DE1205655B

DE1205655B - Process for the production of the new antibiotic WG 696

Info

Publication number: DE1205655B
Application number: DEL46715A
Authority: DE
Inventors: Wagn Ole Godtfredsen; Annelise Helene Kjoller; Henning Otto Bojsen
Original assignee: Leo Pharmaceutical Products Ltd AS
Current assignee: Leo Pharma AS
Priority date: 1963-01-03
Filing date: 1964-01-03
Publication date: 1965-11-25

Description

Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums WG 696 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer bisher unbekannten cytostatischen Verbindung, die im folgenden als WG 696 bezeichnet wird. Diese Verbindung weist, wie sich herausgestellt hat, eine Aktivität gegen Pilze auf.Process for the production of the new antibiotic WG 696 The invention relates to a process for the production of a previously unknown cytostatic compound, which is referred to below as WG 696 . This compound has been found to have antifungal activity.

Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, welches darin besteht, daß der Organismus Trichoderma viride Leo ND 8 in einem wäßrigen Nährmedlum, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen bebrütet wird, bis die Lösung eine wesentliche Aktivität gegen Pilze aufweist, und dann das auf diese Weise gebildete WG 696 isoliert wird.In particular, the invention relates to a method which consists in incubating the organism Trichoderma viride Leo ND 8 in an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources under aerobic conditions until the solution exhibits substantial activity against fungi, and then isolating the WG 696 thus formed.

Der besondere Stamm, der den erwähnten Stoff WG 696 bildet, ist aus einer aus Neuguinea stammenden Bodenprobe isoliert und unter Eingangsnummer 14910 in der American Type Culture Collection hinterlegt worden, wo er nur zum Zwecke des Beweises der Offenbarung der vorliegenden Erfindun erhältlich ist.The particular strain that forms the aforementioned substance WG 696 has been isolated from a soil sample from New Guinea and deposited under accession number 14910 in the American Type Culture Collection, where it is only available for the purpose of proving the disclosure of the present invention.

Dieser Stamm ist eine Variante von Trichoderma viride Pers. ex. Fries, das zur Gruppe der Fungi imperfeeti, der Ordnung Hyphomeytes und der Familie Mucedinaceae gehört.This strain is a variant of Trichoderma viride Pers. ex. Frieze, that to the group of the Fungi imperfeeti, the order Hyphomeytes and the family Mucedinaceae heard.

Makroskopisch ist Trichoderma viride Leo ND 8 durch ein rasches Wachstum auf Agarplatten der folgenden Zusammensetzung: Glycerin ..................... 7,5 g Maisquellwasser (50"/,ig) ...... 2,5 g Glucose ..................... 10,0 g Peptone ..................... 5,0 g M9S04 ...................... 0,05 g KI-I2P04 ..................... 0,06 g FeS04 ....................... 0,005 g CUS04 ...................... 0,004 g Agar ........................ 20,0 g Leitungswasser ............. auf 1000 ml pH ......................... 6,5 gekennzeichnet, auf , elchen sich nach Animpfen innerhalb von 48 Stu,iizn bei einer Temperatur von 25'C Kolonien von etwa 2 cm im Durchmesser entwickeln. Das Mycel ist ia den beiden ersten Tagen weiß und niedrig, dann ent,#Nickelt sich ein wollartiges seriales Mycel, und nach 96 Stunden beginnt die Bildung von Konidien, wobei --.'ch die ganze Kolonie dunkelgrün färbt.Macroscopically, Trichoderma viride Leo ND 8 is characterized by rapid growth on agar plates with the following composition: Glycerine ..................... 7.5 g corn steep water (50 "/, ig ) ...... 2.5 g glucose ..................... 10.0 g peptones ............ ......... 5.0 g M9S04 ...................... 0.05 g KI-I2P04 ....... .............. 0.06 g FeS04 ....................... 0.005 g CUS04 ..... ................. 0.004 g agar ........................ 20.0 g tap water . ............ on 1000 ml pH ......................... 6.5 marked, on , elchen themselves After inoculation, colonies of about 2 cm in diameter develop within 48 hours at a temperature of 25 ° C. The mycelium is generally white and thin for the first two days, then a woolly serial mycelium develops, and after 96 Hours the formation of conidia begins, whereby -. 'Ch turns the whole colony dark green.

Eine mikroskopische Untersuchung zeigt, daß das Mycel hyalin und septiert ist und 11,2 #L breite Hyphen hat. Die Konidienträger sind aufrecht und verzweigt. Die Phialiden treten getrennt oder in Quirlen auf und sind flaschenförmig, 6 bis 10 #t lang und 2,5 bis 3,5 #L breit. Die Konidien sind hyalin, einzellig, glatt und blaßgrün. Sie sind kugelförmig oder schwach eiförmig und von gleichmäßiger Größe, etwa einer Größe von 3,0 bis 3,2 #t im Durchmesser. Die Konidien liegen in Form von Ketten vor, die im vorgeschrittenen Wachstumsstadium kugelförmige, klebrige Klumpen bilden, von welchen jeder etwa zehn bis zwanzig Konidien enthält.Microscopic examination shows that the mycelium is hyaline and septate and has hyphae 11.2 #L wide. The conidiophores are erect and branched. The phialides occur separately or in whorls and are bottle-shaped, 6 to 10 t long and 2.5 to 3.5 l wide. The conidia are hyaline, unicellular, smooth and pale green. They are spherical or slightly ovoid and of uniform size, about 3.0 to 3.2 #t in diameter. The conidia are in the form of chains which, in the advanced stage of growth, form spherical, sticky lumps, each of which contains about ten to twenty conidia.

Wenn der Pilz in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet wird, werden im Verlauf von 48 bis 144 Stunden beträchtliche Mengen von WG 696 gebildet, die durch einen Agarschalentest unter Verwendung von Candida albieans als Testorganismus nachweisbar sind. Die Fähigkeit zur Bildung von WG 696 wurde in einer Reihe von Versuchen nachgewiesen, bei welchen der Pilz in verschiedenen Kulturmedien bebrütet wurde.When the fungus is grown in a liquid culture medium, significant amounts of WG 696 are produced over 48 to 144 hours and are detectable by an agar dish test using Candida albieans as the test organism. The ability to form WG 696 was demonstrated in a series of experiments in which the fungus was incubated in various culture media.

Bei diesen Versuchen wurden 75 ml eines flüssigen Kulturmediums in einen Schüttelkolben mit einem Inhalt von 500 ml eingebracht und nach dem Sterilisieren mit einer vegetativen Kultur des Pilzes angeimpft, und hierauf wurde die Fermentation bei einer Temperatur von 27'C in einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtune, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind aus der nachstehend angeführten Tabelle ersichtlich, in der in der ersten Spalte das verwendete Substrat und in der zweiten und dritten Spalte die Hemmungszone angegeben ist, die bei dem erwähnten Agarschalentest nach einer Bebrütun-szeit von 2 bzw. 6 Tagen bestimmt wurde. 1 1 li 1 111 S-200 ........... 22 mm 23 mm S-25 .............. 47 mm 41 mm S-45 .............. 33 mm 33 mm S-205 ............. 33 mm 30 mm Die Zusammensetzung der verwendeten Substrate war wie folgt S-200: Maisquellwasser (5001jg) ...... 20 g KH2P04 ...................... 10 g M9S04 ...................... 0,5 g Saccharose ................... 50 g Leitungswasser auf ............ 1000 ml pH ......................... 6,7 S-25: Glycerin ..................... 7,5 g Maisquellwasser (501)/,ig) ...... 2,5 g Glucose ..................... 10,09 Staleys Nährstoff (Sojabohnenmehl) ............. 15,0- M9S04 ...................... 0,05 g KH1P04 ..................... 0,06 g FeS04 ....................... 0,005 g CUS04 ...................... 0,004 g Leitungswasser ............ auf 1000 ml pH ......................... 6,5 S-45: Saccharose ................... 50,0 g NH4N0 . .................... 3,0 g KH1P04 ..................... 10,0 g Glycerin ..................... 5,0 g C ...................... 0,5 g O'SO4 KCI ........................ 0,5 g FeS04 ....................... 0,01 g ZiiS04 ...................... 0,001 g Biotin ....................... 0,01 mg Tierisches Öl ................. 1 mi Leitungswasser ............ auf 1000 ml pH ......................... 6,9 S-205: Fleischextrakt ................ log Fischmehl ................... 10 g Maisquellenwasser (50"/,ig) .... 5,0 g Ammonacetat ................ 2,0 g Saccharose ................... 36 g Glucose ..................... 9 g Leitungswasser ............ auf 1000 ml pH ......................... 7,0 Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung erhaltene Verbindung WG 696 ist ein neutraler Stoff, der in Wasser nur in geringem Umfang löslich ist, aber in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Kohlen- wasserstoffen, chlorierten Kohlenwasserstoffen, Alko- holen, Ketonen, Estern u. dgl., leicht löslich ist. Die Verbindung enthält 69,52 0/0 Kohlenstoff und 8,30 0/0 Wasserstoff und daneben nur mehr Sauerstoff, entsprechend der Formel C17H"04, die auch mit den Ergebnissen der Molekulargewichtsbestimmung dieser Verbindung übereinstimmt.In these experiments, 75 ml of a liquid culture medium was placed in a shake flask with a capacity of 500 ml and, after sterilization, inoculated with a vegetative culture of the fungus, and then fermentation was carried out at a temperature of 27 ° C. in a reciprocating shaker , carried out. The results obtained can be seen from the table below, in which the substrate used is indicated in the first column and the inhibition zone is indicated in the second and third columns, which was determined in the agar dish test mentioned after an incubation time of 2 or 6 days . 1 1 left 1 111 S-200 ........... 22 mm 23 mm S-25 .............. 47 mm 41 mm S-45 .............. 33 mm 33 mm S-205 ............. 33 mm 30 mm The composition of the substrates used was as follows S-200: Corn steep water (5001jg) ...... 20 g KH2P04 ...................... 10 g M9S04 ...................... 0.5 g Sucrose ................... 50 g Tap water to ............ 1000 ml pH ......................... 6.7 S-25: Glycerin ..................... 7.5 g Corn steep water (501) /, ig) ...... 2.5 g Glucose ..................... 10.09 Staley's nutrient (Soybean meal) ............. 15.0- M9S04 ...................... 0.05 g KH1P04 ..................... 0.06 g FeS04 ....................... 0.005 g CUS04 ...................... 0.004 g Tap water ............ to 1000 ml pH ......................... 6.5 S-45: Sucrose ................... 50.0 g NH4N0. .................... 3.0 g KH1P04 ..................... 10.0 g Glycerin ..................... 5.0 g C ...................... 0.5 g O'SO4 KCI ........................ 0.5 g FeS04 ....................... 0.01 g ZiiS04 ...................... 0.001 g Biotin ....................... 0.01 mg Animal oil ................. 1 mi Tap water ............ to 1000 ml pH ......................... 6.9 S-205: Meat extract ................ log Fish meal ................... 10 g Corn spring water (50 "ig) .... 5.0 g Ammonium acetate ................ 2.0 g Sucrose ................... 36 g Glucose ..................... 9 g Tap water ............ to 1000 ml pH ......................... 7.0 According to the method according to the invention obtained compound WG 696 is a neutral substance, which is only slightly soluble in water, but in most organic solvents such as carbon hydrogen, chlorinated hydrocarbons, alcohol get, ketones, esters and the like, is easily soluble. The compound contains 69.52% carbon and 8.30% hydrogen and besides only more oxygen, according to the formula C17H "04, which also agrees with the results of the molecular weight determination of this compound.

Der Schmelzpunkt der kristallinen Verbindung liegt bei 46'C, der Siedepunkt bei 110bis112'C/0,05mmHg. Die Verbindung WG 696 ist optisch aktiv und hat eine spezifische Drehung [x]IDI von -11' in Chloroform (10/,). Sie ist ferner durch ihr UV-Spektrum in Äthanol, das ein Absorptionsmaximum bei etwa 205 m#t (s = 2400) zeigt, und durch ihr Spektrum im 1R-Bereich gekennzeichnet, in welchem es, wie aus der Zeichnung hervorgeht, charakteristische Absorptionsbanden bei den in reziproken Zentimetern ausgedrückten Frequenzen y = 960, 970, 1032, 1084, 1224, 1245, 1376 und 1735 cm-' aufweist, wenn diese Bestimmung mit Hilfe einer Lösung der Verbindung in Tetrachlorkohlenstoff (10/,) erfolgt.The melting point of the crystalline compound is 46'C, the boiling point is 110 to 112'C / 0.05mmHg. The compound WG 696 is optically active and has a specific rotation [x] IDI of -11 ' in chloroform (10 /,). It is also characterized by its UV spectrum in ethanol, which shows an absorption maximum at around 205 m # t (s = 2400), and by its spectrum in the 1R range, in which, as can be seen from the drawing, there are characteristic absorption bands at the frequencies y = 960, 970, 1032, 1084, 1224, 1245, 1376 and 1735 cm- ', expressed in reciprocal centimeters, when this determination is made with the aid of a solution of the compound in carbon tetrachloride (10 /,).

Die spezifischen mykostatischen und bakteriostatischen Aktivitäten der Verbindung WG 696 wurden mit Hilfe von Reihenverdünnungsversuchen bestimmt. Die Ergebnisse dieser mikrobiologischen Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben, in der die Aktivitäten als die Menge der Verbindung angegeben sind, die eine 500/(,ige Hemmung (IC,0) des in Frage stehenden Organismus verursacht. Bei diesen Versuchen wurde zur Bestimmung der Aktivität gegen Pilze Sabourauds Nährlösung, zur Bestimmung der Aktivität gegen Bakterien Fleischwasser verwendet. Organismus IC5, #tg#MI Candida albicans ATCC 10231 ........... 0,25 Candida albieans LSI-1 Z248 .............. 0,32 Candida parakrusei ..................... 0,28 Candida parakrusei ..................... 0,40 Candida utilis .......................... 0,25 Aspergillus fumigatus CBS ............... 16,0 Trichophyton mentagrophytes CBS ....... 0,32 Trichophyton mentagrophytes CBS ....... 0,40 Saccharomyces cerevisiae ................ 0,10 Gliocladium deliquescens ................ 5,0 Verticillium sp . ......................... 4,0 Cephalosporium sp . ..................... 5,0 Fusarium sp . ........................... 2,5 Fusarium sp . ........................... 1,0 Fusarium sp . ........................... 3,2 Mucorflavus .......................... 3,2 Cunninghamella elegans ................. 3,2 Cunninghamella blakesleana ............. 3,2 Absidia cylindrospora ................... 1,3 Rhizopus nigricans ...................... 1,3 Penicillium sp ........................... 1,6 Penicillium sp ........................... 3,2 Aspergillus sp ........................... 12,5 Aspergillus fiavus ....................... 12,5 Pseudomonas aeruginosa ................ >l00 Staphylococcus aureus ................... >l00 Sarcina lutea FDA 1001 ... ............. >l00 Streptococcus pyogenes NCTC 6175 ....... >l00 Corynebacterium xerosis NCTC 9755 ...... >l00 Klebsiella pneumoniae ................... >l00 Salmonella typhimurium NCTC 5710 ...... >l00 Baeillus subtilis ......................... >l00 Vibrio comma BCTC 8367 ............... >l00 Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Verbindung WG696 in den angewandten Konzentrationen nur eine geringe aktibakterielle Wirkung hat, wogegen ihre Aktivität sowohl gegen pathogene als auch gegen nichtpathogene Pilze, einschließlich solcher Pilze, die in der Landwirtschaft und Industrie als Schädlinge auftreten, ganz hervorragend ist.The specific mycostatic and bacteriostatic activities of the compound WG 696 were determined with the aid of serial dilution tests. The results of these microbiological tests are shown in the following table, in which the activities are given as the amount of the compound which causes a 500% inhibition (IC, 0) of the organism in question. In these tests, the determination was made of activity against fungi Sabourauds nutrient solution, used to determine activity against bacteria meat water. Organism IC5, # tg # MI Candida albicans ATCC 10231 ........... 0.25 Candida albieans LSI-1 Z248 .............. 0.32 Candida parakrusei ..................... 0.28 Candida parakrusei ..................... 0.40 Candida utilis .......................... 0.25 Aspergillus fumigatus CBS ............... 16.0 Trichophyton mentagrophytes CBS ....... 0.32 Trichophyton mentagrophytes CBS ....... 0.40 Saccharomyces cerevisiae ................ 0.10 Gliocladium deliquescens ................ 5.0 Verticillium sp . ......................... 4.0 Cephalosporium sp . ..................... 5.0 Fusarium sp . ........................... 2.5 Fusarium sp . ........................... 1.0 Fusarium sp . ........................... 3.2 Mucorflavus .......................... 3.2 Cunninghamella elegans ................. 3.2 Cunninghamella blakesleana ............. 3.2 Absidia cylindrospora ................... 1.3 Rhizopus nigricans ...................... 1.3 Penicillium sp ........................... 1.6 Penicillium sp ........................... 3.2 Aspergillus sp ........................... 12.5 Aspergillus fiavus ....................... 12.5 Pseudomonas aeruginosa ................> l00 Staphylococcus aureus ...................> l00 Sarcina lutea FDA 1001 ... .............> l00 Streptococcus pyogenes NCTC 6175 .......> l00 Corynebacterium xerosis NCTC 9755 ......> l00 Klebsiella pneumoniae ...................> l00 Salmonella typhimurium NCTC 5710 ......> l00 Baeillus subtilis .........................> l00 Vibrio comma BCTC 8367 ...............> l00 It can be seen from this table that the compound WG696 in the concentrations used has only a slight active bacterial effect, whereas its activity against both pathogenic and non-pathogenic fungi, including those fungi which occur as pests in agriculture and industry, is very excellent .

Es ist jedoch verständlich, daß die bei den oben angeführten Versuchen festgestellte niedrige antibakterielle Aktivität die Möglichkeit einer Verwendung der Verbindung WG 696 zur Bekämpfung von bestimmten Bakterien, wenn diese Verbindung in höheren Konzentrationen verwendet wird, nicht ausschließt und daß ferner auch eine Verwendung dieser Verbindung in Hinblick auf ihre allgemeine cytostatische Aktivität in Betracht gezogen werden muß. So haben beispielsweise Versuche gezeigt, daß die Verbindung WG 696 in niedrigen Konzentrationen das Wachstum von gewissen Tumorzellen, wie im Falle von Epidermis-Karzinomen des Nasen-Rachen-Raumes von Menschen in einer Gewebekultur, hemmt. Die spezifische Aktivität dieser Verbindung gegen Pilze ist jedoch, was ihre Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin betrifft, besonders vorteilhaft. In dieser Hinsicht ist auch ihre niedrige Toxizität bemerkenswert. So konnte bei Tierversuchen, wenn die Verbindung Mäusen subkutan in Form einer Lösung in einem pflanzlichen Öl verabreicht wurde, ein LD"-Wert von 500 bis 1000 mg/kg beobachtet werden, und wenn die Verbindung in der gleichen Form oral verabreicht wurde, betrug die LD" über 1000 mg/kg.It is understood, however, that the low antibacterial activity found in the experiments cited above does not preclude the possibility of using the compound WG 696 for controlling certain bacteria when this compound is used in higher concentrations and that this compound can also be used in Must be taken into account in terms of their general cytostatic activity. For example, experiments have shown that the compound WG 696 in low concentrations inhibits the growth of certain tumor cells, such as in the case of epidermal carcinomas of the nasopharynx of humans in a tissue culture. However, the specific activity of this compound against fungi is particularly advantageous for its use in human and veterinary medicine. In this regard, their low toxicity is also noteworthy. Thus, in animal experiments, when the compound was subcutaneously administered to mice in the form of a solution in a vegetable oil , an LD "value of 500 to 1000 mg / kg was observed, and when the compound was administered orally in the same form it was LD "over 1000 mg / kg.

Ferner zeigten sich bei topischer Anwendung auf der Haut keine nachteiligen Wirkungen, und die Verbindung erwies sich bei der topischen Behandlung von Mykosen bei Mensch und Tier als sehr nützlich. So zeigte sie sich z. B. bei der klinischen Behandlung von durch den Pilz Candida albicans verursachten Hautinfektion bei Menschen besonders brauchbar, und es konnten sogar schwere, durch diesen Pilz hervorgerufene Infektionen, die bei Anwendung anderer, bekannter Verbindungen mit einer Aktivität gegen Pilze nicht angegriffen werden, bei einer Behandlung mit der Verbindung WG 696 geheilt werden.Furthermore, when applied topically to the skin, there were no adverse effects and the compound was found to be very useful in the topical treatment of mycoses in humans and animals. So she showed z. Particularly useful in the clinical treatment of skin infections caused by the fungus Candida albicans in humans, and even severe infections caused by this fungus, which are not attacked by the use of other known compounds having anti-fungal activity, could be treated with one treatment be healed with the compound WG 696.

Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt die Verfahrensschritte, die darin bestehen, daß der Organismus Trichoderma viride Leo ND 8 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis die Lösung eine wesentliche Aktivität gegen Pilze aufweist, und dann das auf diese Weise gebildete WG 696 isoliert wird.The process according to the invention comprises the process steps which consist in cultivating the organism Trichoderma viride Leo ND 8 in an aqueous nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources under aerobic conditions until the solution exhibits substantial activity against fungi, and then isolating the WG 696 thus formed.

Bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die Bildungsgeschwindigkeit der Verbindung WG 696 während der gesamten Fermentationsdauer durch routinemäßige Bestimmung der Aktivität des Kulturfiltrates festgestellt, wobei für diesen Zweck der Agarschalentest, beispielsweise unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus, angewandt wird.When carrying out the method according to the invention, the rate of formation of the compound WG 696 is determined during the entire fermentation period by routine determination of the activity of the culture filtrate, the agar dish test, for example using Candida albicans as the test organism, being used for this purpose.

Nach den bei der Herstellung der Verbindung WG 696 in einem halbtechnischen Maßstab erhaltenen Ergebnissen wurde die optimale Ausbeute an diesem Stoff in einem Zeitraum von 48 bis 96 Stunden erzielt, wenn das Fermentationsverfahren bei einer Temperatur von 20 bis 30'C, vorzugsweise einer Temperatur von etwa 27'C, durchgeführt wurde. Der Temperaturbereich ist jedoch nicht kritisch, da die zum Erhalt dieser Ausbeuten erforderliche Zeit in einem gewissen Umfang von der mechanischen Beschaffenheit bzw. Art des Fermentationsgefäßes und von dem Typ der verwendeten Rühreinrichtung abhängt.According to the results obtained in the preparation of the compound WG 696 on a pilot plant scale, the optimum yield of this substance was achieved in a period of 48 to 96 hours when the fermentation process at a temperature of 20 to 30'C, preferably a temperature of about 27'C. The temperature range is not critical, however, since the time required to obtain these yields depends to a certain extent on the mechanical nature or type of fermentation vessel and on the type of stirring device used.

Bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung hat sich eine große Anzahl der bekannten Kulturmedien, und zwar sowohl der vollständigen als auch der minimalen Medien, als brauchbar erwiesen.When carrying out the method according to the invention has a large number of known culture media, both complete and the minimal media, proven useful.

Als Kohlenstoff- und Energiequelle werden Zucker Fetten vorgezogen, und von den Zuckern werden Glucose, Fructose, Galactose, Sorbose und Xylose vorzugsweise verwendet, wogegen Saecharose und Lactose von dem Pilz nicht assimiliert werden.As a source of carbon and energy, sugars are preferred to fats, and of the sugars, glucose, fructose, galactose, sorbose and xylose are preferable is used, whereas the fungus does not assimilate the saecharose and lactose.

Als besondere Bestandteile, die an der Zusammensetzung eines geeigneten Kulturmediums beteiligt sind, können Hefeextrakt, Glycerin, Caseinhydrolysate oder Aminosäuren und bestimmte wasserlösliche Vitamine erwähnt werden, und der pH-Wert des Substrates wird vorzugsweise auf etwa 4,5 bis 6,5 eingestellt, bevor das Fermentationsverfahren begonnen wird.As particular ingredients involved in the composition of a suitable culture medium, yeast extract, glycerol, casein hydrolysates or amino acids and certain water-soluble vitamins can be mentioned, and the pH of the substrate is preferably adjusted to about 4.5 to 6.5 before the fermentation process is started.

Wenn die Bildung der Verbindung WG 696 beim Fermentationsverfahren aufhört oder wenn eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht ist, wird die Verbindung abgetrennt, aber vorzugsweise nicht, bevor das Mycel von dem Kulturmedium, z. B. durch Filtration, getrennt ist, Die Verbindung WG 696 wird von der Kultur am besten durch Extraktion derselben mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar oder nur teilweise mischbar ist, wie Methylisobutylketon, Hexan, Chloroform, Leichtpetroleum od. dgl., isoliert.When the formation of the compound WG 696 ceases in the fermentation process or when a satisfactory yield is reached, the compound is separated, but preferably not before the mycelium is removed from the culture medium, e.g. B. by filtration, the compound WG 696 is best from the culture by extraction of the same with an organic solvent that is immiscible or only partially miscible with water, such as methyl isobutyl ketone, hexane, chloroform, light petroleum or the like., isolated.

Der nach Eindampfen des Extraktionsmediums erhaltene Rückstand ist die rohe Verbindung WG 696. Wenn dieses Produkt einer fraktionierten Destillation im Vakuum unterworfen oder chromatographiert wird, wird die reine Verbindung in flüssiger Form erhalten. Als geeignete Adsorbentien für die Chromatographie sind beispielsweise neutrale Tonerde oder Kieselsäuregel und als Lösungsmittel für diesen Zweck insbesondere Kohlenwasserstoffe oder Mischungen von Kohlenwasserstoffen und Äther zu nennen.The residue obtained after evaporation of the extraction medium is the crude compound WG 696. If this product is subjected to fractional distillation in vacuo or chromatographed, the pure compound is obtained in liquid form. Suitable adsorbents for chromatography include, for example, neutral alumina or silica gel, and solvents for this purpose in particular hydrocarbons or mixtures of hydrocarbons and ethers.

Das auf diese Weise erhaltene flüssige Produkt behält, selbst wenn es rein ist, bei einer Temperatur in der Nähe der Raumtemperatur die erwähnte physikalische Form auf Grund einer ausgeprägten Kristallisationsträgheit eine gewisse Zeit lang bei und kann gewünschtenfalls in dieser Form verwendet werden.The liquid product obtained in this way retains even if it is pure, at a temperature close to room temperature the mentioned physical Form for a certain period of time due to pronounced inertia to crystallization at and can be used in this form if desired.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird jedoch auf einfache Weise die Verbindung WG 696 in kristalliner Form erhalten, indem der obenerwähnte Rückstand statt einer fraktionierten Destillation einem Kristallisationsverfahren unterworfen wird, was im Falle einer Herstellung in technischem Maßstab ein Vorteil sein kann, da die Verbindung WG 696 bei erhöhten Temperaturen mehr oder minder instabil ist und selbst dann instabil ist, wenn sie längere Zeit auf die Temperaturen, die für eine Vakuumdestillation erforderlich sind, beispielsweise Temperaturen von 110 bis 120'C, erhitzt wird.In a preferred embodiment of the process according to the invention, however, the compound WG 696 is obtained in crystalline form in a simple manner by subjecting the above-mentioned residue to a crystallization process instead of fractional distillation, which can be an advantage in the case of production on an industrial scale, since the compound WG 696 is more or less unstable at elevated temperatures and is even then unstable if it is heated to the temperatures required for vacuum distillation, for example temperatures of 110 to 120 ° C., for a longer period of time.

Bei dieser günstigen Ausführungsform wird das die Verbindung WG 696 enthaltende Kulturmedium mit einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Leichtpetroleum, extrahiert und die erhaltene organische Phase zur Trockene eingedampft, wonach dann der Rückstand auf eine Temperatur unter -10'C, vorzugsweise auf eine Temperatur zwischen -20 und -70'C, abgekühlt wird, bei der die Verbindung WG 696 in kurzer Zeit kristallisiert. Im allgemeinen ist es aber vorteilhaft, die Kristallisation in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, wie eines Kohlenwasserstoffes, vorzugsweise eines aliphatischen Kohlenwasserstoffes, in dem die Verbindung WG 696 bei niedrigen Temperaturen schwer löslich ist, wie Leichtpetroleum mit einem Kp. von 40 bis 50'C, durchzuführen. Nach dem Kristallisieren wird die ausgefallene Verbindung WG 696 abgetrennt und bei Raumtemperatur getrocknet.In this favorable embodiment, the culture medium containing the compound WG 696 is extracted with an aliphatic hydrocarbon, such as light petroleum, and the organic phase obtained is evaporated to dryness, after which the residue is then brought to a temperature below -10'C, preferably to a temperature between -20 and -70'C, at which the compound WG 696 crystallizes in a short time. In general, however, it is advantageous to carry out the crystallization in the presence of a suitable solvent, such as a hydrocarbon, preferably an aliphatic hydrocarbon in which the compound WG 696 is sparingly soluble at low temperatures, such as light petroleum with a b.p. of 40 to 50 ° C, perform. After crystallization, the compound WG 696 which has precipitated is separated off and dried at room temperature.

In gewissen Fällen, beispielsweise wenn der obenerwähnte Rückstand nicht genügend rein ist, kann es sich als vorteilhaft erweisen, diesen Rückstand vor Durchführung des erwähnten Kristallisationsprozesses einer mehr oder weniger wirksamen fraktionierten Destillation zu unterwerfen oder zu chromatographieren.In certain cases, for example when the residue mentioned above If this residue is not sufficiently pure, it can prove beneficial before carrying out the mentioned crystallization process one more or less subject to effective fractional distillation or chromatograph.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.The invention is explained in more detail by means of the following examples.

Beispiel 1 300 ml eines Substrates der Zusammensetzung: Glycerin ..................... 7,5 g Maisquellwasser (500/0ig) ...... 2,5 g Glucose ..................... 10,0-Staleys Nährstoff (Sojabohnenmehl) .......... 15,0-MgS0 . ...................... 0,05 g KH,PO . ..................... 0,06 g FeSO, ....................... 0,005 g CUSO . ...................... 0,004 g pro Liter Leitungswasser wurden in einen Kolben mit einem Fassungsraum von 2 1 eingebracht, auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und 30 Minuten bei einer Temperatur von 120'C sterilisiert. Nach dem Abkühlen ,wmrde der Inhalt des Kolbens mit einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8, die aus dem Sporenbildungsstadium entwickelt worden war, angeimpft und dann in einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung in einem mit einem Thermostaten ausgestatteten Raum auf einer Temperatur von 27'C gehalten. Die Bildung der Verbindung WG 696 wurde durch Bestimmung der Hemmungszone im Agarschalentest auf filtrierten Proben des Kulturmediums, wobei Candida albicans als Testorganismus verwendet wurde, verfolgt. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden betrug die Gesamtausbeute 300 #tg je Milliliter des Kulturmediums. Beispiel 2 10001 Substrat der obenerwähnten Zusammensetzung, wobei jedoch die Glucosekonzentration auf 5 0/, erhöht war, wurden in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsraum von 15001 eingebracht und bei einer Temperatur von 120'C 30 Minuten lang sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt des Tanks mit 2,5 1 einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8 angeimpft, die durch Bebrüten des Pilzes in einem Medium der gleichen Zusammensetzung, wie sie im Beispiel 1 angegeben ist, während eines Zeitraumes von 48 Stunden in einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei einer Temperatur von 27'C erhalten worden war. Das Fermentationsverfahren in dem Gefäß von halbtechnischem Maßstab wurde 72 Stunden lan- bei einer Temperatur von 27'C unter Rühren und Belüftung durchgeführt, wobei Luft in einer Menge von 0,6 m/h zugeführt wurde. Am Ende der Fermentation lag ein Gehalt von 300 #t- der Verbindung WG 696 je Milliliter des Kulturmediums vor.Example 1 300 ml of a substrate with the composition: glycerine ..................... 7.5 g corn steep liquor (500/0) ...... 2.5 g glucose ..................... 10.0-Staleys nutrient (soybean meal) .......... 15.0-MgS0 . ...................... 0.05 g KH, PO . ..................... 0.06 g FeSO, ....................... 0.005 g of CUSO . ...................... 0.004 g per liter of tap water were introduced into a flask having a capacity of 2 1, adjusted to a pH value of 6.5 and Sterilized for 30 minutes at a temperature of 120'C. After cooling, the contents of the flask would be inoculated with a vegetative culture of Trichoderma viride Leo ND 8 developed from the sporulation stage and then in a reciprocating shaker in a thermostated room at a temperature of 27 'C held. The formation of the compound WG 696 was followed by determining the inhibition zone in the agar dish test on filtered samples of the culture medium, Candida albicans being used as the test organism. After a fermentation time of 48 hours, the total yield was 300 tg per milliliter of the culture medium. Example 2 10001 substrate of the above-mentioned composition, except that the glucose concentration to 5 0 /, was increased, were placed in a stainless steel tank with a capacity of 15001 and sterilized at a temperature of 120'C for 30 minutes. After cooling, the contents of the tank were inoculated with 2.5 l of a vegetative culture of Trichoderma viride Leo ND 8 , which was obtained by incubating the fungus in a medium of the same composition as that given in Example 1 for a period of 48 hours in a reciprocating shaker at a temperature of 27'C. The fermentation process in the pilot-scale vessel was carried out for 72 hours at a temperature of 27 ° C. with stirring and aeration, with air being supplied in an amount of 0.6 m / h. At the end of the fermentation there was a content of 300 # t of the compound WG 696 per milliliter of the culture medium.

8 1 der geklärten Kulturflüssigkeit wurden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit Leichtpetroleum (Kp. 40 bis 50'C) extrahiert; die vereinigten Auszüge (3 1) wurden mit 500 ml Wasser gewaschen, getrocknet und bis zur Sirupkonsistenz eingeengt, und der erhaltene Sirup wurde anschließend im Vakuum destilliert. Die Fraktion mit einem Kp. von 110 bis 112'C/0,05 mm Hg lag in einer Menge von 2,1 g vor und stellte die reine Verbindun- WG 696 dar. 8 l of the clarified culture liquid was adjusted to a pH of 8.0 and extracted twice with light kerosene (boiling point 40 to 50 ° C.); the combined extracts (3 l) were washed with 500 ml of water, dried and concentrated to a syrup consistency, and the syrup obtained was then distilled in vacuo. The fraction with bp. Of 110 to 112'C / 0.05 mm Hg was present in an amount of 2.1 g and put the pure Verbindun- WG 696 represents.

Analyse (C"H"0,): Gefunden ... C 69,52 0/" H 8,30 berechnet ... C 69,83 0/" H 8,27 0/,. [x]'D' # -11' (1 "/, in Chloroform). Das UV-Absorptionsspektrum in Äthanol zeigte ein Absorptionsmaximum bei etwa 205 m#t (e = 2400), und das IR-Spektrum (1 % in Tetrachlorkohlenstoff) zeigte charakteristische Banden bei 960, 970, 1032, 1084, 1224, 1245, 1376, 1735 und 2790 cm-'.Analysis (C "H" 0,): Found ... C 69.52 0 / "H 8.30 calcd ... C 69.83 0 /" H 8.27 0 / ,. [x] 'D'# -11 '(1 "/, in chloroform). The UV absorption spectrum in ethanol showed an absorption maximum at about 205 m # t (e = 2400), and the IR spectrum (1% in carbon tetrachloride ) showed characteristic bands at 960, 970, 1032, 1084, 1224, 1245, 1376, 1735 and 2790 cm- '.

5 g der auf die oben angeführte Weise erhaltenen Verbindung WG 696 wurden in 50 ml Pentan gelöst, und die erhaltene Lösunc, wurde unter Rühren langsam auf eine Temperatur von -70'C abgekühlt, wobei die Verbindung in Form von farblosen Kristallen ausfiel. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit kaltem Pentan (Temperatur -50 bis -70'C) gewaschen und getrocknet; es wurde die gewünschte kristalline Verbindung in einer Ausbeute von 4,6 - mit einem Fp. von 46'C erhalten. 5 g of the compound WG 696 obtained in the above-mentioned manner were dissolved in 50 ml of pentane, and the solution obtained was slowly cooled to a temperature of -70 ° C. with stirring, the compound precipitating in the form of colorless crystals. The crystals were filtered off, washed with cold pentane (temperature -50 to -70'C) and dried; it was the desired crystalline compound in a yield of 4.6 - obtained with a melting point of 46'C..

Die Elementaranalyse, die optische Drehung und das IR- und UV-Spektrum waren identisch mit den entsprechenden Daten für das vorhin genannte ölige Produkt.The elemental analysis, the optical rotation and the IR and UV spectrum were identical to the corresponding data for the aforementioned oily product.

Beispiel 3 100 1 eines Substrates der Zusammensetzung: Glycerin ..................... 7,5 g Maisquellwasser (500/,ig) ...... 2,5 g Glucose ..................... 50,0 g Staleys Nährstoff (Sojabohnenmehl) .......... 15,0 g MgS0 . ...................... 0,05 g KH,PO . ..................... 0,06 g FeS0 ........................ 0,005 g CUSO . ...................... 0,004 g pro Liter Leitungswasser wurden in einem Fermenter einer Versuchsanlage mit einem Fassungsraum von 2001 auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und 30 Minuten bei einer Temperatur von 120'C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt des Fermenters mit 0,5 1 einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8 angeimpft, die durch Bebrüten des Pilzes in einem Kulturgefäß während eines Zeitraumes von 48 Stunden auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei einer Temperatur von 27'C erhalten worden war, wobei das bei diesem Keimverfahren verwendete Substrat die gleiche Zusammensetzun g' wie oben angegeben, aufwies, die Konzentration an Glucose jedoch nur 10/, betrug.Example 3 100 1 of a substrate with the composition: glycerine ..................... 7.5 g corn steep liquor (500 μg) ...... 2, 5 g glucose ..................... 50.0 g Staleys nutrient (soybean meal) .......... 15.0 g MgS0 . ...................... 0.05 g KH, PO . ..................... 0.06 g FeS0 ........................ 0.005 g of CUSO . ...................... 0.004 g per liter of tap water was adjusted to a pH value of 6.5 in a fermenter of a test plant with a capacity of 2001 and 30 Sterilized for minutes at a temperature of 120'C. After cooling, the contents of the fermenter were inoculated with 0.5 l of a vegetative culture of Trichoderma viride Leo ND 8 , which was obtained by incubating the fungus in a culture vessel for a period of 48 hours on a reciprocating shaker at a temperature of 27 'C had been obtained, wherein the substrate used in this nucleation process g the same Composition' as stated above, however, having the concentration of glucose only 10 /, was.

In dem Fermenter der Versuchsanlage wurde ein Fermentationsverfahren 72 Stunden lang bei einer Temperatur von 27'C unter Rühren und Belfftung durchgeführt. Am Ende des Fermentationsprozesses wurde im Agarschalentest unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus ein Gehalt von 250 #tg an der Verbindung WG 696 je Milliliter des Kulturmediums nachgewiesen.In the fermenter of the test plant, a fermentation process was carried out for 72 hours at a temperature of 27 ° C. with stirring and ventilation. At the end of the fermentation process, a content of 250 tg of the compound WG 696 per milliliter of the culture medium was detected in the agar dish test using Candida albicans as the test organism.

25 1 der geklärten Brühe wurden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit Leichtpetroleum (Kp.40 bis50'C) extrahiert.DievereinigtenAuszüge(61) wurden mit Wasser (11) gewaschen, getrocknet und auf eine sirupartige Konsistenz eingedampft; der erhaltene Sirup wurde in 50 ml Pentan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren auf eine Temperatur von -70'C abgekühlt, wobei sich die Verbindung WG 696 in Form von farblosen Kristallen ausschied, die abfiltriert, mit kaltem Pentan gewaschen und getrocknet wurden. Es wurden 5,2 g der Verbindung mit einem Fp. von 44 bis 46'C erhalten. 25 l of the clarified broth was adjusted to pH 8.0 and extracted twice with light kerosene (bp 40 to 50 ° C). The combined extracts (61) were washed with water (11) , dried and evaporated to a syrupy consistency; the obtained syrup was dissolved in 50 ml of pentane. This solution was slowly cooled to a temperature of -70 ° C. with stirring, the compound WG 696 separating out in the form of colorless crystals, which were filtered off, washed with cold pentane and dried. 5.2 g of the compound with a melting point of 44 to 46 ° C. were obtained.

Die auf diese Weise gewonnene Verbindung wurde neuerlich in Pentan (50 ml) gelöst und die Kristallisation unter Kühlen der Lösung auf eine Temperatur von -20'C unter Rühren wiederholt. Die ausgefallenen Kristalle wurden mit kaltem Pentan (-50 bis -70'C) gewaschen und getrocknet, wobei 4,6 g der gewünschten Verbindung mit einem Fp. von 46'C Z, und [x11D1 11' (10/, in Chloroform) erhalten wurden.The compound obtained in this way was redissolved in pentane (50 ml) and the crystallization was repeated while cooling the solution to a temperature of -20.degree. C. with stirring. The precipitated crystals were washed with cold pentane (-50 to -70'C) and dried, whereby 4.6 g of the desired compound with a melting point of 46'C Z, and [x11D1 11 ' (10 /, in chloroform) were obtained.

Claims

Claim: Process for the production of the new antibiotic WG696, characterized in that Trichoderma viride Leo ND 8, strain ATCC 14 910, is cultivated in the usual biological way and the antibiotic WG 696 formed is isolated from the culture medium. Publications considered: Korzybski and Kurylowicz, »Antibiotica% 1961, pp. 899 to 903 and 911 to 913.