DE1593917C - Process for biochemical demethoxylation - Google Patents
Process for biochemical demethoxylationInfo
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Description
In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse von durchgeführten Versuchen zusammengefaßt.The results of tests carried out are summarized in the following table.
Verbindungconnection
Verwendeter MikroorganismusUsed microorganism
FermentationsprodukteFermentation products
H3COH 3 CO
H,COH, CO
HOHO
HOHO
OHOH
OCH,OCH,
Y.Y.
CHOCHO
OHOH
OCH,OCH,
CHOCHO
OHOH
OCH,OCH,
CHOCHO
OHOH
OCH,OCH,
1. Saccharomyces sake ATCC 200181. Saccharomyces sake ATCC 20018
2. Saccharomyces sp. ATCC 200172. Saccharomyces sp. ATCC 20017
3. Torula utilis ATCC 152393. Torula utilis ATCC 15239
4. Saccharomyces cerevisiae ATCC 152484. Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248
.1. Saccharomyces sake ATCC 20018.1. Saccharomyces sake ATCC 20018
1. Saccharomyces sake ATCC 200181. Saccharomyces sake ATCC 20018
2. Torula utilis ATCC 152392. Torula utilis ATCC 15239
1. Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 (Oberflächenfermentation)1. Saccharomyces cerevisiae ATCC 15248 (surface fermentation)
L- Saccharomyces' sakeL- Saccharomyces' sake
ATCC 20018 2. Torula utilisATCC 20018 2. Torula utilis
ATCC 15239ATCC 15239
1. Saccharomyces sake ATCC 200181. Saccharomyces sake ATCC 20018
1. p-Hydroxybenzoesäure1. p-hydroxybenzoic acid
2. p-Hydroxybenzäldehyd2. p-hydroxybenzaldehyde
3. p-Hydroxybenzylalkohol3. p-hydroxybenzyl alcohol
4. Vanillylalkohol4. Vanillyl alcohol
5. Vanillinsäure5. Vanillic acid
1. p-Hydroxybenzoesäure1. p-hydroxybenzoic acid
2. unbestimmte Substanz2. indefinite substance
1. p-Hydroxybenzoesäure1. p-hydroxybenzoic acid
2. p-Hydroxybenzaldehyd2. p-hydroxybenzaldehyde
3. 3,5-Dimethoxy-4-oxybenzylalkohol 3. 3,5-dimethoxy-4-oxybenzyl alcohol
4. 3,5-Dimethoxy-4-oxybenzoe-4. 3,5-dimethoxy-4-oxybenzoic
säureacid
1. p-Hydroxybenzoesäure1. p-hydroxybenzoic acid
2. unbestimmte Substanz2. indefinite substance
1. 3,4-Dihydroxybenzoesäure1. 3,4-dihydroxybenzoic acid
2. 3,4-Dihydroxybenzaldehyd2. 3,4-dihydroxybenzaldehyde
3. 3,4-Dihydroxybenzylalkohol3. 3,4-dihydroxybenzyl alcohol
4. 3-Methoxy-4,5-dioxybenzylalkohol 4. 3-methoxy-4,5-dioxybenzyl alcohol
5. 3-Methoxy-4,5-dioxybenzoesäure 5. 3-methoxy-4,5-dioxybenzoic acid
1. 3,4-Dihydroxybenzoesäure1. 3,4-dihydroxybenzoic acid
2. unbestimmte Substanz2. indefinite substance
COOHCOOH
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die aerobe Kultur eines der genannten Mikroorganismen in einem geeigneten Kulturmedium, welches die durch die obige allgemeine Formel wiedergegebenen Verbindungen enthält, eine Entmethoxylierung der Verbindung in Stellung 3 oder den Stellungen 3 und 5 zur Folge hat. Das gebildete Produkt wird dann im Kulturmedium angehäuft.The above results show that the aerobic culture of one of the named microorganisms in a suitable culture medium containing the compounds represented by the above general formula contains, a demethoxylation of the compound in position 3 or positions 3 and 5 has the consequence. The product formed is then accumulated in the culture medium.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben auf das Gewicht.The following examples further illustrate the invention. Unless otherwise stated, refer to the percentages based on weight.
Einem Kulturmedium aus 100 g Glucose, 2,5 g L-Asparagin, 1,0 g Kaliumdihydrogenphosphat, 3,0 g Magnesiumsulfatheptahydrat und 11 Leitungswasser werden 0,1 g Vanillin zugesetzt. Der pH-Wert des Mediums wird auf 4 bis 5 eingestellt. Dann werden 100 ml einer sporenhaltigen Lösung von Saccharomyces sake ATCC 20018, der getrennt im gleichen Kulturmedium wie oben beschrieben, aber in Abwesenheit von Vanillin gezüchtet wurde, dem Medium zugesetzt.A culture medium composed of 100 g glucose, 2.5 g L-asparagine, 1.0 g potassium dihydrogen phosphate, 3.0 g Magnesium sulfate heptahydrate and 11 tap water are added to 0.1 g vanillin. The pH of the medium is set to 4 to 5. Then 100 ml of a spore-containing solution of Saccharomyces sake ATCC 20018, separately in the same culture medium as described above, but in the absence from vanillin was added to the medium.
Das erhaltene Gemisch wird unter aerobem Schütteln 5 Tage bei einer Temperatur zwischen 28 und 30° C gehalten. Dann wird zentrifugiert. Die so erhaltene obere klare Lösungsschicht wird mit 1 g Kaliumhydroxyd gemischt und dann unter vermindertem Druck auf etwa 200 ml eingeengt. Der Rückstand wird mit Schwefelsäure angesäuert und mit Äther kontinuierlich 2 Tage lang extrahiert, um die Fermentationsprodukte zu sammeln. Der Hauptteil des Lösungsmittels wird abdestilliert, und die konzentrierte Ätherlösung wird mit einer kleinen Menge einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung geschüttelt, um die sauren und die neutralen Komponenten zu trennen. Die in der gesättigten Natriumbicarbonatlösung gelöste saure Phase wird mit Schwefelsäure etwas stärker angesäuert und dann mit Äther extrahiert. Man erhält so ungefähr 0,08 g Extrakt. The mixture obtained is with aerobic shaking for 5 days at a temperature between 28 and Maintained 30 ° C. Then it is centrifuged. The upper clear solution layer thus obtained is treated with 1 g of potassium hydroxide mixed and then concentrated to about 200 ml under reduced pressure. The residue will acidified with sulfuric acid and extracted with ether continuously for 2 days to collect the fermentation products. The main part of the solvent is distilled off, and the concentrated ethereal solution is saturated with a small amount of a Sodium bicarbonate solution shaken to separate the acidic and neutral components. the The acidic phase dissolved in the saturated sodium bicarbonate solution becomes somewhat stronger with sulfuric acid acidified and then extracted with ether. About 0.08 g of extract is obtained in this way.
Die extrahierten Produkte werden papierchromatographisch untersucht. Hierbei werden die extrahierten. Produkte auf der Breitseite eines Filterpapiers aufgetragen, und die aufsteigende Entwicklung des Chromatogramms wird mit 1,5 n-Ammoniak-gesättigtem n-Butanol dreimal wiederholt. Durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht von 2536 Ä können zwei getrennte Absorptionsbanden, eine obere und eine untere, unterschieden werden. Aus diesen beiden Banden lassen sich zwei verschiedene Arten von sauren Produkten isolieren.The extracted products are examined by paper chromatography. The extracted. Products applied to the broad side of a filter paper, and the ascending development of the chromatogram is repeated three times with 1.5 n-ammonia-saturated n-butanol. By exposure to Ultraviolet light of 2536 Å can have two separate absorption bands, an upper and a lower, can be distinguished. From these two bands we can identify two different types of acidic products isolate.
Etwa 0,06 g des aus der oberen Bande erhaltenen Rohproduktes werden durch Sublimation unter vermindertem Druck gereinigt. Dann werden Elementaranalyse, Schmelzpunktmessung, Mischverbindungsuntersuchungen und Messungen der UV- und Infrarotspektren durchgeführt. Die Ergebnisse sind wie folgt: Schmelzpunkt 211°C. Der Mischschmelzpunkt mit einer reinen Probe von p-Hydroxybenzoesäure ergibt keine Schmelzpunkterniedrigung. Die durch Elementaranalyse und Infrarotanalyse erhaltenen Werte stimmen gut überein. Außerdem stimmen die Infrarot- und Ultraviolettspektren vollständig überein, auch in den Einzelheiten. Auf diese Weise wurde das eine der isolierten Produkte als p-Hydroxybenzoesäure identifiziert. Das andere isolierte Produkt erwies sich als Vanillinsäure.About 0.06 g of the crude product obtained from the upper band are reduced by sublimation Pressure cleaned. Then elemental analysis, melting point measurement, mixed compound investigations and measurements of the UV and infrared spectra were carried out. The results are like follows: melting point 211 ° C. The mixed melting point with a neat sample of p-hydroxybenzoic acid does not result in a lowering of the melting point. Those obtained by elemental analysis and infrared analysis Values agree well. In addition, the infrared and ultraviolet spectra completely agree, also in the details. In this way, it became one of the isolated products as p-hydroxybenzoic acid identified. The other isolated product was found to be vanillic acid.
Der nach der Entfernung der sauren Komponenten mit der gesättigten Natriumbicarbonatlösung verbliebene Ätherextrakt wird ebenfalls papierchromatographisch unter Verwendung von Filterpapier untersucht. Nach aufsteigender Entwicklung mit 1,5 n-Ammoniak-gesättigtem n-Butanol über Nacht wurden p-Nitroanilindiazoniumchlorid und 2,4-Dinitrophenylhydrazin aufgesprüht. Hierbei wurde die Bildung von p-Hydroxybenzylalkohol, p-Oxybenzaldehyd und Vanillylalkohol nachgewiesen. Von Vanillin konnten keine Spuren mehr gefunden werden.That remaining after removing the acidic components with the saturated sodium bicarbonate solution Ether extract is also examined by paper chromatography using filter paper. After increasing development with 1.5 n-ammonia-saturated n-butanol overnight p-nitroanilinediazonium chloride and 2,4-dinitrophenyl hydrazine sprayed on. This resulted in the formation of p-hydroxybenzyl alcohol, p-oxybenzaldehyde and Vanillyl alcohol detected. No more traces of vanillin could be found.
1 kg Glucose, 25 g L-Asparagin, 10 g Kaliumdihydrogenphosphat, 30 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 1 g Vanillin und 10 1 Leitungswasser wurden gemischt und auf einen pH-Wert von 4 bis 5 eingestellt. Dieses Kulturmedium wurde in eine 201 fassende, gläserne.1 kg glucose, 25 g L-asparagine, 10 g potassium dihydrogen phosphate, 30 g magnesium sulfate heptahydrate, 1 g of vanillin and 10 1 of tap water were mixed and adjusted to a pH of 4 to 5. This Culture medium was in a 201-capacity, glass.
Fermentierungsflasche gebracht. Dann wurde 1 1 einer sporenhaltigen Lösung von Saccharomyces sake ATCC 20018 zugesetzt, welcher als getrennte Reinkultur im oben beschriebenen Medium, jedoch in Abwesenheit von Vanillin, gezüchtet worden war.Brought fermentation bottle. Then 1 l of a spore-containing solution of Saccharomyces sake ATCC 20018 was added, which was produced as a separate pure culture in the medium described above, but in Absence of vanillin that had been grown.
Das erhaltene Gemisch wird 5 Tage lang unter Durchleiten von sterilisierter Luft mit einer Geschwin-. digkeit von 10 l/min kultiviert. Die so erhaltene Fermentationslösung wird wie im Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet, wobei 0,55 g p-Hydroxybenzoesäurekristalle erhalten werden.The mixture obtained is for 5 days with the passage of sterilized air at a speed. cultivated at a rate of 10 l / min. The fermentation solution thus obtained is worked up as described in Example 1, with 0.55 g of p-hydroxybenzoic acid crystals can be obtained.
100 g Glucose, 2,5 g L-Asparagin, 1,0 g Kaliumdihydrogenphosphat, 3,0 g Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,1 g Vanillin und 11 Leitungswasser werden gemischt. Der pH-Wert der Lösung wird auf 4 bis 5 eingestellt. Dem Kulturmedium werden dann 100 ml einer sporenhaltigen Lösung von Torula utilis ATCC 15239 zugesetzt, welcher im gleichen Medium wie oben beschrieben, aber in Abwesenheit von Vanillin als Reinkultur gezüchtet wurde. Das erhaltene Gemisch wird unter aerobem Schütteln 5 Tage bei einer Temperatur zwischen 28 und 30° C gehalten.100 g glucose, 2.5 g L-asparagine, 1.0 g potassium dihydrogen phosphate, 3.0 g magnesium sulfate heptahydrate, 0.1 g vanillin and 11 tap water are mixed. The pH of the solution is adjusted to 4 to 5 set. 100 ml of a spore-containing solution of Torula utilis ATCC are then added to the culture medium 15239 added, which in the same medium as described above, but in the absence of vanillin was grown as a pure culture. The resulting mixture is stirred for 5 days with aerobic shaking Maintained temperature between 28 and 30 ° C.
Nach Behandlung der erhaltenen Fermentationslösung, wie im Beispiel 1 beschrieben, werden 0,04 g p-Hydroxybenzoesäure erhalten.After treating the fermentation solution obtained, as described in Example 1, 0.04 g obtained p-hydroxybenzoic acid.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren durchge-. ,.führte Kultivierung erfolgt in an sich bekannter Weise:The durchge- in the method according to the invention. , .guided cultivation takes place in a manner known per se:
Das heißt, sie wird unter aeroben Bedingungen, beispielsweise aerobem Schütteln der Kultur oder Rühren einer Submerskultur bei einer Temperatur von etwa 28 bis 35° C und einem pH-Wert von etwa 3,5 bis 6,0 durchgeführt. Als Nährmedium eignet sich sowohl ein synthetisches als auch ein natürliches, solange es die essentiellen Nährstoffe für das Wachstum des speziell verwendeten Stammes enthält. Diese Nährstoffe sind bekannt und umfassen solche Stoffe wie einen Kohlenstofflieferanten, einen Stickstofflieferanten und anorganische Verbindungen, die von dem verwendeten Mikroorganismus in entsprechenden Mengen benötigt werden. Als Kohlenstofflieferanten können beispielsweise Kohlehydrate wie Glucose, Fructose, Maltose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat und Melasse oder andere geeignete Kohlenstoffquellen wie Glycerin und organische Säuren angeführt werden. Diese Substanzen können entweder einzeln oder als Gemische von zwei oder mehreren davon verwendetThat is, it is carried out under aerobic conditions such as aerobic shaking of the culture or stirring a submerged culture at a temperature of about 28 to 35 ° C and a pH of about 3.5 to 6.0 accomplished. Both a synthetic and a natural nutrient medium are suitable as long as it is contains the essential nutrients for the growth of the particular strain used. These nutrients are known and include such substances as a carbon supplier, a nitrogen supplier and inorganic compounds obtained from the microorganism used in appropriate amounts are needed. Carbohydrates such as glucose, fructose, Maltose, sucrose, starch, starch hydrolyzate and molasses or other suitable carbon sources such as glycerine and organic acids are cited. These substances can either be used individually or as Mixtures of two or more thereof are used
werden. Als Stickstofflieferanten können verschiedene Arten von anorganischen oder organischen Salzen oder Verbindungen, wie Harnstoff oder Ammoniumsalze wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumphosphat oder eine oder mehrere Aminosäuren als Gemisch oder natürliche stickstoffhaltige Substanzen, wie Maiswasser, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Fischmehl, Caseinhydrolysat und Fischsolubles (Konzentrat von wasserlöslichen Komponenten von Fischfleisch, das organischen Stickstoff enthält) verwendet werden. Der Stickstofflieferant kann aus einer einzigen Substanz oder einem Gemisch von zwei oder mehreren bestehen. Zu den anorganischen Verbindungen, die dem Kulturmedium zugesetzt werden können, gehören Magnesiumsulfat, Natriumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, iKaliummonohydrogenphosphat, Eisensulfat oder andere Eisensalze, Mangansalze, Manganchlorid und Calciumchlorid. Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu entmethoxylierende Verbindung .· wird vorteilhaft dem Kulturmedium in einer Menge zwischen 0,0001 und 1 Gewichtsprozent zugesetzt.will. Various types of inorganic or organic nitrogen can be used as nitrogen suppliers Salts or compounds such as urea or ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate, Ammonium nitrate and ammonium phosphate or one or more amino acids as a mixture or natural nitrogenous substances such as corn water, yeast extract, meat extract, peptone, fish meal, Casein hydrolyzate and fish solubles (concentrate of water-soluble components of fish meat, containing organic nitrogen). The nitrogen supplier can come from a single Substance or a mixture of two or more. Among the inorganic compounds that May be added to the culture medium include magnesium sulfate, sodium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, i Potassium monohydrogen phosphate, iron sulfate or other iron salts, manganese salts, manganese chloride and calcium chloride. The in Compound to be demethoxylated according to the invention. · is advantageously added to the culture medium in added in an amount between 0.0001 and 1 percent by weight.
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