DE19519065A1

DE19519065A1 - Selective removal of contaminants from biological liq.

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Publication number: DE19519065A1
Application number: DE19519065A
Authority: DE
Original assignee: Mitzner Steffen Drmed 18055 Rostock De
Current assignee: Artcline 18057 Rostock De GmbH
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1995-05-19
Publication date: 1996-11-21

Abstract

Method for selective sepn. of materials utilises phagocytes (PG; e.g. granulocytes or monocytes/macrophages) to remove particulate components and macromolecules from liquids (e.g. biological fluids such as plasma, cell culture media or cell cultures) by endocytosis. The method involves contacting the liq. with PG, to remove contaminants (e.g. bacterial lipopolysaccharides (endotoxins) and/or particles such as bacteria, fungi or viruses) recognised by PG, followed by removal of PG from the liq. Also claimed is an appts. for the method, in which the liq. (e.g. blood plasma) is subjected to a sepn. process (e.g. filtration or centrifugation) to remove particles (e.g. blood cells) with specific characteristics (e.g. size, wt., compsn. or surface structure/properties). The liq. is then contacted with PG in a reactor space to remove components as above followed by sepn. of PG, e.g. by filtration or centrifugation.

Description

1. Keywords

Medizin, Phagozytose, Extrakorporale Blutreinigung, Sterilisation, Bioreaktor, Sepsis, Polychemotherapie, Neutropenie.Medicine, phagocytosis, extracorporeal blood purification, sterilization, bioreactor, sepsis, polychemotherapy, Neutropenia.

Summary

Die selektive Elimination von Mikroorganismen, deren Abbauprodukten oder Partikeln aus Stoffgemischen, welche besonders komplex oder empfindlich sind (z. B. biologische Stoffgemische wie Plasma) stellt nach wie vor eine Herausforderung dar. Durch die Prozessierung dieser Gemische durch phagozytierende Zellen werden selektiv unerwünschte Komponenten aus den Stoffgemischen eliminiert, anschließend die Phagozyten durch auf diese gezielte Trennverfahren, wie z. B. Filtration, Differentialzentrifugation oder Antikörpervermittelte Trennung eliminiert.The selective elimination of microorganisms, their degradation products or particles from mixtures of substances, which are particularly complex or sensitive (eg, biological mixtures such as plasma) continues to provide be a challenge by processing these mixtures by phagocytic cells selectively eliminates unwanted components from the mixtures, then the phagocytes on these targeted separation methods, such. As filtration, differential centrifugation or antibody-mediated Separation eliminated.

Background, problem

Die Abtrennung von Mikroorganismen, deren Abbauprodukten oder unerwünschten anderen Partikeln (abgestorbene Zellen, Partikel usw.) aus biologischen Gemischen (z. B. Blut) stellt nach wie vor eine große Herausforderung dar. Da die unerwünschten Partikel sich oft in physikalischen und chemischen Eigenschaften (Größe, spezifisches Gewicht, Ladung, isoelektrischer Punkt usw.) nicht hinreichend von den gewünschten Partikeln unterscheiden, versagen oft physikalische (z. B. Filtration, Differentialzentrifugation) oder chemische Trennmethoden (Ionenaustauscherchromatographie, Elektrophorese usw.) beim Versuch einer hohen Trennrate.The separation of microorganisms, their degradation products or unwanted other particles (dead cells, particles, etc.) from biological mixtures (eg, blood) is still a big one Challenge. Because the unwanted particles are often in physical and chemical properties (Size, specific gravity, charge, isoelectric point, etc.) are not sufficient from the desired Particles often fail physical (eg filtration, differential centrifugation) or chemical Separation methods (ion exchange chromatography, electrophoresis, etc.) when trying a high Separation rate.

solution

Biologische oder andere Gemische, von denen unerwünschte Mikroorganismen, deren Abbauprodukte oder andere Partikel entfernt werden sollen, werden mit phagozytierenden Zellen (z. B. Makrophagen, Granulozyten o.a.) in deren physiologischem Medium in Kontakt gebracht. Nach der Reinigung des Gemisches werden die phagozytierenden Zellen durch auf diese Zellen gerichtete Trennverfahren aus dem Stoffgemisch wieder eliminiert.Biological or other mixtures of which undesirable microorganisms, their degradation products or other particles are to be removed with phagocytic cells (eg macrophages, granulocytes o.a.) in their physiological medium in contact. After cleaning the mixture, the Phagocytic cells by directed to these cells separation process from the mixture again eliminated.

State of the art

Im Fachgebiet Medizin:
- SepsisIn the field of medicine:
- sepsis

In der Medizin sind verschiedene Krankeitsbilder bekannt, bei denen die dem Körper eigene Phagozytosekapazität stark eingeschränkt oder ganz erschöpft ist. So ist z. B. bei der bakteriellen Sepsis der Phagozytoseindex am Beginn der Sepsis (d. h. beim Übergang aus einer bis dahin lokal begrenzten Infektion, wie z. B. einer Pneumonie, in eine generelle Bakterien-/Toxinüberflutung des Körpers von diesem Lokalherd aus) bereits auf ca. 30% der Norm gesunken. Dieser Index sinkt bei späteren Non-Survivern weiter ab. Bei Survivern steigt er langsam wieder an (INTHORN et al. 1992). Ein Zusammenhang zwischen Phagozytoseleistung und Verlauf und Ausgang einer Sepsis muß angenommen werden. Die Sterblichkeit in der Sepsis liegt nach wie vor bei etwa 30-40%, im Septischen Schock sogar bei bis zu 80% der Fälle. Die Einführung von Verfahren zur Reduktion der Keimzahlen bzw. Toxinkonzentrationen (Antibiotika, Antikörper, Antagonisten) haben die Mortalität in den vergangenen 40 Jahren nicht senken können. Den Antragstellern ist kein Verfahren zur Verbesserung der Phagozytosefunktion aus dem Schriftgut bekannt, wenn man von der Applikation von Phagozytenwachstumsfaktoren wie GM-CSF und/oder G-CSF absieht. Letztere Technik erzielt die gewünschten Effekte insbesondere durch eine vermehrte Nachbildung der Phagozyten aus Vorläuferzellen, was allerdings eine gewisse Zeitspanne in Anspruch nimmt (i.d.R. mehrere Tage), während bei der Sepsis schnellstmögliche therapeutische Intervention nötig ist. In medicine, various diseases are known in which the body own Phagocytic capacity is severely limited or completely exhausted. So z. B. in bacterial sepsis the Phagocytosis index at the onset of sepsis (i.e., transition from hitherto localized infection, such as As a pneumonia, in a general bacterial / Toxinüberflutung the body of this local hearth from) already dropped to about 30% of the norm. This index continues to fall for later non-survivors. at Survivors are slowly increasing again (INTHORN et al., 1992). A connection between Phagocytosis performance and course and outcome of sepsis must be assumed. Mortality in the Sepsis is still around 30-40%, in septic shock as much as 80% of cases. The introduction of methods for the reduction of germ counts or toxin concentrations (antibiotics, Antibodies, antagonists) have not been able to lower mortality over the past 40 years. The Applicants are not aware of any method for improving phagocytosis function from the records when one disregards the application of phagocytic growth factors such as GM-CSF and / or G-CSF. Latter Technique achieves the desired effects in particular by an increased replication of the phagocytes Progenitor cells, which, however, takes a certain amount of time (i.d.R., several days), while sepsis requires the fastest possible therapeutic intervention.

Die Transfusion von blut-und HLA- kompatiblen Granulozytenkonzentraten gesunder Spender ist in den 80er Jahren mit begrenztem Erfolg praktiziert worden, hat sich aber wegen der geringen Zahl transfundierbarer Zellen nicht durchgesetzt.The transfusion of blood and HLA compatible granulocyte concentrates from healthy donors is in the 80's Years of limited success, but has become transfundier because of the small number Cells not enforced.

- Chemotherapie- Chemotherapy

Bei Patienten, die sich einer Polychemotherapie unterziehen müssen, ist die Abtötung von Zellen mit hoher Teilungsrate das vordergründige Therapiekonzept, unter der Vorstellung, Tumorgewebe zu zerstören. Dabei werden neben Haarwurzelzellen und Darmwandepithelien/Schleimhäuten auch die blutbildenen Zellen des Knochenmarks in allen drei Hauptlinien (Erythro-, Leuko-, Thrombopoese) betroffen. Dadurch machen sich regelmäßig Zelltransfusionen (Erythrozyten, Thrombozyten) erforderlich. Da die Leukozyten, und hier insbesondere die Granulozyten, i.d.R. nicht durch Transfusion ersetzbar sind (wegen immunologischer Unverträglichkeit), werden die Patienten regelmäßig leukopenisch nach Chemotherapie. Damit verbunden ist eine deutlich erhöhte Infekt- und Sepisneigung. Das neutropenische Fieber bei Sepsis ist die Haupttodesursache bei den Chemotherapiefolgen. Selbst durch aggressive Antibiotika-/Antimykotika- und antivirale Therapie und keimarme Abschirmung der Patienten kann dieses Problem nicht gelöst werden. Auch bei diesen Patienten liegt eine deutliche Einschrankung der Phagozytosefunktion im Blut vor.In patients undergoing polychemotherapy, the killing of cells is high Division rate the superficial therapy concept, under the notion of destroying tumor tissue. there In addition to hair root cells and intestinal wall epithelia / mucous membranes, the blood - forming cells of the Bone marrow affected in all three main lines (erythrocytic, leuco-, thrombopoiesis). This is how it works regular cell transfusions (erythrocytes, platelets) required. Because the leukocytes, and here in particular the granulocytes, i.d.R. can not be replaced by transfusion (due to immunological Intolerance), patients are regularly leukopenic after chemo. Connected to it a significantly increased susceptibility to infection and sepsis. The neutropenic fever in sepsis is the main cause of death with the chemotherapy consequences. Even by aggressive antibiotic / antimycotic and antiviral therapy and Low-germ shielding the patient can not solve this problem. Also in these patients there is a clear restriction of phagocytosis in the blood.

In der folgenden Tabelle sind medizinisch relevante Situationen mit bezug zur Anmeldung aufgeführt:The following table shows medically relevant situations with regard to registration:

Phagozytose vonPhagocytosis of erwünscht beidesired at Bakterienbacteria Infektion/Sepsis/PolychemotherapieInfection / sepsis / chemotherapy Pilzenmushrooms Myosen/wie obenMyosen / as above Viren/ParasitenViruses / parasites AIDS/MalariaAIDS / Malaria toten Zellendead cells Polychemotherapie/Tumorlyse/HämatomeChemotherapy / tumor lysis / hematoma abnormen Zellenabnormal cells Leukämieleukemia Tumorzellentumor cells Metastasierungmetastasis Zelldetrituscell detritus Mikroembolienmicroembolisms Fett/LDLFat / LDL HLP, Fam. HypercholesterolämieHLP, Fam. Hypercholesterolemia Hämoglobinhemoglobin Malaria, BilirubingeneseMalaria, bilirubingenesis Blutgerinnselblood clot persistierende GefäßverschlüssePersistent vascular occlusions AGP (Advanced glycosylated products)AGP (Advanced glycosylated products) Diabetes mellitus/AgingDiabetes Mellitus / Aging Cryogelcryogel Agingaging

In the fields of biotechnology / pharmacy / food / environmental technology

Die Elimination von Mikroorganismen und derer Abbauprodukte (z. B. Endotoxine) aus biologischen Medien (Eiweißlösungen, Zellsuspensionen usw.) ist durch herkömmliche Sterilisationsverfahren nur eingeschränkt möglich, da durch die physikalischen oder chemischen Belastungen, denen die Mikroorganismen oder deren Abbaustoffe ausgesetzt werden (Endotoxine können z. B. durch 2 ½ h Autoklavieren entfernt werden) oft die biologischen Produkte selbst zerstört werden.The elimination of microorganisms and their degradation products (eg endotoxins) from biological media (Protein solutions, cell suspensions, etc.) is limited by conventional sterilization procedures only possible because of the physical or chemical stresses that the microorganisms or their Exposing degradation substances (eg endotoxins can be removed by autoclaving for 2 ½ h) are often used organic products themselves are destroyed.

Detailed description of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur selektiven Abtrennung von Makromolekülen und/oder partikulären Bestandteilen aus Flüssigkeiten durch Endozytose (Phagozytose/Pinozytose) durch zur Endozytose befähigte Zellen (Phagozyten), sowie eine Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Die Erfindung gehört zum Gebiet, der Medizin (insbesondere Sepsis, Polychemotherapie, Neutropenie, Phagozytose, extrakorporale Blutreinigung), Sterilisation, Biotechnologie, Umweltschutz und Lebensmitteltechnologie, Bioreaktortechnik. Die aufzutrennende Mischung (z. B. mit Bakterien versetztes Plasma oder Plasmaeiweißlösungen) wird mit zur Phagozytose befähigten Zellen (z. B. Granulozyten) versetzt und im Bioreaktor im statischen oder vorzugsweise im dynamischen Fluß kultiviert. Nach Reinigung durch Phagozytose werden diephagozytierenden Zellen durch Filtration, oder auf Phagozyten abgestimmte Zellseparationsprozesse (Lasergestütztes Zytoflow, Differentialzentrifugation, antikörpervermittelte Säulenchromatographie) wieder abgetrennt. The invention relates to a method for the selective separation of macromolecules and / or particulate Components from liquids by endocytosis (phagocytosis / pinocytosis) by endocytosis capable of Cells (phagocytes), as well as a device for carrying out the method. The invention belongs to Area of medicine (especially sepsis, polychemotherapy, neutropenia, phagocytosis, extracorporeal Blood purification), sterilization, biotechnology, environmental protection and food technology, bioreactor technology. The mixture to be separated (eg bacteria-displaced plasma or plasma protein solutions) is added to the Phagocytosis enabled cells (eg, granulocytes) and in the bioreactor in the static or preferably cultivated in the dynamic flow. After purification by phagocytosis, the phagocytic cells are passed through Filtration, or phagocyte-based cell separation processes (laser-assisted cytoflow, Differentialcentrifugation, antibody-mediated column chromatography) again separated.

embodiment 1. Blood purification

Mikroorganismen enthaltendes Blut wird durch Filtration oder Differentialzentrifugation von korpuskulären Blutbestandteilen getrennt (Plasmapherese), das kontaminierte Plasma durch einen Bioreaktor geleitet, in dem Phagozyten (z. B. durch Retinolsäure in granulozytäre Richtung differenzierte HL-60 Zellen) das Plasma unter physioiogischen Bedingungen (5% CO2, 37 Grad Celsius) prozessieren, das gereinigte Plasma wird durch erneute Separation der Zellen durch Filtration oder Differentialzentrifugation von den Phagozyten getrennt und das gereinigte Plasma wieder mit den Blutzellen vermischt. Das Verfahren und die dazu benötigte Einrichtung (zwei Plasmaseparatoren mit dazwischengeschaltetem Bioreaktor) kann extrakorporal zur Behandlung von Patientenblut verwendet werden.Blood containing microorganisms is obtained by filtration or differential centrifugation of corpuscular Blood components separated (plasmapheresis), the contaminated plasma passed through a bioreactor, in the Phagocytes (for example, differentiated by retinoic acid in granulocytic direction HL-60 cells) the plasma below Physiological conditions (5% CO2, 37 degrees Celsius) process, the purified plasma is through re-separation of cells separated by filtration or differential centrifugation of the phagocytes and the purified plasma is mixed again with the blood cells. The procedure and the required equipment (two plasma separators with intervening bioreactor) may be extracorporeal for the treatment of Patient blood can be used.

2. Purification of pharmaceutical solutions

Mikroorganismen enthaltende Pharmalösung wird durch einen Bioreaktor geleitet, in dem Phagozyten (z. B. durch Retinolsäure in granulozytäre Richtung differenzierte HL-60 Zellen) die Lösung unter physiologischen Bedingungen (5% CO2, 37 Grad Celsius) prozessieren, die gereinigte Lösung wird durch Separation der Zellen durch Filtration oder Differentialzentrifugation von den Phagozyten getrennt und das gereinigte Gut verwendet.The microorganism-containing pharmaceutical solution is passed through a bioreactor in which phagocytes (eg. HL-60 cells differentiated by retinoic acid in a granulocytic direction) dissolves the solution Process physiological conditions (5% CO2, 37 degrees Celsius), the purified solution is through Separation of the cells separated by filtration or differential centrifugation of the phagocytes and the used cleaned good.

3. Purification of cell cultures

Eine Mikroorganismen enthaltende Zellkultur wird durch einen Bioreaktor geleitet, in dem Phagozyten (z. B. durch Retinolsäure in granulozytäre Richtung differenzierte HL-60 Zellen) die Kultur unter physiologischen Bedingungen (5% CO2, 37 Grad Celsius) prozessieren, die gereinigte Kultur wird durch erneute Separation der Phagozyten durch selektiv Phagozyten erkennende Trennverfahren (Antikörper gegen Phagozyten vermittelte Zytoflowseparation, Magnetophorese, Säulenchromatographie) von diesen wieder getrennt und steht zur weiteren Verwendung zur Verfügung.A microorganism-containing cell culture is passed through a bioreactor in which phagocytes (e.g. HL-60 cells differentiated by retinolic acid in granulocytic direction) underwent culture physiological conditions (5% CO2, 37 degrees Celsius) process, the purified culture is through re-separation of the phagocytes by selective phagocyte-recognizing separation methods (antibodies against Phagocyte mediated cytoflow separation, magnetophoresis, column chromatography) of these again separated and is available for further use.

definitions

Definitionen im Sinne dieser Anmeldung sind:
Phagozytose: Überbegriff für Phagozytose (Aufnahme partikulärer Substanzen, wie Zellen, Bakterien) und Pinozytose (Aufnahme subpartikulärer Strukturen, wie Moleküle, Flüssigkeiten) in die phagozytierende Zelle unter Zurhilfenahme von Oberflächenstrukturen des Phagozyten, wie Rezeptoren oder Lektinen(?). (Wesentliche Beispiele: Phagozytose über CD14, ComplementRezeptor, CD11/18, FcR (Immunphagozytose) LPS-Aufnahme über CD14), Phagozyten: Zellen, die zur Phagozytose befähigt sind (s. o.). Insbesondere professionelle Phagozyten, wie Neutrophile Granulozyten, Basophile, Eosinophile, Monozyten, Macrophagen, aber auch nichtprofessionelle Phagozyten, wie Endothelzellen oder Tumorzellen. Die in dieser Anmeldung angeführte Begriffe der Phagozytose und Phagozyten sollen im weiteren Sinne jedoch auch alle biologischen Prozesse bzw. prozessierenden Zellen umfassen, bei denen die Ingestion von Makromolekülen (z. B. Lipopolysaccharide), Makromolekülkomplexen (z. B. Lipopolysaccharidkomplexe) durch biologische Aktionen von Zellen erfolgt. Der Begriff Phagozytose ist damit nicht auf im wissenschaftlichen Sinn definierter Phagozyten begrenzt sonder kann auch die Ingestion durch z. B. Tubuluszellen u. a. sinngemäß übertragen werden.Definitions in the context of this application are:
Phagocytosis: generic term for phagocytosis (uptake of particulate substances, such as cells, bacteria) and pinocytosis (uptake of subparticular structures, such as molecules, liquids) into the phagocytic cell with the help of surface structures of the phagocyte, such as receptors or lectins (?). (Substantial examples: phagocytosis via CD14, complement receptor, CD11 / 18, FcR (immunophagocytosis) LPS uptake via CD14), phagocytes: cells capable of phagocytosis (see above). In particular, professional phagocytes, such as neutrophil granulocytes, basophils, eosinophils, monocytes, macrophages, but also non-professional phagocytes, such as endothelial cells or tumor cells. However, the terms of phagocytosis and phagocytes cited in this application are also intended to encompass in a broader sense all biological processes or processing cells in which the ingestion of macromolecules (eg lipopolysaccharides), macromolecule complexes (eg lipopolysaccharide complexes) by biological actions of cells. The term phagocytosis is therefore not limited to scientifically defined phagocytes special also ingestion by z. B. tubule cells, inter alia, be transmitted analogously.

Claims

1. A method for selective separation, characterized by the use of seizure cells (phagocytes) such. As granulocytes or monocytes / macrophages for the removal of particulate matter and macromolecules from liquids by endocytosis, wherein liquids, eg. (II) can be liberated from phagocytally recognizable foreign substances such as bacterial lipopolysaccharides (endotoxins) and / or foreign particles such as bacteria, fungi or viruses, and (II) (phagocytes) III) are then separated again from the phagocytes.

2. The method according to claim (1), characterized in that the phagocytes in co-culture with others Cells, e.g. As hepatocytes make the processing of liquids, with the various Cell types either spatially separated or in a common compartment.

3. The method according to claim (1) and (2), characterized in that after removal of Microorganisms or Mikroorgansimenbestandteilen from cell suspensions by phagocytes latter by selective separation methods (labeling with fluorescent or magnetically loaded antibodies against Phagocytic antigens and separation by laser-assisted preparative flow cytometry or magnetophoresis) can be separated again from this cell suspension.

4. The method and device according to claim (1) and (2) and (3), characterized in that Phagocytes for the method described under (3) before use by means of antibodies and thus associated magnetic / fluorescent or electrical particles are "marked" and thus specifically be modified to the facility for interim cleaning and subsequent separation.

5. Device for the selective separation of substances according to claim (1), characterized in that the treated fluids (eg blood plasma of the blood) by suitable separation methods, for. B. filtration or Centrifugation of particles (eg blood cells) with certain properties, e.g. Size, weight, Composition, surface structures / properties, to be separated, then with the phagocytes in be brought into contact with a reactor space, wherein the desired material separation takes place, then the processed liquids by suitable separation methods, eg. As filtration or centrifugation, of the Phagocytes are separated.

6. Device according to claim (2), characterized in that the processed liquids after Contact with the phagocytes of products and / or components of phagocytes, such as mediators (Interleukins, tumor necrosis factor alpha), oxygen radicals or soluble receptors such as sCD14 be separated, by suitable separation methods, such as. B. by selective adsorption to solid Surfaces.

7. Method and device, characterized in that phagocytes are used in which by suppression or elimination of appropriate genes, the release of unwanted products from the Phagocytes (eg mediators) is prevented.