DE19521181A1

DE19521181A1 - Appts. which determines toxicity of water

Info

Publication number: DE19521181A1
Application number: DE1995121181
Authority: DE
Inventors: Hans-Achim Dr Reimann
Original assignee: REIMANN HANS ACHIM DR
Current assignee: REIMANN, HANS-ACHIM, DR., 61440 OBERURSEL, DE
Priority date: 1995-06-10
Filing date: 1995-06-10
Publication date: 1996-12-12

Abstract

The automated analytical instrument employs Vibrio fischerei photo-bacteria in the bioreactor part of the instrument, the photoluminescent intensity of which acts as a sensor, determining the biological toxicity of water. The Vibrio fischerei photo-bacteria are continually reproduced in a fermentation process with an associated substrate cycle. The substrate cycle is external to the instrument into which it is integrated. The water sample under analysis is supplied by a pump and diluted to requirement before mixing with a suspension of photo-bacteria and release into a light detector.

Description

Es ist bekannt, daß an die Wasserqualität insbesondere der von Abwasser im kommunalen oder gewerblichen Bereich zunehmend hohe Anforderungen gestellt werden. Neben der analytischen Bestimmung einzelner toxischer Inhaltsstoffe und anderer Einzelparametern wie Phosphor-, Stickstoff-, Quecksilber- und Cadmiumgehalt und pH-Wert sieht das Abwasserabgabengesetz (AbwAG, Bundesgesetzblatt 1990, Nr. 61, Teil I, S. 2433-2438) auch die Erfassung von Sum menparametern wie den gesamten Kohlenstoffgehalt (TC), den chemischen und biochemischen Sauerstoffbedarf (CSB und BSB) bzw. Gruppenparametern wie z. B. adsorbierbares organisch gebundenes Halogen (AOX) vor (Laborhandbuch für die Untersuchung von Wasser, Abwasser und Boden, H.H. Rump, H. Krist, VCH-Verlag, 2. Aufl. 1992, S. 71, Umweltanalytik, I.L. Marr, M.S. Cresser, L.J. Ottendorfer, Thieme Verlag 1988, 5. 161f). Als weiterer wichtiger Parameter gilt der sog. Fischtest, der nach DIN 38412 Teil 31 mit Goldorfen durchgeführt wird. Dieser Test liefert als summarische und wirkungsbezogene Größe ein Maß für die biolo gische Toxizität (Wasser und Wasseruntersuchung, Leonhard A. Hütter, Salle und Sauerlän der, 5. Aufl. 1992, S. 241f), deren Auswirkung wegen ihrer Komplexität am besten an einem stoffwechselaktiven Organismus beobachtet werden kann. Die Nachteile dieses Fischtests sind die lange Inkubationszeit von 48 h in der Wasserprobe, die aufwendige Haltung der Goldorfen und nicht zuletzt die schlechte Quantifizierbarkeit des Signals durch die Symptome (Luftschnappen, Taumeln, Orientierungsverlust, Lethargie und Tod). Ein weiteres Testverfah ren mit Wasserorganismen beruht auf der Verwendung von Grünalgen (Scenedesmus-Chloro phyll-Fluoreszenztest nach DIN 38412 Teil 33). Auch bei diesem Verfahren muß eine Inkuba tionszeit von 72 Stunden eingehalten werden, in der die Organismen über mehrere Generatio nen in der Wasserprobe zu kultivieren sind. Bedeutend schneller können Resultate in der Was ser- und Abwasseranalytik mit einem Testverfahren unter Verwendung von Leuchtbakterien nach DIN 38412 Teil 34 und Teil 341 erzielt werden. Die Wasserqualität, insbesondere die biologische Toxizität kann hierbei über die Hemmwirkung auf die bakterielle Lichtemission an den frisch gezüchteten oder konservierten Mikroorganismen charakterisiert werden. Dieses bereits etablierte Verfahren wird gegenwärtig in einem manuellen Küvettentest durchgeführt. Nachteilig sind neben einem entsprechend hohen Personalaufwand und den daraus resultieren den Kosten zudem Fehlerquellen, die durch individuelle Pipettierungsgenauigkeiten bedingt sein können.It is known that the water quality, in particular that of waste water in municipal or increasingly high demands are placed on the commercial sector. In addition to the analytical Determination of individual toxic ingredients and other individual parameters such as phosphorus, The Waste Water Tax Act provides for nitrogen, mercury and cadmium content and pH (AbwAG, Bundesgesetzblatt 1990, No. 61, Part I, pp. 2433-2438) also the recording of sum parameters such as total carbon (TC), chemical and biochemical Oxygen demand (COD and BOD) or group parameters such as B. adsorbable organic bound halogen (AOX) before (laboratory manual for the investigation of water, waste water and Boden, H.H. Rump, H. Krist, VCH-Verlag, 2nd ed. 1992, p. 71, environmental analysis, I.L. Marr, M.S. Cresser, L.J. Ottendorfer, Thieme Verlag 1988, 5.161f). As another important one The so-called fish test applies, which is carried out according to DIN 38412 Part 31 with gold throws becomes. This test provides a measure of the biolo as a summary and effect-related variable Toxicity (water and water analysis, Leonhard A. Hütter, Salle and Sauerlän der, 5th ed. 1992, p. 241f), the impact of which, due to their complexity, is best demonstrated by one metabolically active organism can be observed. The disadvantages of this fish test are the long incubation period of 48 hours in the water sample, the elaborate keeping of the gold throws and last but not least the poor quantifiability of the signal by the symptoms (Gasping, tumbling, loss of orientation, lethargy and death). Another test procedure ren with aquatic organisms is based on the use of green algae (Scenedesmus-Chloro phyll fluorescence test according to DIN 38412 part 33). This procedure also requires an Inkuba 72 hours, in which the organisms spread over several generations must be cultivated in the water sample. Results in the What can be significantly faster Water and wastewater analysis using a test procedure using luminous bacteria according to DIN 38412 part 34 and part 341. The water quality, especially the biological toxicity can be due to the inhibitory effect on bacterial light emission the freshly grown or preserved microorganisms are characterized. This Already established procedures are currently being carried out in a manual cuvette test. In addition to a correspondingly high personnel expenditure and the resultant disadvantages the costs also sources of error caused by individual pipetting accuracies can.

Dem im Patentanspruch 1 genannten Biosensor liegt das Problem zugrunde, die kontinuierliche Bestimmung von Wasserqualität, bezogen auf die biologische Toxizität, durch Messung der Leuchtstärkehemmung von Leuchtbakterien mit einem automatisierten und einfach bedienbaren Gerät mit Lichtdetektor schnell zu ermöglichen
Dieses Problem wird gelöst durch das in Patentanspruch 1 aufgeführte Merkmal, die zur Ana lyse notwendigen Leuchtbakterien Vibrio fischeri (DSM 7151) in einer kleinen kontinuierli chen Fermentation mit angeschlossenem Substratkreislauf innerhalb des Gerätes zu vermehren, um für eine automatisierte Messung ständig Leuchtbakterien zur Verfügung zu haben.The biosensor mentioned in claim 1 is based on the problem of quickly enabling the continuous determination of water quality, based on the biological toxicity, by measuring the luminosity inhibition of luminous bacteria with an automated and easy-to-use device with a light detector
This problem is solved by the feature listed in claim 1, the Vibrio fischeri luminous bacteria (DSM 7151) required for analysis in a small continuous fermentation with connected substrate cycle within the device to multiply, in order to have constantly available luminous bacteria for an automated measurement .

Das in Fig. 1 dargestellte Aufbauschema des Biosensorgerätes mit dem Namen BioTox-Ana lysator läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Probenteil, Fermentationsteil und Detektionsteil. The structure shown in Fig. 1 of the biosensor device with the name BioTox analyzer can be divided into three areas: sample part, fermentation part and detection part.

Bevor die kontinuierlich erzeugten Leuchtbakterien der Wasserprobe zugeführt werden, wird das Wasser im Probenteil des Analysators über eine Zweikopf-Schlauchpumpe (P1) (Schlauchdurchmesser innen 3 mm) als Teilstrom kontinuierlich an der Probenentnahmestelle gefördert. In einem Filterelement (F) mit einer Porenweite von 0,1 mm wird es von Partikeln befreit. Eine Drossel (V5) ermöglicht eine einstellbare Filtrationsrate über den Filter. Die fil trierte Wasserprobe wird anschließend über ein 4/2-Wege-Ventil (V1) und ein 3/2-Wege Ventil (V2) durch die Sogwirkung des zweiten Pumpenkanals von Pumpe 1 (Schlauchdurchmesser innen 1 mm) zu einem statischen Mischer (M) gefördert. Bei dem Ventil 2 handelt es sich um ein zeitlich getaktetes Ventil, so daß je nach Zeittakt ein unterschiedlicher Volumenstrom an Frischwasser aus einem Behälter (B3) dem Probenstrom zugeführt werden kann. Auf diese Weise lassen sich unterschiedliche Verdünnungen der Wasserprobe einstellen, wie es die DIN für die Testverfahren mit Wasserorganismen (Gruppe L) vorschreibt. Über das Ventil 1 können alternativ zur Wasserprobe auch definierte Toxinlösungen, z. B. 3,5-Dichlor phenol, aus einem Vorratsbehalter (B2) zur Eichung bzw. Standardisierung des Detektorsigna les zugeführt werden. Durch veränderte Zeittakte des Ventils 2 werden wiederum verschiedene Verdünnungsstufen eingestellt. In Meßpausen kann außerdem über das Ventil 1 Ethanol aus einem Vorratsbehälter (B1) zur Desinfektion und Reinigung des Systems gefördert werden.Before the continuously generated luminous bacteria are fed into the water sample, the water in the sample part of the analyzer is continuously conveyed as a partial flow at the sampling point via a two-head hose pump (P1) (hose diameter inside 3 mm). Particles are removed in a filter element (F) with a pore size of 0.1 mm. A throttle (V5) enables an adjustable filtration rate via the filter. The filtered water sample is then transferred via a 4/2-way valve (V1) and a 3/2-way valve (V2) through the suction effect of the second pump channel from pump 1 (hose diameter inside 1 mm) to a static mixer (M ) promoted. The valve 2 is a timed valve, so that depending on the timing, a different volume flow of fresh water from a container (B3) can be fed to the sample stream. In this way, different dilutions of the water sample can be set, as prescribed by DIN for the test procedures with water organisms (group L). Via the valve 1 can alternatively to the water sample defined toxin solutions such. B. 3,5-dichlorophenol, from a storage container (B2) for calibration or standardization of the detectorsigna les are supplied. Different dilution levels are in turn set by changing the timing of valve 2 . During measuring breaks, ethanol can also be conveyed via valve 1 from a storage container (B1) for disinfection and cleaning of the system.

Im Fermentationsteil des Analysators wird in einem verschlossenen zylindrischen Bioreaktor (BR) von 250 ml Volumeninhalt die Leuchtbakterienkultur kontinuierlich erzeugt. Durch einen zentralen Überlauf wird überschüssige Fermentationslösung abgeführt. Über eine Pumpe (P2) wird die Fermentationslösung in einem externen Substratkreislauf ständig umgewälzt, was zu einer Durchmischung des Bioreaktorinhaltes führt. Außerdem wird auf der Sogseite von Pumpe 2 über einen Sterilfilter ständig Luftsauerstoff (L) und je nach Stellung einer Drossel (V4) Nährlösung aus einem Vorratsbehälter (B4) der Fermentationslösung zugeführt. Die Nährlösung setzt sich aus 6 g/l Na₂HPO₄×2H₂O, 2,5 g/l K₂HPO₄, 0,2 g/l MgSO₄×7H₂O, 1 g/l NH₄Cl, 5 g/l Pepton, 1 g/l Hefeextrakt, 1 g/l Tris-OH, 30 g/l NaCl und 3,5 ml/l Glycerin zusam men. Bevor die Fermentationslösung in den Bioreaktor zurückfließt, wird sie mit einem Peltier- Element (K) abgekühlt, um eine Fermentationstemperatur unter 20°C zu gewährleisten. Der Vorteil dieser beschriebenen und im Patentanspruch 1 genannten Konstruktion des Bioreaktors mit einem externen Substratkreislauf besteht in einer hinreichend stabilen Fermentation der Leuchtbakterien über einen Zeitraum von mehreren Wochen, um die zur Detektion erforderli che Menge an Leuchtbakterien kontinuierlich zu erzeugen. Außer einem etwa wöchentlichen Nachfüllen der Nährlösung und einer Reinigung und Neubeimpfung des Bioreaktors nach etwa vier Wochen Dauerbetrieb sind keine regelmäßigen Wartungsarbeiten notwendig.In the fermentation part of the analyzer, the luminous bacteria culture is continuously generated in a closed cylindrical bioreactor (BR) with a volume of 250 ml. Excess fermentation solution is removed through a central overflow. The fermentation solution is continuously circulated in an external substrate circuit via a pump (P2), which leads to a thorough mixing of the bioreactor contents. In addition, on the suction side of pump 2, atmospheric oxygen (L) and, depending on the position of a throttle (V4), nutrient solution from a storage container (B4) are continuously fed to the fermentation solution via a sterile filter. The nutrient solution consists of 6 g / l Na₂HPO₄ × 2H₂O, 2.5 g / l K₂HPO₄, 0.2 g / l MgSO₄ × 7H₂O, 1 g / l NH₄Cl, 5 g / l peptone, 1 g / l yeast extract, 1 g / l Tris-OH, 30 g / l NaCl and 3.5 ml / l glycerol together. Before the fermentation solution flows back into the bioreactor, it is cooled with a Peltier element (K) in order to ensure a fermentation temperature below 20 ° C. The advantage of this described and mentioned in claim 1 construction of the bioreactor with an external substrate circuit consists in a sufficiently stable fermentation of the luminous bacteria over a period of several weeks in order to continuously generate the amount of luminous bacteria required for detection. Apart from refilling the nutrient solution about once a week and cleaning and re-inoculating the bioreactor after about four weeks of continuous operation, no regular maintenance work is necessary.

Der in Patentanspruch 2 bezeichnete Vorteil besteht in der Anwendung eines seriellen Doppel detektors. Zwei baugleiche Durchflußküvetten mit je einer Photodiode sind durch eine Inkuba tionsschleife miteinander verbunden. Durch diese Anordnung wird gewährleistet, daß die aus dem Bioreaktor nach Öffnung eines Ventils (V3) durch Sog der Pumpe 1 entnommene Leuchtbakteriensuspension nicht zwingend in einer konstanten Zusammensetzung zur Messung vorliegen muß. Die in ihrer Leuchtstärke in Abhängigkeit vom Sauerstoff-, Nährstoff- und Biomassenanteil um eine Mittelwert schwankende Bakteriensuspension wird im statischen Mi scher (M) der Wasserprobe zugemischt und über ein kurzes Verbindungsstück in den Detek torteil (D) gefördert. Die erste Photodiode registriert ein frühes Lichtsignal (S1) zu einem Zeitpunkt, an dem die in der Wasserprobe vorhandenen Toxine erst eine geringe Anfangshem mung auf die Leuchtbakterien zeigen. Nach Durchlaufen der Inkubationsschleife vervollstän digt sich die toxische Wirkung je nach Konzentration der biologischen Toxine in der Wasser probe, so daß das Lichtsignal der zweiten Photodiode (S2) weiter geschwächt ist. Die Idee basiert auf der Tatsache, daß die Geschwindigkeit der Hemmung der Leuchtbakterien abhängig von der Toxinkonzentration in der Wasserprobe ist. Auf diese Weise kann aus der Licht signaldifferenz unabhängig von den geringen Schwankungen der Bakteriensuspension die bio logische Toxizitätswirkung quantitativ ermittelt werden, da beide Signale von derselben Lö sung nach unterschiedlichem Zeitpunkt gemessen werden. Das Signal S1 entspricht dem Refe renzsignal zu dem eigentlichen Meßsignal S2. Ein programmierbarer Mikrocontroller steuert die Ventile und Pumpen und verrechnet die Meßsignale.The advantage referred to in claim 2 consists in the use of a serial double detector. Two identical flow cells, each with a photodiode, are connected by an incubation loop. This arrangement ensures that the luminescent bacteria suspension removed from the bioreactor after the opening of a valve (V3) by suction of the pump 1 does not necessarily have to be in a constant composition for measurement. The bacterial suspension, which fluctuates in its luminosity as a function of the oxygen, nutrient and biomass content, is mixed in the static mixer (M) of the water sample and conveyed into the detector part (D) via a short connecting piece. The first photodiode registers an early light signal (S1) at a point in time at which the toxins present in the water sample show only a slight initial inhibition of the luminous bacteria. After passing through the incubation loop, the toxic effect is completed depending on the concentration of the biological toxins in the water sample, so that the light signal of the second photodiode (S2) is further weakened. The idea is based on the fact that the rate of inhibition of the luminous bacteria depends on the toxin concentration in the water sample. In this way, the biological toxicity effect can be determined quantitatively from the light signal difference, regardless of the slight fluctuations in the bacterial suspension, since both signals from the same solution are measured at different times. The signal S1 corresponds to the reference signal to the actual measurement signal S2. A programmable microcontroller controls the valves and pumps and calculates the measurement signals.

Die kontinuierliche Arbeitsweise des Analysators führt zu der in Patentanspruch 3 aufgeführten Möglichkeit der ständigen Kontrolle von Abwasser in Kläranlagen. Neben der Endkontrolle des aufgereinigten Abwassers kann das Gerät auch zum Schutz der biologischen Klärstufe ein gesetzt werden, da die Leuchtbakterien in der Eingangskontrolle eine Funktion als "Vorkoster" für die Klärbiologie ausüben können.The continuous operation of the analyzer leads to that listed in claim 3 Possibility of constant control of wastewater in sewage plants. In addition to the final inspection The device can also use the treated wastewater to protect the biological clarification stage be set because the luminescent bacteria in the entrance control function as a "pre-taster" can practice for sewage biology.

Der Vorteil dieses Biosensors besteht in der kontinuierlichen und automatisierten Messung der Hemmwirkung von Toxin-belastetem Wasser auf die Lichtemission von Leuchtbakterien in Analogie zur DIN 38412 Teil 34. Das Gerät ermöglicht eine quantitative, reproduzierbare und kostengünstige Bestimmung der biologischen Toxizität und kann auch dann eingesetzt werden, wenn entsprechend ausgebildetes Personal nicht finanzierbar ist. Auf diese Weise können z. B. auch kleinere Unternehmen in die Lage versetzt werden, die biologische Toxizität ihrer Ab wässer regelmäßig bzw. ständig zu überprüfen.The advantage of this biosensor is the continuous and automated measurement of Inhibitory effect of water contaminated with toxins on the light emission of luminous bacteria in Analogy to DIN 38412 part 34. The device enables a quantitative, reproducible and inexpensive determination of biological toxicity and can also be used if appropriately trained personnel cannot be financed. In this way, e.g. B. Smaller companies will also be able to control the biological toxicity of their ab Check the water regularly or continuously.

Claims

1. Automated analyzer with luminous bacteria for the continuous determination of biological toxicity in water, characterized in that in the bioreactor part of the device, the luminous bacterium Vibrio fischeri, the light intensity of which serves as a sensor signal, is continuously generated in a fermentation with the substrate cycle connected.

2. Analyzer according to claim 1, characterized in that a serial double light end for measuring the light signal tector, consisting of two individual ones separated by an incubation loop th photodiode elements with separate signal amplification is used.

3. Analyzer according to claim 1, characterized in that by using this automated device continuously Initial measurements in wastewater treatment plants to control the biological toxicity act at the entrance to protect the biological cleaning stage and at the exit to the end control are possible.