DE19500354C1 - Verfahren zur Herstellung von Durchflußreaktionskartuschen für bioanalytische Systeme und Bioreaktoren - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein einfaches, neuartiges Ver­ fahren zur Herstellung von Trägermaterialien mit immobili­ sierten Biokatalysatoren für Durchflußreaktionskartuschen. Die Erfindung bezieht sich auf die Immobilisierung von Enzymen (und, gegebenenfalls zusätzlich Elektronenmediatoren und/oder Coenzyme oder Coenzymanaloga), Mikroben oder anderen biolo­ gischen oder biochemischen Systemen auf elektrisch leitfähigen Materialien mit einer den Durchfluß einer Flüssigkeit erlau­ benden porösen Struktur (filz-, schwamm- oder gewebeartig), die als Füllmaterial in Kartuschen oder Reaktoren für Durch­ fluß-Systeme (z. B. FIA) eingesetzt werden können. Die Immo­ bilisierung erfolgt durch Einschluß der biokatalytisch aktiven Komponente(n) in elektrolytisch auf das Trägermaterial abzu­ scheidende Polymere. Dabei wird der Träger - z. B. Graphitfilz - als Anode geschaltet. Die Abscheidung kann auf großflächigen Stücken des Materials vorgenommen werden, so daß aus einem Stück eine Vielzahl von Einzelkartuschen mit möglichst gleichen Eigenschaften hergestellt werden können.

Oftmals werden in Fließinjektions-Analysensystemen (J. Ruzicka, E. H. Hansen, Anal. Chim. Acta 78 (1975) 145) sogenannte Enzym­ kartuschen eingesetzt, die in der durchfließenden Lösung eine Reaktion durch enzymatische Katalyse hervorrufen. Ein Beispiel hierfür liefern Ukeda, Yoshioka, Matsumoto und Osajima (in: GBF Monogr. 17, VCH Weinheim 1991). Üblicherweise erfolgt erst nach Durchfluß durch die Kartusche die Detektion eines Reaktionsproduktes (oder der Konzentrationsabnahme eines Eduktes) mittels verschiedener Methoden. Hierbei können neben elektrischen auch optische oder thermische Detektionsverfahren eingesetzt werden.

Für die Immobilisierung der Enzyme in der Kartusche werden verschiedene Verfahren angewendet. Gebräuchlich ist die kovalente Immobilisierung an kommerziell erhältlichen, akti­ vierten Materialien wie CNBr-aktivierter Sepharose (Ukeda et al., a.a.O.) oder CPG (controlled porous glass) (P.W. Carr, L.D. Bowers, Immobilized Enzymes in Analytical and Clinical Chemistry; Fundamentals & Applications, Vol. 56, New York 1980). Auch Einschlußverfahren z. B. in Alginatkügelchen finden Verwendung.

Allen Verfahren ist gemeinsam, daß die Immobilisierung vergleichsweise aufwendig und hinsichtlich der Reprodu­ zierbarkeit relativ problematisch ist. Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabenstellung wird dadurch gelöst, daß die Biokomponenten mittels eines einfachen, ein- oder mehrstufigen Verfahrens durch Einschluß in ein auf einem elektrisch leitenden Träger abzuscheidendes Polymer immobilisiert werden. Diese Immobilisierungsmethode ist für die Fixierung von Enzymen aufaktiven Elektrodenoberflächen weit verbreitet (H.L. Schmidt, w. Schuhmann, F.W. Scheller, F. Schubert, in: Sensors - A Comprehensive Survey Vol. 3, VCH Weinheim 1992). Dabei kann die Enzymbeladung erhöht werden, indem man die effektive Elektrodenoberfläche maximiert. So verwendeten Esch und Lukas für ihren Glucose-Biosensor eine aus transversal zur Oberfläche verlaufenden Hohlfibern bestehende Membran (Eur. Pat. App1., 10 pp., CODEN: EPXXDW EP 554 955 A1 930 811).

Die Abscheidung von Elektropolymeren ist jedoch keineswegs nur auf relativ glatte Elektrodenoberflächen beschränkt. So ist auch die Beschichtung von Graphitfilz mit Polypyrrol be­ schrieben (H. Feldhues, Ger. Offen., 6 pp., CODEN: GWXXBX DE 36 09 646 A1 870 924, 1987).

Gegenstand der beschriebenen Erfindung ist die Anwendung der Abscheidung von Elektropolymeren auf Graphitfilz oder Mate­ rialien vergleichbarer Eigenschaften (poröse Struktur, große spezifische Oberfläche und elektrische Leitfähigkeit), um auf diesem Material Enzyme oder andere Biokomponenten zu immo­ bilisieren. Auf diese Weise lassen sich Füllmaterialien für Durchflußreaktoren mit immobilisierten Biokomponenten her­ stellen.

Dabei wird der Filz zunächst für die Immobilisierung als Anode geschaltet. Befindet er sich hierbei in einer Lösung der Biokomponenten und eines elektropolymerisierbaren Monomers - z. B. Pyrrol -, so wird auf dem Filz eine Schicht des Polymers abgeschieden, in welche die Biokomponenten eingeschlossen sind. Gegebenenfalls kann auch vor der Polymerisation eine Adsorption oder Elektroadsorption der Biokomponenten vorgenommen werden. In diesem Falle, würde eine Adsorbatschicht erzeugt, welche erst nachträglich mit dem Elektropolymer abgedeckt und so fixiert wird. Auch der nachträgliche Einschluß in ein zuvor abgeschiedenes Polymer durch elektrochemische Behandlung oder eine elektrochemische Regenerierung einer solchem Immobilisatschicht ist denkbar. Ein Vorteil des erfindungs­ gemäßen Verfahrens ist, daß der Immobilisierungsprozeß auf großen Trägermaterialstücken erfolgen kann, die erst nach­ träglich zerschnitten werden. Damit sollte sich ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit hinsichtlich der katalytischen Eigen­ schaften der Einzelstücke erreichen lassen. In bioanalytischen Fließsystemen kann einer mit einem solchen katalytisch aktiven Material beschickten Kartusche ein Detektorsystem zur Messung eines Eduktes oder Produktes der in der Kartusche ablaufenden Reaktion nachgeschaltet werden. Dies ist mit den verschie­ densten optischen, elektrochemischen oder thermischen Detektionsverfahren denkbar.

Prinzipiell eignet sich das Material nicht nur bei der Immo­ bilisierung, sondern auch im Durchflußreaktor als Elektrode. Somit erlaubt die Durchflußreaktionskartusche nicht nur die Durchführung chemischer und biokatalysierter, sondern auch elektrochemischer und elektrokatalytischer Reaktionen bzw. Kombinationen dieser Reaktionstypen. Dabei kann der Träger auch zur elektrochemischen Detektion eingesetzt werden. Hierbei kann sich die große Elektrodenoberfläche vorteilhaft auswirken. Bei coulometrischer Detektion etwa kann diese die quantitative Umsetzung eines Substrates garantieren. So kann z. B. ein Substrat katalytisch durch im Polymer eingeschlossenes Enzym unter Wasserstoffperoxidbildung quantitativ oxidiert werden. Das Wasserstoffperoxid kann sodann am als Anode geschalteten Träger quantitativ oxidiert werden. Gegebenenfalls kann durch Zugabe eines organischen oder anorganischen Mediators, z. B. Iodid, in die Trägerstromlösung die Überspannung des Wasserstoffperoxids am Elektrodenmaterial herabgesetzt werden.

Das Verfahren eignet sich für alle biokatalytisch aktiven Komponenten, die sich in Elektropolymere einschließen lassen, also Enzyme, Elektronenmediatoren, (modifizierte) Coenzyme, Mikroben, Zellen sowie Kombinationen aus den genannten Kompo­ nenten.

Nachführend wird ein Ausführungsbeispiel beschrieben, daß die Möglichkeit der Immobilisierung durch Einschluß in ein auf Graphitfilz abgeschiedenem Polypyrrol und den Einsatz in einem Fließinjektionssystem belegt.

Beispiel

Als Trägermaterial wurde ®Sigratherm GFA 5, ein kommerziell erhältlicher Graphitfilz, verwendet. Dieser wird üblicherweise als Wärmedämmung, Filter, poröse Elektrode, Lötunterlage etc. verwendet wird.

Auf dem als Anode geschaltetem Stück Graphitfilz wurde eine Polypyrrol-Glucose-Oxidaseschicht abgeschieden. Hierzu wurde ein Stück des Filzes (ca. 5×5×5 mm³) in einer GOD-Lösung (500 u/ml in 0.1 M KCl, 0.1 M Pyrrol) für 300 Sekunden auf 750 mV vs. Ag/Agcl/3 M KCl polarisiert.

Das Ansprechverhalten des Filzes bei Injektion einer 100 mM Glucoselösung wurde in einem einfachen, nach dem wall-jet- Prinzip konstruierten FIA-System untersucht. Hierzu wurde der Filz selber als Arbeitselektrode geschaltet (700 mV vs Ag/Agcl/3 M KCl). Es zeigt:

Fig. 1 das Ansprechverhalten des Polypyrrol-Glucoseoxidase­ beschichteten Graphitfilzes im FIA-System bei dreifacher Injektion einer 100 mM Glucose-Lösung.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung von Trägermaterialien mit immobi­ lisierten Biokomponenten für Durchflußreaktionskartuschen dadurch gekennzeichnet, daß als Träger elektrisch leitende Materialien poröser, filz- oder wolleartiger Struktur dienen und auf diesen durch Einschluß in durch anodische Oxidation abgeschiedene Polymere die Biokomponenten eingeschlossen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymere unsubstituierte oder substituierte Polypyrrole, Poly­ phenole, Polyaniline, Polythiophene, Polyazulene, Polyphen­ oxazine, Polyphenothiophene, Polyphenazine verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger Graphitfilz, Kohlefilz, Platinwolle oder Silberwolle, metallisierter Graphit- oder Kohlefilz oder ein metallisierter oder graphitisierter poröser Träger verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als katalytisch aktive Biokomponente Enzyme, Coenzyme, Coenzymanaloga, Elektronenmediatoren, Zellen, Antikörper oder Kombinationen solcher Komponenten eingeschlossen werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial selbst als Arbeitselektrode dient.

6. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß eine Regenerierung oder Erhöhung der Aktivität des Immobilisat­ beschichteten Trägers durch elektrochemische Behandlung erfolgt.

7. Verwendung des mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erzeugten Trägermaterials in Durchflußreaktionskartuschen zur Durch­ führung biochemischer und elektrochemischer Reaktionen.

8. Verwendung des mit dem Verfahren gemäß Anspruch 1 erzeugten Trägermaterials in Sensoren.