DE19522999C1

DE19522999C1 - Fluorescence suppression system for Raman spectroscopy

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Publication number: DE19522999C1
Application number: DE1995122999
Authority: DE
Inventors: Thomas Kaiser; Gustav Schweiger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-06-24
Filing date: 1995-06-24
Publication date: 1996-09-05
Anticipated expiration: 2015-06-25

Abstract

The fluorescence suppression system has the sample irradiated with electromagnetic radiation with a very high field strength with frequencies in the absorption range for reducing the fluorescence of the sample substance. The very high field strength of the electromagnetic radiation is pref. provided by focussing a laser beam onto a small quantity of the substance in the nanogram range.

Description

Die spontane Ramanspektroskopie ist eine sehr leistungsfähige Analysemethode, die zur Aufklärung der Molekülstruktur, kontakt- und zerstörungsfreien optischen Messung von Temperaturen, Drücken und Konzentrationen eingesetzt wird. Bisher blieb die Anwendung dieser Technik jedoch auf gering oder nicht fluoreszierende, meist hochreine Substanzen be schränkt da sehr geringe Mengen von Verunreinigungen Fluoreszenz hervorrufen können, die sich dem Ramanspektrum überlagert. Ramanspektren vieler Substanzen und Substanzgemi sche können daher nur mit sehr schlechtem Signal-/Rauschverhältnis oder, bei sehr starker Fluoreszenz, überhaupt nicht gemessen werden.The spontaneous Raman spectroscopy is a very powerful analysis method that is used for Clarification of the molecular structure, non-contact and non-destructive optical measurement of Temperatures, pressures and concentrations are used. So far, the application has remained this technique, however, be based on low or non-fluorescent, mostly high-purity substances limits very small amounts of contaminants which can cause fluorescence overlaps the Raman spectrum. Raman spectra of many substances and substance mixtures can therefore only with a very poor signal / noise ratio or, in the case of a very strong one Fluorescence, cannot be measured at all.

In den letzten Jahren wurden Methoden vorgestellt, die die Fluoreszenz zu umgehen versu chen, indem man Anregungswellenlängen im Infraroten (IR) und nahen Infrarot (NIR) wählt. In diesem Wellenlängenbereich sind dispersive Bauelemente, wie Gittermonochromatoren, und herkömmliche Detektoren (Photomultiplier und CCD-Sensoren) aufgrund der geringen Transmission bzw. Quantenausbeute nur noch begrenzt einsetzbar. Daher wurden FT-Raman spektrometer (B. Chase, Appl. Spectrosc. 48 (1994), pp. 14A-19A) entwickelt, die die zeitli che Abhängigkeit der Streulichtintensität mit Hilfe einer schnellen Fouriertransformation (FFT) in den Frequenzbereich übertragen. Ein Problem dieser Geräte ist oft eine starke Ab sorption der Proben im IR und eine damit verbundene Aufheizung und eventuell thermische Zersetzung. Die neuesten Techniken der Ramanspektroskopie und die mit ihnen verbundenen Probleme werden von Schrader vorgestellt (B. Schrader (Ed.) Infrared and Raman spec troscopy: methods and applications, VCH, Weinheim (1995)). Ein weiterer Nachteil ist, daß der, ohnehin sehr geringe, Streuquerschnitt für einen Ramanübergang proportional zur vierten Potenz der einfallenden Frequenz ist. Dies bedeutet, daß das Streulicht mit zunehmender Wellenlänge dramatisch abnimmt. Aus den obengenannten Gründen wäre es daher günstiger Anregungswellenlängen im kurzwelligen Bereich des Lichtes (also z. B. im blauen oder grü nen Bereich) zu wählen.In recent years, methods have been presented that try to avoid fluorescence by choosing excitation wavelengths in the infrared (IR) and near infrared (NIR). In this wavelength range are dispersive components, such as grating monochromators, and conventional detectors (photomultiplier and CCD sensors) due to the low Transmission or quantum yield can only be used to a limited extent. Hence FT-Raman spectrometer (B. Chase, Appl. Spectrosc. 48 (1994), pp. 14A-19A), which developed the Zeitli che dependence of the scattered light intensity with the help of a fast Fourier transformation (FFT) in the frequency domain. One problem with these devices is often a strong Ab sorption of the samples in the IR and a related heating and possibly thermal Decomposition. The latest techniques of Raman spectroscopy and the related ones Problems are presented by Schrader (B. Schrader (Ed.) Infrared and Raman spec troscopy: methods and applications, VCH, Weinheim (1995)). Another disadvantage is that the, anyway very small, scattering cross section for a Raman transition proportional to the fourth Is the power of the incident frequency. This means that the stray light increases with increasing Wavelength decreases dramatically. It would therefore be cheaper for the reasons mentioned above Excitation wavelengths in the short-wave range of light (e.g. in the blue or green area).

Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, die bei der Raman spektroskopie auftretende Fluoreszenz zu reduzieren.The invention addresses the problem with Raman spectroscopy to reduce fluorescence.

Gemäß den Patentansprüchen 5 bis 8 können einzelne flüssige oder feste Partikel im Untersuchungsvolumen des Ramanspektrometers durch optische, akustische oder elektrische Kräfte fixiert werden. Erfindungsgemäß führen bei genügend hohen Strahlungsflußdichten die sehr hohen Energiedichten, die durch den Fokussierungseffekt der Mikropartikel und auftretende Resonanzeffekte (Anspruch 3) im Inneren der Partikel entstehen, zu einer Unterdrückung der Fluoreszenz. Häufige Ursache dafür ist ein Multiphotonenprozeß, der nur die nicht gewollten Verunreinigungen zerstört und die Hauptkomponenten des Partikels nicht beeinflußt.According to claims 5 to 8, individual liquid or solid particles in the Examination volume of the Raman spectrometer by optical, acoustic or electrical Forces are fixed. According to the invention lead to sufficiently high radiation flux densities the very high energy densities caused by the focusing effect of the microparticles and occurring resonance effects (claim 3) arise in the interior of the particles to a Suppression of fluorescence. A common cause of this is a multiphoton process that only the unwanted impurities are destroyed and the main components of the particle are not influenced.

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen somit insbesondere darin, daßThe advantages achieved with the invention are thus in particular that

- Very small amounts of substance (in the nanogram range) with Raman spectroscopy can be examined (claim 2),
the fluorescence of interfering contaminants is suppressed by photolysis,
- There is no fluorescence from cell walls or glass substrates (claims 4 to 8th),
- Very good signal / noise ratios due to excitation wavelengths in the visible range rich and conventional spectrographs / monochromators with CCD cameras or Photomultipliers can be achieved (claims 9 and 10).

Eine erfindungsgemäß besonders bevorzugte Ausführung (Anspruch 5 und 9) wird im folgenden näher beschrieben. In den beiliegenden Zeichnungen sind Details der Erfindung dargestellt:A particularly preferred embodiment according to the invention (claims 5 and 9) is in following described in more detail. In the accompanying drawings are details of the invention shown:

Fig. 1 zeigt eine Skizze des Versuchsaufbaus zur Ramanspektroskopie an optisch levitier ten Partikeln. Fig. 1 shows a sketch of the experimental setup for Raman spectroscopy on optically levitated particles.

Fig. 2 zeigt Ramanspektren von fluoreszierenden DOP/Coumarin 6 Gemischen an einem Einzelpartikel und in der Küvette. Fig. 2 shows Raman spectra of fluorescent DOP / Coumarin 6 mixtures on a single particle and in the cuvette.

Fig. 3 zeigt Ramanspektren von einem Photomonomer SOMOS™ 3100 (DuPont) am Einzelpartikel und in der Küvette gemessen. Fig. 3 shows Raman spectra of a photomonomer SOMOS 3100 ™ (DuPont), measured on individual particles and in the cuvette.

Fig. 4 zeigt Ramanspektren von Motoröl Castrol GTX 3 am Einzelpartikel und in der Küvette gemessen. Fig. 4 shows Raman spectra of engine oil Castrol GTX 3 measured on individual particles and in the cuvette.

Der in Fig. 1 dargestellte Versuchsstand (T. Kaiser, G. Roll, G. Schweiger, J. Opt. Soc. Am. B 12 (1995) pp. 281-286) benutzt einen Argonionenlaser (LEXEL 3000-5) zur optischen Levitation der Partikel und gleichzeitigen Anregung der Ramanstreuung. Typische Laserlei stungen während des Versuches liegen zwischen 0.5 W und 1.0 W bei einer Wellenlänge von 488 oder 514.5 nm. Nach einer Aufweitung des Laserstrahls mit einem Mikroskop- und einem Teleskopobjektiv wird der Laserstrahl in die Vertikale justiert und in der Meßkammer (Durchmesser 12 mm, Länge 150 mm mit aufgeklebten optischen Fenstern) fokussiert. Die Position des levitierten Tropfens wird durch Anpassen der Laserleistung stabil geregelt. Dies geschieht über einen Rechner mit A/D- und D/A-Wandler. Die Information über die Position wird dem Rechner über eine positionssensitive Diode zugeführt, auf die das levitierte Partikel abgebildet wird. Die Leistung des Lasers wird durch einen implementierten PID-Regelalgo rithmus angepaßt, um den Tropfen an derselben Stelle zu halten. Das Streulicht des Tropfens wird unter einem Streuwinkel von θ=90° mit einem Öffnungswinkel von Ω≈40° auf den Ein trittsspalt eines Tripelmonochromators (DILOR XY 500) abgebildet. Die Intensität des inela stisch gestreuten Lichts wird mit einer flüssig-Stickstoff-gekühlten CCD-Kamera detektiert und von einem Rechner mit geeignetem Interface-Board und Software verarbeitet. Die Trop fen werden mit einem Schwingblendengenerator (R. N. Berglund, B. Y. H. Liu, Environ. Sci. Technol. 7 (1973) pp. 147-153) oberhalb der Meßkammer erzeugt. Diese Aerosolwolke se dimentiert in einem ≈0.5 m langem Glasrohr mit einem Durchmesser von ≈60 mm. Zum Ab bremsen des Aerosols wird eine geringe Gegenströmung mit einer Membranpumpe aufge bracht, um die Partikel langsam in die Meßkammer abzusenken. Nach dem Einfangen eines Partikels (mit einem typischen Durchmesser von ≈20 µm) durch die optischen Kräfte, wird die Meßkammer mit einem Ventil verschlossen und nach Einschalten der Positionsregelung kann die spektroskopische Untersuchung gestartet werden.The trainer shown in Fig. 1 (T. Kaiser, G. Roll, G. Schweiger, J. Opt. Soc. Am. B 12 (1995) pp. 281-286) uses an argon ion laser (LEXEL 3000-5) for optical Levitation of the particles and simultaneous stimulation of Raman scattering. Typical Laserlei stungen during the experiment are between 0.5 W and 1.0 W at a wavelength of 488 or 514.5 nm. After expanding the laser beam with a microscope and a telescope lens, the laser beam is adjusted vertically and in the measuring chamber (diameter 12 mm, Length 150 mm with glued on optical windows). The position of the levitated drop is stably regulated by adjusting the laser power. This is done using a computer with A / D and D / A converter. The information about the position is fed to the computer via a position-sensitive diode on which the levitated particle is imaged. The power of the laser is adjusted by an implemented PID control algorithm to keep the drop in the same place. The scattered light of the drop is imaged on the entrance slit of a triple monochromator (DILOR XY 500) at a scattering angle of θ = 90 ° with an aperture angle of Ω≈40 °. The intensity of the inelastic scattered light is detected with a liquid nitrogen-cooled CCD camera and processed by a computer with a suitable interface board and software. The droplets are generated with an oscillating diaphragm generator (RN Berglund, BYH Liu, Environ. Sci. Technol. 7 (1973) pp. 147-153) above the measuring chamber. This aerosol cloud separates in a ≈0.5 m long glass tube with a diameter of ≈60 mm. To slow down the aerosol, a small counterflow is brought up with a membrane pump to slowly lower the particles into the measuring chamber. After a particle (with a typical diameter of ≈20 µm) is captured by the optical forces, the measuring chamber is closed with a valve and after switching on the position control, the spectroscopic examination can be started.

In Fig. 2 sind Spektren von DOP dargestellt, welches mit Coumarin 6, einem Laserfarb stoff, versetzt wurde. Die oberste Kurve (a) stammt von einem DOP/Coumarin 6 Einzelparti kel während Kurve (b) von reinem DOP in der Küvette stammt. Spektrum (c) zeigt das Spek trum der verwendeten Aerosolsubstanz, die aus leichtflüchtigem 1,1,2-Trichlortrifluormethan (Frigen 113) und DOP (9 : 1) mit Coumarin 6 besteht, in einer Küvette gemessen. Die starken Ramanlinien zwischen 300 und 1500 cm^-1, die sich auf einem sehr breiten Fluoreszenzunter grund befinden, werden durch das Frigen verursacht, während die C-H-Schwingungsbande bei 2900 cm^-1 vom DOP stammt. Das Küvettenspektrum von Frigen 113 ist in Fig. 2 (d) dargestellt. Die letzte Kurve (e) in Fig. 2 zeigt das Küvettenspektrum der Aerosolsubstanz aus (a) und (c) gemessen an einer Tropfenkette. In diesem Versuch fielen die Tropfen durch den Laserstrahl und hatten dort eine Aufenthaltsdauer von ≈10 µs. Diese Zeitspanne reicht nicht aus, um durch Photolyse die fluoreszierenden Moleküle zu zerstören.In Fig. 2 spectra of DOP are shown, which was mixed with Coumarin 6, a laser dye. The top curve (a) comes from a DOP / Coumarin 6 individual particles while curve (b) comes from pure DOP in the cuvette. Spectrum (c) shows the spectrum of the aerosol substance used, which consists of volatile 1,1,2-trichlorotrifluoromethane (Frigen 113) and DOP (9: 1) with coumarin 6, measured in a cuvette. The strong Raman lines between 300 and 1500 cm ^-1 , which are located on a very wide fluorescence background, are caused by the freezing, while the CH vibration band at 2900 cm ^-1 comes from the DOP. The cuvette spectrum of Frigen 113 is shown in Fig. 2 (d). The last curve (e) in FIG. 2 shows the cuvette spectrum of the aerosol substance from (a) and (c) measured on a drop chain. In this experiment, the drops fell through the laser beam and stayed there for ≈10 µs. This period of time is not sufficient to destroy the fluorescent molecules by photolysis.

Daher müssen erfindungsgemäß einzelne Partikel länger im Untersuchungsvolumen des Spektrometers gehalten werden. Eine typische Messung, die keine Fluoreszenz mehr zeigt, kann wenige Sekunden nach dem Einfangen des Partikels erfolgen.Therefore, according to the invention, individual particles have to last longer in the examination volume of the Spectrometer are kept. A typical measurement that no longer shows fluorescence, can occur a few seconds after the particle is captured.

Weitere untersuchte Substanzen, die mit der Ramanspektroskopie im sichtbaren Bereich bisher nicht untersucht werden können zeigen Fig. 3 und Fig. 4. In Fig. 3 ist das Ramanspek trum von einem kommerziell erhältlichen Photomonomer (SOMOS™ 3100, DuPont, erhält lich bei Electro Optical Systems, EOS, München), welches üblicherweise in der Laser Stereo lithographie eingesetzt wird, an einem Einzelpartikel und in der Küvette gemessen, darge stellt. Fig. 4 zeigt das Ramanspektrum von kommerziell erhältlichem Motoröl (Castrol GTX 3) wiederum an einem Einzelpartikel und in der Küvette gemessen. In beiden Fällen zeigt das Küvettenspektrum einen extrem hohen Untergrund, auf dem bei dem Monomer Ramanbanden zu erkennen sind. Diese Ramanbanden sind von der Position und der relativen Amplitude identisch mit denen im Einzelpartikelspektrum. Dies beweist, wie auch bei dem DOP-Partikel, daß keine chemische Veränderung an der eigentlichen Substanz verursacht wird. Bei dem Motoröl ist der Untergrund sogar so stark, daß keine Ramanbanden mehr detektiert werden können. Dagegen zeigt das Einzelpartikelspektrum ein sehr gutes Spektrum mit hervorragendem Signal-/Rauschverhältnis auf einem niedrigen Untergrund. Dieser Untergrund zeigt einige scharfe Spitzen, die von der Größe und Form der Partikel abhängen und sogenannten Strukturresonanzen (S. C. Hill, R. E. Benner in: Optical effects associated with small particles, P. Barber, R. K. Chang (Eds.), World Scientific, Singapore, 1988) zuzuschreiben sind. Die Resonanzen müssen bei der Interpretation des Spektrums berücksichtigt werden, sie liefern aber zusätzlich eine Information über die Größe des levitierten Partikels. FIGS . 3 and 4 show further substances that have not been investigated in the visible range with Raman spectroscopy . In FIG. 3, the Raman spectrum is obtained from a commercially available photomonomer (SOMOS ™ 3100, DuPont, available from Electro Optical Systems, EOS, Munich), which is commonly used in laser stereo lithography, measured on a single particle and in the cuvette, represents Darge. Fig. 4 shows the Raman spectrum of commercially available engine oil (Castrol GTX 3) measured in turn in a single particle, and in the cuvette. In both cases the cuvette spectrum shows an extremely high background on which Raman bands can be seen with the monomer. These Raman bands are identical in position and relative amplitude to those in the single particle spectrum. As with the DOP particle, this proves that no chemical change is caused to the actual substance. The surface of the motor oil is so thick that Raman bands can no longer be detected. In contrast, the single particle spectrum shows a very good spectrum with an excellent signal-to-noise ratio on a low background. This background shows some sharp peaks that depend on the size and shape of the particles and so-called structure resonances (SC Hill, RE Benner in: Optical effects associated with small particles, P. Barber, RK Chang (Eds.), World Scientific, Singapore, 1988) are attributable. The resonances must be taken into account when interpreting the spectrum, but they also provide information about the size of the levitated particle.

Erfindungsgemäß können auch andere Techniken der sogenannten optischen Pinzette ver wendet werden. In der Literatur werden Einstrahlgradientenfallen (A. Ashkin, J. M. Dziedzic, J. E. Bjorkholm, S. Chu, Opt. Lett. 11 (1986) pp. 288-290) und optische Fallen mit zwei hori zontalen Laserstrahlen (G. Roosen, C. Imbert, Phys. Lett. 59A (1976) pp. 6-9) beschrieben.According to the invention, other techniques of the so-called optical tweezers can also be used be applied. In the literature, radiation gradient traps are used (A. Ashkin, J. M. Dziedzic, J.E. Bjorkholm, S. Chu, Opt. Lett. 11 (1986) pp. 288-290) and optical traps with two hori zontal laser beams (G. Roosen, C. Imbert, Phys. Lett. 59A (1976) pp. 6-9).

Erfindungsgemäß kann die Levitation nicht nur durch optische Kräfte, sondern auch durch akustische oder elektrische erfolgen. Entweder werden die Partikel hierbei in einem Schallfeld oder geladene Partikel in einem elektrischen Feld (elektrodynamisch oder elektrostatisch) fi xiert.According to the invention, levitation can be achieved not only through optical forces, but also through acoustic or electrical. Either the particles are in a sound field or charged particles in an electric field (electrodynamic or electrostatic) fi xiert.

Erfindungsgemäß können sowohl feste als auch flüssige Partikel oder auch Mehrphasen partikel untersucht werden.According to the invention, both solid and liquid particles or multiphases can be used particles are examined.

Erfindungsgemäß kann als Lichtquelle jeder Laser (Dauerstrich oder Puls) mit genügend hoher Leistung benutzt werden.According to the invention, any laser (continuous wave or pulse) can be sufficient as a light source high performance.

Erfindungsgemäß können beliebige frequenzselektive Bauelemente wie Interferenzfilter, Monochromatoren und Spektrographen mit Gittern oder Prismen mit ein oder mehr Stufen eingesetzt werden. Das sehr starke elastische Streulicht kann eventuell auch mit einem Vorfil ter unterdrückt werden. Das inelastische Streulicht kann mit einem Photomultiplier, Diodenarray oder einem CCD-Sensor gemessen werden.According to the invention, any frequency-selective components such as interference filters, Monochromators and spectrographs with grids or prisms with one or more stages be used. The very strong elastic scattered light can possibly also with a Vorfil be suppressed. The inelastic scattered light can also be used a photomultiplier, diode array or a CCD sensor can be measured.

Erfindungsgemäß kann die Einbringung des Aerosols mit verschiedenen Generatortypen realisiert werden.According to the invention, the aerosol can be introduced with different generator types will be realized.

Die Positionskontrolle des Partikels kann, wie oben beschrieben, eingesetzt werden oder durch Anpassung der Laserleistung über einen elektrooptischen Modulator. Wenn sicherge stellt ist, daß das Bild des Partikels nicht aus dem Eintrittsspalt des frequenzselektiven Ele ments wandert, kann auch auf eine Regelung verzichtet werden.The position control of the particle can be used as described above or by adjusting the laser power via an electro-optical modulator. If secured is that the image of the particle does not emerge from the entrance slit of the frequency-selective Ele regulations, a regulation can also be dispensed with.

Claims

1. A method for suppressing fluorescence in Raman spectroscopy of solid or liquid substances, characterized in that the fluorescence is reduced or suppressed by illuminating the sample with electromagnetic radiation of very high field strengths with frequencies in the absorption range of the fluorescent substances by illuminating the portion of these substances is reduced by photolysis.

2. The method according to claim 1, characterized in that the high field strengths by Focusing a laser beam on small amounts of material in the nanogram range will.

3. The method according to claim 1, characterized in that the high field strengths by Excitation of structure resonances in microparticles arise.

4. The method according to claim 1, characterized in that the fixation of the substance done without contact with solid walls.

5. The method according to claim 4, characterized in that the fixation in space by optical forces occur.

6. The method according to claim 4, characterized in that the fixation in space by acoustic forces occur.

7. The method according to claim 4, characterized in that the fixation in space by electrical forces occur.

8. The method according to claim 4, characterized in that the fixation with a Re The particle position is adjusted to include samples with variable mass or Vo to examine lumens.

9. The method according to claim 1, characterized in that the imaging of the scattered light on different frequency-selective components (monochromator, spectrograph, interface renzfilter) with lenses.

10. The method according to claim 1, characterized in that the imaging of the scattered light on different frequency-selective components (monochromator, spectrograph, interface limit filter) with optical fibers.