise aufgereinigten Peptidgemisches (Beispiel 1) verwandt werden.Another object of the present invention is to provide a manufacturing method for this GCAP-II as well as the use of the GCAP-II as a medicine for various therapeutic and diagnostic indications. The CAP-II can be used as a high-purity substance or - if sufficient for the particular use - within a partially cleaned up Peptide mixture (Example 1) can be used.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter verschiedene Verfahren zur Herstellung dieses GCAP-II oder seiner Derivate dadurch gekennzeichnet, daß dieses über eine prokaryontische oder eine eukaryontische Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt wird, sowie ein weiteres Verfahren zur Herstellung der GCAP-II bezogenen Moleküle bzw. seiner Derivate, indem man es aus menschlichem Blut über Chromatographie-Verfahren in bekannter Weise isoliert, und schließlich ein Verfahren zur Herstellung des GCAP-II oder seiner Derivate, indem man diese GCAP-II-Moleküle durch die üblichen Verfahren der Festphasen- und Flüssigphasen-Synthese aus den geschützten Aminosäuren, die in der angegebenen Sequenz enthalten sind, herstellt, deblockiert und es mit den gängigen Chromatographie-Verfahren reinigt (Beispiel 2).The present invention further relates to various processes for the preparation of this GCAP-II or its derivatives, characterized in that this via a prokaryotic or a eukaryotic expression is prepared and chromatographically purified, as well as another Process for the preparation of the GCAP-II-related molecules or their derivatives by using it isolated from human blood by chromatography in a known manner, and finally a process for the preparation of the GCAP-II or its derivatives by using these GCAP-II molecules by the usual methods of solid phase and liquid phase synthesis the protected amino acids contained in the given sequence and clean it with the usual chromatography methods (Example 2).

Die GCAP-II-Moleküle wurden chemisch synthetisiert (vgl. Beispiel 2) und als Arzneimittel zubereitet. Auch die gentechnologische Herstellung über übliche Vektoren ist erarbeitet: auf gentechnologischem Wege wird das GCAP-II-Peptid sowohl (1) in pro- als auch (2) in eukaryontischen Organismen hergestellt. Hierfür stehen u. a. Expressionsvektoren zur sekretorischen Expression (z. B. pSP6, pRit-Derivate, Pharmacia), zur direkten cytoplasmatischen Expression (z. B. pKK-Derivate, Pharmacia) oder Expression als Fusionsprotein (pMC1871, Pharmacia). Für die eukaryontische Expression haben wir verschiedene Organismen und Vektoren zur Verfügung, z. B. Insektenzellen (Summers and Smith, Tex.Agric.Exp.Stn.(bull) 1555, 1987), Hefen (Hitzeman et al., Nature, 293, 717-722, 1981), filamentöse Pilze (Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81, 1470-1474, 1984)) und Säugerzellen (Zettlmeissl et al., Biotechnology, 5, 720-725, 1987), von denen wir vorzugsweise die Insektenzellen benutzen. Die exprimierten Peptide der GCAP-II werden mit Methoden der Chromatographie gereinigt, vorzugsweise wie in Beispiel 1 angegeben.The GCAP-II molecules were synthesized chemically (see Example 2) and as a drug prepared. Genetic engineering production using conventional vectors has also been developed: on The GCAP-II peptide is genetically engineered both (1) in pro- and (2) in eukaryotic organisms. For this stand u. a. Expression vectors for secretory expression (e.g. pSP6, pRit derivatives, Pharmacia), for direct cytoplasmic Expression (e.g. pKK derivatives, Pharmacia) or expression as a fusion protein (pMC1871, Pharmacia). We have different organisms and vectors for eukaryotic expression available, e.g. B. Insect cells (Summers and Smith, Tex.Agric.Exp.Stn. (Bull) 1555, 1987), Yeast (Hitzeman et al., Nature, 293, 717-722, 1981), filamentous fungi (Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 81, 1470-1474, 1984)) and mammalian cells (Zettlmeissl et al., Biotechnology, 5, 720-725, 1987), of which we prefer to use the insect cells. The expressed peptides of GCAP-II are purified using methods of chromatography, preferably as indicated in Example 1.

Die Arzneimittelzubereitung enthält GCAP-II oder ein physiologisch verträgliches Salz des GCAP-II. Die Form und Zusammensetzung des Arzneimittels, welches das GCAP-II enthält, richtet sich nach der Art der Verabreichung. Das humane GCAP-II kann parenteral, intranasal, oral und mittels Inhalation verabreicht werden. Vorzugsweise wird GCAP-II zu einem Injektionspräparat, entweder als Lösung oder als Lyophilisat zur Auflösung unmittelbar vor Gebrauch, konfektioniert. Die Arzneimittelzubereitung kann außerdem Hilfsstoffe enthalten, die abfülltechnisch bedingt sind, einen Beitrag zur Löslichkeit, Stabilität oder Sterilität des Arzneimittels leisten oder den Wirkungsgrad der Aufnahme in den Körper erhöhen. The pharmaceutical preparation contains GCAP-II or a physiologically acceptable salt of GCAP-II. The form and composition of the drug, which contains the GCAP-II, depends according to the mode of administration. The human GCAP-II can be administered parenterally, intranasally, orally and by means of Inhalation can be administered. Preferably GCAP-II becomes an injectable, either packaged as a solution or as a lyophilisate for dissolution immediately before use. The Pharmaceutical preparation can also contain auxiliary substances that are due to filling technology, contribute to the solubility, stability or sterility of the medicinal product, or Increase the efficiency of absorption in the body.

Die zu verabreichende Tagesdosis für GCAP-II hängt von der Indikation und der Anwendung bestimmter Derivate ab. Bei i.v./i.m. Injektion liegt sie im Bereich von 100 bis 1200 Einheiten (µg)/Tag, bei täglicher subcutaner Injektion vorzugsweise bei 300-2400 Einheiten (µg)/Tag.The daily dose to be administered for GCAP-II depends on the indication and the application certain derivatives. At i.v./i.m. Injection is in the range of 100 to 1200 units (µg) / day, with daily subcutaneous injection preferably at 300-2400 units (µg) / day.

Die Bestimmung der biologischen Aktivität für das GCAP-II basiert auf Messungen gegen internationale und hauseigene Referenzpräparationen für humanes GCAP-II oder seiner Analoga in einem gebräuchlichen biologischen Testverfahren für dieselben. Dazu wird vorzugsweise ein standardisierter cGMP Generationstest mit T84-Zellen benutzt (Beispiel 3).The determination of the biological activity for the GCAP-II is based on measurements against international and in-house reference preparations for human GCAP-II or its analogues in a common biological test procedure for the same. For this purpose, preferably a standardized cGMP generation test with T84 cells used (Example 3).

Das erfindungsgemäße Peptid GCAP-II ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich besonders auch für die Langzeit-Therapie bei Durchfallerkrankungen eignet, da es über eine ausgezeichnete biologische Wirksamkeit verfügt und andererseits auch bei Dauerbehandlung keine Immunreaktion auslöst.The peptide GCAP-II according to the invention is characterized in that it is particularly suitable for The long-term therapy for diarrheal diseases is suitable because it has an excellent biological Efficacy and on the other hand does not trigger an immune response even with long-term treatment.

Aufgrund der biologischen Wirkung ist gezeigt, daß das erfindungsgemäße Präparat weiter als Mittel zur Therapie von Nierenerkrankungen, Herzerkrankungen, Erkrankungen endokriner Organe, in der Intensivpflege und bei Lungenerkrankungen anzuwenden (vgl. Beispiel 3) ist.Because of the biological effect, it is shown that the preparation according to the invention is more than Agent for therapy of kidney diseases, heart diseases, endocrine diseases Organs, in intensive care and for lung diseases (see Example 3).

Das erfindungsgemäße Präparat ist weiter als Mittel zur Therapie und Diagnose bei Stoffwechselerkrankungen des Magen-Darm-Traktes (insbesondere Dünndarm und Bauchspeicheldrüse), der Atemwege, des Herz-Kreislaufsystems und Urogenitalapparates, endokriner Organe sowie des Nervensystems einzusetzen, da es zur Herstellung von human verträglichen Antikörpern verwandt werden kann, die geeignet sind, Änderungen der Stoffwechsellage dieser Organe festzustellen oder zu beeinflussen. The preparation according to the invention is also used as a means of therapy and diagnosis Metabolic diseases of the gastrointestinal tract (especially the small intestine and Pancreas), the respiratory tract, the cardiovascular system and the urogenital system, endocrine organs as well as the nervous system because it is used for the production of human compatible antibodies can be used, which are likely to change the Determine or influence the metabolic position of these organs.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen und den folgenden Abbildungen, auf die in den Beispielen (und teilweise den Ansprüchen) Bezug genommen wird, erläutert:
Es zeigen:The invention is explained below using examples and the following figures, to which reference is made in the examples (and in part the claims):
Show it:

Fig. 1

Sequenzanalyse: Nach Auftragen von 1/20 des Materials aus dem endgereinigten GCAP-II nach Chromatographie in Abbildung 7, ca. 50-100 pmol, konnten die Reste von Position 1 bis 24 deutlich ohne nachweisbare Nebensequenz festgestellt werden. Die Art der Sequenzierung ist im Text ausführlich beschrieben.Sequence analysis: After applying 1/20 of the material from the finally cleaned GCAP-II after Chromatography in Figure 7, approx. 50-100 pmol, allowed the residues from position 1 to 24 can be clearly identified without a detectable secondary sequence. The type of sequencing is in the Text described in detail.

Positionen 1 bis 24 aus direkter Sequenzierung:Positions 1 to 24 from direct sequencing:

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - LeuPhe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - Leu

Fig. 2

Verwendete Primer in 5′→3′ Orientierung. Unterstrichene Bereiche enthalten Erkennungs sequenzen für Restriktionsendonukleasen, die eine effiziente Klonierung der PCR-Produkte gewährleisten.Primers used in 5 ′ → 3 ′ orientation. Underlined areas contain recognition sequences for restriction endonucleases, which allow efficient cloning of the PCR products guarantee.

Fig. 3

cDNA-Sequenz des GCAP-II/Uroguanylin-Vorläufers und abgeleitete Aminosäuresequenz. Die translatierten Bereiche sind in Großbuchstaben, die nichttranslatierten Bereiche in Kleinbuchstaben dargestellt. Das ATG-Startcodon, das TGA-Stopcodon sowie das AATAAA-Polyadenylierungs signal sind unterstrichen. Die Positionen der verwendeten Primer sind mit Pfeilen gekennzeichnet. Die erste Aminosäure des isolierten GCAP-II ist mit einem Dreieck, die erste Aminosäure des Uroguanylins mit einer Raute gekennzeichnet.GCAP-II / uroguanylin precursor cDNA sequence and deduced amino acid sequence. The Translated areas are in upper case, the non-translated areas in lower case shown. The ATG start codon, the TGA stop codon and the AATAAA polyadenylation signal are underlined. The positions of the primers used are marked with arrows. The first amino acid of the isolated GCAP-II is with a triangle, the first amino acid of the Uroguanylins marked with a rhombus.

Fig. 4

Durch Spaltung mit spezifischen Endoproteasen erhaltbare C-terminale Fragmente des Uro guanylin-Vorläuferproteins. Die entsprechende Endoprotease ist über den Sequenzen der damit generierten Teilfragmente aufgeführt.C-terminal fragments of the Uro that can be obtained by cleavage with specific endoproteases guanylin precursor protein. The corresponding endoprotease is over the sequences of the generated partial fragments.

Endoprotease Arg-C

1.
Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Gln Ser Thr Gln Ser Val Tyr Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu1.
Ala Ala Ser Gly Leu Leu Pro Gly Val Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Gln Ser Thr Gln Ser Val Tyr Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu2nd
Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu3rd
Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu4th
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease Lys-C

1.
Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu1.
Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu2nd
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu3rd
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease Asp-N

1.
Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu1.
Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu2nd
Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu3rd
Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 4th
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Trypsin

3.
Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu3rd
Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gin Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu4th
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

5.
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu5.
Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

6.
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 6.
Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Chymotrypsin

1.
Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu1.
Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gin Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu2nd
Gln Gly Phe Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu3rd
Arg Val Gln Leu Glu Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu4th
Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease for 2 basic amino acids

1.
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu1.
Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 2nd
Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

Endoprotease Glu-C or S. aureus U8

1.
Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu1.
Ser Met Lys Lys Leu Ser Asp Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

2.
Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu2nd
Leu Glu Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

3.
Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu3rd
Ala Gln Trp Ala Pro Ser Pro Arg Leu Gln Ala Gln Ser Leu Leu Pro Ala Val Cys His His Pro Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

4.
Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu4th
Leu Gln Pro Val Cys Ala Ser Gln Glu Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

5.
Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu5.
Ala Ser Ser Ile Phe Lys Thr Leu Arg Thr Ile Ala Asn Asp Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

6.
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu6.
Asp Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

7.
Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu7.
Cys Glu Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

8.
Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu 8th.
Leu Cys Val Asn Val Ala Cys Thr Gly Cys Leu

example 1

Direkter Nachweis der Aminosäuren-Sequenz des zirkulierenden, biologisch aktiven GCAP-II nach Isolierung aus Hemofiltrat.Direct detection of the amino acid sequence of the circulating, biologically active GCAP-II after Hemofiltrate insulation.

Als Ausgangsmaterial wurde Hemofiltrat verwendet, das in großen Mengen bei der Behandlung niereninsuffizienter Patienten anfällt und alle Plasmabestandteile bis zu einer Molekülgröße von ca. 20.000 Dalton enthält.Hemofiltrate was used as the starting material Treatment of renal insufficiency patients and all plasma components up to a molecular size of approximately 20,000 daltons.

I. Obtaining the raw peptide material

Das Hemofiltrat wurde mittels einer Hemofiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung von Cellulosetriacetat-Filtern mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 40042, Sartorius, Göttingen, BRD) gewonnen. Das Filtrat stammte von niereninsuffizienten Patienten, die sich durch Langzeit-Hemofiltration in einer stabilen Stoffwechsellage befanden. 3000 l Hemofiltrat wurden gewonnen und unmittelbar nach der Gewinnung mittels Ansäuern und Abkühlung auf 4°C gegen proteolytischen Abbau geschützt. Anschließend wurde durch vier Kationenaustauscher extraktionen eine Rohpeptidfraktion (570,5 g) gewonnen. Durch die folgende Ultrafiltration mittels einer Ultrafiltrationsanlage der Firma Sartorius unter Verwendung eines Cellulosetriacetat-Filters mit einer Ausschlußgröße von 20.000 Dalton (Typ SM 3031454901E, Sartorius) wurde ein von Plasmabestandteilen größer 20.000 Dalton weitestgehend befreites Filtrat gewonnen.The hemofiltrate was used using a Sartorius hemofiltration system cellulose triacetate filters with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 40042, Sartorius, Göttingen, FRG) won. The filtrate was from kidney failure patients were in a stable metabolic state due to long-term hemofiltration. 3000 l hemofiltrate were obtained and immediately after extraction by means of acidification and cooling to 4 ° C protected against proteolytic degradation. It was then replaced by four cation exchangers extractions a crude peptide fraction (570.5 g) was obtained. By the following ultrafiltration using an ultrafiltration system from Sartorius using a cellulose triacetate filter with an exclusion size of 20,000 daltons (type SM 3031454901E, Sartorius) was one of Plasma components greater than 20,000 daltons largely freed filtrate.

II. Isolation of a fraction with cGMP-generating activity on T84 cells 1. Desalting and fractionation of the raw peptide material over RP-C18 solid phase (Step 1)

Die Rohpeptidfraktion aus der Ultrafiltration wurde über eine mit RP-C18 Material (Vydac, Hesperia, CA, USA) gefüllte Kartusche, die mit 0,01 N Salzsäure equilibriert war, chromatographisch mittels HPLC aufgetrennt:The crude peptide fraction from the ultrafiltration was removed using an RP-C18 material (Vydac, Hesperia, CA, USA) filled cartridge, which was equilibrated with 0.01 N hydrochloric acid, separated by chromatography using HPLC:

Die cGMP generierende Wirkung der Fraktionen wurde an T84 Zeilen, gezüchtet in Fischer- Medium (Gibco) gemessen, indem die Zunahme mittels eines Radioimmunoassays nach 60 min festgestellt wurde und mit Kontrollen verglichen, bei denen zum Kulturmedium statt der HF- Peptide 0,9% NaCl gegeben wurde. Die im cGMP-Gernerations-Test meßbar bioaktiven Fraktionen aus 11 Läufen dieser Reinigungsstufe wurden im Pool VI zusammengefaßt.The cGMP-generating effect of the fractions was determined on T84 lines, grown in fishing Medium (Gibco) measured by the increase using a radioimmunoassay after 60 min and was compared with controls using the culture medium instead of the HF Peptides 0.9% NaCl was given. The bioactive measurable in the cGMP generation test Fractions from 11 runs of this purification level were pooled in Pool VI.

Der betreffende Pool VI wurde für die weitere Isolierung eingesetzt.The relevant pool VI was used for further insulation.

2. Preparative Large Scale RP Chromatography II of Pool VI (Level 2)

Eine weitere präparative Aufreinigung der GCAP-II-haltigen Peptidfraktionen erfolgte bei Raumtemperatur über eine RP-C18 Material (Vydac, Hesperia, CA, USA) gefüllte Kartusche mittels einer HPLC-Anlage (BioCAD, PerSeptive Biosystems, Freiburg, BRD) wobei die cGMP-ge nerierende wirksame Peptidfraktion wieder eingeengt werden konnte. Das Material des Pools VI wurde dabei als abrotierte Flüssigkeit in einem Lauf aufgetragen. Die Fraktionen 4-6 enthielten Bioaktivität bezüglich des cGMP-Generationstestes an T84-Zellen. Die Fraktion 5 wurde für die weitere Auftrennung verwendet. Bedingungen:A further preparative purification of the GCAP-II-containing peptide fractions was carried out in Room temperature filled with a cartridge filled with RP-C18 material (Vydac, Hesperia, CA, USA) by means of an HPLC system (BioCAD, PerSeptive Biosystems, Freiburg, FRG) where the cGMP-ge effective peptide fraction could be concentrated again. The material of the pool VI was applied as an evaporated liquid in one run. Fractions 4-6 contained Bioactivity regarding the cGMP generation test on T84 cells. Fraction 5 was for the further separation used. Conditions:

3. Analytical cation exchange chromatography of GCAP-II-containing Preparative RP-C18 Chromatography II fraction (level 3)

Die bioaktive GCAP-II-haltige immunreaktive Fraktion (50 ml) wurde über eine analytische Kationenaustauscher-Chromatographie weiter gereinigt. Die biologische Aktivität erscheint dabei im Bereich einer Retentionszeit von 8 und 9% des Eluenten B. Diese Fraktionen aus 17 identischen Läufen wurden gepoolt. Bedingungen:The bioactive GCAP-II-containing immunoreactive fraction (50 ml) was analyzed Cation exchanger chromatography further purified. The biological activity appears in the range of a retention time of 8 and 9% of the eluent B. These fractions from 17 identical Runs were pooled. Conditions:

4. Analytical HPLC-RP-C4 chromatography of the GCAP-II-containing pool analytical cation exchange chromatography (level 4)

Die Aufarbeitung des Pools, der die cGMP-generierende, bioaktive Wirkung zeigte, wurde durch eine RP-C4-Chromatographie in weitere Unterbestandteile aufgetrennt, wobei sich deutlich eine GCAP-II-Aktivität nach einer Chromatographiezeit von 34-36 min nach Programmstart feststellen ließ (2 Fraktionen). Diese je zwei hochaktiven Fraktionen von fünf Chromatographieläufen wurden wieder gepoolt und direkt weiter verarbeitet. Bedingungen:The pool was worked up, which showed the cGMP-generating, bioactive effect RP-C4 chromatography separated into further sub-components, whereby clearly one Determine GCAP-II activity after a chromatography time of 34-36 min after program start let (2 fractions). These were each two highly active fractions from five chromatography runs pooled again and processed immediately. Conditions:

5. Analytical RP-C18 chromatography of the GCAP-II bioactive pool from the analytical HPLC-RP-C4 chromatography (level 5)

Die gesamte Substanz der fünf Läufe aus Reinigungsstufe 4 wurde in Lösung gelassen, mit Eluent A verdünnt und auf einer Vydac RP-C18-HPLC-Anlage (Kontron) in drei gleichartigen Läufen chromatographiert. Das T84-Zellen aktivierende Peptid war in einem Bereich nachzuweisen, der innerhalb von einer Minute eluierte. Das gesamte weitere Material der bioaktiven Fraktionen wurde schließlich mit der gleichen Säule rechromatographiert (s. Stufe 6). Bedingungen:The entire substance of the five runs from purification stage 4 was left in solution with eluent A diluted and on a Vydac RP-C18 HPLC system (Kontron) in three identical runs chromatographed. The peptide activating T84 was detectable in an area that eluted within a minute. All other material of the bioactive fractions was finally re-chromatographed on the same column (see step 6). Conditions:

6. Analytical RP Chromatography III of the GCAP-II bioactive fractions pools from analytical RP chromatography II (stage 6, final cleaning)

Die gesamte Substanz der drei Läufe aus Reinigungsstufe 5 wurde in Lösung gelassen, mit Eluent A verdünnt und dann auf einer Vydac RP-C18-HPLC-Anlage (Kontron) in zwei Läufen rechromatographiert. Das gesuchte cGMP-aktivierende Peptid (GCAP-II) war nun in einem Peak nachzuweisen, der in drei Teilfraktionen per Hand gesammelt wurde. Jede Fraktion wurde im Bioassay getestet (siehe Beispiel 3), ansequenziert und im Massenspektrometer mittels LC-MS- Kopplung analysiert. Bedingungen:The entire substance of the three runs from cleaning stage 5 was left in solution with eluent A diluted and then on a Vydac RP-C18 HPLC system (Kontron) in two runs rechromatographed. The cGMP-activating peptide (GCAP-II) was now in a peak to be demonstrated, which was collected in three sub-fractions by hand. Each faction was Bioassay tested (see example 3), sequenced and in the mass spectrometer using LC-MS Coupling analyzed. Conditions:

7. Sequence analytical determination of the primary structure of the GCAP-II

Aus Fraktion 8 des 1. Laufes und Fraktion 26 der Reinigungsstufe 6 wurden je 14 µl aus der Gesamtmenge von je 280 µl zur Aminosäuren-Sequenz-Analyse benutzt. Nach Isolierung aus Hemofiltrat wie oben beschrieben, wurden mit Hilfe des Gasphasensequenators Typ ABI 473 A (Applied Biosystems) sequenziert. Der EDMAN-Abbau (Edman und Begg, Eur. J. Biochem. L 80-91, 1967) erfolgte mit dem Standardprogramm PTHRUN. Die Analyse der derivatisierten Aminosäuren wurde im on-line-Verfahren unter Verwendung des Standardprotokolls ABI durchgeführt.Fraction 8 of the first run and fraction 26 of the cleaning stage 6 were each 14 µl from the Total amount of 280 ul used for amino acid sequence analysis. After isolation Hemofiltrate as described above, were using the gas phase separator type ABI 473 A (Applied Biosystems) sequenced. The EDMAN degradation (Edman and Begg, Eur. J. Biochem. L 80-91, 1967) was carried out with the standard program PTHRUN. Analysis of the derivatized Amino acids were processed online using the standard ABI protocol carried out.

Für diese Fraktionen konnte eine Sequenz von 24 Aminosäuren bestimmt werden (Abb. 1). Bei der gefundenen Sequenz handelt es sich um die NH₂-terminal verlängerte Form des humanen Uroguanylins. Sie besitzt strukturelle Homologien zu denen des humanen Guanylins und der hitzestabilen Enterotoxine aus Bakterien. Für diese Peptide ist die aktivierende Wirkung auf die Guanylatcyclase-C beschrieben.A sequence of 24 amino acids could be determined for these fractions (Fig. 1). At the sequence found is the NH₂-terminal extended form of human Uroguanylins. It has structural homologies to that of human guanylin and heat-stable enterotoxins from bacteria. For these peptides, the activating effect on the Guanylate cyclase-C.

Des weiteren wurde nun aus dem Endprodukt der Aufreinigung nach Stufe 6 alle bioaktiven Unterfraktion des per Hand gesammelten Peaks einer Microbore-HPLC-MS-Kopplung unterworfen, um über die Masse 2597,7 Dalton die Identität des GCAP-II in diesen Unterfraktionen zu bestätigen. Nach dieser Bestimmung war abzuleiten, daß GCAP-II für die Bioaktivität in den Unterfraktionen verantwortlich ist.Furthermore, the end product of the purification according to stage 6 now became all bioactive Sub-fraction of the manually collected peak of a microbore-HPLC-MS coupling subjected to the mass of 2597.7 daltons the identity of GCAP-II in these To confirm sub-fractions. After this determination it could be deduced that GCAP-II for the Bioactivity in the sub-fractions is responsible.

Der äußerst geringe Kontaminierungsgrad des nativen GCAP-II konnte somit in den Unterfraktion festgestellt werden, woraus hervorging, daß das Peptid in hochreiner Form vorlag und die biologische Wirkung nach dem derzeitigen Stand der Kenntnis nicht auf eine Verunreinigung zu beziehen war.The extremely low degree of contamination of the native GCAP-II could thus be in the sub-fraction were determined, from which it emerged that the peptide was in highly pure form and the According to the current state of knowledge, biological effects do not lead to contamination was related.

8. Detection of the molecular weight of the native GCAP-II by microbore HPLC mass spectrometry coupling

Aus dem Endprodukt der Aufreinigung nach Stufe 6 wurden weiter alle Unterfraktionen des per Hand gesammelten Peaks massenspektrometrisch untersucht. Die Analysen wurden unter Verwendung des Dual Syringe Solvent Delivery System ABI 140A (Applied Biosystems, Weiterstadt, BRD), einer RP-C18-Säule AQS 1.0 × 250 mm (YMC, Schernbeck, BRD) und einem mit einem Articulated Ion Spray inlet ausgestatteten API III Biomolecular Mass Analyser (Sciex, Perkin Elmer, Langen, BRD) durchgeführt. Die molekularen Massen wurden im Positiv-Ion-Mode gemessen. Mittels dieser Bestimmung wurde festgestellt, daß alle Unterfraktionen GCAP-II mit einem MG von 2597,7 Dalton enthielten. In allen Fraktion war die Substanz dieses Molekulargewichtes quantitativ dominierend. From the end product of the purification according to stage 6, all sub-fractions of the per Hand-collected peaks examined by mass spectrometry. The analyzes were under Use of the Dual Syringe Solvent Delivery System ABI 140A (Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany), an RP-C18 AQS 1.0 × 250 mm column (YMC, Schernbeck, Germany) and one with an Articulated Ion Spray inlet equipped API III Biomolecular Mass Analyzer (Sciex, Perkin Elmer, Langen, Germany). The molecular masses were in positive ion mode measured. Using this determination it was found that all sub-fractions GCAP-II with contained an MG of 2597.7 daltons. In all factions the substance was this Molecular weight dominates quantitatively.

Example 2

Chemische Synthese des humanen Guanylatcyclase-Aktivierenden Peptides II (GCAP-II).Chemical synthesis of the human guanylate cyclase activator Peptides II (GCAP-II).

1. Strategy for the synthesis of human GCAP-II

Für die Synthese des Peptids mit der Formel:For the synthesis of the peptide with the formula:

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc- Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - LeuPhe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc- Val - Asn - Val - Ala - Cys - Thr - Gly - Cyc - Leu

wurde die Durchflußmethode (Atherton und Sheppard, Solid phase peptide synthesis. IRL Press, Oxford, 1989) angewendet. Die genannte Peptidsequenz wurde mit Hilfe einer automatischen Peptidsynthese-Apparatur (Model 9050, Biosearch/PerSeptive) unter Verwendung von Fmoc- Aminosäuren synthetisiert. Folgende Fmoc-Aminosäuren wurden im Überschuß (4 Äquivalente) eingesetzt (verwendet wurden jeweils die Derivate der L-Aminosäuren):
Fmoc-Ala, Fmoc-Asp(OBu^t), Fmoc-Glu(OBu_t), Fmoc-Leu, Fmoc-Arg(Pbf), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Gly, Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Gln-OPfp, Fmoc- Gln(Trt), Fmoc-Val-OPfp, Fmoc-Val.the flow method (Atherton and Sheppard, Solid phase peptide synthesis. IRL Press, Oxford, 1989) was used. The peptide sequence mentioned was synthesized using an automatic peptide synthesis apparatus (Model 9050, Biosearch / PerSeptive) using Fmoc amino acids. The following Fmoc amino acids were used in excess (4 equivalents) (the derivatives of the L-amino acids were used in each case):
Fmoc-Ala, Fmoc-Asp (OBu ^t ), Fmoc-Glu (OBu _t ), Fmoc-Leu, Fmoc-Arg (Pbf), Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Ile, Fmoc-Phe, Fmoc-Gly, Fmoc-Asn (Trt), Fmoc-Gln-OPfp, Fmoc-Gln (Trt), Fmoc-Val-OPfp, Fmoc-Val.

Die Synthese wurde durch in situ-Aktivierung unter Zugabe von 4,4 Äquivalenten TBTU [O-(1H- Benzotriazol-1-yl)-N,N,N,N′-tetramethyluronium-tetrafluoroborat], 4,4 Äquivalenten 1- Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 8,8 Äquivalenten Diisopropylethylamingebildeten in N,N- Dimethylformamid durchgeführt. Als Träger-Harz für die Synthese wurde vorbelegtes Fmoc-L- Cys(Acm)-PEG-PS-Harz (0.20 mmol/g Belegungsgrad, Biosearch/PerSeptive) eingesetzt. Zur regioselektiven Einführung der beiden Disulfidbrücken wurden die Cysteinreste in Position 15 und 23 als Acetamidomethyl(Acm)-geschützte Cysteinderivate eingesetzt während die Cysteinreste in den Positionen 12 und 20 als Trityl-geschützte Derivate eingesetzt wurden. Nach Abspaltung und Entblockierung des Peptides vom Träger bleiben die Acm-Gruppen erhalten, so daß die erste Disulfidbrücke durch Luftoxidation eingeführt werden kann. Anschließend wird die zweite Disulfidbrücke durch Oxidation mit Iod gebildet, so daß keine falsch verbrückten Guanylin- Isomere entstehen können. The synthesis was carried out by in situ activation with the addition of 4.4 equivalents of TBTU [O- (1H- Benzotriazol-1-yl) -N, N, N, N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate], 4.4 equivalents 1- Hydroxybenzotriazole (HOBt) and 8.8 equivalents of diisopropylethylamine formed in N, N- Dimethylformamide performed. Pre-assigned Fmoc-L- was used as the carrier resin for the synthesis. Cys (Acm) -PEG-PS resin (0.20 mmol / g coverage, Biosearch / PerSeptive) used. For Regioselective introduction of the two disulfide bridges were the cysteine residues in position 15 and 23 used as acetamidomethyl (Acm) -protected cysteine derivatives while the cysteine residues in positions 12 and 20 were used as trityl-protected derivatives. After spin-off and Unblocking of the peptide from the carrier, the Acm groups are retained, so that the first Disulfide bridge can be introduced by air oxidation. Then the second Disulfide bridge formed by oxidation with iodine, so that no incorrectly bridged guanylin Isomers can arise.

2. Practical implementation of the synthesis of human GCAP-II

Die Synthese vonThe synthesis of

Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys -Thr - Gly - Cyc - Leu GCAP-IIPhe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys -Thr - Gly - Cyc - Leu GCAP-II

wurde mit dem automatischen 9050 PepSynthesizer (Programm Version 1.3, Biosearch/PerSeptive) nach der continuousflow-Methode durchgeführt. Fmoc-Aminosäuren waren L-konfiguriert und in 0,8 mmol-Portionen verwendet. Alle zur Synthese notwendigen Reagenzien wurden von Biosearch/PerSeptive bezogen: N,N-Dimethylformamid, 20% Piperidin in N,N- Dimethylformamid und 1-Hydroxybenzotriazol. Die L-Aminosäurederivate wurden in vierfachem Überschuß bezogen auf das harzgebundene Fmoc-L-Leucin eingesetzt, durchgeführt. Folgender Synthesecyclus wurde verwendet: Fmoc-Abspaltung mit 20% Piperidin in DMF (10 min), waschen mit DMF (12 min), Acylierung (30 min) und waschen mit DMF (8 min). Die fortschreitende Synthese wurde durch kontinuierliche UV-Detektion verfolgt. Die Synthese wurde mit der Abspaltung des N-terminalen Fmoc-Restes abgeschlossen. Das harzgebundene Peptid wurde dreimal mit je 50 ml Isopropanol, Isopropanol und tert-Butylmethylether gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.was created with the automatic 9050 PepSynthesizer (program version 1.3, Biosearch / PerSeptive) carried out according to the continuous flow method. Fmoc amino acids were L-configured and used in 0.8 mmol portions. All reagents necessary for the synthesis were obtained from Biosearch / PerSeptive: N, N-dimethylformamide, 20% piperidine in N, N- Dimethylformamide and 1-hydroxybenzotriazole. The L-amino acid derivatives were four-fold Excess based on the resin-bound Fmoc-L-leucine used performed. Following Synthesis cycle was used: Fmoc cleavage with 20% piperidine in DMF (10 min), wash with DMF (12 min), acylation (30 min) and wash with DMF (8 min). The progressive synthesis was followed by continuous UV detection. The synthesis was completed with the cleavage of the N-terminal Fmoc residue. The resin bound peptide was washed three times with 50 ml of isopropanol, isopropanol and tert-butyl methyl ether and until dried to constant weight.

Die Abspaltung vom Harz erfolgte mit Trifluoressigsäure/Ethandithiol/Wasser im Verhältnis 94 : 3 : 3 (10 ml, v/v/v) innerhalb von 90 Minuten. Die Lösung wird in vacuo eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Diethylether ausgefällt. Das erhaltene Rohpeptid wird mehrere Male mit Diethylether gewaschen, getrocknet und anschließend in Wasser aufgenommen und gefriergetrocknet. Aus 490 mg Peptid-Harz werden 85 mg Rohpeptid erhalten.The resin was split off using trifluoroacetic acid / ethanedithiol / water in a ratio of 94: 3: 3 (10 ml, v / v / v) within 90 minutes. The solution is concentrated in vacuo and the product precipitated by adding diethyl ether. The crude peptide obtained is used several times Washed diethyl ether, dried and then taken up in water and freeze-dried. 85 mg of crude peptide are obtained from 490 mg of peptide-resin.

Zur Einführung der ersten Disulfidbrücke wird das Rohpeptid mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 0,1 M wäßrige Ammoniumcarbonat-Lösung bei pH=8,3 gegeben. Bei Raumtemperatur wird diese Mischung 48 Stunden an der Luft gerührt und anschließend lyophilisiert. Zur Einführung der zweiten Disulfidbrücke wird das erhaltene Produkt in 80% Methanol in Wasser aufgenommen und mit 5 Äquivalenten festem Iod versetzt. Diese tiefbraune Mischung wird unter Stickstoffatmosphäre 3 Stunden heftig gerührt. Das überschüssige Iod wird anschließend unter tropfenweiser Zugabe von 0,1 M Natriumthiosulfat-Lösung bis zur Entfärbung versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit einem Volumenteil Wasser verdünnt und das Peptid dann gereinigt.To introduce the first disulfide bridge, the crude peptide is used at a concentration of 1 mg / ml placed in 0.1 M aqueous ammonium carbonate solution at pH = 8.3. At room temperature this mixture was stirred in air for 48 hours and then lyophilized. To introduce the second disulfide bridge, the product obtained is taken up in 80% methanol in water and mixed with 5 equivalents of solid iodine. This deep brown mixture is made under a nitrogen atmosphere Vigorously stirred for 3 hours. The excess iodine is then added dropwise from 0.1 M sodium thiosulfate solution until decolorization. The solution obtained is with diluted in a volume of water and the peptide then purified.

Die Reinigung erfolgte unter Benutzung eines in unabhängiger Synthese hergestellten Standards von GCAP-II, dessen korrekte Sequenz durch MS (Massenspektrometrie) und Sequenzanalyse bestätigt war. Hierzu wurde eine Reversed-phase-HPLC (Vydac C18, 22 × 250 mm, 10 µ, 300 Å, Flußrate 8 ml/min, Detektion bei 230 nm, Elutionsmittel A=0,06% Trifluoressigsäure in Wasser, B=0.055% Trifluoressigsäure in Acetonitril/Wasser 4 : 1 (v/v), Gradient: 0-100% B in 70 min). The cleaning was done using a standard made in independent synthesis of GCAP-II, its correct sequence by MS (mass spectrometry) and sequence analysis was confirmed. Reversed-phase HPLC (Vydac C18, 22 × 250 mm, 10 µ, 300 Å, Flow rate 8 ml / min, detection at 230 nm, eluent A = 0.06% trifluoroacetic acid in water, B = 0.055% trifluoroacetic acid in acetonitrile / water 4: 1 (v / v), gradient: 0-100% B in 70 min).

Die Ausbeute betrug 3,6 mg.The yield was 3.6 mg.

Das erhaltene Material coeluiert in einer analytischen RP-HPLC mit C18-Material mit dem unabhängig hergestellten Standard. Die Identität des synthetisierten Materials mit der vorgegebenen Primärstruktur von GCAP-II wurde durch Massenspektrometrie (Sciex API III, Perkin-Elmer) und Sequenzierung in einem Gassphasensequenator (Modell 470, Perkin-Elmer) bestätigt. Die biologische Aktivität des synthetischen GCAP-II wurde im Funktionstest durch die cGMP- Generations-stimulierende Wirkung an T84-Koloncarcinom-Zellen nachgewiesen. Dieser zeigte, daß das synthetische Material eine korrekte biologische Aktivität aufweist.The material obtained co-elutes with the in an analytical RP-HPLC with C18 material independently manufactured standard. The identity of the synthesized material with the given one The primary structure of GCAP-II was determined by mass spectrometry (Sciex API III, Perkin-Elmer) and Sequencing in a gas phase sequencer (model 470, Perkin-Elmer) confirmed. The biological activity of the synthetic GCAP-II was tested in the functional test by the cGMP Generation-stimulating effects demonstrated on T84 colon carcinoma cells. This showed that the synthetic material has a correct biological activity.

Example 3 Biological effects and application of the GCAP-II

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde Hemofiltrat chromatographisch aufgearbeitet, wobei GCAP- II-enthaltende Fraktionen in allen Reinigungsstufen gefunden wurden. Das gemäß Beispiel 2 synthetisierte GCAP-II wurden für den folgenden Test als Substanz eingesetzt. Auf gleiche Weise konnten aus dem Hemofiltrat in allen Reinigungsstufen Fraktionen nachgewiesen werden, die die biologische, cGMP-generierende Wirkung wie GCAP-II zeigte.As described in Example 1, hemofiltrate was worked up chromatographically, using GCAP Fractions containing II were found in all purification stages. That according to example 2 synthesized GCAP-II was used as a substance for the following test. The same way Fractions could be detected from the hemofiltrate in all purification stages, which the biological, cGMP-generating effect as shown by GCAP-II.

Die Zellen wurden nach Aussaat in 24 Well-Platten nach ca. 2-3 Tagen verwendet. Die Inkubation erfolgte mit 0,5 ml Zellmedium in Gegenwart von 1 mM IBMX (Sigma) bei 37°C. Die GCAP-II- Peptid enthaltenden Präparate wurden unmittelbar vor Versuchsbeginn im Zellmedium aufgenommen. Im Versuchsansatz wurden 1,5 × 105 Zellen mit 0,1 mM GCAP-II bzw. während der Aufarbeitung Aliquots GCAP-II-Peptid enthaltender Fraktionen für 60 min inkubiert und die cGMP-generierende Wirkung gegenüber Kontrollen gemessen. Zur Kontrolle wurden Zellen mit Fischer-Medium (1.) ohne jeglichen Zusatz, und (2.) mit verschiedenen Konzentrationen an GCAP-II pro Wells (0,5 ml) inkubiert. Die erhaltenen Werte der cGMP-Generation sind als Mittelwerte von Vierfachansätzen ± S.D. angegeben.After sowing in 24 well plates, the cells were used after approx. 2-3 days. The incubation was carried out with 0.5 ml of cell medium in the presence of 1 mM IBMX (Sigma) at 37 ° C. The GCAP-II Preparations containing peptide were in the cell medium immediately before the start of the experiment added. In the test batch 1.5 × 105 cells with 0.1 mM GCAP-II or during the processing of aliquots of GCAP-II peptide-containing fractions incubated for 60 min and the cGMP-generating effect measured against controls. Cells were checked with Fischer medium (1.) without any addition, and (2.) with different concentrations GCAP-II incubated per wells (0.5 ml). The cGMP generation values obtained are as Mean values of quadruple approaches ± S.D. specified.

Der Zusatz von GCAP-II bzw. die Zusammensetzung des Mediums wurde zu Beginn der Inkulation vorgenommen und während der Versuchszeit bleiben die Proben im Inkubator bei 37°C.The addition of GCAP-II or the composition of the medium was at the beginning of the Inculation carried out and the samples remain in the incubator at 37 ° C during the test period.

Die Ergebnisse zeigten, daß signifikante Unterschiede in der Wirksamkeit des GCAP-II im Vergleich zu den Kontrollen mit den untersuchten Zellsystem bestehen. Außerdem besteht eine Dosis abhängige Wirkung. Dieses Ergebnis läßt auf Unterschiede in der Wirkungsweise dieses Peptides schließen, die sich auf den Aktivierungsmechanismus des GCAP-II beziehen. Damit ist gezeigt, daß GCAP-II die cGMP Generation in T84-Zellen über einen bereits früher identifizierten Receptor für hitzestabile Enterotoxine beeinflussen muß.The results showed that significant differences in the effectiveness of the GCAP-II in Compared to the controls with the cell system examined. There is also a Dose dependent effect. This result suggests differences in the way this works Close peptides related to the activation mechanism of GCAP-II. So that is demonstrated that GCAP-II identified the cGMP generation in T84 cells via one previously Receptor for heat-stable enterotoxins must affect.

In ähnlicher Weise wurde festgestellt daß auch weitere Zellarten auf GCAP-II ansprechen, u. a. Belegzellen des Magens, Kryptenzellen des Dünndarms, Schaltzellen der Pankreasgänge und Leber, die unter Verwendung des GCAP-II auch die intracelluläre Ca⁺⁺ Konzentration ändern.Similarly, it was found that other cell types respond to GCAP-II, including a. Parietal cells of the stomach, crypt cells of the small intestine, switching cells of the pancreatic ducts and Liver that also change the intracellular Ca⁺⁺ concentration using the GCAP-II.

Example 4 Representation of the cDNA for the precursor protein of human GCAP-II / uroguanylin

Aus acht humanen Geweben (Duodenum, Colon, Magen, Leber, Pankreas, Niere, Nebenniere und Harnblase) wurde mit Standardmethoden die Gesamt-RNA gewonnen. Mit Hilfe MMLV-Reverser Transkriptase und des Oligo(dT)-Primers UNIP-5 (siehe Abb. 2 u. 3), der teilweise komplementär zum Poly(A)-Schwanz eukaryontischer mRNA ist, erfolgte eine Umschreibung in cDNA- Erststrang.From eight human tissues (duodenum, colon, stomach, liver, pancreas, kidney, adrenal and Bladder), the total RNA was obtained using standard methods. With the help of MMLV-Reverser Transcriptase and the oligo (dT) primer UNIP-5 (see Fig. 2 and 3), which are partially complementary to poly (A) tail is eukaryotic mRNA, a rewriting was made in cDNA- First strand.

Ausgehend von der GCAP II-Aminosäuresequenz (FKTLRTIANDDCELCVNVACTGCL) wurde der degenerierte PCR-Primer HUGU-5 (siehe Abb. 2 u. 3) konstruiert, der die Codons für das C- terminale Fragment CVNVAC beinhaltet. Mit Hilfe dieses Primers und des Primers UMP-6 (siehe Abb. 2 u. 3), dessen Sequenz in UNIP-5 enthalten ist, wurden anschließend unter Verwendung der verschiedenen cDNAs Polymerase-Kettenreaktionen (PCRs) (Saiki, R.K. et al., Science, 239, 487-491, 1988) durchgeführt. Nur im Falle der Colon-cDNA erhielten wir ein 280 bp großes Amplifikationsprodukt. Dieses DNA-Fragment wurde kloniert und sequenziert. Die Analyse der Nucleotidsequenz ergab, daß in 3′-Richtung hinter der Region, welche dem Primer HUGU-5 entspricht, ein Bereich folgt, der im korrekten Leseraster für die Aminosäuren codiert, die aus den Peptidsequenzen zu erwarten sind. Dies bestätigte die Klonierung eines GCAP-II/Uroguanylin-spe zifischen cDNA-Fragmentes. Auf das Codon für Leucin in Position 24 von GCAP II bzw. in Position 16 von Uroguanylin folgt dann ein TGA-Translationsstopcodon, was ein Beweis dafür darstellt, daß die isolierten Peptide den C-Terminus eines Vorläuferproteins repräsentieren.Based on the GCAP II amino acid sequence (FKTLRTIANDDCELCVNVACTGCL) was constructed the degenerate PCR primer HUGU-5 (see Fig. 2 and 3), which contains the codons for the C- includes terminal fragment CVNVAC. With the help of this primer and the primer UMP-6 (see Fig. 2 u. 3), the sequence of which is contained in UNIP-5, were subsequently used using the various cDNAs polymerase chain reactions (PCRs) (Saiki, R.K. et al., Science, 239, 487-491, 1988). We received a 280 bp size only in the case of the colon cDNA Amplification product. This DNA fragment was cloned and sequenced. The analysis of the Nucleotide sequence revealed that in the 3'-direction behind the region which the primer HUGU-5 corresponds to a region which codes in the correct reading frame for the amino acids which result from the Peptide sequences are expected. This confirmed the cloning of a GCAP-II / uroguanylin-spe specific cDNA fragment. On the codon for leucine in position 24 of GCAP II or in Position 16 of Uroguanylin is then followed by a TGA translation stop codon, which is evidence of this represents that the isolated peptides represent the C-terminus of a precursor protein.

Um mögliche Syntheseorte des GCAP-II/Uroguanylin-Vorläuferproteins zu identifizieren, wurde eine Northern-Hybridisierung (Thomas, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205, 1980) mit Gesamt-RNA aus einer Reihe humaner Gewebe (Tonsillen, Parotis, Herzaurikel, Magen, Pankreas, Leber, Colon, Niere und Nebenniere) durchgeführt. Als Hybridisierungsprobe wurde ein inneres, mit den Primern HUGU-8 und HUGU-9 (siehe Abb. 2 u. 3) erhaltenes PCR- Fragment verwendet, welches nicht mehr die Oligo(dT)-Sequenz des Primers HUGU-5 enthält und daher nicht zu einem unspezifischen Hintergrund durch Kreuzhybridisierung mit den Poly(A)- Schwänzen eukaryontischer mRNAs führt. Von den untersuchten Geweben zeigte nur Colon ein relativ starkes Signal, was für eine hohe Expressionsrate des DCAP-II/Uroguanylin-Gens in diesem Gewebe spricht.In order to identify possible synthesis sites of the GCAP-II / uroguanylin precursor protein, Northern hybridization (Thomas, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5201-5205, 1980) with total RNA from a number of human tissues (tonsils, parotid, cardiac Stomach, pancreas, liver, colon, kidney and adrenal gland). As a hybridization sample was an inner PCR obtained with the primers HUGU-8 and HUGU-9 (see Fig. 2 and 3) Fragment used, which no longer contains the oligo (dT) sequence of the primer HUGU-5 and therefore not to an unspecific background by cross-hybridization with the poly (A) - Tails eukaryotic mRNAs leads. Only Colon showed one of the examined tissues relatively strong signal, which indicates a high expression rate of the DCAP-II / uroguanylin gene in this tissue speaks.

Die Kenntnis des Syntheseortes erlaubte nun die Durchführung einer sogenannten 5′-RACE-PCR (Frohmann, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988) zur Amplifikation des 5′-terminalen Restes der GCAP-II/Uroguanylin-cDNA. Hierzu wurden die selbstkonstruierten Primer HUGU-7, HUGU-9 und HUGU-10, humane Colon-Gesamt-RNA und das 5′-RACE-System von Gibco BRL (Eggenstein) verwendet. Tatsächlich wurde ein 500 bp großes homogenes Fragment im letzten Amplifikationsschritt erhalten. Durch Klonierung und Sequenzierung konnte die Spezifität für GCAP-II/Uroguanylin bestätigt und zusammen mit der zuerst erhaltenen Sequenz eine komplette, 583 Basenpaare große cDNA-Sequenz des GCAP- II/Uroguanylin-Vorläufers zusammengesetzt werden (siehe Abb. 3).Knowing the place of synthesis allowed a so-called 5'-RACE-PCR to be carried out (Frohmann, M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988) for amplification of the 5'-terminal residue of the GCAP-II / uroguanylin cDNA. For this, the self-designed primers HUGU-7, HUGU-9 and HUGU-10, human colon total RNA and used the 5′-RACE system from Gibco BRL (Eggenstein). In fact, a 500 bp large homogeneous fragment obtained in the last amplification step. By cloning and The sequencing confirmed the specificity for GCAP-II / uroguanylin and together with the first sequence obtained a complete, 583 base pair cDNA sequence of the GCAP II / uroguanylin precursor (see Fig. 3).

Das erste in der Sequenz erscheinende potentielle Translationsstartcodon ATG ist tatsächlich der Beginn eines offenen Leserasters von 336 Basenpaaren, das für einen 112 Aminosäuren großen GCAP-II/Uroguanylin-Vorläufer codiert. Die N-terminal ersten 21 Aminosäuren zeigen erwartungsgemäß die typischen Charakteristika (hohe Hydrophobizität) eines sekretorischen Signalpeptides (Von Heÿne, G., Eur. i. Biochem., 133, 17-21, 1983). Der 3′-Terminus der cDNA-Sequenz codiert wie bereits erwähnt für die isolierten Peptide GCAP-II und Uroguanylin.The first potential translation start codon ATG appearing in the sequence is actually the Start of an open reading frame of 336 base pairs, the one for 112 amino acids GCAP-II / uroguanylin precursor encoded. The N-terminal first shows 21 amino acids As expected, the typical characteristics (high hydrophobicity) of a secretory Signal peptides (Von Heÿne, G., Eur. I. Biochem., 133, 17-21, 1983). The 3′-terminus of As already mentioned, the cDNA sequence codes for the isolated peptides GCAP-II and uroguanylin.

Claims

1. GCAP-II with the amino acid sequence Phe - Lys - Thr - Leu - Arg - Thr - Ile - Ala - Asn - Asp - Asp - Cys - Glu - Leu - Cyc - Val - Asn - Val - Ala - Cys -Thr - Gly - Cvc - Leu GCAP-II as well as its natural and pharmacologically acceptable derivatives, especially amidated, Acetylated, phosphorylated and glycosylated GCAP-II derivatives. Still natural and Artificial fragments with biological effects derived from the amino acid sequence will.

2. GCAP-II precursor cDNA sequence and deduced amino acid sequence of the GCAP-II Precursor according to Fig. 3.

3. C-terminal fragments of the from the obtained by specific endoproteolytic cleavage cDNA sequence derived GCAP-II precursor with biological activity according to Fig. 4.

4. Process for the preparation of the GCAP-II or its derivatives and its fragments Claim 1 characterized in that this via a prokaryotic or eukaryotic expression is prepared and purified by chromatography.

5. Process for the preparation of the GCAP-II or its derivatives and its fragments Claim 1 characterized in that it is made from human blood via usual Chromatography method isolated in a known manner.

6. Process for the preparation of GCAP-II or its derivatives and its fragments Claim 1, characterized in that the GCAP-II or its derivatives by the usual Process of solid-phase and liquid-phase synthesis from the protected amino acids, which in the output sequence are included, manufactures, unblocked and it with the usual Chromatography procedure cleans.

7. Medicament containing the human circulating GCAP-II or its derivatives and its Fragments according to claims 1 and 3 or produced according to claims 4 to 6, the GCAP-II as active ingredient in addition to usual auxiliaries and additives.

8. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of diseases which Malfunctions in the electrolyte-water balance occur (kidney and bowel diseases).

9. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of diseases of the human organism, especially with involvement of the gastrointestinal tract, respiratory tract and the urogenital system.

10. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of diseases of the human organism, especially with involvement of the cardiovascular and nervous systems.

11. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of diseases of the human organism, especially with the involvement of the intugement and sensory organs.

12. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of systemic diseases Overproduction or deficiency of GCAP-II, especially in e.g. B. by application against this antibodies formed or for the use of GCAP-II for substitution therapy.

13. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of chronic Diseases, partly associated with diseases according to claims 8 to 12, by in suitable form for the treatment for the electrolyte effect in diseases on the Bone remodeling (osteoporosis) or on the dental apparatus is used.

14. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of endocrine Diseases associated with stimulation of the cGMP level in endocrine cells such as e.g. B. the diseases of the endocrine pancreas (diabetes), the pituitary and the endocrine Gastrointestinal tract.

15. Use of the medicament according to claim 7 for the treatment of acute diseases, according to claims 8 to 14, by being in a suitable form for the treatment in intensive care of these diseases is used.

16. Use of the medicament according to claim 7 for the diagnosis of diseases, in particular according to any one of claims 8 to 14, by specific antibodies against the synthetic peptide or its derivatives and its fragments are produced and the Blood concentration GCAP-II is measured via immunoassays.

17. Use of the medicament according to claim 7 in various galenic Application forms, in particular the lyophilized form taken up with mannitol in sterile Ampoules for dissolution in physiological saline and / or infusion solutions for repeated single injection and / or continuous infusion in amounts from 300 micrograms to 30 Milligrams of pure GCAP-II per therapy unit.

18. Use of the human cDNA for the detection and treatment of claims 8 to 14 diseases mentioned, by using gene probes derived from the sequenced area, synthetically or biotechnologically manufactured and for diagnosis using hybridization techniques (e.g. Southern and Northern blots) as well as with a specific PCR reaction.

19. Use of the human cDNA as a hybridization probe or for the production of Oligonucleotides as hybridization probes which serve to clone the human GCAP-II gene.

20. Use of the gene according to claim 18 for the construction of vectors which are specific in the Gene therapy for GCAP-II dependent diseases can be used.

21. Use of the cDNA or the gene according to claim 18 with the developed Nucleotide sequences for the construction of expression systems, consisting of the in these Sequences contain nucleotide fragments for the production of GCAP-II-related peptides for the economic exploitation, in particular the treatment of claims 8 to 14 diseases mentioned.

22. Use of the human GCAP-II gene according to claim 18 with its developed Nucleotide sequence for changing the genome in animals, commercial use find, e.g. B. in the form of transgenic species or modified animal species that are particularly resistant against the diseases mentioned in claims 8 to 14.

23. Claim 14 also includes the use of other known peptides from this group of substances namely Guanylin-I (GCAP-I) claimed because the endocrine organs mentioned in the context were included in this study. These include the substances Guanylin I (GCAP-I) and its Precursor protein with its primary structures and natural cleavage products.