DE1467878C3

DE1467878C3 - Process for the preparation of a medicament from porcine pancreas

Info

Publication number: DE1467878C3
Application number: DE19641467878
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: Eurorga S.A., Villeras, Saclay, Seine-et-Oise (Frankreich)
Priority date: 1963-04-25
Filing date: 1964-04-24
Publication date: 1978-01-19

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes für die Humantherapie aus Schweinepankreas, wobei der vom Tierkörper abgetrennte Pankreas von unerwünschten Bestandteilen gereinigt, in kleine Teile zerlegt, gefroren und lyophilisiert wird.The present invention is a method for producing a medicament for Human therapy from pig pancreas, whereby the separated pancreas from the animal body of undesired Components cleaned, broken down into small parts, frozen and lyophilized.

Es gibt zahlreiche pharmazeutische Pankreaspräparate. Einige werden aus getrocknetem und entfettetem Pankreas, wie enzymatische Präparate auf Basis von »Pankreatin«, andere aus gereinigten, aus dem Pankreas extrahierten Enzymen, die Pankreas-»Lepase« enthalten, hergestellt.There are numerous pharmaceutical pancreatic preparations available. Some are made from dried and defatted pancreas, such as enzymatic preparations based on "Pancreatin", others from purified enzymes extracted from the pancreas that contain pancreatic "lepase", manufactured.

So wird in der GB-PS 1 88 660 ein Pankreaspräparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung beschrieben, wobei das Verfahren darin besteht, daß man den gemahlenen Pankreas zwecks Entwässerung zur Erzielung eines trockenen Produktes mit wasserfreien Salzen, wie gebranntem Gips, wasserfreiem Natriumsulfat, Ammoniumchlorid, wasserfreiem Magnesiumsulfat oder wasserfreiem Natriumphosphat, verreibt, wobei ein fast trockenes Pulver erhalten wird, das Produkt bei tiefen Temperaturen trocknet und zerkleinert Ein gemäß diesem Verfahren erhaltenes Produkt, das aus zermahlenem Pankreas, gebranntem Gips und verschiedenen wasserfreien Salzen in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen besteht, kann in der Humantherapie kaum Verwendung rinden, da es zumindest unverdaulich ist, sicher stark abführend wirkt und sehr wahrscheinlich toxisch ist Dieses Entwässerungsverfahren ist in der pharmazeutischen Industrie zur Erzielung wirksamer Präparate keinesfalls anwendbar.For example, GB-PS 1 88 660 describes a pancreatic preparation and a process for its production, the method consisting in taking the ground pancreas for dehydration to obtain a dry product with anhydrous salts, such as plaster of paris, anhydrous sodium sulfate, Ammonium chloride, anhydrous magnesium sulfate or anhydrous sodium phosphate, triturated, whereby an almost dry powder is obtained, the product dries and crushes at low temperatures Product obtained according to this process consisting of ground pancreas, plaster of paris and various Anhydrous salts in different mixing ratios can be used in human therapy Bark hardly any use, because it is at least indigestible, certainly has a strong laxative effect and very This dehydration method is likely to be toxic in the pharmaceutical industry to achieve effective preparations in no way applicable.

Das aus der DT-PS 8 75 640 bekannte Verfahren, wobei dem bei der Insulinextraktion aus zerkleinerten frischen oder wohlkonservierten Pankreasdrüsen mit saurem Alkohol oder Aceton angefallenen Rückstand die Enzyme mittels eines wäßrigen Mediums, worin gegebenenfalls anwesender Alkohol oder Aceton mit einer Konzentration unterhalb 60 Volumenprozent enthalten ist, entzogen wird, resultiert in der Gewinnung von proteolytischen Pankreasenzymen aus Säugetieren.The method known from DT-PS 8 75 640, where the crushed in the insulin extraction fresh or well-preserved pancreatic glands with acidic alcohol or acetone residue the enzymes by means of an aqueous medium, in which alcohol or acetone may be present with a concentration below 60 percent by volume, is withdrawn, results in recovery of mammalian pancreatic proteolytic enzymes.

In der Pharmacopoea gallica (Codex von 1937 und 1949) wird das Pankreatin als das Produkt definiert, das erhalten wird, wenn man den Brei von Schweinepankreas bei niedriger Temperatur trocknet und anschließend durch Behandlung mit Äther die Fettstoffe entfernt und das Material pulverisiert. Auch das »Dispensatory of the USA (based on the 12th revision of the US. Pharmacopoea, the National Formulary, 7th edition, and the British Pharmacopoea 1932 and addenda)« gibt an, daß nach der britischen Pharmacopoea das Pankreatin aus frischem Pankreas gewisser, üblicherweise für Ernährungszwecke verwendeter Tiere durch Extraktion mittels 4 Teilen 25prozentigen Alkohols auf einen Teil Pankreas hergestellt werden kann.In the Pharmacopoea gallica (Codex of 1937 and 1949) pancreatin is defined as the product that obtained by drying the porcine pancreas porridge at a low temperature and then drying it the fatty substances are removed by treatment with ether and the material is pulverized. The “Dispensatory of the USA (based on the 12th revision of the US. Pharmacopoea, the National Formulary, 7th edition, and the British Pharmacopoeia 1932 and addenda) «states that according to the British Pharmacopoeia, pancreatin from the fresh pancreas of certain animals commonly used for nutritional purposes by extraction can be prepared using 4 parts of 25 percent alcohol per part of pancreas.

Klinische Versuche haben ergeben, daß Präparate aus frischem vollständigem Pankreas bei schweren chronischen Pankreasentzündungen wirksam sind, während die Pankreatinpräparate nicht wirksam sind.Clinical trials have shown that preparations from fresh whole pancreas can be used in severe chronic Pancreatitis is effective while the pancreatin supplements are ineffective.

Man muß annehmen, daß gewisse wertvolle Bestandteile des frischen vollständigen Pankreas durch die Arbeitsgänge, die bei der Herstellung von Pankreatin notwendig sind, zerstört, inaktiviert oder beseitigt werden.It must be assumed that certain valuable constituents of the fresh whole pancreas are caused by the Processes that are necessary in the production of pancreatin are destroyed, inactivated or eliminated will.

Ferner wurde durch zahlreiche Arbeiten über enzymatische Stoffe des Pankreas gezeigt, daß es keine einheitliche Lipase im Pankreas gibt; es finden sich dort alle Arten von spezifischen oder nicht spezifischen Esterasen, wasserlösliche oder fettlösliche echte Lipasen und Lipoprotein-Lipasen, d. h. Verbindungen von echten Lipasen und Proteasen, insbesondere Collagenasen, speziell die Elastase des Pankreas.Furthermore, it has been shown by numerous works on enzymatic substances in the pancreas that there are none gives uniform lipase in the pancreas; there are all kinds of specific and non-specific Esterases, water-soluble or fat-soluble true lipases and lipoprotein lipases, d. H. Connections from real lipases and proteases, especially collagenases, especially the elastase of the pancreas.

Es ist möglich, daß die Abwesenheit einer oder mehrerer der vorstehend genannten Substanzen in den bekannten Medikamenten eine Erklärung für ihre Unwirksamkeit bei der Behandlung von Kranken darstellt, die unter schwerer chronischer Pankreatitis leiden, denn das Einnehmen von rohem Pankreas beseitigt die Wirkungen der totalen Pankreatectomie bei Tieren und vermindert oder beseitigt die Folgen der chronischen Pankreatitis (Ausscheidung von Nahrungsfetten und -proteiden im Stuhl). Nun ist es einerseits für die Kranken schwierig, sich jeden Tag die erforderliche Radon an frischem Schweinepankreas (ein Pankreas von 60 bis 80 g) zu beschaffen, andererseits wird infolge des abstoßenden Aussehens, des unangenehmen Geschmacks, der sich kaum überdecken läßt, und der Verderblichkeit diese Behandlung nur angewendet, wenn ein Überleben nur um diesen Preis möglich ist.It is possible that the absence of one or more of the substances mentioned above in the known drugs explain their ineffectiveness in treating the sick who suffer from severe chronic pancreatitis from ingesting raw pancreas eliminates the effects of total pancreatectomy in animals and diminishes or eliminates the consequences of chronic pancreatitis (excretion of dietary fats and proteins in the stool). Now it's the one for the sick find it difficult to get the required radon every day from fresh pig pancreas (a pancreas from 60 to 80 g), on the other hand, due to the repulsive appearance, the unpleasant taste, which can hardly be covered up, and the perishability of this treatment only applied when survival is only possible at this price.

Gemäß der vorliegenden Erfindung sollen diese Unannehmlichkeiten beseitigt werden und ein Medikament in Form eines Pulvers hergestellt werden, das unverändert d. h. insbesondere ohne enterischen Überzug eingenommen werden kann, und das aus noch ungeklärten Gründen ein unerwartetes Heilvermögen aufweistAccording to the present invention, this inconvenience is to be eliminated and a medicament be produced in the form of a powder that remains unchanged d. H. especially without an enteric coating can be taken, and for reasons that are still unexplained, it has an unexpected healing power having

In der CH-PS 2 83 588 wird zwar ein Verfahren zur Konservierung von Organzellenpräparaten durch Entwässern mittels Lyophilisieren beschrieben, gemäß welchem die Organe nach Entfernung aus dem Tierkörper von unerwünschten Bestandteilen, wie Fettschicht gereinigt in kleine Teile zerlegt gefroren und lyophilisiert werden, doch weisen auch die gemäß diesem Verfahren hergestellten Präparate, wie durchIn CH-PS 2 83 588, a process for the preservation of organ cell preparations by dehydration is disclosed described by means of lyophilization, according to which the organs after removal from the Carcasses of unwanted components, such as fat layer, cleaned and frozen broken down into small pieces and lyophilized, but the preparations made according to this process also have, as by

Vergleich gezeigt wird, nicht die Wirksamkeit der Produkte auf, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden.Comparison does not show the effectiveness of the products after the invention Process are produced.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Medikamentes aus Schweinepankreas, wobei der vom Tierkörper abgetrennte Pankreas von unerwünschten Bestandteilen gereinigt, in kleine Teile zerlegt, gefroren und lyophilisiert wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß man den vollständigen, frischen und nicht entfetteten, spätestens eine Viertelstunde nach dem Schlachten vom Tierkörper abgetrennten Schweinepankreas zur Stabilisierung auf eine Temperatur von nicht über 8° C abkühlt, durch Vermählen zerkleinert, wobei die Temperatur nicht über 15° C steigen darf, dem gemahlenen Pankreas etwa 30 bis 100 Gew.-% Eiswasser zusetzt, das gegebenenfalls aromatisiert wurde, die erhaltene Mischung mit einem Turbomahlwerk zerkleinert und das emulgierte Produkt spätestens zwei Stunden nach dem Schlachten zur Lyophilisieren einfriert.The inventive method for producing a medicament from pig pancreas, wherein the Pancreas separated from the carcass cleaned of unwanted components, into small parts is disassembled, frozen and lyophilized, is characterized in that the whole, fresh and not defatted, separated from the carcass no later than 15 minutes after slaughter Cool the pig pancreas to a temperature not exceeding 8 ° C for stabilization by grinding crushed, whereby the temperature must not rise above 15 ° C, the ground pancreas about 30 to 100 % By weight ice water is added, which has optionally been flavored, the mixture obtained with a Turbo grinder crushed and the emulsified product no later than two hours after slaughtering Lyophilize freezes.

Unter vollständigem Pankreas ist die ganze Drüse zu verstehen, von der lediglich das Fett und die Gewebe abgetrennt werden, die ihr außen anhängen und keinen Teil der Drüse bilden. Die Eigenschaft »frisch« bedeutet, daß die Drüse so bald als möglich nach der Entnahme aus dem gerade geschlachteten Schweinekörper lyophilisiert werden soll. In der Praxis wird ein Pankreas als frisch angesehen, der spätestens eine Viertelstunde nach dem Schlachten von dem Tierkörper abgetrennt, dann auf eine 8° C nicht übersteigende Temperatur zur Stabilisierung abgekühlt und spätestens zwei Stunden nach dem Schlachten für die Lyophilisierung eingefroren wurde.Complete pancreas means the whole gland, of which only the fat and tissues which are attached to the outside and do not form part of the gland. The attribute "fresh" means that the gland lyophilize as soon as possible after removal from the pig carcass that has just been slaughtered shall be. In practice, a pancreas is considered fresh, a quarter of an hour later at the latest separated from the carcass after slaughter, then to a temperature not exceeding 8 ° C Stabilization cooled and frozen for lyophilization no later than two hours after slaughter would.

Erfindungsgemäß wird vorzugsweise wie folgt verfahren: According to the invention, the procedure is preferably as follows:

Frischer Schweinepankreas, der sofort nach dem Schlachten entnommen wird, wird von anhängendem Fett und anhängenden Geweben gereinigt. Ohne zwischenzeitliches Einfrieren, jedoch nach Kühlen auf eine Temperatur nicht über +8⁰C, wird der auf diese Weise zugerichtete Pankreas in einem Mahlwerk behandelt, wobei die Temperatur nicht über +15° C ansteigen darf, dann wird dem .beim Mahlen erhaltenen Produkt Eiswasser, das möglicherweise aromatisiert ist, in einer Menge von 30 bis 100 Gew.-%, vorzugsweise etwa 50 Gew.-%, bezogen auf das Produkt, zugesetzt. Es ist vorteilhaft, auch etwa 1 bis 10 Gew.-% Lactose zuzusetzen, wodurch die Sublimierung während' der, Lyophilisierung sowie die endgültige Zerkleinerung erleichtert wird. Die Gegenwart von Lactose im Endprodukt ist auf die Wirksamkeit des Präparates ohne Einfluß; die Verwendung von 1 bis 10% Lactose ist zwar verfahrenstechnisch vorteilhaft, jedoch nicht zwingend notwendig.Fresh pig pancreas removed immediately after slaughter is cleaned of attached fat and tissues. Without intermittent freezing, but after cooling to a temperature not above +8 ⁰ C, the pancreas prepared in this way is treated in a grinder, the temperature must not rise above + 15 ° C, then the product obtained during grinding becomes ice water , which may be flavored, is added in an amount of 30 to 100% by weight, preferably about 50% by weight, based on the product. It is advantageous also to add about 1 to 10% by weight of lactose, which facilitates sublimation during the "lyophilization" as well as the final comminution. The presence of lactose in the end product has no effect on the effectiveness of the preparation; the use of 1 to 10% lactose is advantageous in terms of process technology, but not absolutely necessary.

Es ist auch möglich, anstelle von Laktose oder zusätzlich zu Lactose Ascorbinsäure in einer Menge von etwa 0,1 Gew.-%, bezogen auf das anfängliche Gewicht des Pankreas, zuzusetzen. It is also possible to add ascorbic acid in an amount of about 0.1% by weight, based on the initial weight of the pancreas, instead of lactose or in addition to lactose .

Die Mischung wird danach in ein feineres Mahlwerk gebracht, so daß eine außerordentlich feine und gleichmäßige flüssige Paste erhalten wird. Diese Paste wird im Hinblick auf die Lyophiiisierung direkt in Form von Platten eingefroren. Dieses Einfrieren kann bei -40⁰C erfolgen, genauso wie die Sublimierung der vereisten Substanz, die unter Vakuum bis zur vollständigen Dehydratisierung des Produktes durchgeführt wird.The mixture is then brought into a finer grinder so that an extremely fine and uniform liquid paste is obtained. This paste is frozen directly in the form of plates with a view to lyophilization. This freezing can be carried out at -40 ⁰ C, as well as the sublimation of icy substance that is carried out under vacuum until complete dehydration of the product.

Die lyophilisierten Pankreaskuchen werden anschließend (ohne Entfettung) gemahlen, so daß ein vollständiges Pankreaspräparat erhalten wird, in dem alle Eigenschaften des frischen Pankreas erhalten sind. Das erhaltene Pulver kann gesiebt und in Fläschchen gefüllt werden, die unter Vakuum oder einem inerten Gas geschlossen werden und mit einem dehydratisierenden Stopfen versehen sind.The lyophilized pancreatic cakes are then ground (without degreasing) so that a complete Pancreatic preparation is obtained in which all the properties of the fresh pancreas are preserved. The obtained powder can be sieved and filled into vials under vacuum or an inert gas closed and fitted with a dehydrating stopper.

Zur Aromatisierung kann das eingesetzte Eiswasser mit frisch ausgepreßtem Orangensaft versetzt werden.Freshly squeezed orange juice can be added to the ice water used for flavoring.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.The following example illustrates the invention.

example

Frischer Pankreas, der aseptisch gewonnen und gekühlt worden ist, wird zunächst in einem Turbomahlwerk mit einer Lochplatte mit 2 mm großen Löchern gemahlen. Infolge eines sehr schnellen Durchgangs ist die Ausgangstemperatur des Mahlguts wenig höher als die Eingangstemperatur (beispielsweise 14°C anstelle von 8° C).Fresh pancreas that has been aseptically collected and cooled is first placed in a turbo grinder ground with a perforated plate with 2 mm holes. As a result of a very fast passage it is the outlet temperature of the grist is slightly higher than the inlet temperature (for example 14 ° C instead of of 8 ° C).

Das Mahlgut wird anschließend mit 25 Gew.-% Wasser (davon 10% in Form von Eis), 2,5% Lactose und 0,1% Ascorbinsäure versetzt. Um das Präparat zu aromatisieren, setzt man zu diesem Zeitpunkt 30 Gew.-% frisch ausgepreßten Orangensaft zu.The grist is then with 25 wt .-% water (10% of which in the form of ice), 2.5% lactose and 0.1% ascorbic acid added. In order to flavor the preparation, one sets 30 at this point in time % By weight of freshly squeezed orange juice.

Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird wieder in das Turbomahlwerk KS gebracht, das diesmal jedoch mit einer Lochplatte mit einem Lochdurchmesser von 0,8 mm versehen ist, und das die Zerkleinerung der Fasern beendet und die ganze Masse innig emulsioniert (das Eis verhindert hierbei jede Erwärmung). The suspension obtained in this way is brought back into the turbo grinder KS, this time However, it is provided with a perforated plate with a hole diameter of 0.8 mm, and that the comminution the fibers are finished and the whole mass is intimately emulsified (the ice prevents any warming).

Die Suspension wird nun in Schalen gebracht und in zwei Stunden in einem Gefriergefäß, das bei — 6O⁰C gehalten wird, auf -40⁰C gefroren.The suspension is then placed on trays and in two hours in a freezer vessel at - Frozen held 6O ⁰ C to -40 ⁰ C.

Die Schalen werden in eine Sublimierungsvorrichtung gestellt, in der die folgenden Bedingungen herrschen:The trays are placed in a sublimation machine in which the following conditions are met:

1. Teildruck in der Größenordnung von 0,2 mm Hg,1. partial pressure of the order of 0.2 mm Hg,

2. Temperatur des Produktes auf -30⁰C eingestellt. Die Sublimationsdämpfe kondensieren an einer2. Temperature of the product to -30 ⁰ C. The sublimation vapors condense on one

Kühlschlange bei — 6O⁰C. Eine elektrische Heizung gleicht die Wärmeverluste durch Sublimierung aus. Es stellt sich ein Gleichgewicht ein, das die Einhaltung einer konstanten Temperatur ermöglicht. Nachdem die eigentliche Sublimierung (etwa 20 Stunden) beendet ist, beträgt die restliche Feuchtigkeit noch 4 bis 5%.Cooling coil at - 6O ⁰ C. An electric heater compensates for the heat losses through sublimation. An equilibrium is established which enables a constant temperature to be maintained. After the actual sublimation has ended (around 20 hours), the remaining moisture is 4 to 5%.

Das Pankreasmaterial wird nun auf +35⁰C erwärmt, und der Teildruck wird auf einen Maximalwert von 0,01 mm Hg herabgesetzt Nach Ablauf von 4 Stunden ist die restliche Feuchtigkeit auf etwa 0,5% gefallen.The pancreas material is now heated to +35 ⁰ C, and the partial pressure is reduced to a maximum value of 0.01 mm Hg After 4 hours, the residual moisture has fallen to about 0.5%.

Die Pankreasscheiben werden dann in schmale Streifen geschnitten und in ein Turbinenmahlwerk gebracht. Die zentrale Turbine wirft das Pankreasmaterial gegen einen Rost mit ovalen 0,2 mm χ 0,5 mm großen Löchern und zerkleinert es. Nach einem zweiten Durchgang wird ein feines Pulver erhalten.The pancreatic slices are then cut into narrow strips and placed in a turbine grinder brought. The central turbine throws the pancreatic material against a grate with an oval 0.2 mm χ 0.5 mm large holes and crushed it. A fine powder is obtained after a second pass.

Mit einer Pulverdosiervorrichtung werden Fläschchen mit 10 g gefüllt und anschließend in das Sublimierungsgefäß gestellt Man erzeugt ein Hochvakuum (unter 0,01 mm Hg) und erhitzt 4 Stunden bei 35°C.With a powder dosing device, bottles are filled with 10 g and then placed in the Sublimation vessel placed A high vacuum (below 0.01 mm Hg) is created and heated for 4 hours 35 ° C.

Beim Aufheben des Vakuums läßt man trockenes Argon in das Gefäß ein, wodurch nicht nur jede Wiederaufnahme von Feuchtigkeit (Luftfeuchtigkeit) vermieden, sonderen auch die Desorption erleichtert wird.When the vacuum is broken, dry argon is let into the vessel, which means that not only every Re-absorption of moisture (air humidity) is avoided, but also facilitates desorption will.

Die Fläschchen werden sofort nach der Entnahme mit einer Polyäthylenkappe verschlossen, die mit einer Tablette eines dehydratisierenden Materials versehen sind, und mit einer Aluminiumkapsel umgeben.Immediately after removal, the vials are closed with a polyethylene cap with a Tablet of a dehydrating material are provided and surrounded by an aluminum capsule.

Das erhaltene Produkt hat die Form eines Pulvers, das in einer Menge von etwa 14 g bei Behandlung eines Pankreas von 60 bis 80 g gewonnen wird. Das Verhältnis von Aminstickstoff zu Gesamtstickstoff zeigt, daß die Proteide keine Autolyse erlitten haben. Im allgemeinen beträgt der Gesamtstickstoffgehalt 8,6% ±0,8% und der Gehalt an Lipiden 30,5% ±3%. Ferner wurden bei sechs Präparaten Histamingehalte von 3, 5, 3, 7, 3 bzw. 4γ pro g lyophilisiertes Produkt festgestellt, was weit unter den Werten liegt, die bei handelsüblichen Pankreatinpräparaten erhalten werden.The product obtained is in the form of a powder obtained in an amount of about 14 g when treating a pancreas of 60 to 80 g. The ratio of amine nitrogen to total nitrogen shows that the proteids have not suffered autolysis. In general, the total nitrogen content is 8.6% ± 0.8% and the lipid content is 30.5% ± 3%. In addition, histamine contents of 3, 5, 3, 7, 3 and 4γ per g of lyophilized product were found in six preparations, which is far below the values obtained with commercially available pancreatin preparations.

Das lyophilisierte Pulver des vollständigen Pankreas findet seine Hauptanwendung bei chronischen Pancreatitiszuständen, die eine totale Substitutionstherapie rechtfertigen, denn:The lyophilized powder of the whole pancreas finds its main use in chronic pancreatitis conditions, that justify total substitution therapy because:

— es kann die Drüse bei den schwersten Erkrankungen ergänzen, und das Leben der am stärksten benachteiligten Kranken verändern;- it can complement the gland in the most serious diseases, and life of the most powerful change disadvantaged sick people;

— es kann in den Fällen eingesetzt werden, in denen die anderen im Handel erhätlichen Pankreatinpräparate sich als unzureichend erweisen;- It can be used in cases where the other commercially available pancreatin preparations prove inadequate;

— seine Wirkung ist mit der des frischen Pankreas absolut identisch, an dessen Stelle es infolge der leichten Absorption, guten Konservierung und genauen Dosierung mit Vorteil verwendet wird.- Its action is absolutely identical to that of the fresh pancreas, in the place of which it is due to the ease of absorption, good preservation, and precise dosage is used to advantage.

Es findet weiterhin eine wichtige Anwendung bei Pankreasfisteln, weilIt also has an important application in pancreatic fistulas because

— es imstande ist, die Drüse zur Ruhe zu bringen, wodurch eine rasche Schließung der Fistel möglich wird,- it is able to bring the gland to rest, which allows the fistula to close quickly will,

— und es andererseits vorübergehend die Drüse ersetzt, wodurch die Protein-Lipid-Verdauung sehr verbessert wird.- and on the other hand it temporarily replaces the gland, which makes the protein-lipid digestion very much is improved.

Schließlich kann das lyophilisierte Pulver des vollständigen PankreasFinally, the lyophilized powder can be used for the whole pancreas

— nach Entfernung großer Teile des Pankreas, indem es den exokrinen Mangel mildert, den solche Eingriffe als unmittelbare Folge haben können,- after the removal of large parts of the pancreas, in that it alleviates the exocrine deficiency, which such Interventions as a direct consequence,

— bei der Behandlung der Aerophagie und der Substitutionsbehandlung des senilen Pankreas,- in the treatment of aerophagia and substitution treatment of the senile pancreas,

— wie auch bei starker Unterernäherung infolge funktioneller externer Unzulänglichkeit des Pankreas, die allein durch diätetische Behandlung manchmal nicht kompensiert werden kann,- as in the case of severe shortening due to functional external inadequacy of the pancreas, which sometimes cannot be compensated for by dietary treatment alone,

Anwendung finden.Find application.

Um die volle Wirksamkeit des auf die vorstehende Weise erhaltenen Pulvers zu bewahren, soll es vorzugsweise unverändert, so wie es ist, auf oralem Wege eingenommen werden; man kann es jedoch auch in Form von Körnchen, Tabletten oder Dragees ohne enterischen Überzug verabreichen.In order to retain the full effectiveness of the powder obtained in the above manner, it should preferably to be taken unchanged, as it is, by the oral route; but you can too Administer in the form of granules, tablets or dragees without an enteric coating.

Im allgemeinen werden Dosierungen in der Größenordnung von 10 g pro Tag bei einer totalen Substitutionstherapie und Dosierungen in der Größenordnung von 0,5 bis 1 g pro Tag bei leichteren Beschwerden des Verdauungsweges angewendet.In general, dosages on the order of 10 grams per day will be used for total replacement therapy and dosages of the order of 0.5 to 1 g per day for milder complaints of the Applied to the digestive tract.

Es wurden bereits eine große Anzahl unerwarteter Ergebnisse registriert:A large number of unexpected results have already been registered:

Kranke, die unter schwerer chronischer Pankreatitis litten und bei denen der Pankreas keine Funktion mehr ausübte, mußten täglich eine Insulininjektion erhalten und jeden Tag einen frischen und rohen Schweinepankreas zu sich nehmen. Der letztere wurde durch das vorstehend definierte lyophilisierte Produkt in einer Dosis von 10 bis 14 g pro Tag ersetzt. Dieses Pulver rief bei den Kranken kein Gefühl des Widerwillens wie der rohe Pankreas hervor; sie aßen anscheinend mit größerem Appetit und ihr Allgemeinzustand hatte sich nach einmonatiger Behandlung deutlich verbessert.Sick people who suffered from severe chronic pancreatitis and in whom the pancreas no longer functions exercised had to be injected with insulin every day and a fresh and raw pig pancreas every day to take in. The latter was by the lyophilized product defined above in one Replaced dose of 10 to 14 g per day. This powder did not induce any disgust like that in the sick raw pancreas protruding; they apparently ate with greater appetite and their general condition had deteriorated significantly improved after one month of treatment.

Einer der Kranken unterwarf sich einem Versuch, der darin bestand, daß anstelle des vollständigen Pulvers das gleiche, jedoch mit Petroläther entfettete Pulver verwendet wurde; zwei Tage später wurden unverdaute Fettstücken in seinem Stuhl gefunden. Bei Wiederaufnahme der Behandlung mit dem nicht entfetteten Pulver hatten die Kranken wieder normalen Stuhl (Konsistenz, Geruch, Abwesenheit von unverdautem Fett).One of the patients subjected himself to an experiment which consisted in the fact that instead of the whole powder the the same powder was used but defatted with petroleum ether; two days later they were undigested Pieces of fat found in his stool. When resuming treatment with the non-defatted powder the patient had normal stool again (consistency, smell, absence of undigested fat).

Ferner zeigte das lyophilisierte Pulver des vollständigen Pankreas in einem sehr schweren Fall von chronischer Pankreatitis durch Verkalkung infolge Alkoholismus, bei dem die im Handel erhältlichen Pankreasextrakte (Pankreatin) sich als unzulänglich erwiesen, ganz überraschende Ergebnisse.Further, the lyophilized powder showed the whole pancreas in a very severe case of chronic pancreatitis due to calcification due to alcoholism, in which those commercially available Pancreatic extracts (pancreatin) turned out to be inadequate, with quite surprising results.

Bemerkenswerte Ergebnisse wurden bei der Behandlung von blähender Dyspepsie, Aerocolie, Aerogastrie, Colophanie mit Fermentierung, durch das Pulver erzielt, das ohne Veränderung, so wie es ist, in einer Dosis von 3 bis 5 g eingenommen wurde. Selbst ohne enterischen Überzug sind die in dem Pulver enthaltenen Enzyme also gegen die Zerstörung durch die Verdauungssäfte geschützt.Remarkable results have been obtained in the treatment of flatulent dyspepsia, aerocolie, aerogastria, Colophanie with fermentation, obtained by the powder, which is unchanged as it is, in a dose of 3 until 5 g has been taken. Even without an enteric coating, the enzymes contained in the powder are thus protected against destruction by the digestive juices.

Untersuchungen der Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten Produkte im Vergleich zu gemäß bekannten bzw. gemäß bekannten Verfahren hergestellten Produkten.Investigations of the effectiveness of the products produced according to the invention in comparison to according to known products or products manufactured according to known processes.

1) Im Rahmen der pharmakologischen Experimente mit dem erfindungsgemäßen Präparat und Vergleichspräparaten wurden bei Ratten Leerdarmfilsteln angelegt. Diesen Ratten wurde mit einer fetthaltigen Nahrung (Olivenöl) der vollständige lyophilisierte Pankreas verabreicht. Mit Hilfe der aus der Leerdarmfilstel gewonnenen Flüssigkeit wurde die lipolytische Aktivität des Präparates bestimmt und mit der verglichen, die man unter gleichen Versuchsbedingungen mit handelsüblichem Pankreatin erhält. In der folgenden Tabelle wurden die Ergebnisse zusammengestellt.. Wie daraus ersichtlich, wurde mit dem vollständigen lyophilisierten Pankreas eine viel höhere Aktivität erzielt, da der lyophilisierte Pankreas beim Passieren des Magens im Gegensatz zum Pankreatin von der Magensäure nicht denaturiert wird.1) In the course of the pharmacological experiments with the preparation according to the invention and comparative preparations, jejunctival filstles were created in rats. These rats were completely lyophilized with a fatty diet (olive oil) Administered to the pancreas. With the help of the fluid obtained from the Leerdingenfilstel the lipolytic Activity of the preparation was determined and compared with that obtained under the same test conditions with commercial pancreatin. The results are compiled in the following table. As can be seen, with the whole lyophilized pancreas, the activity became much higher achieved because the lyophilized pancreas when passing through the stomach, in contrast to the pancreatin of the Stomach acid is not denatured.

VersuchstiereLaboratory animals Pro 3 ml FlüssigkeitPer 3 ml of liquid VersuchstiereLaboratory animals Pro 3 ml FlüssigkeitPer 3 ml of liquid der Leerdarmfistelthe venous fistula der Leerdarmfistelthe venous fistula freigesetzte Fettsäurereleased fatty acid freigesetzte Fettsäurereleased fatty acid Pulver GesamtpankreasPowder whole pancreas Pankreatin entfettetPancreatin defatted Ratte 1Rat 1 15,2 mg15.2 mg Ratte TiRat ti 88th Ratte 2Rat 2 1313th Ratte T2Rat T2 1010 Ratte 3Rat 3 1818th Ratte T3Rat T3 1111th Ratte 4Rat 4 12,512.5 Ratte T4Rat T4 99 Ratte 5Rat 5 14,814.8 Ratte T5Rat T5 88th Ratte 6Rat 6 13,313.3 Ratte TeRat te 77th

7
Fortsetzung 7th
continuation 14671467 878878 88th VersuchstiereLaboratory animals Pro 3 ml Flüssigkeit
der Leerdarmfistel
freigesetzte Fettsäure
Pulver GesamtpankreasPer 3 ml of liquid
the venous fistula
released fatty acid
Powder whole pancreas VersuchstiereLaboratory animals Pro 3 ml Flüssigkeit
der Leerdarmfistel
freigesetzte Fettsäure
Pankreatin entfettetPer 3 ml of liquid
the venous fistula
released fatty acid
Pancreatin defatted Ratte 7
Ratte 8
Ratte 9Rat 7
Rat 8
Rat 9 15,2
12,4
17
Mittelwert 14,615.2
12.4
17th
Mean 14.6 Ratte T7
Ratte Ts
Ratte TgRat T7
Rat ts
Rat Tg 9
12
10,3
Mittelwert 9,369
12th
10.3
Mean 9.36

Die überlegenen Ergebnisse erreicht man mit einer Menge von 10 bis 15 g Präparat pro Tag. Durch die Lyophilisierung wird außerdem eine ausgezeichnete Stabilität des Präparates erzielt.The superior results are achieved with an amount of 10 to 15 g of the preparation per day. Through the Lyophilization also results in excellent stability of the preparation.

Die klinischen Versuche bestätigen den Erfolg der Tierversuche. Die obige Menge von 10 bis 15 g hat die gleiche Wirkung wie etwa 40 bis 60 g roher Pankreas bei der Behandlung chronischer Pankreatitis, Pankreasfisteln, Folgeerscheinungen einer Pankreasextirpation oder Magenresektion. Auf die Nachteile der Verwendung roher Drüsen wurde in der Beschreibung bereits hingewiesen.The clinical trials confirm the success of the animal experiments. The above amount of 10 to 15 g has the same effect as about 40 to 60 g raw pancreas in the treatment of chronic pancreatitis, pancreatic fistulas, Sequelae of pancreatic extirpation or gastric resection. On the disadvantages of using raw glands have already been pointed out in the description.

Das Verhalten verschiedener Patienten wurde an sogenannten Fäkalogrammen untersucht, die den Gehalt der Fäces, insbesondere an Stickstoff und Lipioden während 48 Stunden aufzeichnen und damit Aufschluß geben über den Grad der Pankreasinsuffizienz. Die folgende Tabelle zeigt die Entwicklung von Steatorrhöe und Kreatorrhöe unter dem Einfluß des lyophilisierten Gesamtpankreaspulvers.The behavior of various patients was examined using so-called fecalograms, which show the Record content of faeces, especially nitrogen and lipiodes, for 48 hours and thus Provide information about the degree of pancreatic insufficiency. The following table shows the development of Steatorrhea and creatorrhea under the influence of lyophilized whole pancreatic powder.

Diagnosediagnosis SteatorrhöeSteatorrhea nach derafter KreatorrhöeCreatorrhea nach derafter (g/24 Stdn.)(g / 24 hrs.) Behandlungtreatment (g/24 Stdn.)(g / 24 hrs.) Behandlungtreatment vor derbefore the vor derbefore the Behandlungtreatment Behandlungtreatment

Chronische Pankreatitis durch Verkalkung
Chronische Pankreatitis durch Verkalkung
Chronische Pankreatitis
Duodeno-Pankreatektomie
Magenresektion und Fistel D. P.
Magenresektion und Duodeno-Pankreatektomie
Pankreatitis bei cystischer FibröseChronic pancreatitis due to calcification
Chronic pancreatitis due to calcification
Chronic pancreatitis
Duodeno-pancreatectomy
Gastric resection and fistula DP
Gastric resection and duodeno-pancreatectomy
Cystic Fibrous Pancreatitis

7777 20,520.5 9,99.9 5,975.97 9,79.7 2,52.5 2,32.3 1,041.04 17,517.5 3,33.3 6,56.5 1,851.85 20,620.6 3,33.3 4,64.6 0,630.63 51,751.7 16,216.2 13,613.6 2,92.9 58,858.8 31,331.3 5,45.4 3,23.2 1414th 11,611.6 3,23.2 1,91.9

Man hat in einigen Fällen, sich stützend auf biologische Gegebenheiten, die Wirkung der entfetteten Pankreatine mit der des rohen Pankreas und der des lyophilisierten Gesamt-Pankreaspulvers vergleichen können.In some cases, based on biological conditions, one has the effect of the defatted Compare pancreatine with that of the raw pancreas and that of the lyophilized whole pancreatic powder be able.

Bei einem Patienten mit chronischer Pankreatitis durch Verkalkung auf Grund von Alkoholismus war bereits eine Pankreatomie durchgeführt worden. Er litt beträchtlich an Diarrhöe verbunden mit Steatorrhöe und Kreatorrhöe. Er erhielt nach und nach alle handelsüblichen Pankreaspräparate. Die Ergebnisse des Fäkalogramms sind folgende:It was in a patient with chronic pancreatitis due to calcification due to alcoholism a pancreatomy has already been performed. He suffered considerably from diarrhea combined with steatorrhea and creatorrhea. Little by little, he received all of the commercially available pancreatic preparations. The results of the Fecalograms are as follows:

StuhlgewichtChair weight SteatorrhöeSteatorrhea KreatorrhöeCreatorrhea

Vor den BehandlungenBefore the treatments

a) Pankreatin 14 Tabletten/Taga) Pancreatin 14 tablets / day

Roher Pankreas 60 g/TagRaw pancreas 60 g / day

Erfindungsgemäß hergestelltes Medikament, 15 g/TagMedicament made according to the invention, 15 g / day

650 g650 g 77g77g 9,9 g9.9 g 620 g620 g 56,5 g56.5 g 11,7 g11.7 g 350 g350 g 24 g24 g 4,32 g4.32 g 320 g320 g 20,65 g20.65 g 5,97 g5.97 g

Die Beispiele zeigen die Wirksamkeit des erfindungsgemäß hergestellten Medikamentes aus lyophilisiertem Pankreas auf die Diarrhöen auf Grund von Pankreasinduffizienz schwerster Art Sie zeigen gleichzeitig, daß das erfindungsgemäß hergestellte Medikament eine dem rohen Pankreas vergleichbare Aktivität besitzt, auch im Hinblick auf die pharmakodynamische Wirkung, und handelsüblichen Präparaten überlegen istThe examples show the effectiveness of the medicament prepared according to the invention from lyophilized Pancreas on the diarrhea due to pancreatic insufficiency of the most severe kind. They show at the same time that the drug produced according to the invention has an activity comparable to that of the raw pancreas, also with regard to the pharmacodynamic effect, and is superior to commercially available preparations

2)i) Um die vorteilhafte Wirkung der Emulgierung des Pankreasgewebes vor der Lyophilisierung (d.h. des erfindungsgemäßen Verfahrens) auf die Lipaseaktivität des erhaltenen Produkts im Vergleich zu derjenigen der Extrakte gemäß der Schweizer Patentschrift 2 83 588, die ohne vorheriges Emulgieren aus Drüsenstücken hergestellt wurden, zu demonstrieren, wurden die nachfolgenden Versuche durchgeführt:2) i) In order to have the beneficial effect of emulsifying the pancreatic tissue prior to lyophilization (i.e. des method according to the invention) on the lipase activity of the product obtained compared to that of the Extracts according to Swiss patent 2 83 588, which are obtained from pieces of gland without prior emulsification to demonstrate the following tests were carried out:

Sechs Schweine-Bauchspeicheldrüsen, die erst vor etwa 20 Minuten geschlachteten Schweinen entnommen wurden, wurden mit einem Messer in kleine Stücke von 0,5 bis 1 cm (Breite) zerschnitten. Die Stücke wurden vermischt, bevor sie in zwei Proben aufgeteilt wurden: die Probe »T« (Vergleichsprobe) und die Probe »E« (Testprobe). Die Stücke der Probe »T« wurden auf eine Gefrierplatte gebracht, wo sie anschließend lyophilisiert wurden (gemäß der Schweizer Patentschrift 2 83 588), während die Stücke der Probe »E« in einem »ultra-turax«-Mahlwerk emulgiert wurden. Erst nach dieser Emulgierung wurde die so erhaltene sehr feineSix pig pancreases taken from pigs slaughtered about 20 minutes ago were cut into small pieces 0.5 to 1 cm (width) with a knife. The pieces were mixed before they were divided into two samples: sample "T" (comparative sample) and sample "E" (Test sample). The pieces of sample "T" were placed on a freezer plate, where they were then lyophilized were (according to Swiss patent 2 83 588), while the pieces of sample "E" in a "Ultra-turax" grinder were emulsified. Only after this emulsification did it become very fine

709 683/9709 683/9

Masse auf eine Gefrierplatte gebracht, um sie anschließend zu lyophilisieren (Verfahren gemäß der vorliegenden Patentanmeldung).Put the mass on a freezing plate in order to then lyophilize it (method according to present patent application).

Nach der Lyophilisierung wurden die Proben »T« und »E« sowie eine Probe lyophilisiertem Pankreas, der der laufenden Produktion entnommen wurde (Probe P.L.E.), bei 5⁰C mit einer wäßrigen Lösung von 0,15molarem Natriumchlorid extrahiertAfter lyophilization, the samples "T" and "E" as well as a sample of lyophilized pancreas, was taken from the current production (Sample PLE) extracted at 5 ⁰ C with an aqueous solution of sodium chloride 0,15molarem

Nach der Sedimentation (immer noch bei 5° C) wurde eine Konzentrierung der Lipasenaktivität bei jedem der drei erhaltenen Extrakte gemäß dem Verfahren von Melius (P) und Simmons (W. S.) Biochim. Biophys. Acta, 1965, 105, 600 vorgenommen; das Verfahren besteht darin, daß man eine Butanol-Extraktion der Natriumchloridphase der Extrakte durchführt und dann eine Ausfällung mit Ammoniumsulfat und anschließend mit kaltem Aceton bei einem pH-Wert von 5,6 vornimmt.After sedimentation (still at 5 ° C) there was a concentration of lipase activity in each of the three extracts obtained according to the method of Melius (P) and Simmons (W.S.) Biochim. Biophys. Acta, Made 1965, 105, 600; the method consists in doing a butanol extraction of the sodium chloride phase the extracts and then a precipitation with ammonium sulfate and then with cold acetone at a pH of 5.6.

Erneute Lösung der Acetonniederschläge in 8%igem Butanol (V/V) bei einem pH-Wert von 8,9 und Wiederausfällung mit Ammoniumsulfat (Niederschläge PT, PE, PLE).Renewed dissolution of the acetone precipitates in 8% strength butanol (V / V) at a pH of 8.9 and Reprecipitation with ammonium sulphate (precipitates PT, PE, PLE).

Bei je einer aliquoten Fraktion der so erhaltenen Niederschläge wurde einerseits der gesamte Stickstoffgehalt und andererseits die Lipasenaktivität nach üblichen Verfahren bestimmt (Desnuelle P. et al., Potentiometrische Technik zum Messen der Aktivität der Pankreaslipase, Bull. Soc. Chim. Biol. 1955,37,285).In the case of an aliquot fraction of each of the precipitates thus obtained, the total nitrogen content was on the one hand and on the other hand, the lipase activity is determined by conventional methods (Desnuelle P. et al., Potentiometric Technique for Measuring Pancreatic Lipase Activity, Bull. Soc. Chim. Biol. 1955,37,285).

Die spezifische Lipasenaktivität jeder der drei Niederschläge ist der Mittelwert aus 5 aufeinanderfolgenden Bestimmungen, und sie ist ausgedrückt durch Lipaseeinheiten (U) pro mg Proteine (gesamter Stickstoff χ 6,25), die in jedem der drei Niederschläge enthalten waren.The specific lipase activity of each of the three precipitates is the mean of 5 consecutive ones Determinations, and it is expressed as lipase units (U) per mg protein (total Nitrogen χ 6.25) contained in each of the three precipitates.

Lipaseeinheit (U) wird definiert als die Enzymmenge, die unter den Versuchsbedingungen 1 Mikroäquivalent Säure pro Minute freisetztLipase unit (U) is defined as the amount of enzyme which, under the test conditions, is 1 microequivalent Releases acid per minute

Ergebnisseresults

(Mittelwerte aus.
5 Bestimmungen)(Mean values from.
5 determinations)

Probe »T«
Probe »E«
Probe »P.L.E.«Sample "T"
Sample "E"
Sample "PLE"

352 U/mg
1047 U/mg
1122 U/mg352 U / mg
1047 U / mg
1122 U / mg

Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, wurde die spezifische Lipasenaktivität durch die Emulgierung des Pankreasgewebes, die vor der Lyophilisierung durchgeführt wurde, sei es mit einer Laboraparatur, wie »ultra-turax« (Probe E) oder mit einer industriellen Lochplatten-Kolloidmühle, (Probe P. L. EL), im Verhältnis zu dem gemäß der Schweizer Patentschrift 2 83 588 von N i e h a η s beschriebenen Verfahren (Probe »T«), das keine Emulgierung des Pankreasgewebes vor der Lyophilisierung vorsieht etwa verdreifachtAs can be seen from the results, the specific lipase activity was determined by the emulsification of the Pancreatic tissue performed before lyophilization was it, be it with a laboratory device such as »ultra-turax« (sample E) or with an industrial one Perforated plate colloid mill, (sample P. L. EL), in relation to that according to Swiss patent 2 83 588 by N i e h a η s described method (sample "T"), which does not emulsify the pancreatic tissue before the Lyophilization provides roughly tripled

Modifizierung der chemischen Natur der Lipase
im Laufe der Emulgierung des PankreasgewebesModification of the chemical nature of the lipase
in the course of the emulsification of the pancreatic tissue

Ein anderer aliquoter Teil jeder der drei Niederschläge PT, PE und PLE wurde in einer Lösung aus Calciumchlorid (0,01 molares CaCl₂) und 0,5% Natriumtaurocholat suspendiert Man konnte beobachten, daß sich einmal in den Fällen der Proben PE und PLE eine Lösung und ein Niederschlag bildete, während man bei der Probe PT eine homogene Pseudolösung erhielt. Zur Beurteilung der chemischen Natur der bei den Proben PE und PLE erhaltenen Niederschläge wurden die Niederschläge jeweils in einem Gemisch aus Chloroform/Methanol/Wasser (85 : 35 : 5) V/V gelöst, um einer Dünnschicht-Chromatographie auf einer Silicagelplatte mit einem Glycerid (Triolein), einer Fettsäure (Oleinsäure) und einem Phospholipid (Lecithin) als Kontrollsubstanzen unterworfen zu werden.Another aliquot of each of the three precipitates PT, PE and PLE was _{suspended in a solution of calcium chloride (0.01 molar CaCl 2} ) and 0.5% sodium taurocholate Solution and a precipitate formed, while sample PT gave a homogeneous pseudo-solution. To evaluate the chemical nature of the precipitates obtained in samples PE and PLE, the precipitates were each dissolved in a mixture of chloroform / methanol / water (85: 35: 5) V / V for thin-layer chromatography on a silica gel plate with a glyceride (Triolein), a fatty acid (oleic acid) and a phospholipid (lecithin) as control substances.

Nach der Chromatographie, mit dem gleichen Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol/Wasser oder dem System Hexan/Diäthyläther/Essigsäure (80:20:1) V/V, ermöglichten die Rf-Werte der Wanderung einmal der Bestandteile der Calciumtaurochol-Niederschläge der Proben PE und PLE und zum anderen der Kontrollsubstanzen (Triglycerid, Fettsäure, Lecithin), jeweils in jedem der Niederschläge PE und PLE eine wesentliche Fraktion Phospholipide, begleitet von kleinen Glycerid- und Fettsäurefraktionen sowie von nicht identifizierten Lipidbestandteilen zu identifizieren. After the chromatography, with the same solvent system chloroform / methanol / water or the system hexane / diethyl ether / acetic acid (80: 20: 1) V / V, made possible the Rf values of the Migration of the components of the calcium taurochol precipitate once of the samples PE and PLE and on the other hand the control substances (triglyceride, fatty acid, Lecithin), accompanied by a substantial fraction of phospholipids in each of the precipitates PE and PLE to identify small glyceride and fatty acid fractions as well as unidentified lipid components.

ii) Bestimmung der Lipasen-Aktivität
20 ii) Determination of the lipase activity
20th

Der Pankreas eines 100 kg wiegenden ausgewachsenen Schweines wurde noch im Schlachthaus aus dem Tierkörper entfernt und sofort in einen Gefrierbehälter gebracht Eine Stunde später (die Transportzeit zum Labor) wurde er in zwei gleiche Teile A und B zerteilt.The pancreas of a 100 kg adult pig was removed from the slaughterhouse Carcasses removed and immediately placed in a freezer.One hour later (the transport time to Laboratory) it was divided into two equal parts A and B.

Behandlung des Pankreasteils ATreatment of the pancreatic part A.

Mit einer Rasierklinge wurde dieser Teil A in »kleine Teile« von höchstens der Größe eines Weizenkorns zerteiltWith a razor blade, this part A was cut into “small Pieces "no more than the size of a grain of wheat

1 g dieser Teile wurde mit 5 g Natriumchlorid in einen 200-ml-Kolben gebracht, der dann mit destilliertem Wasser auf 200 ml aufgefüllt wurde. Nach Rühren mittels eines Magnetrührers wurden der erhaltenen Aufschlämmung aliquote 0,5 ml Teile entnommen, um die Lipasen-Aktivität gemäß der nachfolgend beschriebenen Methode zu bestimmen.1 g of these parts was placed in a 200 ml flask with 5 g of sodium chloride, which was then distilled with Water was made up to 200 ml. After stirring with a magnetic stirrer, the obtained Slurry aliquots are taken in 0.5 ml portions to determine the lipase activity according to the procedure described below Method to be determined.

Behandlung des Pankreasteils BTreatment of the pancreatic part B

Dieser Teil B wurde in die Schale einer Laborkolloidmühle gebracht und 2 Minuten bei 15 000 U/min emulgiert 1 g dieser Emulsion wurde mit 5 g Natriumchlorid in einen 200-ml-Kolben gebracht der dann mit destilliertem Wasser auf 200 ml aufgefüllt wurde.This Part B was placed in the bowl of a laboratory colloid mill and set at 15,000 rpm for 2 minutes emulsified 1 g of this emulsion was placed in a 200 ml flask with 5 g of sodium chloride and then was made up to 200 ml with distilled water.

Nach Rühren mittels eines Magnetrühres wurde die Lipasen-Aktivität dieser Aufschlämmung, wie beschrieben, bestimmtAfter stirring by means of a magnetic stirrer, the lipase activity of this slurry was determined as described, definitely

Diese Lipase-Bestimmung wird durch Potentiometermessung bei konstanter Temperatur und konstanten pH-Weiten durchgeführt (Desnuelle, P. Co η s t a η t i π, H. J.; B a 1 d y, J.; Bull. Soc Chim. Biol. 1955, 37,285).This lipase determination is made by potentiometer measurement at constant temperature and constant pH widths carried out (Desnuelle, P. Co η s t a η t i π, H. J .; B a 1 d y, J .; Bull. Soc Chim. Biol. 1955, 37.285).

a) Prinzipa) Principle

Die von Lopase während der Hydrolyse einer Triglycerid-Emulsion freigesetzte Säure wurden mit einer Sodalösung titrimetrisch bestimmtThe acids released by Lopase during hydrolysis of a triglyceride emulsion were with a soda solution determined titrimetrically

Die Mikroäquivalente der Säure wurden in dem Maße neutralisiert, wie sie freigesetzt wurden, und die zur Erhaltung des konstanten pH-Wertes verwendete Sodamenge wurde automatisch registriertThe microequivalents of the acid were neutralized to the extent that they were released, and the for Maintaining a constant pH value, the amount of soda used was automatically registered

Eine internationale Lipase-Einheit ist die Enzymmenge, die pro Minute bei pH 9 und 37° C unter den Versuchsbedingungen ein Mikroäquivalent Säure freisetzt. One international lipase unit is the amount of enzyme that is released per minute at pH 9 and 37 ° C below the Experimental conditions releases a microequivalent of acid.

b) Versuchsgerätb) Experimental device

Kombititrator (vom Typ 3 D Metrohm) mit:
einem pH-StatometerCombination titrator (of the 3 D Metrohm type) with:
a pH statometer

einer automatischen 10-ml-Bürette mit direkter Aufzeichnung auf Papierstreifen
einem 50-ml-Thermostatgefäß
einer Dauerschüttelvorrichtung.
Dieses Gerät registrierte die Ergebnisse, die mit einer Mikroelektrode, die in das Reaktionsmedium eingetaucht ist, ermittelt wurden.a 10 ml automatic burette with direct recording on paper strips
a 50 ml thermostatic jar
a continuous shaker.
This device recorded the results obtained with a microelectrode immersed in the reaction medium.

c) Reaktionsteilnehmer
Olivenölemulsionc) respondents
Olive oil emulsion

15 g Gummiarabicum wurden in 200 ml siedendem destilliertem Wasser gelöst und durch Glaswolle filtriert15 g of gum arabic was dissolved in 200 ml of boiling distilled water and washed through glass wool filtered

In die Schale eines Mixers wurdenWere in the bowl of a blender

Gummi-arabicum-Lösung
Neutrales Olivenöl
Reines NatriumbenzoatGum arabic solution
Neutral olive oil
Pure sodium benzoate

100 ml
100 ml
0,2 g100 ml
100 ml
0.2 g

gebrachtbrought

Das Gemisch wurde auf +4⁰C abgekühlt und dann bei Höchstgeschwindigkeit des Mixers 2 Minuten gerührt und anschließend auf die Temperatur von +4⁰C gebrachtThe mixture was cooled to +4 ⁰ C and then stirred at maximum speed of the mixer 2 minutes and then brought to the temperature of +4 ⁰ C

Es wurde erneut 2 Minuten gerührt und dann bei +4° C konserviertIt was stirred again for 2 minutes and then preserved at + 4 ° C

5%ige Natrium-desoxycholatlösung5% sodium deoxycholate solution

2,5 g reines Natirum-desoxycholat (durch Chromatographie erhalten) wurden in 50 ml destilliertem Wasser gelöst und dann bei + 4° C konserviert2.5 g of pure sodium deoxycholate (by chromatography obtained) were dissolved in 50 ml of distilled water and then preserved at + 4 ° C

pH 9-PufferlösungpH 9 buffer solution

665 mg Tri-(hydroxymethyl)-aminomethan wurden in 800 ml destilliertem Wasser gelöst und mit N/10-Salzsäure auf pH 9 eingestellt.665 mg of tri- (hydroxymethyl) aminomethane were dissolved in 800 ml of distilled water and treated with N / 10 hydrochloric acid adjusted to pH 9.

Mit destilliertem Wasser wurde auf 1000 ml aufgefüllt und bei +4⁰C konserviert.With distilled water was added up to 1000 ml and preserved at +4 ⁰ C.

Decarbonisierte und^genau titrierte
N/50-Soda-LösungDecarbonized and precisely titrated
N / 50 soda solution

Alle Reaktionsteilnehmer müssen unmittelbar hergestellt werden.All reactants must be prepared immediately.

d) Enzymlösungd) enzyme solution

Wie vorstehend beschrieben (Teil A oder B).As described above (Part A or B).

e) Arbeitsweisee) Working method

Der pH-Statometer wurde auf pH 9 eingestellt. In den Thermostatbehälter wurdenThe pH statometer was set to pH 9. In the Thermostatic tanks were

Destilliertes WasserDistilled water 8,5 ml8.5 ml OlivenölemulsionOlive oil emulsion 10 ml10 ml PufferlösungBuffer solution 9 ml9 ml Natrium-desoxycholatlösungSodium deoxycholate solution 2 ml2 ml

ίοίο

Der Verbrauch der N/50-Soda-Lösung, der notwendig ist, um den pH-Wert 5 Minuten auf 9 zu halten, wurde registriert.The consumption of the N / 50 soda solution necessary to keep the pH at 9 for 5 minutes, was registered.

f) Berechnungf) calculation

Von der erhaltenen Kurve ausgehend wurde der Verbrauch der N/50-Soda-Lösung pro Minute mit η bezeichnet.On the basis of the curve obtained, the consumption of the N / 50 soda solution per minute was denoted by η.

Da 1 ml N/50-Soda pro Minute 20 Mikroäquivalente Säure neutralisieren kann, wurden die Ergebnisse für 1 g Pankreas durch folgende Rechnung ermittelt:Since 1 ml of N / 50 soda per minute can neutralize 20 microequivalents of acid, the results for 1 g Pancreas determined by the following calculation:

» · 20 ■ 1000»· 20 ■ 1000

2~3 ■2 ~ 3 ■

Ergebnisseresults

Die erhaltenen Ergebnisse der enzymatischen Aktivitäten sind in internationalen Einheiten für Lipase pro Gramm Pankreas ausgedrückt. Gemäß der Enzymkommission der Internationalen Vereinigung für Biochemie (Commission des Enzyms de l'Union Internationale de Biochimie) entspricht eine internationale Einheit der Enzymmenge, die beim Angriff auf ein Mikromol des Substrates pro Minute 1 Mikroäquivalent Säure freisetzt.The results obtained for the enzymatic activities are in international units for lipase per Grams of pancreas expressed. According to the Enzyme Commission of the International Biochemistry Association (Commission des Enzyms de l'Union Internationale de Biochimie) corresponds to an international unit of Amount of enzyme which, when attacking one micromole of the substrate, produces 1 microequivalent acid per minute releases.

Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:The following results were obtained:

gebrachtbrought

Das Gemisch wurde mit einem Magnetrührer gerührt bis es eine Temperatur von 37° C erreichte.The mixture was stirred with a magnetic stirrer until it reached a temperature of 37 ° C.

Durch automatischen Zusatz von N/50-Soda wurde der pH-Wert bei 9 gehalten.The pH was kept at 9 by the automatic addition of N / 50 soda.

Wenn pH-Wert und Temperatur stabilisiert waren, wurden 0,5 ml der Enzymlösung (entsprechend 2,5 mg Pankreas) in das Reaktionsmedium gebracht.When pH and temperature have stabilized, 0.5 ml of the enzyme solution (corresponding to 2.5 mg of pancreas) were brought into the reaction medium.

Pankreas APancreas A.

(in kleine Teile zerlegt)(disassembled into small parts)

Pankreas B (emulgiert)Pancreas B (emulsified)

5880 i.EJg
29200 i.E7g5880 i.EJg
29200 i.E7g

Dieser Versuch zeigte also ausdrücklich, daß das gleiche Pankreasgewebe abhängig von der Art seiner ZerkleinerungThis experiment thus explicitly showed that the same pancreatic tissue depends on the nature of its Crushing

a) Zerschneiden in kleine Teile nach der in der CH-Patentschrift 2 83 588 beschriebenen Methode odera) Cutting into small pieces according to the method described in Swiss Patent No. 2,883,588 or

b) Emulgieren in der Kolloidmühle wie im erfindungsgemäßen Verfahrenb) Emulsification in the colloid mill as in the process according to the invention

sehr verschiedene Lipase-Aktivität besitzen kann.can have very different lipase activity.

Bestimmung der Stabilität der Lipoprotein-EnzymeDetermination of the stability of the lipoprotein enzymes

Die Stabilität der Lipoprotein-Enzyme, die aus den Protein-Enzymen erhalten werden, wurde folgendermaßen bestimmt:The stability of the lipoprotein enzymes obtained from the protein enzymes was as follows definitely:

Die Pankreas-Teilchen von höchstens der Größe eines Weizenkorns und der emulgierte Pankreas wurden unter gleichen Bedingungen entfettet, und zwar mit Äthyläther. In beiden Fällen wurden pro g Pankreas 10 ml Äthyläther, bei einer Rührzeit von 10 Minuten, verwendet.The pancreas particles no larger than a grain of wheat and the emulsified pancreas were degreased under the same conditions with ethyl ether. In both cases per g of pancreas 10 ml of ethyl ether, with a stirring time of 10 minutes, used.

Es ist bekannt, daß Protein-Enzyme von Äther in großem Maße denaturiert werden und daß vor allem Pankreas-Lipase durch ihn ihre Aktivität verliert.It is known that protein enzymes are largely denatured by ether and that above all It causes pancreatic lipase to lose its activity.

Die Ergebnisse, die mit den beiden Präparaten A und B erhalten wurden, ausgedrückt in internationalen Einheiten für Lipase pro 1 g Pankreas, waren wie folgt:The results obtained with the two preparations A and B are expressed in international terms Units for lipase per 1 g of pancreas were as follows:

Pankreas APancreas A.

(in »kleine Teile«) 320 E/g(in "small parts") 320 U / g

Pankreas B (emulgiert) 720 E/gPancreas B (emulsified) 720 U / g

Man kann also feststellen, daß eine vorhergehende Emulgierung des Pankreasgewebes die Lipase teilweise vor der denaturierenden Wirkung des Äthyiäthers schützt, und daß die Menge der verbliebenen aktiven Enzyme in dem emulgieren Pankreas mehr als doppelt so hoch ist als die in dem in kleine Teile zerteilten Pankreas.It can thus be stated that a previous emulsification of the pancreatic tissue partially depleted the lipase protects against the denaturing effect of the ethyl ether, and that the amount of the remaining active Enzymes in the emulsified pancreas is more than twice as high as those in the broken up into small pieces Pancreas.

Claims

Patent claims:

1. Process for the preparation of a medicament from pig pancreas, wherein that from the carcass separated pancreas cleaned of unwanted components, disassembled into small parts, frozen and is lyophilized, characterized in that the whole, fresh and not defatted pig pancreas, separated from the carcass at the latest a quarter of an hour after slaughter cools to a temperature not exceeding 8 ° C for stabilization, crushed by grinding, the temperature must not rise above 15 ° C, the ground pancreas about 30 to 100 % By weight ice water is added, which has optionally been flavored, the mixture obtained with a turbo grinder and the emulsified product no later than two hours after Freezes battles for lyophilization.

2. The method according to claim 1, characterized in that that there is also an amount of lactose between the first and second milling from about 1 to 10% by weight and / or ascorbic acid in an amount of about 0.1% by weight, based on the initial weight of the pancreas, adds.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the ice water with fresh flavored with squeezed orange juice.

3030th