DE1806741B2

DE1806741B2 - PROCESS FOR ACHIEVING A FINE CRYSTALLINE OR AMORPHIC SOLID STATE DURING RAPID FREEZING OF HYDROGEN SUBSTANCES, IN PARTICULAR BIOLOGICAL OBJECTS

Info

Publication number: DE1806741B2
Application number: DE19681806741
Authority: DE
Inventors: Hans Prof Dr Egg Zurich Riehle Udo Dipl Ing Zurich Witikon Moor, (Schweiz)
Original assignee: Balzers Hochvakuum GmbH, 6000 Frank fürt
Priority date: 1967-11-14
Filing date: 1968-11-02
Publication date: 1973-04-12
Also published as: GB1230120A; DE1806741C3; FR1592246A; DE1806741A1; NL135905C; NL6800448A; CH459598A

Description

Bei der Herstellung von Präparaten, z. B. für die Elektronenmikroskopie, kommt es entscheidend darauf an, daß die Struktur der untersuchten Objekte durch den Präparationsvorgang nichv verändert oder gar zerstört wird. Wasserhaltige Substanzen, z. B. biologische Gewebe, werden üblicherweise zuerst durch Einfrieren fixiert, sodann wird mittels eines Mikrotoms die zu untersuchende Fläche freigelegt, gegebenenfalls zwecks Kontrasterhöhung mit einem Metall im Vakuum bedampft und anschließend im Licht- oder Elektronenmikroskop untersucht. Die Fixierung durch Gefrieren hat den bekannten Nachteil, daß die Struktur der untersuchten Objekte durch Eiskristallbildung gestört wird, und zwar um so mehr, je größer die sich bildenden Eiskristalle sind. Um beim Einfrieren einen feinkristallinen oder wenn möglich sogar amorphen festen Zustand des gefrorenen Wassers zu erreichen, ist es schon bekannt, die Abkühlung möglichst schlagartig durchzuführen, beispielsweise durch Eintauchen der zu gefrierenden Substanzen oder eines Behälters mit dieser Substanz in ein verflüssigtes Gas, etwa flüssigen Stickstoff, als Kältemittel. Auf diese Weise gelingt es, einen amorphen oder genügend fein kristallinen (sogenannten vitrifizierten) Zustand in einer äußeren Randzone der zu gefrierenden Substanz zu erreichen, deren Dicke im wesentlichen von der Art der Substanz, ihrem Wassergehalt und der angewendeten Abkühlgeschwindigkeit abhängt.In the manufacture of preparations, e.g. B. for electron microscopy, it is crucial on that the structure of the examined objects is not changed by the preparation process or even destroyed. Substances containing water, e.g. B. biological tissues, are usually first fixed by freezing, then the area to be examined is exposed using a microtome, optionally vapor-deposited with a metal in a vacuum to increase the contrast and then im Examined by a light or electron microscope. Fixation by freezing has the known disadvantage that the structure of the objects examined is disturbed by the formation of ice crystals, and all the more so, the larger the ice crystals that form are. To a fine crystalline when freezing or if It is already known that even the amorphous solid state of frozen water can be achieved Carry out cooling as suddenly as possible, for example by dipping the to be frozen Substances or a container with this substance in a liquefied gas, such as liquid nitrogen, as Refrigerant. In this way it is possible to produce an amorphous or sufficiently finely crystalline (so-called vitrified) state in an outer edge zone of the substance to be frozen, its thickness essentially on the type of substance, its water content and the cooling rate used depends.

Es ist auch ein Verfahren bekannt, wonach beim Abkühlen der zu gefrierenden Substanz durch Anwendung eines hohen Druckes von etwa 2000 at infolge Erniedrigung des Gefrierpunktes das Einfrieren zunächst unterdrückt wird, bis eine Temperatur von etwa -20° C erreicht ist, worauf durch plötzliche Druckentlastung ein unterkühlter Zustand geschaffen wird, aus welchem heraus die Substanz schlagartig gefriert. Leider hat sich gezeigt, daß dieses bekannte Verfahren des Schnellgefrierens zu einem grobkristallinen Eisgefüge führt oder jedenfalls sehr schwer so zu handhaben ist, daß der gewünschte Vitrifizierungszustand erreicht wird Diese Grobkristallbildung kann vielleicht dadurch erklärt werden, daß die Temperatur der zu gefrierenden Substanz im Augenblick des Gefrierens infolge der dabei frei werdenden A method is also known, according to which when the substance to be frozen is cooled by applying a high pressure of about 2000 atm as a result of lowering the freezing point, the freezing is initially suppressed until a temperature of about -20 ° C is reached, whereupon the pressure is suddenly released supercooled state is created , out of which the substance suddenly freezes. Unfortunately, it has been shown that this known method of quick freezing leads to a coarsely crystalline ice structure or is at least very difficult to handle in such a way that the desired state of vitrification is achieved as a result of the freed up

ίο Kristallisationswänne und wegen unzureichender Wärmeableitung kurzzeitig auf einen Wert ansteigt, bei welchem die Geschwindigkeit des Kristallwachstums stark erhöht ist.ίο Wells of crystallization and because of insufficient Heat dissipation increases briefly to a value at which the rate of crystal growth is greatly increased.

Die Erfahrung lehrt, daß die meisten biologischenExperience teaches that most of them are biological

Zellsysteme zu einem mehr oder weniger großen Grad der Unterkühlbarkeit vor dem Einfrieren neigen. Wird das die Zellen umgebende Wasser durch eine plötzliche Druckabsenkung nahe seiner normalen Gefriertemperatur zu spontaner Kristallbildung an- Cell systems tend to be hypothermic to a greater or lesser extent before freezing. If the water surrounding the cells is caused to spontaneously form crystals by a sudden drop in pressure close to its normal freezing temperature.

geregt, so ergibt sich die Möglichkeit, daß die extrazellulär entstehenden Eiskristalle die ZeI!wände durchdringen und so das intrazelluläre Wasser durch heterogene Bekeimung zur Bildung großer Kristalle anregen.excited, there is the possibility that the extracellular The resulting ice crystals penetrate the cell walls and so penetrate the intracellular water Stimulate heterogeneous germination to form large crystals.

Die vorhegende Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Erzielung eines feinkristallinen oder amorphen festen Zustandes beim schnellen Gefrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere biologischer Objekte, anzugeben, wobei die /u gefrierende wasserhaltige Substanz während eines Teiles der Abkühllungsperiode einem hohen Druck unterworfen wird. Dieses Verfahren ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß der Druck aufrechterhalten wird, bis die Oberflächentemperatur der zu gefrierenden Substanz - 50 C unterschritten hat.The present invention has the task of a method of obtaining a fine crystalline or amorphous solid state in the rapid Freezing of water-containing substances, in particular biological objects, to indicate, the / u freezing subjected to high pressure during part of the cooling period will. According to the invention, this method is characterized in that the pressure is maintained will be until the surface temperature of the to be frozen Substance - has fallen below 50 C.

Im Vergleich zu dem bekannten Verfahren muß also bei dem Verfahren nach der Erfindung die Druckentlastung nicht angewendet werden, um den Gefriervorgang einzuhalten. Der Erfindung liegt vielmehr die neue Erkenntnis zugrunde, daß, um das angestrebte Ziel der Vitrinkation der zu gefrierenden Substanz besser zu erreichen, die Anwendung eines hohen Druckes wenigstens während eines Teiles der Abkühlungsperiode zwar nützlich ist, daß jedoch der naheliegende Weg der Entspannung zwecks schlagartiger Einleitung des Gefrierens bei 20 C, wobei man Grobkristallbildung in Kauf nimmt, vermieden werden soll, entgegen der an sich gültigen Regel, daß schnelles Gefrieren zu einem feineren KristallgefügeCompared to the known method must therefore in the method according to the invention Depressurization may not be used to stop the freezing process. Rather, the invention lies based on the new knowledge that in order to achieve the desired goal of vitrinkation of the to be frozen To achieve better substance, the application of high pressure at least during part of the Cooling down period is useful, but the obvious way to relax is more sudden Initiation of freezing at 20 ° C., taking into account the formation of coarse crystals, avoided should be, contrary to the actually valid rule that rapid freezing to a finer crystal structure

5" führt als langsames.5 "leads as slow.

Der durch die Erfindung erzielte Fortschritt läßt sich vielleicht dadurch erklären, daß durch die Aufrechterhaltung des hohen Druckes bis zu einer Temperatur T=-50⁰C, d.h. einer Temperatur, bei welcher die intrazellulare Bildung von Kristallisationskeimen kritischer Größe bereits einen hohen Wert erreicht hat, bewirkt wird, daß die folgende Druckabsenkung eine nochmalige starke Vermehrung der in den Zellkörpern vorhandenen Krislallkeime kritischer Größe mit dem Effekt einer submikroskopisch feinen Eisstruktur mit sich bringt. Dabei stört es nicht, wenn das bereits zu einem früheren Zeitpunkt eingefrorene extrazelluläre Wasser gegebenenfalls eine gröbere Struktur aufweist.The progress achieved by the invention can perhaps be explained by the fact that by maintaining the high pressure up to a temperature T = - 50 ⁰ C, ie a temperature at which the intracellular formation of crystallization nuclei of critical size has already reached a high value, the effect is that the subsequent pressure reduction brings about a further strong increase in the crystal germs of critical size present in the cell bodies with the effect of a submicroscopically fine ice structure. It does not matter if the extracellular water that has already frozen at an earlier point in time may have a coarser structure.

Ein Beispiel füi die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und eine hierzu geeignete Vorrichtung werden an Hand der Zeichnungen näher beschrieben. An example for the implementation of the invention The method and a device suitable for this purpose are described in more detail with reference to the drawings.

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Die Fig. 1 zeigt den wesentlichen Teil der Ein- wartet, bis ein praktisch vollständiger Temperaturrichtung in detaillierter Ausführung; ausgleich zwischen dem angewendeten Kühlmittel1 shows the essential part of the waiting time until a practically complete temperature direction in detailed execution; equalization between the applied coolant

die F i g. 2 zeigt die Gesamtanordnuag. und dein Gefriergut eingetreten ist.the F i g. 2 shows the overall arrangement. and your frozen food has entered.

In Fig. 1 bedeutetl einen röhrenförmigen, ein- In manchen Fällen wird das erfindungsgemäße seitig geschlossenen, dünnwandigen Behälter aus 5 Verfahren vorteilhafterweise so ausgebildet, daß einem gut wärmeleitenden Material, z. B. Kupfer, während der Abkühlung ein variabler Druck angewelcher die zu gefrierende Probe 2 aufnimmt An wendet wird. Da nämlich der Druck, wenn er zu seinem oberen Ende 3 ist dieser Behälter trichterför- lange andauert, bei biologischen Objekten zu Schämig erweitert und zwischen dem Kühlteil 4 und dem digungen führen kann, empfielt es sich in diesem DruckteilS der Anordnung eingespannt. Über die io Falle, daß während des Vorkühlens der zu gefriezentrale Bohrung 6 des Teiles 5 kann mittels einer renden Substanz auf eine vorgewählte Einfriertem-Übertragerflü!,sigkeit — am einfachsten Wasser — peratur der Druck so variiert wird, daß er in jedem auf die zu gefrierende Probe ein hoher Druck von Augenblick der Vorkühlung gerade ausreicht, das beispielsweise 1000 at, welcher mit an sich bekannten Einfrieren zu verhindern.In Fig. 1, it means a tubular, in some cases that of the invention laterally closed, thin-walled container from 5 processes advantageously designed so that a material that conducts heat well, e.g. B. copper, a variable pressure while cooling the sample to be frozen 2 takes up is applied. Because there is the pressure when it is too At its upper end 3, this container is funnel-shaped and too shameful in the case of biological objects extended and can lead between the refrigerator part 4 and the dungen, it is recommended in this Pressure part of the arrangement clamped. About the io trap that during the pre-cooling of the too freezing center Bore 6 of part 5 can be transferred to a preselected freezing transfer fluid by means of a generating substance - the simplest is water - temperature the pressure is varied so that it is in each A high pressure on the sample to be frozen is just sufficient from the moment of pre-cooling for example 1000 at, which is known per se to prevent freezing.

Vorrichtungen erzeugt werden kann, ausgeübt wer- 15 Die Größe der für die Durchführung der ErfindungDevices can be generated, exercised

den. Der Behälter 1 ragt in einen Raum 7 hinein, der nützlichen Drücke liegt zwischen etwa 100 und eini-the. The container 1 protrudes into a space 7, the useful pressures are between about 100 and a few

eine Zuführungsleitung für das KüW-nittel aufweist, gen 1000 aL Es soll ein so hoher Druck angewendethas a supply line for the KüW-nittel, gen 1000 aL. Such a high pressure should be used

welche aus den Leitungswegen 8, 9 und 10 gebildet werden, daß sich eine Gefrierpunkterniedrigung derwhich are formed from the lines 8, 9 and 10 that a lowering of the freezing point

wird. Bei Kühlung umspült das Kühlmittel die Außen- zu gefrierenden wasserhaltigen Substanz um wenit:-will. When cooling, the coolant washes around the water-containing substance to be frozen by less: -

wandung des Behälters Ϊ, wobei es, wenn es flüssig 20 stens 5 C ergibt.wall of the container Ϊ, where it, if it is liquid 20 at least 5 C results.

ist, im Raum 7 hochsteigt, bis es in den als Auffaiig- Um eine hinreichend schnelle Temperatur schwan -is, rises in room 7 until it fluctuates in the

rinne gebildeten Hohlraum 11 des Teiles 4 überläuft kung zu erreichen, welche auch für die Durchfüh-channel formed cavity 11 of part 4 overflows to achieve kung, which is also for the implementation

und schließlich durch die öffnungen 12 entweichen rung der Erfindung von Bedeutung 4, empfiehlt esand finally through the openings 12 escape the invention of importance 4, it recommends

kann. sich, wie das beschriebene Beispiel zeigt, den Trägercan. As the example described shows, the carrier

Die Fi g. 2 zeigt, wie diese Einrichtung mit einer 25 für die zu gefrierende Substanz als gut wärmeleitendeThe Fi g. 2 shows how this device with a 25 for the substance to be frozen as a good heat conductor

Hilfsvorrichtung zur Erzeugung des benötigten Trennwand zwischen einem Druckraum und einemAuxiliary device for generating the required partition between a pressure space and a

Druckes zusammengebaut werden kann. Dazu ist der Kühlraum auszubilden und das Kühlmittel in demPressure can be configured. For this purpose, the cooling space and the coolant in the

von einem an dem lisch 14 befestigten Stativ 15/16 Kühlraum beim Abkühlen mit möglichst hoher Ge-from a stand 15/16 attached to the table 14 cooling space when cooling with the highest possible

gehallerte, der Druckübertragung dienende Teil 5 als schwindigkeit einströmen zu lassen. Da ferner, wiethunderous, the pressure transmission serving part 5 to flow in as speed. Since further, how

Hydraulikzylinder ausgebildet, wobei der Zylinder- 30 sich ebenfalls aus den obigen Ausführungen ergibt,Hydraulic cylinder formed, the cylinder 30 also results from the above explanations,

raum 17 mit der Bohrung 6 verbunden ist und der die Abkühlung der Probe und die Anwendung desSpace 17 is connected to the bore 6 and the cooling of the sample and the application of the

hydraulische Druckkolben 18 über die Hubstangc 19 Druckes zeitlich genau aufeinander abgestimmt wc·hydraulic pressure piston 18 via the lifting rod c 19 pressure precisely timed to one another wc

vom Druckluftkolben 20 eines Druckzylinders be- den müssen, ist es zweckmäßig, für das Steuern die-from the compressed air piston 20 of a pressure cylinder, it is useful to control the

tätigt werden kann. Der Druckzylinder 21, dessen ser beiden Vorgänge ein automatisches Schaltgerätcan be made. The pressure cylinder 21, the two processes of which an automatic switching device

unterer Teil gezeichnet ist, ist in bekannter Weise mit 35 zu benutzen, welches das zeitliche Verhaltes zwi-The lower part is drawn, is to be used in a known manner with 35, which shows the temporal relationship between

Druckluftzu- und -ableitungen 22, 23 versehen. sehen dem Einströmen des Kühlmittels und derCompressed air supply and discharge lines 22, 23 are provided. see the inflow of the coolant and the

Der Rahmen 24 dient der Halterung des Druck- Druckanwendung genau regelbar einzustellen ge-The frame 24 is used to hold the pressure and pressure application can be precisely adjusted.

luftzylinders. 25 ist eine an den Säulen 15. 16 des stattet. Ohne jedesmal die schwierige Messung derair cylinder. 25 is one on the pillars 15. 16 of the equips. Without the difficult measurement of the

Stative geführte, in vertikaler Richtung mittels des Obcrflächeirtemperatur der Probe durchführen zuStand guided, in the vertical direction by means of the surface temperature of the sample

Handrades 26 und der Gewindespindel 27 verschieb- 40 müssen, kann dieser zeitliche Abstand auf Grund vonHandwheel 26 and the threaded spindle 27 must move 40, this time interval can be due to

bare Trägerplatte für den Kiihlteil 4. 28 ist ein Mano- Vorversuchen so gewählt werden, daß eine optimalebare carrier plate for the cooling part 4. 28 is a mano preliminary tests are chosen so that an optimal

meter, das der Überwachung des auf die Probe im Vitrifizierung der Probe erreicht wird. Das Steuerge-meter, which is used to monitor the sample in vitrification of the sample. The tax

Behälter 1 ausgeübten Druckes dient. rät kann so ausgebildet werden, daß die Größe desContainer 1 applied pressure is used. advises can be designed so that the size of the

Zur beispielsweisen Durchführung des erfindungs- Druckes nach einem vorgewählten zeitlichen Progemäßen Verfahrens wird die zu gefrierende Probe 2 45 gramm verläuft oder in Abhängigkeit von der an der bei abgesenktem Kühlteil 4 in den Behälter 1 einge- Probe gemessenen Temperatur geregelt wird,
bracht, sodann dieser durch Betätigen des Handrades Die Ausbildung des Steuergerätes bildet nicht den 26 gegen den Druckteil 5 gedrückt, worauf die Probe Gegenstand vorliegender Erfindung,
mittels der beschriebenen pneumatisch-hydraulischen Der Anwendungsbereich der Erfindung beschränkt Einrichtung durch die Druckübertragungsflüssigkeit 50 sich nicht auf den obenerwähnten Zweck der strukmit einem Druck von 1000 bis 2000 at beaufschlagt turerhaltenden Fixierung biologischer Untersuchungswird. Unter Aufrechterhaltung dieses Druckes wird objekte, sondern umfaßt ebenso die Konservierung darauf durch die Leitungswege 8, 9, 10 das Kühlme- hochwertiger biologischer Stoffe, z. B. von Blutdium z. B. flüssiger Stickstoff oder ein tiefgekühltes, plasma. Auch für die strukturerhaltende Fixierung bei der gewünschten Temperatur noch nicht konden- 55 anorganischer Stoffe kann die Erfindung mit Vorteil siertes Gas eingeführt, wodurch die Probe sich mit eingesetzt werden, z. B. um die Stoffverteilung in einer bestimmten großen Geschwindigkeit abkühlt. Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Gelen od. dgl. Es empfiehlt sich, den Druck beim Abkühlen so lange Mischphasen zu studieren bzw. solche Mischphasen aufrechtzuerhalten, bis wenigstens eine äußere Rand- für spätere Anwendungen durch Gefrieren zu fixiezone der wasserhaltigen Substanz eingefroren ist, 60 ren. Auch in Fällen, in denen eine gewisse Strukturjedenfalls aber so lange, bis die Oberflächentemperatur veränderung in Kauf genommen werden kann, kann der zu gefrierenden Substanz -5O⁰C unterschritten die Anwendung der Erfindung von Vorteil sein, nämhat, was z. B. durch ein an der Probe angebrachtes lieh dadurch, daß man schon mit wesentlich gerin-Thermoelement überprüft werden kann. Zweckmäßi- geren Abkühlgeschwindigkeiten und damit wirtschaftweise wird mit der Aufhebung des Druckes züge- 65 licher zum gleichen Ziele kommt.For example, to carry out the pressure according to the invention according to a preselected time-based program, the sample to be frozen 2 runs 45 grams or is regulated as a function of the temperature measured at the temperature measured in the container 1 when the cooling part 4 is lowered,
then this by operating the handwheel. The design of the control device does not form the 26 pressed against the pressure part 5, whereupon the sample is the subject of the present invention
The scope of application of the invention is limited by means of the described pneumatic-hydraulic device by means of the pressure transmission fluid 50, which is not limited to the above-mentioned purpose, which is subjected to a pressure of 1000 to 2000 atm for the maintenance of the biological examination. While maintaining this pressure is objects, but also includes the preservation on it through the lines 8, 9, 10 the Kühlme- high quality biological substances such. B. of Blutdium z. B. liquid nitrogen or a frozen, plasma. Also for the structure-preserving fixation of non-condensing inorganic substances at the desired temperature, the invention can advantageously introduce gas, whereby the sample can also be used, e.g. B. to cool the substance distribution in a certain high speed. Solutions, suspensions, emulsions, gels or the like. It is advisable to study the pressure during cooling as long as mixed phases or to maintain such mixed phases until at least one outer edge zone of the water-containing substance is frozen for later applications by freezing to fixy zone, 60 Ren. Even in cases in which a certain structure but in any case until the surface temperature change can be accepted, the substance to be frozen below -5O ⁰ C can be advantageous, namely what z. B. by an attached to the sample borrowed in that one can already be checked with much less thermocouple. With the release of the pressure, the same goal will be achieved more expediently and more economically.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings

Claims

Patent claims:

1. Verfahren zur Erzielung eines feinkristallinen oder amorphen festen Zustandes beim schnellen Gefrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere biologischer Objekte, wobei die zu gefrierende wasserhaltige Substanz während eines Teiles der Abkühlungsperiode einem hohen Druck unterworfen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck aufrechterhalten wird, bis die Oberfiächentemperatur der zu gefrierenden Substanz —50° C unterschritten hat.1. Process for obtaining a finely crystalline or amorphous solid state in the rapid Freezing of water-containing substances, especially biological objects, the ones to be frozen water-containing substance is subjected to high pressure during part of the cooling period, characterized in that that the pressure is maintained until the surface temperature of the substance to be frozen has fallen below -50 ° C.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der Abkühlung ein variabler Druck angewendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a during cooling variable pressure is applied.

3. The method according to claim 1, characterized in that during the pre-cooling of the substance to be frozen is varied to a preselected freezing pressure ucr so that at every moment of the pre-cooling it is just sufficient to prevent freezing.

4. The method according to claim 1, characterized in that such a high pressure is applied that there is a lowering of the freezing point of the water-containing substance to be frozen gives at least 5 ° C.