DE19509792A1

DE19509792A1 - Agent for influencing cell differentiation and its use

Info

Publication number: DE19509792A1
Application number: DE1995109792
Authority: DE
Inventors: Walter Prof Dr Birchmeier
Original assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Current assignee: Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1995-03-17
Publication date: 1996-09-19
Also published as: WO1996029090A1

Abstract

The object of the invention is to develop an agent by means of which mesenchyme-epithelial cell interaction can be influenced in vivo. This agent should enable pathological changes owing to impairment of the interactions between stroma and epithelia to be eliminated and novel therapy concepts to be prepared. A concrete aim is to use these agents for a novel method of treating masto and other carcinoma. This object is achieved by an agent for influencing the differentiation of epithelia cells which is characterized in that it contains the recombinant factors scatter factor/hepatocyte-growth factor (SF/HGF) and/or new differentiation factor (NDF/HRG) or inhibitors of these factors. These factors are formed in vivo from mesenchymal cells.

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Beeinflussung der Differenzierung von Zellen sowie seine Verwendung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.The invention relates to a means for influencing Differentiation of cells and its use. Areas of application of the invention are medicine and Pharmaceutical Industry.

Wachstum und Morphogenese von Epithelzellen bilden wesentliche Schritte in der Entwicklung vieler eukaryontischer Organe. Eine Reihe von Studien hat gezeigt, daß Wachstum und Morphogenese von Epithelien wesentlich durch Mesenchym/Epithel-Wechselwirkungen beeinflußt werden. Diese Studien beinhalten Transplantations- und Organkultur-Untersuchungen an Speicheldrüsen, Lunge, Niere oder Brust. Die Moleküle, die in diese Mesenchym/Epithel- Wechselwirkungen einbezogen sind, sind noch weitgehend unbekannt. Neueste Befunde legen jedoch den Schluß nahe, daß epitheliale Tyrosinkinase-Rezeptoren und ihre mesenchymalen Liganden als Kandidaten für einen solchen Signaltransfer wichtig sind (Birchmeier und Birchmeier, Annu. Rev. Cell Biol. 9, 511- 540, 1993).Epithelial cell growth and morphogenesis are essential Steps in the development of many eukaryotic organs. A A number of studies have shown that growth and morphogenesis of Epithelia essentially due to mesenchyme / epithelium interactions to be influenced. These studies include transplant and organ culture studies on salivary glands, lungs, kidneys or chest. The molecules in this mesenchyme / epithelium Interactions are still largely involved unknown. However, the latest findings suggest that epithelial tyrosine kinase receptors and their mesenchymal Ligands are important candidates for such signal transfer (Birchmeier and Birchmeier, Annu. Rev. Cell Biol. 9, 511- 540, 1993).

Verschiedene Tyrosinkinase-Rezeptoren mit ausschließlicher oder bevorzugter Expression in Epithelzellen sind vor kurzem charakterisiert worden. Weiterhin wurden die entsprechenden Liganden identifiziert, welche durch mesenchymale Zellen synthe tisiert wurden und ausschließlich oder hauptsächlich auf Epithelzellen agieren. Da diese Tyrosinkinase-Rezeptoren meist wegen ihres transformierenden Potentials (Onkogene) entdeckt wurden, nahm man allgemein an, daß sie vor allem mitogene Signale vermitteln. In jüngster Zeit wurde jedoch sichtbar, daß die Tyrosinkinasen auch Signale zur direkten Differenzierung, Zellwanderung oder Morphogenese geben, d. h. diese Rezeptoren und ihre Liganden sind in der Lage, die epitheliale Entwicklung an entscheidenden Stellen zu beeinflussen (Birchmeier und Birchmeier, 1993). Beispielsweise wurde gezeigt, daß SF/HGF in der Lage ist, die Bildung von Verzweigungen von Nieren- Epithelzellen in vitro zu induzieren (Montesano et al, Cell 66, 697-711, 1991). Zell- und entwicklungsbiologische Studien haben gezeigt, daß SF/HGF durch mesenchymale Zellen synthetisiert wird, während ihr Rezeptor, die Tyrosinkinase c-met, in epithelialen Zellen lokalisiert ist (Weidner et al, J. Cell Biol 121, 145-154, 1993). Gleichermaßen wurde berichtet, daß NDF/HRG Wachstum und Differenzierung von Epithel-(Karzinom-)zellen beeinflußt und im embryonalen Mesenchym exprimiert wird (Meyer und Birchmeier, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91, 1064-1068, 1994).Different tyrosine kinase receptors with exclusive or preferred expression in epithelial cells are recent have been characterized. Furthermore, the corresponding Ligands identified by mesenchymal cells were exclusively and mainly based on Epithelial cells act. Because these tyrosine kinase receptors mostly discovered because of its transforming potential (oncogenes) , it was generally assumed that they were primarily mitogenic Convey signals. However, it has recently become apparent that the tyrosine kinases also signals for direct differentiation, Give cell migration or morphogenesis, d. H. these receptors and their ligands are capable of epithelial development at crucial points (Birchmeier and Birchmeier, 1993). For example, it has been shown that SF / HGF in is able to prevent the formation of branches of kidney To induce epithelial cells in vitro (Montesano et al, Cell 66, 697-711, 1991). Have cell and developmental studies demonstrated that SF / HGF is synthesized by mesenchymal cells while its receptor, the tyrosine kinase c-met, epithelial cells is localized (Weidner et al, J. Cell Biol 121, 145-154, 1993). Likewise, it has been reported that NDF / HRG Growth and differentiation of epithelial (carcinoma) cells is influenced and expressed in the embryonic mesenchyme (Meyer and Birchmeier, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91, 1064-1068, 1994).

Zur Herstellung und zum Einsatz von zellbiologischen Faktoren wurden bereits Patente angemeldet. In EP 583 050 (Yeda Research Co., Yarden et al) werden rekombinante Faktoren (NRSF) zur Stimulierung des Neu Rezeptors bzw. auch seine Teilsequenzen beansprucht. Diese Faktoren haben u. a. die Fähigkeit zur Differenzierung von humanen Brusttumorzellen und können mit dem natürlich vorkommenden Neu Rezeptor bei Rezeptorbindungen konkurrieren. In EP 502 812 (Ciba Geigy, Groner et al) werden rekombinante Antikörper zur extrazellulären Domäne des humanen Wachstumsfaktor-Rezeptors c-erbB-2 hergestellt. Zielstellung ist die Verwendung dieser Antikörper für die Diagnose und Behandlung von Krebserkrankungen.For the production and use of cell biological factors patents have already been registered. In EP 583 050 (Yeda Research Co., Yarden et al) become recombinant factors (NRSF) Stimulation of the new receptor or its partial sequences claimed. These factors may have a. the ability to Differentiation of human breast tumor cells and can with the naturally occurring new receptor in receptor binding compete. In EP 502 812 (Ciba Geigy, Groner et al) recombinant antibodies to the extracellular domain of the human Growth factor receptor c-erbB-2 produced. Goal is the use of these antibodies for diagnosis and treatment of cancers.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ausgehend von den bisher in vitro gefundenen Wirkungen der Faktoren SF/HGF und NDF/HRG ein Mittel zu entwickeln, mit dem in vivo auf die Mesenchym-Epithel-Wechselwirkungen Einfluß genommen werden kann. Dieses Mittel soll die Möglichkeit eröffnen, krankhafte Veränderungen aufgrund von Störungen der Wechselwirkungen zwischen Stroma und Epithelien zu beseitigen und neue Therapiekonzepte bereitzustellen. Eine konkrete Zielstellung liegt darin, ein Mittel für eine neue Behandlungsmethode für Mammakarzinome und andere Karzinome bereitzustellen.The invention is based, based on the task effects of the factors SF / HGF and NDF / HRG to develop a means with which in vivo on the Mesenchymal-epithelial interactions can be influenced. This remedy is said to open up the possibility of pathological Changes due to interference disorders between stroma and epithelia to eliminate and new To provide therapy concepts. A concrete goal is a means of a new treatment for Breast cancer and other cancers.

Es wurde gefunden, daß die beiden mesenchymalen Faktoren SF/RGF und NDF/HRG die Morphogenese und die Differenzierung von Epithelzellen während der Brustdrüsenentwicklung kontrollieren. The two mesenchymal factors were found to be SF / RGF and NDF / HRG the morphogenesis and differentiation of Check epithelial cells during mammary development.

SF/HGF bewirkt die Verzweigung der Brustdrüsen während der adulten Entwicklung, während NDF/HRG die Bildung von lobulären Alveolen und die abschließende Differenzierung zur Zeit der Schwangerschaft fördert. Mit den entsprechenden Antisense- Oligonukleotiden können beide Wirkungen verhindert werden. Die in vivo Expression der beiden Faktoren erfolgt eng verbunden mit ihrer Funktion, d. h. SF/HGF wird während der Verzweigungs periode produziert, wohingegen NDF/HRG stark während der Entwicklung der lobulären Alveolen zur Zeit der Schwangerschaft gebildet wird. Wichtige Schritte in der Brustdrüsenentwicklung können jetzt erstmalig auf molekularem Niveau erklärt werden: Spezifische Morphogene werden im Mesenchym ausgeschieden und reagieren mit dem umgebenden Epithelium. Weiterhin agieren die Faktoren nacheinander in 2 Entwicklungsperioden. Die Daten zeigen ferner an, daß die epithelialen Tyrosinkinase-Rezeptoren c-met und Mitglieder der c-erbB-Familie kritische Komponenten in der Antwort auf mesenchymale Signale repräsentieren.SF / HGF causes the mammary glands to branch during the adult development, while NDF / HRG the formation of lobular Alveoli and the final differentiation at the time of Promotes pregnancy. With the appropriate antisense Both effects can be prevented by oligonucleotides. The in vivo expression of the two factors is closely related their function, d. H. SF / HGF is used during the branching period, whereas NDF / HRG is strong during the Development of the lobular alveoli at the time of pregnancy is formed. Important steps in breast development can now be explained at the molecular level for the first time: Specific morphogens are excreted in the mesenchyme and react with the surrounding epithelium. The continue to act Factors in succession in 2 development periods. The data also indicate that the epithelial tyrosine kinase receptors c-met and members of the c-erbB family critical components in the response to mesenchymal signals.

Aus diesen Befunden leitet sich das erfindungsgemäße Mittel ab. Es ist dadurch gekennzeichnet, daß es die rekombinanten Faktoren Scatter Faktor/Hepatozyten-Wachstumsfaktor (SF/HGF) und/oder Neu Differentiation Faktor (NDF/HRG) bzw. Inhibitoren dieser Faktoren enthält. Bevorzugte Konzentrationen dieser Faktoren sind 5-100 ng/ml SF/HGF bzw. eine 1-10nmolare Konzentration von NDF/HRG. Werden beide Faktoren gemeinsam eingesetzt, dann liegen die Konzentrationsverhältnisse zwischen 10 : 1 bis 1 : 10. Es wird zur Beeinflussung der Zelldifferenzierung durch Behandlung von Säugerzellen eingesetzt. Wenn die Zelldifferenzierung gehemmt werden soll, dann kann das Mittel zusätzlich Antisense- Oligonukleotide oder davon abgeleitete Substanzen zu SF/HGF und /oder NDF/HRG enthalten. Als Säugerzellen werben bevorzugt Organkulturen von Brustdrüsen oder von Mammakarzinomen eingesetzt.The agent according to the invention is derived from these findings. It is characterized in that it is the recombinant factors Scatter factor / hepatocyte growth factor (SF / HGF) and / or new Differentiation factor (NDF / HRG) or inhibitors of these Contains factors. Preferred concentrations of these factors are 5-100 ng / ml SF / HGF or a 1-10 nmolar concentration of NDF / HRG. If both factors are used together, then the concentration ratios are between 10: 1 to 1: 10 is used to influence cell differentiation through treatment used by mammalian cells. If cell differentiation should be inhibited, the agent can additionally antisense Oligonucleotides or substances derived therefrom to SF / HGF and / or NDF / HRG included. Advertise as mammalian cells preferred Organ cultures of mammary glands or breast cancer used.

Eine Therapiemöglichkeit liegt u. a. darin, Karzinom-Patienten mit dem erfindungsgemäßen Mittel, nämlich mit SF/HGF oder NDF/HRG oder davon abgeleiteten Substanzen zu behandeln. Überraschend fördern die beiden Faktoren die Differenzierung der Karzinome und ermöglichen damit Heilungschancen. Man entnimmt dazu Gewebeteile von Patienten mit Brustdrüsentumoren und behandelt diese zuerst mit dem erfindungsgemäßen Mittel vor, d. h. mit den Faktoren bzw. Inhibitoren. Wenn eine Differenzierung der Tumorzellen beobachtet wird, werden die Faktoren/Inhibitoren zur Therapie eingesetzt.A therapy option is u. a. in carcinoma patients with the agent according to the invention, namely with SF / HGF or Treat NDF / HRG or derived substances. Surprisingly, the two factors promote the differentiation of Carcinomas and thus enable chances of recovery. One removes also tissue parts from patients with mammary gland tumors and treats these first with the agent according to the invention, d. H. with the factors or inhibitors. When a Differentiation of the tumor cells is observed, the Factors / inhibitors used for therapy.

Die Erfindung soll nachstehend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.The invention is intended to be explained in more detail below by means of exemplary embodiments are explained.

example 1 Effect of SF / HGF and NDF / HRG on organ cultures of the mammary glands

Organkulturen von Brustdrüsen von hormonell behandelten, vier Wochen alten Mäusen werden hergestellt. In diesem Stadium nimmt ein spärlich entwickelter epithelialer "Drüsenbaum" mit Endknospen ungefähr 40% des Brustfettgewebes ein. Unter unseren Standardbedingungen für Organkulturen setzt innerhalb der nächsten Woche Verzweigung und Bildung von Alveolen ein, wodurch ein vollentwickelter Drüsenbaum entsteht und Milchbestandteile synthetisiert werden (Abb. 1). Dieses Organkultursystem erlaubt damit die Testung der Wirkung von exogenen Modulatoren während der Brustdrüsenentwicklung. Da gegenüberliegende Paare von Drüsen praktisch identische Muster der epithelialen Morphogenese aufweisen, kann der Effekt der Faktoren auf eine der paarigen Drüsen leicht mit der unbehandelten Kontrolle verglichen werden.Organ cultures of mammary glands from hormone-treated four-week-old mice are produced. At this stage, a sparsely developed epithelial "gland tree" with end buds takes up approximately 40% of breast fat tissue. Under our standard conditions for organ cultures, branching and formation of alveoli will begin within the next week, creating a fully developed glandular tree and synthesizing milk components ( Fig. 1). This organ culture system allows testing the effects of exogenous modulators during mammary development. Because opposing pairs of glands have virtually identical patterns of epithelial morphogenesis, the effect of the factors on one of the paired glands can easily be compared to the untreated control.

Bei 5tägiger Behandlung von Drüsen in Organkulturen mit rekombinantem SF/HGF (20 ng/ml) entstehen extrem stark verzweigte Drüsenbäume (vgl. Abb. 1b, d mit 1a, c). In der Kontrolle haben die ursprünglichen Zweige nur wenige Seitenzweige (mit Pfeilen in Abb. 1a, c markiert). In Gegenwart von SF/HGF wird die Verzweigung intensiviert, wobei zahlreiche Hauptzweige entstehen, die sich bis zum Ende des Fettgewebes ausdehnen (mit Pfeilen in den Abb. 1b, d markiert). Morphometrische Analysen offenbaren einen Durchschnitt von 2 Hauptseitenzweigen (Bereich 1-3) in Abwesenheit und 6 Seitenzweigen (Bereich 3-8) in Gegenwart von SF/HGF. Gleichzeitig inhibiert SF/HGF die sekretorische Aktivität der Epithelzellen (Abb. 1e, f): In Kontrolldrüsen zeigen 82±3% der Alveolen sekretorische Aktivität in Abwesenheit und 26±2% in Gegenwart von SF/HGF. Konzentrationen von 20 ng/ml SF/HGF sind für die Stimulation von Verzweigungen am effektivsten, niedrigere Konzentrationen sind weniger wirksam.Treatment of glands in organ cultures with recombinant SF / HGF (20 ng / ml) for 5 days produces extremely branched gland trees (see Fig. 1b, d with 1a, c). In the control, the original branches have only a few side branches (marked with arrows in Fig. 1a, c). In the presence of SF / HGF, branching is intensified, creating numerous main branches that extend to the end of the adipose tissue (marked with arrows in Figs. 1b, d). Morphometric analyzes reveal an average of 2 main side branches (range 1-3 ) in the absence and 6 side branches (range 3-8 ) in the presence of SF / HGF. At the same time, SF / HGF inhibits the secretory activity of the epithelial cells ( Fig. 1e, f): In control glands, 82 ± 3% of the alveoli show secretory activity in the absence and 26 ± 2% in the presence of SF / HGF. Concentrations of 20 ng / ml SF / HGF are most effective for branch stimulation, lower concentrations are less effective.

Dagegen stimuliert der 5tägige Zusatz von rekombinantem NDF/HRG zum Kulturmedium die Ausbildung von lobulo-alveolären Strukturen. Das ist besonders offensichtlich bei verminderter Prolactin-Konzentration, d. h. unter Bedingungen, unter denen die Differenzierung der Kontrolle vermindert ist. In Kontrolldrüsen entwickeln sich nur einzelne Alveolen (Abb. 2a, c). In Gegenwart von NDF/HRG (3nM) wird die Zahl der Alveolen merklich erhöht, es bilden sich in Trauben angeordnete Alveolen (Abb. 2b, d, Pfeile). Die morphometrische Analyse zeigt einen Durchschnitt von 3 Trauben pro Feld (Bereich 0-6) in Abwesenheit und 17 Trauben (Bereich 10-30) in Gegenwart von NDF/HRG. Eine Konzentration von 3nM hat sich als optimal erwiesen. Histologische Analysen bestätigen die fortge schrittenere lobuläre Entwicklung in Gegenwart von NDF/HRG und zeigen eine erhöhte Proteinsekretion und intrazelluläre Anhäufung von Fetttröpfchen: 21±9% der Alveolen zeigen eine sekretorische Aktivität in Abwesenheit und 97±2% in Gegenwart von NDF/HRG. Der Anteil der Fetttröpfchen-positiven Alveolen erhöht sich von 20±8% auf 99%.In contrast, the 5-day addition of recombinant NDF / HRG to the culture medium stimulates the formation of lobulo-alveolar structures. This is particularly evident when the prolactin concentration is reduced, ie under conditions in which the differentiation of the control is reduced. Only individual alveoli develop in control glands ( Fig. 2a, c). In the presence of NDF / HRG (3nM) the number of alveoli is noticeably increased, alveoli arranged in clusters form ( Fig. 2b, d, arrows). The morphometric analysis shows an average of 3 grapes per field (range 0-6 ) in the absence and 17 grapes (range 10-30 ) in the presence of NDF / HRG. A concentration of 3nM has proven to be optimal. Histological analyzes confirm the more advanced lobular development in the presence of NDF / HRG and show an increased protein secretion and intracellular accumulation of fat droplets: 21 ± 9% of the alveoli show secretory activity in the absence and 97 ± 2% in the presence of NDF / HRG. The proportion of fat droplet-positive alveoli increases from 20 ± 8% to 99%.

Example 2 Expression of SF / HGF and NDF / HRG during the mammary glands development in vivo

Um zu prüfen, ob die SF/HGF- und NDF/HRG-Expression mit den funktionellen Effekten korreliert, wurde die Expression der beiden Faktoren während der verschiedenen Stufen der Brust drüsenentwicklung in vivo mittels RNase-Protektionsanalyse untersucht. Wir fanden, daß die SF/HGF-Expression während der Brustdrüsenentwicklung streng reguliert ist und das höchste Niveau während der Verzweigungsphase im adulten Tier erreicht (Abb. 3A, B). Die Expressionsniveaus erniedrigen sich während Schwangerschaft und Milchbildung und steigen nach der Schwangerschaft wieder an. Die quantitative Analyse zeigte, daß die SF/HGF-Expression im adulten Stadium um etwa eine Größenordnung erhöht ist. Im Unterschied dazu ändern sich mRNA- Niveaus für den SF/HGF-Receptor c-met (und für Aktin als Kontrolle) nicht merklich.In order to check whether the SF / HGF and NDF / HRG expression correlated with the functional effects, the expression of the two factors was examined in vivo during the various stages of mammary development using RNase protection analysis. We found that SF / HGF expression is strictly regulated during mammary development and reaches the highest level during the branching phase in the adult animal ( Fig. 3A, B). Expression levels decrease during pregnancy and milk production and rise again after pregnancy. The quantitative analysis showed that the SF / HGF expression in the adult stage is increased by about an order of magnitude. In contrast, mRNA levels for the SF / HGF receptor c-met (and for actin as a control) do not change appreciably.

NDF/HRG zeigte ein vollkommen verschiedenes, aber ebenfalls streng reguliertes Expressionsmuster: Das höchste Niveau der Transkription wird während der Bildung der lobulären Alveolen zur Zeit der Schwangerschaft beobachtet (Abb. 3A, C). Während der adulten Periode wird keine NDF/HRG mRNA gemessen, dagegen steigt die Expression während der Milchbildung nach der Schwangerschaft stark an. Die NDF/HRG-Expression während der Schwangerschaft ist mindestens zwei Größenordnungen höher als in der adulten Phase. Die RNAse-Protektionsanalyse hat weiter gezeigt, daß der Alpha 2-Subtyp von NDF/HRG zur Zeit der Schwangerschaft exprimiert wird. Die Expression des hoch affinen Rezeptors von NDF/HRG wurde ebenfalls untersucht, c-erbB-4 wird in den Drüsen der präpubertalen Mäuse nicht exprimiert, jedoch in adulten Tieren und in sämtlichen weiteren Entwicklungsstadien (Abb. 3C).NDF / HRG showed a completely different but also strictly regulated expression pattern: the highest level of transcription is observed during the formation of the lobular alveoli at the time of pregnancy ( Fig. 3A, C). No NDF / HRG mRNA is measured during the adult period, but expression increases sharply during milk formation after pregnancy. NDF / HRG expression during pregnancy is at least two orders of magnitude higher than in the adult phase. RNAse protection analysis has further shown that the alpha 2 subtype of NDF / HRG is expressed at the time of pregnancy. The expression of the high affinity receptor of NDF / HRG was also examined, c-erbB-4 is not expressed in the glands of the prepubertal mice, but in adult animals and in all further developmental stages ( Fig. 3C).

Die SF/HGF- und NDF/HRG-Expression während der Brustdrüsen entwicklung wurde auch durch in situ-Hybridisation untersucht: In adulten Drüsen wurden SF/HGF-Transkripte in einer dünnen Schicht von Fibroblasten gefunden, die an das duktale Epithelium angrenzt. Zum Unterschied davon waren die Transkripte für den c met-Rezeptor innerhalb der basalen epithelialen Zellschicht des duktalen Epitheliums lokalisiert (vgl. die Pfeile in Abb. 4b). Während der Schwangerschaft wurden NDF/HRG-Transkripte in einem weiten Bereich des Bindegewebes um die duktalen und alveolaren Strukturen gefunden (Abb. 4 c, d). SF / HGF and NDF / HRG expression during mammary development was also investigated by in situ hybridization: SF / HGF transcripts were found in adult glands in a thin layer of fibroblasts adjacent to the ductal epithelium. In contrast, the transcripts for the c met receptor were located within the basal epithelial cell layer of the ductal epithelium (cf. the arrows in Fig. 4b). During pregnancy, NDF / HRG transcripts were found in a wide area of the connective tissue around the ductal and alveolar structures ( Fig. 4 c, d).

Example 3 Treatment of organ cultures of mammary glands with antisense Oligonucleotides

Weitere Klarheit über die unterschiedlichen Rollen von SF/HGF und NDF/HRG bei der Morphogenese von Verzweigung und lobulärer Alveolenbildung wurde durch Behandlung mit Antisense- Phosphorothioat-Oligonukleotiden erhalten. Die Behandlung von Organkulturen mit Antisense-SF/HGF-Oligonukleotiden verhindert die Expression von SF/HGF mRNA, wohingegen das Sense- Oligonukleotid keinen Effekt hat (Abb. 5A, vgl. Linien 3 und 4). Die Behandlung der Drüsen mit Antisense NDF/HRG vermindert die Expression von NDF/HRG mRNA sehr stark (Abb. 5A, vgl. Linien 5 und 6). Dementsprechend verhindern Antisense SF/HGF-Oligonukleo tide die Verzweigung der Drüsen (vgl. Pfeile und Pfeilspitzen in Abb. 5B, b, d), während das Sense-Oligonukleotid keinen Effekt hat (Abb. 5B, a, c). Antisense NDF/HRG-Oligonukleotide vermindern die lobuläre Alveolenentwicklung in einem Stadium, wo hauptsächlich primäre Zweige vorhanden sind (vgl. Pfeilspitzen in Abb. 5B, f, h). Auch hier haben die entsprechenden Sense- Oligonukleotide keinen Effekt (Abb. 5B, e, g). Die NDF/HRG- Antisense-Oligonukleotide vermindern auch deutlich die Milchprotein-Expression. Eine Titration der biologischen Aktivität der Oligonukleotide zeigte maximale Effekte bei 10µM (für SF/HGF) und 3µM (für NDF/HRG).Further clarity on the different roles of SF / HGF and NDF / HRG in the morphogenesis of branching and lobular alveolar formation was obtained by treatment with antisense phosphorothioate oligonucleotides. Treatment of organ cultures with antisense SF / HGF oligonucleotides prevents expression of SF / HGF mRNA, whereas the sense oligonucleotide has no effect ( Fig. 5A, see lines 3 and 4 ). Treatment of the glands with Antisense NDF / HRG greatly reduces the expression of NDF / HRG mRNA ( Fig. 5A, see lines 5 and 6 ). Accordingly, antisense SF / HGF oligonucleotides prevent branching of the glands (see arrows and arrow tips in Fig. 5B, b, d), while the sense oligonucleotide has no effect ( Fig. 5B, a, c). Antisense NDF / HRG oligonucleotides reduce the lobular alveolar development at a stage where primarily primary branches are present (cf. arrowheads in Fig. 5B, f, h). Here too, the corresponding sense oligonucleotides have no effect ( Fig. 5B, e, g). The NDF / HRG antisense oligonucleotides also significantly reduce milk protein expression. Titration of the biological activity of the oligonucleotides showed maximum effects at 10µM (for SF / HGF) and 3µM (for NDF / HRG).

Wir haben ferner gezeigt, daß die Effekte der Behandlung mit Antisense-Oligonukleotiden durch Zusatz von entsprechenden exogenen Faktoren kompensiert werden können. So läßt sich die Verzweigung in Drüsen, die mit SF/HGF-Antisense-Oligonukleo tiden behandelt wurden, durch Zugabe von SF/HGF wiederherstellen (Abb. 6A, vgl. a und b). In der histologischen Analyse sind zahlreiche sich entwickelnde Seitenzweige zu sehen (Pfeile in Abb. 6A, d vgl. mit der Kontrolle in c). Gleichermaßen wird die lobuläre Alveolenentwicklung in den Drüsen, die vorher mit NDF/HRG-Antisense-Oligonukleotiden behandelt wurden, durch Zusatz von NDF/HRG wiederhergestellt (Abb. 6B, vgl. a, c und b, d), d. h. der Zusatz von exogenem NDF/HRG hebt den Effekt der Antisense-Oligonukleotide wieder auf.We have also shown that the effects of treatment with antisense oligonucleotides can be compensated for by adding appropriate exogenous factors. The branching in glands that have been treated with SF / HGF antisense oligonucleotides can be restored by adding SF / HGF ( Fig. 6A, cf. a and b). In the histological analysis, numerous developing side branches can be seen (arrows in Fig. 6A, d see with the control in c). Likewise, the lobular alveolar development in the glands that were previously treated with NDF / HRG antisense oligonucleotides is restored by adding NDF / HRG ( Fig. 6B, see a, c and b, d), ie adding exogenous NDF / HRG cancels the effect of the antisense oligonucleotides.

Legend to the illustrations

Abb. 1 Wirkung von SF/HGF auf die Morphologie von Brustdrüsen in Organkulturen
Abb. 2 Wirkung von NDF/HRG auf die Morphologie von Brustdrüsen in Organkulturen
Abb. 3 Unterschiedliche Expression von SF/HGF und NDF/HRG während der Brustdrüsenentwicklung
Abb. 4 Zelluläre Lokalisierung von SF/HGF-, c-met- und NDF/HRG-Expression in Brüstdrüsen durch in situ Hybridisation
Abb. 5 Wirkung von SF/HGF- und NDF/HRG-Antisense- Oligonukleotiden auf Brustdrüsen in Organkulturen
Abb. 6 Wiederherstellung von Verzweigungen und der Differenzierung in Antisense-Oligonukleotid-behandelten Organ kulturen. Fig. 1 Effect of SF / HGF on the morphology of mammary glands in organ cultures
Fig. 2 Effect of NDF / HRG on the morphology of mammary glands in organ cultures
Fig. 3 Different expression of SF / HGF and NDF / HRG during mammary development
Fig. 4 Cellular localization of SF / HGF, c-met and NDF / HRG expression in mammary glands by in situ hybridization
Fig. 5 Effect of SF / HGF and NDF / HRG antisense oligonucleotides on mammary glands in organ cultures
Fig. 6 Restoration of branches and differentiation in antisense oligonucleotide-treated organ cultures.

Claims

1. Agent for influencing cell differentiation, characterized in that it contains the recombinant factors scatter factor / hepatocyte growth factor (SF / HGF) and / or new differentiation factor (NDF / HRG) or inhibitors of these factors.

2. Composition according to claim 1, characterized in that it is the Factor SF / HGF contains in a concentration of 5-100 ng / ml.

3. Means according to claim 1, characterized in that it is the Contains factor NDF / HRG in a concentration of 1-10nmolar.

4. Means according to claim 1, characterized in that it is the Factors SF / HGF and NDF / HRG in the ratio 10: 1 to 1:10 contains.

5. Means according to claim 1, characterized in that it Antisense oligonucleotides or substances derived therefrom SF / HGF and / or NDF / HRG contains.

6. Use of an agent containing the recombinant factors Scatter factor / hepatocyte growth factor (SF / HGF) and / or new Differentiation factor (NDF / HRG) or inhibitors of these Contains factors to influence cell differentiation by treating mammalian cells.

7. Use according to claim 6, characterized in that the The factor SF / HGF in a concentration of 5-100 ng / ml contains.

8. Use according to claim 6, characterized in that the Average the factor NDF / HRG in a concentration of 1-10nmolar contains.

9. Use according to claim 6, characterized in that the Contains SF / HGF and NDF / HRG in a ratio of 10: 1 to 1:10.

10. Use according to claim 6, characterized in that the Antisense oligonucleotides or derivatives thereof SF / HGF and / or NDF / HRG substances to inhibit Contains cell differentiation.

11. Use according to claim 6, characterized in that as Mammalian organ cultures from mammary glands are used.

12. Use according to claim 6, characterized in that as Mammalian cell organ cultures used for breast cancer will.