DE1617748A1 - Rheumatism diagnostic - Google Patents
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Description
Es ist bekannt, daß beim Rheumatismus verua,, der vorwiegend durch Streptokokken-Infektion auegelöst wird, Antikörper gegen Streptokokkensubstanzen im Serum nachgewiesen werden können. In der klinischen Diagnostik hat sich lediglich die Bestimmung des Antistreptolysisi-Titexs bewährte Die hierbei nachgewiesenen Antikörper* stehen jedoch in keinem Zusammenhang mit dem Rheumatismus yexus· Si® zeigen, lediglich eine . Immunisierung gegen das-'.Str«ptolyein &®r St^pto-kokken an« Die Reaktion ist infolgedeseep uaspo&ifiseia und erfordert außerdem als in-vitro-Töst ®±ne mnfw©na±g® und zeitraubend®It is known that in rheumatism verua ,, which is mainly caused by streptococcal infection, antibodies against streptococcal substances can be detected in the serum. In clinical diagnostics, only the determination of the Antistreptolysisi-Titex has proven itself. However, the antibodies * detected here are not related to the rheumatism yexus · Si® show, only one. Immunization against the - '. Str «ptolyein & ®r St ^ pto-cokken an« As a result, the reaction is seep uaspo & ifiseia and also requires an in vitro toast ® ± ne mnfw © na ± g® and time consuming®
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fiolalt-asfiolalt-as
1 S / 11 S / 1
- 2 - Fw 5128 A- 2 - Fw 5128 A
etwa 259 mu aufweist und eine Wanderungsge.schwindigkeit von 4,5 bis 6 cm/2 Std. in der Papierelektrophorese (Veronal-1 ,. puffer 0,1 MpH 8,6 t n V/cm, 22°C) zeigt.about 259 μm and a migration speed of 4.5 to 6 cm / 2 hours in paper electrophoresis (veronal 1 , buffer 0.1 MpH, 8.6 t n V / cm, 22 ° C.).
ί . .■■'■■. v. , ·ί. . ■■ '■■. v . , ·
* . Das Diagnostikuin besteht vorzugsweise aus einer Lösung von aus Streptokokken gewonnenen Nucleoproteid in Wasser • bzw. wasserhaltigen Lösungen, z.B. physiologischer Kochsalzlösung und anderen von der Haut reaktionslos bzw. mit nur sehr geringer Reaktion verträglichen Lösungsmitteln und Lösungsmittelgemischen. Diese Lösungen bzw. Lösungsmittelgemische können wiederum in Form geeigneter Dispersionen, z.B. von Öl-in-Wasser- bzw. Wasser-in-Öl-Emulsionen angewendet werden, wobei weitere Substanzen, wie sie bei derartigen Zubereitungen eingesetzt werden, verwendet werden können. Solche sind auch Niehtlöser wie z.B. Fette und Öle sowie emulgierende bzw. dispergierende wirkende Substanzen vom Typ der Emulgatoren bzw. Schutzkolloide organischer und anorganischer Natur. Auch können weiter Substanzen, die vjblicheyweise bei Herstellung solcher Zubereitungen ver- ' wendet werden z.B. Puffer, Stabilisatoren usw. zugesetzt werden.*. The diagnosis preferably consists of a solution of nucleoproteins obtained from streptococci in water or aqueous solutions, eg physiological saline solution and other solvents and solvent mixtures that are unreactive or tolerated by the skin with only a very slight reaction. These solutions or solvent mixtures can in turn be used in the form of suitable dispersions, for example oil-in-water or water-in-oil emulsions, it being possible to use other substances such as are used in such preparations. These are also non-dissolvents such as fats and oils, as well as emulsifying or dispersing substances of the emulsifier or protective colloid type of organic and inorganic nature. Also, further substances that vjblich e y i we se comparable such preparations in manufacturing applies' will etc. may be added, for example, buffers, stabilizers.
Der Gehalt an dem Nucleoproteid in diesen Zubereitungen liegtThe content of the nucleoprotein in these preparations is
— 7 >-4- 7> -4
gewöhnlich zwischen IO und 10 g %% bezogen auf die Gesamtzubereitung,
jedoch kann dieser Gehalt in Spezial.fällen unter- oder überschritten werden. Im Falle eines besonders hohen
Immunisierungsgrades wird eine höhere, im Falle eines relativ
niedrigeren Immunisierungegrades wird ein· nied—rigere Konzentration
ausreichend sein· Als besonders geeignete Konzentratio
anzusehenusually obtained between 10 g and IO%% on the total formulation, but this content may be lower in Spezial.fällen or exceeded. In the case of a particularly high degree of immunization, a higher, and in the case of a relatively lower degree of immunization, a lower concentration will be sufficient. As a particularly suitable concentration
to watch
zentration ist ein Bereich zwischen 10** ' g % bis ΙΟ"'* g % centering is a range between 10 ** 'g % to ΙΟ "' * g %
Das «rfindungäsgamäß® Diagnostikum gestattet es, Rheumatismus verus durch einen sehr ®infaeSie» Isutraeutantest nachzuweiaen. J® ssaöh Art der Zubereitung kams d&& Diagnostikum als Iirstracutan oderThe “rfindungäsgamäß® diagnostic agent” allows the detection of rheumatism verus by means of a very ®infaeSie ”isutraeutant test. J® ssaöh type of preparation kams d && Diagnostikum als Iirstracutan or
t 0 9 8 1 S / 1 8 4t 0 9 8 1 S / 1 8 4
- 3 - Fw 5128 A - 3 - Fw 5128 A
Beim Intracutantest werden z.B. 0,1 ecm der Testlösung streng intracutan injiziert. Es entsteht bei positivem Ausfall des Testes eine Rötung und Infiltration. Das Diagnostikum führt zu einer Hautreaktion vom Tuberkulintyp, Als günstig für die Ablesung der Reaktion hat sich z.B. ein Zeitintervall von 48 Stunden nach Anlegen des Testes ergeben. Der Test kann auch als Percutanprobe durch Einreiben eines erbsengroßen Stückes einer Salbenzuber*i.tung des Nucleoproteide als Pflasterprobe ähnlichen den Variationen der Tuberkolinprobe durchgeführt werden. Im Sertun sind homorale Antikörper bei entsprechenden Patienten gegen das beschriebene Nucleoproteid in den verschiedenen Immunreaktionen wie z.B. Onchterlony-Test, Immunelektrophorese usw. nachweisbar. Der Gehalt des Serums ist meist jedoch so gering, daß die Gamma-Globulinfraktion zunächst konzentriert werden muß»In the intracutaneous test, e.g. 0.1 ecm of the test solution injected strictly intracutaneously. It arises from positive Failure of the test resulted in reddening and infiltration. The diagnostic tool leads to a skin reaction of the tuberculin type, Als For example, a time interval of 48 hours after applying the test has proven to be beneficial for reading the reaction result. The test can also be performed as a percutaneous test by rubbing in a pea-sized piece of an ointment tub of the nucleoprotein as a plaster sample similar to the variations the tubercoline test can be carried out. Are in Sertun homoral antibodies against the described nucleoprotein in the various immune reactions such as Onchterlony test, immunoelectrophoresis, etc. verifiable. However, the content of the serum is usually so low that that the gamma globulin fraction are first concentrated got to"
Die einfache Handhabung des Intracutantestes, die es jedem Arzt auch ohne Laboratorium ermöglicht+ den Test durchzuführen, läßt diesen Test als überlegen erscheinen.The simple handling of the intracutaneous test, which enables any doctor to carry out the test even without a laboratory + , makes this test appear to be superior.
Das erfindungsgemäß als wirksame Substanz in dem Diagnostik kum eingesetzte Nucleoproteid wird aus Streptokokken vorzugsweise solchen der Gruppe A und C gewonnen. ■According to the invention as an effective substance in diagnostics Cumulatively used nucleoprotein is obtained from streptococci, preferably those of groups A and C. ■
ί ·ί ·
- J- J
Die Abtrennung des Nucleoproteide a^u.8 dem Extrakt kann durch eine Kombination von Zentrifugieren und Behandeln mit proteinfällenden Salzen bzw. Salzlösungen unter schiedlicler · Konzentration oder durch Extraktion mit geeigneten Lösungen1, bzw» Verfahren der Elektrophorese, Gegenstromverteilung, Chromatographie usw.' sowie von Kombinationen dieser Verfahren untereinander vorgenommen werden.The nucleoproteins can be separated from the extract by a combination of centrifugation and treatment with protein-precipitating salts or salt solutions at different concentrations or by extraction with suitable solutions 1 or "methods of electrophoresis, countercurrent distribution, chromatography, etc." as well as combinations of these processes with one another.
Eine sehr zweckmäßige IsolierungswAise für das Nucleoproteid besteht darin, daß man Streptokokken mit der doppelten Menge Wasser oder wasserhaltigen Lösungen(bezogen auf das Streptokokkengewicht) homogenisiert und den Extrakt durch eine der üblichen Abtrennungsmethoden, z.B. Zentrifugieren, isoliert.A very useful way of isolating the nucleoprotein consists in getting streptococci with twice the amount Water or aqueous solutions (based on the streptococcal weight) homogenized and the extract through one of the common separation methods, e.g. centrifugation, isolated.
TO 9 815/1848TO 9 815/1848
- k - Fy j.12,8 A 161/748 - k - Fy j 12.8 A 161/748
Daran anschließend stellt man das Homogenat auf einen hohen Salzgehalt, z.B. um 40 % Ammonsulfat ein und trennt hierdurch eine Vorfraktion ab, die verworfen wird. Nach Abtrennung der Vörfraktion wirdcfer Salzgehalt erhöht, z.B. auf etwa 70 % Ammonsulfat. Hierbei fällt ein Niederschlag aus, den man z.B. durch Zentrifugieren abtrennt und ihn in wässriger oder wasserhaltiger Lösung gegen Wasser oder eine wasserhaltige Lösung dialysiert. Man überführt die dialysierte Lösung entweder als solche oder nach Trocknung in einen Puffer um pH 7 ,und gibt die Lösung auf einen basischen Austauscher, z.B. DCAE-Zellulose. Die Säule wird mit einem Puffer von pH solange gewaschen, bis das Eluat einen pH-Wert von 3 erreicht hat. Danach wird dem Puffer ein Salz, z.B.- NaCJ in einer* Konzentration von etwa 3 % zugesetzt. Eine Vorfraktion wird verworfen und die nachfolgende Hauptfraktion aufgefangen. Zur Entfernung des Kochsalzes und der Puffersubstanζon wird das Eluat dialysiert, z.B. gegen dest. Wasser. Dir Looting kann sodann über Blaugel getrocknet werden.The homogenate is then adjusted to a high salt content, for example around 40 % ammonium sulfate, and a preliminary fraction is thereby separated off, which is discarded. After the preliminary fraction has been separated off, the ferrous salt content is increased, for example to about 70 % ammonium sulphate. A precipitate separates out, for example by centrifugation, and dialyzed in an aqueous or aqueous solution against water or an aqueous solution. The dialyzed solution is transferred either as such or after drying in a buffer around pH 7, and the solution is transferred to a basic exchanger, for example DCAE cellulose. The column is washed with a pH buffer until the eluate has reached a pH of 3. Then a salt, for example NaCI, is added to the buffer in a concentration of about 3 % . A preliminary fraction is discarded and the following main fraction is collected. To remove the common salt and the buffer substance, the eluate is dialyzed, for example against dist. Water. The looting can then be dried over blue gel.
Das erf indungsgernäß eingesetzte Nticleoproteid i st durch ein IF£-Maximum von etwa 259 tau. charakterisiert und 7;eigt bei der/elektrophorese (Veronalpuffer 0,1 MfpII 0,6, 11 V/cm) eine Wanderungsgeschwindigkeit von 4,5 - 6cm/2 Std. Weitere Reaktionen shd Schwarzfärbung mit Amidoschwarz 10 b, Phosphatfärbung nach Waid vrnd Morgan. Anfärbung auf Calcium nach Pollard und Mc Omie, Lipidanfärbung nach Si*alm und Anfärhing auf Purine nach Michel und Haberler. Bei der alkalischen und sauren Hydrolyse werden in'bekannter Weise Adenin, Cytosin, Guanin und Uracil nachgewiesen. Nach Partridge wird -iibose ermittelt. An Aminsosäuren sind nach der Methode .von Doso und Caputo bisher Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, · Alanin, Serin, Threonin, Valin und Leucin nachzuweisen.The anticleoprotein used according to the invention is through an IF £ maximum of about 259 tau. characterized and 7; in the electrophoresis (Veronal buffer 0.1 M f pII 0.6, 11 V / cm) a migration speed of 4.5-6 cm / 2 hours vrnd Morgan. Staining for calcium according to Pollard and Mc Omie, lipid staining according to Si * alm and staining for purines according to Michel and Haberler. In the case of alkaline and acid hydrolysis, adenine, cytosine, guanine and uracil are detected in a known manner. According to Partridge, -iibose is determined. According to the Doso and Caputo method, aspartic acid, glutamic acid, glycine, alanine, serine, threonine, valine and leucine have so far been detected in amino acids.
Das Nucleoproteid führt auch in höheren Verdünnungen bei Zugabe zu Τχ-opokoIlagenlösungen zur Bildung von kollagenen Fibrillen.Even in higher dilutions, the nucleoprotein leads to the formation of collagens when added to Τχ-opocoIlage solutions Fibrils.
BAD ORiGlINAL 109815/1848BATH ORiGlINAL 109815/1848
- 5 > ;.. Fw gi2;8- 5>; .. Fw gi2 ; 8
Das.Nucleoproteid bindet sich ausgezeichnet an ein Serumprotein des Menschen. Dies ist sowohl im Oüchertlony-Test und in der Immunelefctrophorese nachweisbar.The nucleoprotein binds excellently to a serum protein of the human. This is both in the Oüchertlony test and detectable in immune electrophoresis.
Es reagiert außerdem mit hochgereinigtem menschlichen Gamma-■ Globulin.. Diese Hüaktion ist ebenfalls gut in der Immune l.ektr ο phorese und im Ouchterlony-Test nachweisbar.It also reacts with highly purified human gamma ■ Globulin .. This action is also good in the immune l. electr ο phoresis and detectable in the Ouchterlony test.
Das Nucleoproteid ist in Wasser sehr gut -löslich, unlöslich in Alkohol, Äther und Chloroform. ,The nucleoprotein is very readily soluble, insoluble in water in alcohol, ether and chloroform. ,
Das neue erfindungsgemäß herstellbare Diagnostüsum stellt ein wertvolles, bisher unbekanntes Hilfsmittel in der ärztlichen Diagnostik dar. Es ermöglicht es überraschenderweise, mittels einer äußerst einfachen Methodik den Nachweis für das Vorliegen einer rheumatischen Erkrankung zu ι führen,. Das bedeutet elften erheblichen Fortschritt. E» war aifcht t vorauszusehen, daß das erfindungsgemäß eingesetzte'Nucleoproteid eine'derartige Testreaktion ergeben würde.The new diagnostic device that can be produced according to the invention is discontinued valuable, previously unknown tool in medical diagnostics. Surprisingly, it makes it possible to use an extremely simple method to provide evidence of its existence lead to a rheumatic disease. That means eleventh significant progress. I was afraid to foresee that that nucleoprotein used according to the invention is such Test reaction would result.
100815/1848100815/1848
/6/ 6
- δ -* Fw 5128 A- δ - * Fw 5128 A
161774a161774a
Beispiel: -, · Example: -,
50 g getrocknete Streptokokken werden mit 1OO ml dest. Wasser im ßtter-Homogen!sator homgeiiisiert. Das Iioinogenat Λγ-ird anschließend 3 Stunden bei Zimmertemperatur mechanisch gerührt und darauf 15 Minuten bei 5OOO ITbidrehimgen zentrifugiert. BAe überstehende Lösung; wird ini Wasserbad auf 80 C erhitzt und nach Abkühlen OtLt Ammonsulfat bei kO % (g/Vo lumen) eine Vbrfraktion aus ΐΐτι-spezifischein Material gefällt, 12 Stunden ijn ,Kühlschrank bei +4°C gehalten und damn ±5 Minuten bei 500O Umdrehungeii zentrifugiert. In der erhaltenen !»ösung wird der Ammonsulfatgehalt auf 7O % erhöht, die Fällung viederim 12 Stunden im Kühlschrank bei + 4°C gehalten und erneut 15 Minuten bei 5000 Umdrehungen zentrifaägiert. Der Niederschlag xvdLx-d in Wasser aufgenommen und zweimal 2% Stunden,gegen Aqua dest. dxalysiert. Nach dieser Zeit können mit Bariumchlorid keine Sitlfatiouen mehr nachgewiesen werden. Bie dialysierte Lösung wird daraufhin über Blaugel getrocknet«50 g of dried streptococci are diluted with 1OO ml. Water homogenized in the first homogenizer. The ionogenate γ-ird is then stirred mechanically for 3 hours at room temperature and then centrifuged for 15 minutes at 50000 ITbidrehimgen. BAe supernatant solution; is heated in a water bath to 80 C and, after cooling, ammonium sulfate at kO% (g / volume) precipitated a fraction of ΐΐτι-specific material, kept for 12 hours in the refrigerator at + 4 ° C and then centrifuged for ± 5 minutes at 500O revolutions . In the solution obtained, the ammonium sulfate content is increased to 70% , the precipitate is kept in the refrigerator at + 4 ° C for another 12 hours and centrifuged again for 15 minutes at 5000 revolutions. The precipitate xvdLx-d taken up in water and twice 2% hours, against distilled water. dxalysed. After this time, no more sitlfatiouen can be detected with barium chloride. The dialyzed solution is then dried over blue gel «
Zur weiteren Reinigung wird DEAE-Zallulose {Firma Serva Nr. 12 113 PA) verwendet. Bazu -»«Tuen. 12 g des Aitstauschers in 590 ecm Michaelispuffer von pH 7,0 suspendiert, nach 45DEAE-Zallulose (Serva No. 12 113 PA) is used for further purification. Bazu - »« Do. 12 g of the exchanger suspended in 590 ecm Michaelis buffer of pH 7.0, after 45
Minuten die überstehende X.ösung dekantiert und. mit dem auspendle Austauscher eine Säule vom JO ml Inhalt gefüllt· O»5 g der Steptokokkensubs tanz werden in 10 ml Puffer hei pH 7 Ό gel&t, die schwache Trübung dureM 15-minütiges,Zentrifugieren bei 20 000 Umdrehungen entfernt land auf die AustataDliersäule gegeben. Die Säule wird mit Puffer von pH 3,0 solange gewaschen, bis das Eluat eisen pH>¥ert von J1O erreicht hat. Danach wird mit dem gleichen Puffer, dem J % NaCl zugesetzt worden sind, desorbiert. Bie ersten 20 ml des Eluates werden verworfen, die folgenden ®O ml w&ru*n aufgefangen und 2h Stunden gegen dest· ^&amms· bei 4 C dialysieirt. Nach dieser Zeit können keine ChI#ifiassem taahr nachgewieeen werden· Die Suspension wird daraufhin iHfoex*. Blaug·! getrocknet.Minutes the excess X. solution is decanted and. a column of JO ml content is filled with the reciprocating exchanger. 5 g of the steptococcal substance are dissolved in 10 ml of buffer at pH 7, the slight turbidity is 15 minutes away by centrifugation at 20,000 revolutions and placed on the AustataDler column. The column is washed with buffer of pH 3.0 until the eluate iron pH> ¥ ert of J 1 O has reached. It is then desorbed with the same buffer to which J % NaCl has been added. The first 20 ml of the eluate are discarded, the following ®O ml are collected and dialyzed for 2 hours against distilled water at 4 ° C. After this time no ChI # ifiassem taahr can be re-weighed · The suspension will then iHfoex *. Blue ·! dried.
BAD ORIGINALBATH ORIGINAL
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