Verfahren zur Darstellung von. 35S-L-Cysteinhydrochlorid Bisherige
Verfahren zur Synthese von 35S-Cystein basieren auf einer Biosynthese von Cystein,
bzw. Cystin aus 35S-Sulfat mit Hilfe von Mikroorganismen.Procedure for the representation of. 35S-L-Cysteine Hydrochloride Previous
Processes for the synthesis of 35S-cysteine are based on a biosynthesis of cysteine,
or cystine from 35S sulfate with the help of microorganisms.
Bei diesem Verfahren ist die erreichbare spezifische Aktivität des
Endproduktes begrenzt durch die Strahlenschädigung der zur Biosynthese verwandten
Mikroorganismen. 35S-L-Cysteinhydrochlorid läßt sich erfindungsgemäß in jeder gewünschten
spezifischen Aktivität enzymatisch unter Verwendung eines Fermentextraktes als Katalysator
aus Serin und Na z35S darstellen und als Hydrochlorid isolieren. Zu diesem Zweck
wird ein Fermentextrakt, z. B. --aus Hefe, mit Serin und Na 235S und ausreichenden
Mengen von Pyridoxalphosphat im ph-Bereich von 7 - 9 bis zur Einstellung des enzymatischen
Gleichgewichtes in Stickstoffatmosphäre inkubiert. Die geeignete Reaktionstemperatur
liegt von 20 - 390C. Die enzymatische Umsetzung wird durch bekannte Eiweißfällungsmittel,
z. B. Metaphosphorsäure oder Trichloressigsäure, beendet. Das 35S-L-Cystein aus
dem Ansatz kann nach zwei Verfahren isoliert werden.In this process, the specific activity that can be achieved is
End product limited by radiation damage to those related to biosynthesis
Microorganisms. 35S-L-cysteine hydrochloride can be used according to the invention in any desired
specific activity enzymatically using a ferment extract as a catalyst
from serine and Na z35S and isolate as hydrochloride. To this end
a ferment extract, e.g. B. --from yeast, with serine and Na 235S and sufficient
Quantities of pyridoxal phosphate in the pH range of 7 - 9 up to the setting of the enzymatic
Incubated equilibrium in a nitrogen atmosphere. The appropriate reaction temperature
is from 20 - 390C. The enzymatic conversion is carried out by known protein precipitants,
z. B. metaphosphoric acid or trichloroacetic acid ended. The 35S-L-cysteine out
The approach can be isolated by two methods.
1. Fällung als Quecksilberkomplex mit einem Überschuß von Quecksilberacetat
mit anschließender Spaltung des Komplexes durch Dithizon, wobei das Quecksilberdithizonat
mit Tetrachlorkohlenstoff extrahiert wird. Das in der sauren-wässrigen Phase verbliebene
Rohcystein wird durch Chromatographie
an einem Kationenaustauscher
mit verdünnter HC1 gereinigt, wobei mehrere radioaktive Verunreinigungen abgetrennt
werden.1. Precipitation as a mercury complex with an excess of mercury acetate
with subsequent cleavage of the complex by dithizone, the mercury dithizonate
is extracted with carbon tetrachloride. That which remained in the acidic-aqueous phase
Crude cysteine is determined by chromatography
on a cation exchanger
Purified with dilute HC1, whereby several radioactive impurities are separated
will.
2; Nach weitgehender Beseitigung des Eiweißfällungsmittels, z. H.
Extraktion der Trichloressigsäure mit Äther, wird das Reaktionsgemisch an einer
Kationenaustauschersäule von nicht umgesetztem Serin, den Puffersubstanzen, radioaktiven
Verunreinigungen und sonstigen Produkten durch Chromatographie mit verdünnter HCl
gereinigt. Das Cysteinhydrochlorid wird anschließend unter gleichen Bedingungen
rechromatographiert. Das 'abgetrennte, radiochemisch:Ieinheitliche 35S-L-Cysten
wird im Vakuum eingeengt und liegt als Hydrochlorid vor. Patentanspruch Verfahren
zur Darstellung von 35S-L-Cysteinhyfro- -chlord dadurch gekennzeichnet, daß durch
ein geeignetes Ferment als Katalysator für die Umsetzung von Serin und Na
23535 -in schwach alkalischer Lö-
sung gebildetes -35S-L-Cystein als
Hydrochlorid entweder nach vorheriger Abtrennung als üg-Komplex mit nachfolgender
Dithizonspaltung des Komplexes durch Chromatographie an einem Kationenaustauscher
mit Salzsäure isoliert .wird oder das 35S-L-Cystein aus dem ReaktI®nsansatz direkt
durch eine gleiche Chromatographie als Hydrochlorid isoliert wird.
B
e i s p i e 1
500 uMol 1-Serin, 10 mg. Pyridoxalphosphat, 500 uMol Na
35S und 110 mg Äthylendiamintetraacetat werden zusammen mit einem Enzymextract
geeigneter Aktivität in ca. 40 ml
Pufferlösung im ph-Bereich 7-9 bei einer
Temperatur von 29-39C unter Stickstoffatmosphäre mehrere Stunden inkubiert.2; After extensive elimination of the protein precipitant, z. H. Extraction of the trichloroacetic acid with ether, the reaction mixture is purified from unreacted serine, the buffer substances, radioactive impurities and other products by chromatography with dilute HCl on a cation exchange column. The cysteine hydrochloride is then rechromatographed under the same conditions. The separated, radiochemically uniform 35S-L-cyst is concentrated in vacuo and is present as the hydrochloride. Patent claim A method for the preparation of 35S-L-Cysteinhyfro- -chlord characterized in that prior by a suitable enzyme as a catalyst for the conversion of serine and Na 23535 -in weakly alkaline solu- tion formed 35S-L-cysteine hydrochloride either Separation as a complex with subsequent dithizone cleavage of the complex by chromatography on a cation exchanger with hydrochloric acid is isolated or the 35S-L-cysteine is isolated from the reaction mixture directly as the hydrochloride by the same chromatography. B e i SPIE 1500 micromoles 1-serine, 10 mg. Pyridoxal phosphate, 500 μmol Na 35S and 110 mg ethylenediamine tetraacetate are incubated for several hours together with an enzyme extract of suitable activity in approx. 40 ml buffer solution in the pH range 7-9 at a temperature of 29-39C under a nitrogen atmosphere.
Das Äthylendiamintetraacetat dient als Komplexbildner, um divarente-Schwermetallspuren
zu beseitigen, die die Enzymaktivität beeinträchtigen. Die Dauer der Inkubation
ist abhängig von der Enzymaktivität und der gewählten Temperatur.. Die Umsetzung
wird durch Zugabe von 15 ml 30 %iger Metaghosphorsäure beendigt, das gefällt
Eiweiß abzentrifuglert und danach das Cystein aus der Lösung durch Zusatz von Quecksil'-beracetat
im Überschuß (Suspension von 3 g in 10 ml H20) ausgefällt und abgetrennt. Der Niederschlag
wird in 10 m1 etwa 092 n Essigsäure suspendiert und das in dem Niederschlag
enthaltene Quecksilber wird erschöpfend mit Dithizon in Tetrachlorkohlenstoff extrahiert.
Das so gewonnene Rohcystein wird auf eine Kationsaustauschersäule in der H+-Form
gegeben und anschließend mit 1.5n HCl. als Elutionsmittel chromatographiert.
Aus dem Cystein enthaltenen Frak# tionen wird dieses durch Gefriertrocknung
isoliert.The ethylenediaminetetraacetate acts as a complexing agent to eliminate traces of heavy metals that impair the enzyme activity. The duration of the incubation depends on the enzyme activity and the selected temperature. The reaction is terminated by adding 15 ml of 30% metaghosphoric acid, the precipitated protein is centrifuged off and then the cysteine is removed from the solution by adding an excess of mercury acetate ( Suspension of 3 g in 10 ml of H20) precipitated and separated. The precipitate is suspended in 10 ml of approximately 092 N acetic acid and the mercury contained in the precipitate is exhaustively extracted with dithizone in carbon tetrachloride. The crude cysteine obtained in this way is placed on a cation exchange column in the H + form and then with 1.5N HCl. chromatographed as the eluent. This is isolated from the fractions contained in the cysteine by freeze-drying.