DE1150779B

DE1150779B - Process for obtaining organ preparations with a spasmolytic effect

Info

Publication number: DE1150779B
Application number: DER22914A
Authority: DE
Inventors: Dr Pharm Maurice Roux
Original assignee: PHARM MAURICE ROUX DR
Current assignee: PHARM MAURICE ROUX DR
Priority date: 1957-03-20
Filing date: 1958-03-17
Publication date: 1963-06-27

Description

Verfahren zur Gewinnung von Organpräparaten mit spasmolytischer Wirkung Die Erfindung betnfft ein Verfahren zur Gewinnung von Polypeptiden mit spasmolytischer Wirksamkeit. Process for obtaining organ specimens with a spasmolytic effect The invention concerns a method for obtaining polypeptides with spasmolytic Effectiveness.

Diese Stoffe sind zur Benutzung als krampflösende Mittel in der Gastro-Enterologie und der Urologie bestimmt. Sie haben eine gallenflußfördernde Wirkung auf den Verdauungsapparat und liefern sehr gute Ergebnisse in Fällen von spastischer Kolitis. Die Magengeschwüre begleitenden Magenschmerzen werden durch diese Stoffe beseitigt. Diese Stoffe haben auch auf den Harnapparat eine sehr interessante Wirkung in allen Krankheiten, bei welchen Kontraktionen der glatten Muskeln auftreten. These substances are intended for use as antispasmodic agents in gastro-enterology and urology determined. They have a bile flow-promoting effect on the digestive system and give very good results in cases of spastic colitis. The stomach ulcers accompanying stomach pains are eliminated by these substances. These substances have also has a very interesting effect in all diseases on the urinary system what smooth muscle contractions occur.

Die erfindungsgemäß herstellbaren Polypeptide weisen außerdem besonders eine überlegene Wirkung in krampflösender oder oxytozischer Hinsicht bei Geburten auf, ohne daß irgendwelche abträglichen Nebenwirkungen z. B. eine Hypertonie oder Rhythmusstörungen der Uteruskontraktionen zu bemerken wären. Auch auf den Fötus werden keine nachträglichen Wirkungen ausgeübt. Dagegen ist die Aktion der erfindungsgemäß herstellbaren Polypeptide auf die Dilatation außerordentlich schnell; sie findet im allgemeinen schon 2 bis 15 Minuten nach der Verabreichung der Polypeptide statt. The polypeptides which can be prepared according to the invention also have particularly a superior antispasmodic or oxytocic effect in childbirth without any adverse side effects such. B. hypertension or Arrhythmias of the uterine contractions would be noticed. Also on the fetus no subsequent effects are exerted. In contrast, the action is that according to the invention producible polypeptides on the dilation extremely quickly; she finds generally takes place as early as 2 to 15 minutes after administration of the polypeptides.

Die Erfindung bezweckt die Angabe eines Verfahrens zur Herstellung derartiger Stoffe, welche besser als bisher den Erfordernissen der Praxis entsprechen, insbesondere hinsichtlich der Reinheit der erhaltenen Stoffe. The invention aims to provide a method of manufacture such substances, which meet the requirements of practice better than before, especially with regard to the purity of the substances obtained.

Erfindungsgemäß hydrolysiert man die zu einem Brei zerkleinerten Lymphknoten von Ochsen oder Schafen oder die Thymusdrüsen von Kälbern mit der Lösung einer Protease insbesondere von Papain unter Erwärmen, inaktiviert das Enzym durch Erhitzen der Lösung, fällt aus dem Filtrat die Polypeptide fraktioniert mit Alkohol und gewinnt aus dem mit absolutem Alkohol gefällten Produkt den Wirkstoff gegebenenfalls nach Dialyse gegen Wasser. According to the invention, those comminuted to a pulp are hydrolyzed Ox or sheep lymph nodes or the thymus glands of calves with the solution a protease, in particular from papain, by heating, inactivates the enzyme Heating the solution, the filtrate precipitates the polypeptides fractionated with alcohol and if necessary, wins the active ingredient from the product precipitated with absolute alcohol after dialysis against water.

Vorzugsweise wird beim Arbeiten z. B. mit Lymphknoten folgende Arbeitsweise angewandt: Die Lymphknoten werden sofort nach dem Schlachten der Tiere entnommen, von dem anhängenden Gewebe und Fett getrennt, worauf sie sofort in gekühltes Azeton getaucht und schnell gefroren werden. Preferably when working z. B. with lymph nodes the following working method applied: the lymph nodes are removed immediately after the animals are slaughtered, separated from the attached tissue and fat, whereupon they are immediately placed in chilled acetone submerged and frozen quickly.

Die Lymphknoten werden dann, gegebenenfalls nach Entfernen des Acetons, zu einem Brei zerkleinert. The lymph nodes are then, if necessary after removing the acetone, crushed to a pulp.

Ein Kilogramm dieses Breis wird in 21 Wasser suspendiert und das Ganze auf eine Temperatur von etwa 600 C erhitzt. Nach Erreichung dieser Tempe- ratur wird das p11 geprüft, um sicher zu sein, daß es in der Nähe von 7 liegt. One kilogram of this pulp is suspended in water and that Whole heated to a temperature of about 600 C. After reaching this temperature rature the p11 is checked to be sure it is close to 7.

Hierauf wird eine Enzymlösung hergestellt, z. B. aus Papain, die z. B. 10 g Papain auf 100 cm8 Wasser enthält. An enzyme solution is then prepared, e.g. B. from papain, the z. B. contains 10 g papain per 100 cm8 of water.

Diese Lösung wird in die auf obige Weise hergestellte Drüsenaufschlämmung gegossen und während 15 Minuten bei 600 C zur Einwirkung gebracht, worauf das Ganze auf Siedetemperatur gebracht wird. This solution becomes the glandular slurry prepared in the above manner poured and brought to action for 15 minutes at 600 C, whereupon the whole thing is brought to boiling temperature.

Eine Temperatur von 1000 C wird während 10 Minuten aufrechterhalten und das Erzeugnis auf einem Filtertuch gefiltert.A temperature of 1000 C is maintained for 10 minutes and filtered the product on a filter cloth.

Die gefilterte Flüssigkeit wird dann mit dem gleichen Volumen 900/oigen Alkohol versetzt und das Ganze eine Nacht im Kühlschrank stehengelassen. The filtered liquid is then 900 / oigen with the same volume Alcohol was added and the whole thing left in the refrigerator for one night.

Der sich bildende Niederschlag wird entfernt. Dieser erste Alkoholniederschlag enthält im allgemeinen verschiedene Proteine, die keinen enzymischen Abbau erfahren haben und nach intramuskulärer Einspritzung eine Sensibilisierungswfrkung haben können.The precipitate that forms is removed. That first alcoholic precipitate generally contains various proteins that do not undergo enzymatic degradation and have a sensitizing effect after intramuscular injection can.

Schließlich wird der Rest auf Papier gefiltert, und nach Zusatz von 7 Volumteilen gekühltem absolutem Alkohol erhält man einen Niederschlag, der das gewünschte Erzeugnis bildet, d. h. das Polypeptid. Finally, the rest is filtered on paper, and after adding 7 parts by volume chilled absolute Alcohol gives a precipitate, which forms the desired product, d. H. the polypeptide.

Dieser letztere Niederschlag wird nach Absetzen in einem Eiskasten mit absolutem Alkohol und hierauf mit wasserfreiem Äther gewaschen und schließlich im Vakuum bei hoher Temperatur getrocknet. This latter precipitate is deposited in an ice box after settling washed with absolute alcohol and then with anhydrous ether and finally dried in vacuum at high temperature.

Man erhält so schließlich etwa 50g eines Rohhydrolysats, das das obenerwähnte Polypeptid enthält, von dem sich bei Versuchen gezeigt hat, daß es krampflösende und gefäßerweiternde Eigenschaften hat. This finally gives about 50g of a crude hydrolyzate that contains the Contains the above-mentioned polypeptide which has been shown in experiments to be Has antispasmodic and vasodilator properties.

Wenn man Thymusdrüsen von Kälbern anstatt der Lymphknoten einsetzt, wird in genau derselben Weise vorgegangen. Using calf thymus glands instead of lymph nodes is done in exactly the same way.

Zur Messung der krampflösenden Wirkung des Erzeugnisses kann folgende Methode benutzt werden: Ratten mit einem Gewicht von 150 bis 200 g werden betäubt und durch Durchschneiden ihrer Halsschlagader ausgeblutet, worauf etwa 10 cm des Zwölfnngerdarrns dieser Tiere sofort entnommen werden. Das Eingeweide wird dann in eine Tyrodelösung getaucht. Ein Zwölffingerdarmstück von etwa 2,5 cm Länge wird in einem isolierten Gefäß befestigt, das die belüftete Tyrodelösung enthält. Die Temperatur des Wasserbades wird auf 380 C gehalten. Sobald das Eingeweidestück erschlafft ist, wird dem Bad ein Milligramm Bariumchlorid zugesetzt, worauf eine die halbe Erschlaffung des Krampfes bewirkende Menge Polypeptid in aufeinanderfolgenden Dosen zugesetzt wird. To measure the antispasmodic effect of the product the following can be used Method to be used: Rats weighing 150 to 200 g are anesthetized and bled out by cutting through her carotid artery, whereupon about 10 cm of the Twelve-nosed bowels of these animals must be removed immediately. The bowels will then immersed in a Tyrode solution. A piece of duodenum approximately 2.5 cm in length is made fixed in an insulated vessel containing the aerated Tyrode solution. the The temperature of the water bath is kept at 380.degree. As soon as the viscera has slackened one milligram of barium chloride is added to the bath, whereupon one half is added Amount of polypeptide to relax the spasm in consecutive doses is added.

Als biologische Einheit für das Polypeptid wird die Menge vorgeschlagen, welche je Kubikzentimeter der Tyrodelösung die halbe Lösung des Krampfs bewirkt, welcher an einem Zwölffingerdarmstück einer Ratte durch 0,10 Milligramm Bariumchlorid erzeugt wird. The proposed biological unit for the polypeptide is the amount which per cubic centimeter of the Tyrode solution causes half the solution of the spasm, which on a piece of the duodenum of a rat by 0.10 milligrams of barium chloride is produced.

Diese Methode gestattet die Bestimmung der Verbesserung der Wirksamkeit des krampflösenden Erzeugnisses durch die verschiedenen, im folgenden beschriebenen Anreicherungsmethoden. This method allows the improvement in effectiveness to be determined of the antispasmodic product through the various options described below Enrichment methods.

Eine Methode besteht in einer Dialyse, z. B. durch das im Handel unter dem Namen »Cellophan« bekannte Material gegen destilliertes Wasser. One method is dialysis, e.g. B. through the trade Material known as "cellophane" against distilled water.

Die Dialyse wird bei einer Temperatur von + 40 C vorgenommen und während 48 Stunden unter Toluol aufrechterhalten. Das durch eine derartige Dialyse erhaltene Erzeugnis ist nach Konzentration im Vakuum bei niedriger Temperatur fünfmal wirksamer als das Rohpolypeptid. Dialysis is carried out at a temperature of + 40 C and maintained under toluene for 48 hours. That by dialysis like this obtained product is five times after concentration in vacuum at low temperature more effective than the crude polypeptide.

Eine andere Methode besteht in der Auflösung in Essigsäure. Another method is to dissolve it in acetic acid.

Das Rohpolypeptid wird mit Eisessigsäure behandelt, und der unlösliche Teil wird durch Zentrifugieren ausgeschieden. Die Flüssigkeit über dem unlöslichen Teil wird abgegossen und dann mit 8 Volumen wasserfreiem Äther behandelt. Der nach Zentrifugieren erhaltene Niederschlag wird mit Äther gewaschen, und die Eisessigsäure wird durch Erhitzen im Vakuum entfernt. Man erhält so ein Polypeptid, welches drei- bis fünfmal wirksamer ist. The crude polypeptide is treated with glacial acetic acid, and the insoluble one Part is eliminated by centrifugation. The liquid above the insoluble Part is poured off and then treated with 8 volumes of anhydrous ether. The after Centrifugation obtained precipitate is washed with ether, and the glacial acetic acid is removed by heating in vacuo. A polypeptide is obtained that has three up to five times more effective.

Ein weiteres Verfahren ist die chromatographische Adsorption, z. B. an einer Aluminiumoxydsäule. Another method is chromatographic adsorption, e.g. B. on an aluminum oxide column.

Für die Chromatographie geeignetes Aluminiumoxyd wird während einer Stunde mit normaler Salzsäure umgerührt und hierauf mit destilliertem Wasser gewaschen, bis das p, gleich 6 wird. Hierauf wird es im Vakuum bei 700 C getrocknet und mit 400/obigem Alkohol in Berührung gebracht, worauf es in eine Säule mit einem Durchmesser von 3 cm und einer Höhe von 10 cm gebracht wird, wobei ein Eindringen von Luft in die Säule vermieden wird. Die Kolonne wird mit 400/oigem Alkohol gewaschen, worauf die Chromatographie von 0,500 g Rohpolypeptid in Lösung in 100 cm3 400/oigem Alkohol vorgenommen wird. Der Durchgang erfolgt langsam durch Benutzung eines Vakuums zur Erzeugung einer leichten Saugwirkung. Alumina suitable for chromatography is used during a Stirred with normal hydrochloric acid for an hour and then washed with distilled water, until the p, equals 6. It is then dried in vacuo at 700 ° C. and with 400 / brought into contact with the above alcohol, whereupon it into a column with a diameter of 3 cm and a height of 10 cm, with an ingress of air into the column is avoided. The column is washed with 400% alcohol, whereupon the chromatography of 0.500 g of crude polypeptide in solution in 100 cm3 of 400% alcohol is made. The passage is done slowly using a vacuum Creates a slight suction effect.

Die ersten 200 cm8 werden entfernt, welche keine wirksame Substanz enthalten, und die nächsten 250 cm8 werden aufgefangen. Man erhält so ein Polypeptid, welches zwölfmal so wirksam und vollständig von Pigmenten frei ist. The first 200 cm8 are removed, which is no active substance and the next 250 cm8 are collected. A polypeptide is obtained, which is twelve times as effective and completely free of pigments.

Gemäß einem anderen Verfahren wird eine Trennungschromatographie an einer Zellulosesäule vorgenommen. Another method is separation chromatography made on a cellulose column.

Ein aschefreies Zellulosepulver wird in einem Lösungsmittel aufgeschlämmt, welches aus einem Gemisch von 78°/o n-Butanol, 5°/0 Essigsäure und l70/o Wasser besteht. An ashless cellulose powder is slurried in a solvent, which consists of a mixture of 78% n-butanol, 5% acetic acid and 170% water consists.

Diese Aufschlämmung wird in eine Säule mit einer Höhe von 12 cm und einem Durchmesser von 3 cm gebracht. Mittels einer Wasserstrahlpumpe wird eine leichte Saugwirkung erzeugt, und der Inhalt der Säule wird lange mit dem Lösungsmittel gewaschen. Dann erfolgt die Chromatographie dadurch, daß oben in die Säule zunächst eine Lösung von 100 Milligramm Rohpolypeptid in 0,5 cm3 Wasser und hierauf das in geringen Mengen eingegossen wird. This slurry is poured into a column with a height of 12 cm and brought a diameter of 3 cm. A water jet pump is used to create a light Suction is generated, and the contents of the column are washed with the solvent for a long time. Chromatography is then carried out by first adding a solution to the top of the column of 100 milligrams of crude polypeptide in 0.5 cm3 of water and then in small quantities is poured.

Die ersten 100 cm3 werden entfernt. Der wirksame Stoff ist in den nächsten 60 cm8 konzentriert, was gestattet, ein siebenmal so wirksames Polypeptid zu erhalten. The first 100 cm3 are removed. The active substance is in the next 60 cm8, which allows a polypeptide that is seven times as effective to obtain.

Es ist zu bemerken, daß bei gleichzeitiger Benutzung der obigen Anreicherungsmethoden (Dialyse mit nachfolgender Chromatographie an Aluminiumoxyd und hierauf Chromatographie an Zellulose) ein Polypeptid erhalten werden kann, welches zweiundaohtzigmal wirksamer als das Rohpolypeptid ist. It should be noted that when the above enrichment methods are used simultaneously (Dialysis with subsequent chromatography on aluminum oxide and then chromatography on cellulose) a polypeptide can be obtained which is eighty-two times more effective than is the crude polypeptide.

Das erhaltene Präparat kann auch auf anderen Gebieten als dem Heilmittelgebiet angewandt werden. The preparation obtained can also be used in fields other than the field of medicinal products can be applied.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for obtaining organ specimens with spasmolytic effectiveness, characterized in that the crushed to a pulp Ox or sheep lymph nodes or the thymus glands of calves with the solution a protease, in particular papain, is hydrolyzed by heating the enzyme Heating the solution inactivated, from the filtrate fractionated the polypeptides, using Alcohol falls and from the product precipitated with absolute alcohol the active ingredient, possibly after dialysis against water, wins.

2. The method according to claim 1, characterized in that 15 Hydrolyzed with papain for minutes at about 600 C at a pH of about 7.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that that one begins the fractional precipitation with 1 volume of about 900% alcohol, the precipitate is removed and the active ingredient is precipitated with 7 volumes of absolute alcohol.

4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that that the active ingredient after precipitation with alcohol by dissolving in acetic acid and repeated precipitation with ether cleans.

5. The method according to claims 1 to 3, characterized in that that the active ingredient after precipitation with alcohol by chromatographic adsorption cleans on an aluminum oxide and / or cellulose column.