DE1138510B

DE1138510B - Production and extraction of the antibiotic rufomycin

Info

Publication number: DE1138510B
Application number: DET19628A
Authority: DE
Inventors: Koiti Nakazawa; Motoo Shibata; Eiji Higashidi; Toshiniko Kanzaki; Hiroishi Yamamoto; Akira Miyake; Jisaburo Ueyanagi; Hidesuke Iwasaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1960-02-08
Filing date: 1961-02-07
Publication date: 1962-10-25

Description

Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums Rufomycin Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Rufomycin, eines neuen Antibiotikums, das durch einen Stamm eines zur Gattung Streptomyces gehörenden Mikroorganismus erzeugt wird.Manufacture and Obtainment of the Antibiotic Rufomycin The Invention refers to the manufacture of rufomycin, a new antibiotic that is made by a strain of a microorganism belonging to the genus Streptomyces is produced.

Um ein neues Antibiotikum zu finden, wurde von den Erfindern eine umfassende Nachforschung durchgeführt, die sich auf Stoffwechselprodukte erstreckte, die durch viele Arten von Mikroorganismen erzeugt werden, welche von Bodenproben aus den verschiedensten Bezirken von Japan isoliert wurden. Als Ergebnis wurde gefunden, daß ein gewisser Mikroorganismus ein neues Antibiotikum erzeugt, daß der Mikroorganismus künstlich zur Anreicherung des Antibiotikums in der Nährlösung bebrütet werden kann, daß das Antibiotikum aus der Nährlösung abtrennbar ist und daß der Mikroorganismus zur Gattung Streptomyces gehört. Die Erfinder bezeichneten diesen Stamm als Streptomyces atratus nov. sp. und das Antibiotikum als Rufomycin. Streptomyces atratus erzeugt im allgemeinen gleichzeitig zwei Arten von Antibiotika, die sich in den Eigenschaften voneinander unterscheiden. Beide werden jedoch Rufomycin genannt. Falls sie jedoch unterschieden werden müssen, werden sie Rufomycin A und Rufomycin B genannt.In order to find a new antibiotic, the inventors created a extensive research carried out on metabolic products, generated by many types of microorganisms, which are from soil samples isolated from various districts of Japan. As a result it was found that a certain microorganism creates a new antibiotic, that microorganism can be artificially incubated to enrich the antibiotic in the nutrient solution, that the antibiotic can be separated from the nutrient solution and that the microorganism belongs to the genus Streptomyces. The inventors named this strain Streptomyces atratus nov. sp. and the antibiotic called rufomycin. Streptomyces atratus generally simultaneously two types of antibiotics, which differ in the properties differ from each other. However, both are called rufomycin. But if they do need to be distinguished, they are called rufomycin A and rufomycin B.

Ein Stamm von Streptomyces atratus wurde von den Erfindern erstmals von einer Bodenprobe isoliert, die am Ufer des Kinokawa, Präfektur Wakayama, Japan, entnommen wurde. Der Stamm wurde beim Institut für Fermentation, Osaka, Japan, und beim American Type Culture Collection, Washington, D. C., unter der Nummer IFO-3897 und ATCC-14046 hinterlegt. Die Kulturmerkmale des Stamms werden beschrieben. Hierbei liegen den mit »Rdg.« gekennzeichneten Farbbezeichnungen Ridgway's Color Standards and Color Nomenclature zugrunde.A strain of Streptomyces atratus was first identified by the inventors isolated from a soil sample taken on the banks of Kinokawa, Wakayama Prefecture, Japan, was taken. The strain was obtained from the Fermentation Institute, Osaka, Japan, and from the American Type Culture Collection, Washington, D. C., under number IFO-3897 and ATCC-14046. The culture characteristics of the strain are described. Here are based on the Ridgway's Color Standards marked with »Rdg.« and Color Nomenclature.

1. Dieser Stamm wird als ein zur Gruppe Streptomyces hygroscopicus gehörender Mikroorganismus angesehen, da sein Luftmycel naß und schwarz wird, wenn er 2 Wochen oder mehr auf Glukose-Asparagin-Agar bebrütet wird.1. This strain is classified as belonging to the group Streptomyces hygroscopicus considered to belong to the microorganism as its aerial mycelium becomes wet and black when it is incubated on glucose-asparagine agar for 2 weeks or more.

2. Vegetatives Mycel: Sich ausbreitend, dringt in das Medium ein, farblos bis chamois (Rdg. XXX, 19"-b); Hyphen 0,5 bis 0,6 #L Durchmesser. Kein lösliches Pigment bei den meisten Medien.2. Vegetative mycelium: spreading, penetrating the medium, colorless to chamois (Rdg. XXX, 19 "-b); hyphae 0.5 to 0.6 #L in diameter. Not soluble Pigment in most media.

3. Luftmycel: Pulverartig, weiß, später dunkel mausgrau (Rdg. LI,15""'-i) bis schieferfarben (Rdg. LIII, Carbon gray-k), wird auf gewissen Medien (z. B. Glukose-Asparagin-Agar) feucht und weist dunkle glänzende Flecken auf. Sporen erzeugen offene Schlingen oder Spiralen. Hyphen ist kurz, verfilzt, verzweigt, 1,5 bis 1,8 #t Durchmesser. Sporen ellipsoidal bis zylindrisch, 1,3 bis 1,4 - 1,6 bis 2,3 @a. 4. Kulturmerkmale verschiedener Medien: Tabelle 1 Czapek-Agar: Vegetatives Mycel Dünn, sich ausbreitend, farb- los, dringt in das Medium ein. Luftmycel ....... Spärlich, weiß, später maus- grau (Rdg. LI, 15""'). Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment. Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Czapek-Glukose-Agar Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend, farblos, später tief »Colonial Buff<c (Rdg. XXX, 21"-b). Luftmycel ....... Spärlich, weiß bis tiefmaus- grau (Rdg. LI, 15""'-i). Rückseite . ... .. . . Farblos, später cremefarben (Rdg. XVI, 19'-f). Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Glukose-Asparagin-Agar: Vegetatives Mycel Dünn, sich ausbreitend, farb- los, dringt in das Medium ein. Luftmycel ....... Pulverartig, weiß, später tief mausgrau (Rdg. LI, 15""'-i) bis schieferfarben (Rdg. LIII, Carbon gray-k); wird nach einer Kulturzeit von mehr als 2 Wochen auf diesem Medium feucht und weist dunkle glän- zende Flecken auf. Rückseite . . . . . . . . Farblos, später schwarz. Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Hefeextrakt-Agar: Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend, faltig, farblos. Luftmycel ....... Sehr spärlich, weiß. Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment. Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Nähragar: Vegetatives Mycel Sich ausbreitend, glatt, farblos. Luftmycel ....... Nicht vorhanden. Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment. Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Glukose-Nähragar: Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend, faltig, farblos. Luftmycel ....... Reichlich, weiß, später dunkel mausgrau (Rdg. LI, 15""'-k) bis schwärzlichmausgrau (Rdg. LI, 15""'-m). Rückseite ... . .... Farblos bis schwärzlichmaus- grau (Rdg. LI, 15""'-m). Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Glycerin-Nähragar: Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend, faltig, farblos bis gelblichgrün (Rdg. XLI, 25"'-f). Luftmycel ....... Spärlich, weiß bis mausgrau (Rdg. LI, 15 ""' ). Rückseite . . . . . . . . Farblos bis grünlichbraun. Lösliches Pigment Farblos bis gelblichgrün (Rdg. XLI, 25"'-f). Bouillon . .. . . . . .. Transparente Hyphen, kein Mycel am Oberflächenrand, Wachstum sinkt zu Boden. Glukose-Bouillon Transparente Hyphen, kein Mycel am Oberflächenrand, Wachstum sinkt zu Boden. Cellulose ........ Kein Wachstum. Eimedium Vegetatives Mycel Sich ausbreitend, faltig, tief »colonial buff«c (Rdg. XXX, 21 "-b). Luftmycel ....... Spärlich, weiß. Bemerkungen .... Keine Veränderung des Me- diums. Milch ........... Starke Peptonisierung ohne Koagulierung innerhalb von 10 Tagen bei 27'C. Möhrenbrei: Vegetatives Mycel Farblos, sich ausbreitend. Luftmycel ....... Weiß, später tiefmausgrau (Rdg. LI, 15""'-i). Bemerkungen .... Keine Veränderung des Me- diums. Kartoffelbrei: Vegetatives Mycel Reichlich, gefalten, honiggelb (Rdg. XXX, 19"). Luftmycel ....... Nicht vorhanden. Bemerkungen .... Keine Veränderung des Me- diums. Gelatine . . . . . . . . . Vollständige Verflüssigung in einer Woche ohne lösliches Pigment. Tyrosinate-Agar: Vegetatives Mycel Dünn, sich ausbreitend, farb- los. Luftmycel ....... Nicht vorhanden. Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment. Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Calciummalat-Agar: Vegetatives Mycel Reichlich, sich ausbreitend, farblos bis »Colonial BuffR (Rdg. LI, 15""') Luftmycel ....... Spärlich, weiß, später maus- grau (Rdg. LI, 15""'). Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment. Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Nitrat . . . . .. . . . . . Reduktion, transparent mit reichlichem Mycel am Boden. Stärke-Agar: Vegetatives Mycel Farblos, sich ausbreitend. Luftmycel ....... Sehr spärlich, weiß. Rückseite . . . . . . . . Kein Pigment. Lösliches Pigment Nicht vorhanden. Stärke-Agarplatte HydrolysierteZoneproWachs- tumsdurchmesser von 4 bis 6. Hydrolysierte Zone/Wachs- tumsdurchmesser = 33 mm/ 5,5 mm. 5. Kohlenstoffausnutzung auf Agar nach der Methode von Pridhan und Gottlieb: Glycerin ...... +++ Sorbit . . . . . . . . . . . Xylose ....... - Saccharose ...... - Fructose ...... + Raffinose . . . . . . . . +++ Ribose ....... ++ Rhamnose ....... ++ Glukose ...... +++ Cellobiose ....... +++ Sorbose ...... - Erythrit . . . . . . . . . - Mannose ..... +++ Dextrin . . . . . . . . . +-E--I- Maltose ...... +++ Stärke . . . . . . . . . . -f- Galactose ..... +++ Natriumacetat . . . +-I- Lactose ....... ++ Natriumcitrat . . . . +-I- Mannit ....... - Natriumsuccinat . . ++ Bemerkungen: @--f--I- = sehr gutes Wachstum. -I-+ = gutes Wachstum. -!- = mittelmäßiges Wachstum. spärliches Wachstum. - = kein Wachstum. 6. Antimikrobisches Spektrum der lebenden Kultur: Auf einem Bouillon-Agar oder einem Glycerin-Bouillon-Agar in einer Schale wird Streptomyces atratus in Streifen aufgebracht und 4 Tage bei 28°C bebrütet. Dann wurde die folgende Kultur im rechten Winkel dazu aufgebracht. Die Inhibierungslänge bei den folgenden Mikroorganismen war Null.3. Aerial mycelium: Powdery, white, later dark mouse gray (Rdg. LI, 15 ""'- i) to slate-colored (Rdg. LIII, Carbon gray-k), becomes on certain media (e.g. glucose-asparagine-agar ) damp and has dark, shiny spots. Spores create open loops or spirals. Hyphae is short, matted, branched, 1.5 to 1.8 #t in diameter. Spores ellipsoidal to cylindrical, 1.3 to 1.4 - 1.6 to 2.3 @a. 4. Cultural characteristics of different media: Table 1 Czapek agar: Vegetative mycelium Thin, spreading, colored go, penetrate the medium. Aerial mycelium ....... Scanty, white, later mouse- gray (Rdg. LI, 15 ""'). Back. . . . . . . . No pigment. Soluble pigment Not available. Czapek glucose agar Vegetative mycelium Abundant, spreading, colorless, later deep »Colonial Buff <c (Rdg. XXX, 21 "-b). Aerial mycelium ....... Scanty, white to deep mouse- gray (Rdg. LI, 15 ""'- i). Back. ... ... . Colorless, later cream-colored (Rdg. XVI, 19'-f). Soluble pigment Not available. Glucose asparagine agar: Vegetative mycelium Thin, spreading, colored go, penetrate the medium. Aerial mycelium ....... Powder-like, white, later deep mouse gray (round LI, 15 ""'- i) to slate-colored (Rdg. LIII, Carbon gray-k); will after a culture time of more than 2 weeks on this medium moist and has dark, shiny sparkling spots. Back. . . . . . . . Colorless, later black. Soluble pigment Not available. Yeast Extract Agar: Vegetative mycelium Abundant, spreading, wrinkled, colorless. Aerial mycelium ....... Very sparse, white. Back. . . . . . . . No pigment. Soluble pigment Not available. Nutrient agar: Vegetative mycelium Spreading, smooth, colorless. Aerial mycelium ....... Not available. Back. . . . . . . . No pigment. Soluble pigment Not available. Glucose nutrient agar: Vegetative mycelium Abundant, spreading, wrinkled, colorless. Aerial mycelium ....... Abundant, white, later dark mouse gray (round LI, 15 ""'- k) to blackish mouse gray (Rdg. LI, 15 ""'- m). Back side .... .... colorless to blackish mouse gray (round LI, 15 ""'- m). Soluble pigment Not available. Glycerine nutrient agar: Vegetative mycelium Abundant, spreading, wrinkled, colorless to yellowish green (Rdg. XLI, 25 "'- f). Aerial mycelium ....... Scanty, white to mouse gray (Rdg. LI, 15 ""'). Back. . . . . . . . Colorless to greenish brown. Soluble pigment Colorless to yellowish green (Rdg. XLI, 25 "'- f). Bouillon. ... . . . .. Transparent hyphae, no Mycelium on the surface edge, Growth sinks to the ground. Glucose Broth Transparent hyphae, no Mycelium on the surface edge, Growth sinks to the ground. Cellulose ........ No growth. Egg medium Vegetative mycelium Spreading, wrinkled, deep "Colonial buff" c (Rdg. XXX, 21 "-b). Aerial mycelium ....... Scanty, white. Remarks .... No change in the diums. Milk ........... Strong peptonization without Coagulation within 10 days at 27'C. Carrot mash: Vegetative mycelium Colorless, spreading. Aerial mycelium ....... white, later deep mouse gray (Rdg. LI, 15 ""'- i). Remarks .... No change in the diums. Mashed potatoes: Vegetative mycelium Abundant, wrinkled, honey yellow (Rdg. XXX, 19 "). Aerial mycelium ....... Not available. Remarks .... No change in the diums. Gelatin. . . . . . . . . Complete liquefaction in a week without soluble Pigment. Tyrosinate agar: Vegetative mycelium Thin, spreading, colored Come on. Aerial mycelium ....... Not available. Back. . . . . . . . No pigment. Soluble pigment Not available. Calcium malate agar: Vegetative mycelium Abundant, spreading, colorless to »Colonial BuffR (Rdg. LI, 15 ""') Aerial mycelium ....... Scanty, white, later mouse- gray (Rdg. LI, 15 ""'). Back. . . . . . . . No pigment. Soluble pigment Not available. Nitrate. . . . ... . . . . Reduction, transparent with abundant mycelium on the bottom. Starch agar: Vegetative mycelium Colorless, spreading. Aerial mycelium ....... Very sparse, white. Back. . . . . . . . No pigment. Soluble pigment Not available. Starch Agar Plate Hydrolyzed Zone Pro Wax diameter from 4 to 6. Hydrolyzed zone / wax drum diameter = 33 mm / 5.5 mm. 5. Carbon utilization on agar by the method from Pridhan and Gottlieb: Glycerin ...... +++ Sorbitol. . . . . . . . . . . Xylose ....... - Sucrose ...... - Fructose ...... + raffinose. . . . . . . . +++ Ribose ....... ++ Rhamnose ....... ++ Glucose ...... +++ Cellobiose ....... +++ Sorbose ...... - erythritol. . . . . . . . . - Mannose ..... +++ Dextrin. . . . . . . . . + -E - I- Maltose ...... +++ starch. . . . . . . . . . -f- Galactose ..... +++ Sodium Acetate. . . + -I- Lactose ....... ++ Sodium Citrate. . . . + -I- Mannitol ....... - sodium succinate. . ++ Remarks: @ - f - I- = very good growth. -I- + = good growth. -! - = medium growth. sparse growth. - = no growth. 6. Antimicrobial spectrum of the living culture: Streptomyces atratus is applied in strips to a broth agar or a glycerol broth agar in a dish and incubated at 28 ° C. for 4 days. Then the following culture was applied at right angles thereto. The inhibition length in the following microorganisms was zero.

Auf beiden Medien untersuchte Mikroorganismen: Escherichia coli.Microorganisms examined on both media: Escherichia coli.

Proteus vulgaris. Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis. Bacillus cereus.Proteus vulgaris. Staphylococcus aureus. Bacillus subtilis. Bacillus cereus.

Nur auf Bouillon-Agar untersuchte Mikroorganismen Serratia marcescens. Bacillus brevis.Serratia marcescens microorganisms tested only on broth agar. Bacillus brevis.

Nur auf Glycerin-Bouillon-Agar untersuchte Mikroorganismen Mycobacterium sp. 607. Mycobacterium avium.Mycobacterium microorganisms tested only on glycerine broth agar sp. 607. Mycobacterium avium.

Mycobacterium avim, streptomycin-resistent. Zu den bekannten Mikroorganismen, die Streptomyces atratus am nächsten kommen, gehören die Gattungen Streptomyces halstedii und Streptomyces hygroscopicus, aber gerade die bei diesen beiden Gattungen beobachteten Eigenschaften unterscheiden sich deutlich von denen des Streptomyces atratus. Die deutlichen Unterschiede zwischen Streptomyces atratus und Streptomyces halstedii bzw. Streptomyces hygroscopicus in den jeweiligen Eigenschaften auf den verschiedensten Kulturmedien sind in Tabelle 2 aufgeführt.Mycobacterium avim, streptomycin resistant. To the known microorganisms, the closest to Streptomyces atratus belong to the genera Streptomyces halstedii and Streptomyces hygroscopicus, but precisely those in these two genera observed properties differ significantly from those of Streptomyces atratus. The clear differences between Streptomyces atratus and Streptomyces halstedii or Streptomyces hygroscopicus in the respective properties on the A wide variety of culture media are listed in Table 2.

Die morphologischen Unterschiede bestehen darin, daß die Sporophoren von Streptomyces atratus hauptsächlich schlingenförmig sind und selten Spiralen mit einer bis zwei Windungen bilden, während Streptomyces halstedii viele geschlossene Spiralen und Streptomyces hygroscopicus hauptsächlich Spiralen mit einer bis zwei Windungen aufweist. Mehrere Unterschiede bestehen in der Verwertung des Kohlenstoffs. Diese Unterschiede sind in Tabelle 3 aufgeführt. Der wichtigste Unterschied zwischen Streptomyces atratus und den anderen Mikroorganismen besteht darin, daß Streptomyces halstedii Carbomycin und CarbomycinB erzeugt und Streptomyces hygroscopicus Hygromycin, Hygroscopin, Angustmycin usw. bildet, während Streptomyces atratus keines dieser Antibiotika, sondern Rufomycin erzeugt. Tabelle 2 Kulturmedium Streptomyces atratus Streptomyces halstedii Streptomyces hygroscopicus Glukose-Asparagin-Agar Rückseite farblos, später Rückseite farblos, später Rückseite cremefarben schwarz schwarz Glukose-Bouillon-Agar Rückseite farblos, später Rückseite farblos, später Rückseite farblos und Glycerin-Bouillon- schwarz schwarz Agar Eimedium Vegetatives Mycel tief Vegetatives Mycel farblos Kein Wachstum »Colonial Buff« Hefeextrakt-Agar Rückseite farblos Rückseite farblos, später Rückseite farblos schwarz Kartoffelbrei Vegetatives Mycel honig- Vegetatives Medium farb- Vegetatives Mycel farblos gelb. Keine Veränderung los bis cremefarben. bis cremefarben. Farbe der Farbe des Mediums Farbe des Mediums blaß- des Mediums braun braun Möhrenbrei Vegetatives Mycel reichlich, Kein Wachstum. Farbe des Vegetatives Mycel, kräftig farblos. Keine Farb- Mediums dunkelgrau olivfarbig änderung des Mediums Czapek-Glukose-Agar Vegetatives Mycel sich aus- Vegetatives Mycel Vegetatives Mycel sich aus- breitend, nicht nach oben beschränkt, aufwärts breitend, aufwärts stehend, farblos, später stehend, klumpenförmig, stehend, farblos, später tief »Colonial Buff«, gelb, Rückseite farblos zimthautfarben, Rück- Rückseite farblos, später seite farblos, später zimt- cremefarben farben Milch Starke Peptonisierung ohne Schwache Peptonisierung Ziemlich starke Peptonisi- Koagulierung mit Koagulierung rung ohne Koagulierung Nitratreduktion Reduktion Reduktion Keine Reduktion Calciummalat-Agar Vegetatives Mycel sich aus- Vegetatives Mycel Vegetatives Mycel sich aus- breitend, farblos bis beschränkt, farblos, breitend, farblos. Rück- »Colonial Buff«, Rück- Rückseite farblos seite cremefarben seite farblos Tyrosinat-Agar Vegetatives Mycel sich aus- Vegetatives Mycel Vegetatives Mycel sich aus- breitend, farblos. Rück- beschränkt, wein-haut- breitend, wein-haut-far- seite farblos farben. Rückseite farb- ben bis gelb. Rückseite los, später wein-haut- farblos, später »Tüleul- farben Buff« Anmerkung: Die Farbbezeichnungen basieren auf »Color Standards and Color Nomenclature« von R. Rigdway. Tabelle 3 St. atratus St. halstedii St. hygro- scopicus D-Xylose .... - T""I-T T L-Rhamnose. . ++ - - L-Sorbose .... - - -f- D-Mannit .... - - ++-f- Sorbit ....... - - ++ Die vorstehenden Kulturmerkmale und Vergleichsdaten zeigen, daß Streptomyces atratus eine neue Art ist, die zu Actinomycetes gehört. Ferner eignen sich natürlich auch alle Mutanten oder Varianten von Streptomyces atratus, die vom Boden isoliert werden, von Streptomyces atratus abgeleitete Stämme oder durch künstliche Mutation und/oder Variation hervorgebrachte Mutanten oder Varianten, solange sie ihre Fähigkeit behalten, Rufomycin zu erzeugen. Künstliche Mutation oder Variation kann beispielsweise durch Bestrahlung, Zusatz von Chemikalien zum Kulturmedium, Isolierung von Monosporen usw. erfolgen.The morphological differences are that the sporophores of Streptomyces atratus are mainly loop-shaped and rarely form spirals with one or two turns, while Streptomyces halstedii has many closed spirals and Streptomyces hygroscopicus has mainly spirals with one or two turns. There are several differences in the way the carbon is used. These differences are listed in Table 3. The main difference between Streptomyces atratus and the other microorganisms is that Streptomyces halstedii produces carbomycin and carbomycin B, and Streptomyces hygroscopicus produces hygromycin, hygroscopin, angustmycin, etc., while Streptomyces atratus does not produce any of these antibiotics but rufomycin. Table 2 Culture medium Streptomyces atratus Streptomyces halstedii Streptomyces hygroscopicus Glucose asparagine agar reverse side colorless, later reverse side colorless, later reverse side cream-colored black Black Glucose bouillon agar reverse side colorless, later reverse side colorless, later reverse side colorless and glycerine bouillon black black Agar Egg medium Vegetative mycelium deep Vegetative mycelium colorless No growth "Colonial Buff" Yeast extract agar reverse side colorless reverse side colorless, later reverse side colorless black Mashed potatoes Vegetative mycelium honey- Vegetative medium color- Vegetative mycelium colorless yellow. No change going on until cream colored. to off-white. colour the color of the medium color of the medium pale- the medium brown Brown Carrot porridge Vegetative mycelium abundant, no growth. Vegetative mycelium color, strong colorless. No color medium dark gray olive colored change of medium Czapek glucose agar Vegetative mycelium made up- Vegetative mycelium Vegetative mycelium made up- spreading, not restricted upwards, spreading upwards, upwards standing, colorless, later standing, lump-shaped, standing, colorless, later deep "Colonial Buff", yellow, reverse side colorless, cinnamon-colored, reverse Back colorless, later side colorless, later cinnamon cream colors Milk Strong peptonization without weak peptonization Fairly strong peptonization Coagulation with coagulation tion without coagulation Nitrate reduction Reduction Reduction No reduction Calcium malate agar Vegetative mycelium is made up- Vegetative mycelium Vegetative mycelium is made up- spreading, colorless to limited, colorless, spreading, colorless. Return »Colonial Buff«, reverse side colorless, side cream-colored side colorless Tyrosinate agar Vegetative mycelium made up- Vegetative mycelium Vegetative mycelium made up- spreading, colorless. Back-restricted, wine-skin-spreading, wine-skin-far side colorless. The reverse side is colored to yellow. back go, later wine-skin-colorless, later »Tüleul- colors buff « Note: The color names are based on "Color Standards and Color Nomenclature" by R. Rigdway. Table 3 St. atratus St. halstedii St. hygro- scopicus D-xylose .... - T "" IT T L-rhamnose. . ++ - - L-sorbose .... - - -f- D-mannitol .... - - ++ - f- Sorbitol ....... - - ++ The above culture characteristics and comparative data indicate that Streptomyces atratus is a new species belonging to Actinomycetes. Furthermore, all mutants or variants of Streptomyces atratus which are isolated from the soil, strains derived from Streptomyces atratus or mutants or variants produced by artificial mutation and / or variation are of course also suitable, as long as they retain their ability to produce rufomycin. Artificial mutation or variation can take place, for example, by irradiation, addition of chemicals to the culture medium, isolation of monospores, etc.

Im Verfahren gemäß der Erfindung wird ein geeigneter Stamm in einem Kulturmedium gezüchtet. Das Kulturmedium kann fest oder flüssig sein, jedoch wird die flüssige Form zur Durchführung des Verfahrens im großen Maßstab bevorzugt. Es ist gewöhnlich zweckmäßig, wenn das Kulturmedium auch Nährstoffe, wie assimilierbaren Kohlenstoff, digerierbaren Stickstoff, anorganische Substanzen, Vitamine, Spurenelemente, wachstumsfördernde Stoffe usw., enthält. Diese Nährstoffe können aus natürlichen Quellen erhalten oder synthetisiert sein. Als Kohlenstoff quellen eignen sich beispielsweise Glukose, Lactose, Glycerin, Stärke, Dextrin, Maltose usw., als Stickstoffquellen beispielsweise Pepton, Sojabohnenmehl, Reiskleie, Mais-Extraktionsflüssigkeit, Gluten, Kasein usw. und als anorganische Nährstoffe beispielsweise Natriumchlorid, Carbonate, Mineralsalze, Phosphate usw. Zweckmäßig ist die Züchtung des Stamms unter aeroben Bedingungen, wobei Bewegung und/oder Belüftung vorteilhaft ist. Im allgemeinen sind eine Temperatur von 26 bis 30°C, ein pH-Wert des Mediums etwa im neutralen Bereich und eine Bebrütungsdauer von 3 bis 5 Tagen am vorteilhaftesten. Natürlich können diese Bedingungen verändert werden, solange die gewünschten Ergebnisse dadurch nicht beeinträchtigt werden.In the method according to the invention, a suitable strain is in one Culture medium grown. The culture medium can be solid or liquid, however the liquid form is preferred for carrying out the process on a large scale. It is usually useful when the culture medium also includes nutrients, such as assimilable Carbon, digestible nitrogen, inorganic substances, vitamins, trace elements, contains growth-promoting substances, etc. These nutrients can be from natural Sources preserved or synthesized. Sources of carbon are suitable, for example Glucose, lactose, glycerin, starch, dextrin, maltose, etc., as nitrogen sources for example peptone, soybean meal, rice bran, corn extraction liquid, gluten, Casein etc. and as inorganic nutrients for example sodium chloride, carbonates, Mineral salts, phosphates, etc. It is expedient to cultivate the strain under aerobic conditions Conditions where exercise and / or ventilation is beneficial. Generally are a temperature of 26 to 30 ° C, a pH value of the medium approximately in the neutral range and an incubation period of 3 to 5 days is most advantageous. Of course you can these conditions can be changed as long as this does not produce the desired results be affected.

Rufomycin wird im Zuchtmedium gebildet und angereichert. Ein Teil des auf diese Weise gebildeten Rufomycins bleibt im Mycel des bebrüteten Mikroorganismus, während der Rest durch die Zellwand in das Medium gelangt und dort angereichert wird. Das erzeugte Rufomycin kann also unmittelbar aus dem gesamten Nährmedium abgetrennt werden. Häufig ist es jedoch vorteilhafter, den flüssigen Teil des Mediums vom festen Teil beispielsweise durch Filtration, Zentrifugieren usw. zu trennen und beide Teile zur Gewinnung des Rufomycins zu extrahieren. Die Gewinnung des Rufomycins aus der fermentierten Nährflüssigkeit kann unter Ausnutzung von Unterschieden in den chemisch-physikalischen Eigenschaften, wie Löslichkeit in einem Lösungsmittel, Adsorbierbarkeit an einem Adsorptionsmittel, Kristallisierbarkeit usw., zwischen Rufomycin und den Verunreinigungen vorgenommen werden. Beispielsweise kann Rufomycin aus der Brühe mit einem Lösungsmittel, wie Alkohol, Essigsäureester, Aceton od. dgl., extrahiert werden. Entsprechend den chemisch-physikalischen Eigenschaften von Rufomycin und der Verunreinigungen läßt sich das erstere in einfacher Weise reinigen, beispielsweise durch Adsorptionschromatographie, wobei ein geeignetes Adsorptionsmittel, wie Aluminiumoxyd, Kieselgel usw., verwendet wird, durch Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie Äthnanol, Methanol, einem wäßrigen Alkohol usw., durch Gegenstromverteilung, fraktionierte Fällung oder nach anderen Methoden, die gewöhnlich zur Gewinnung eines Produkts aus einem Nährmedium angewendet werden.Rufomycin is formed and accumulated in the culture medium. A part the rufomycin formed in this way remains in the mycelium of the incubated microorganism, while the rest passes through the cell wall into the medium and accumulates there will. The rufomycin produced can thus be separated off directly from the entire nutrient medium will. However, it is often more advantageous to separate the liquid part of the medium from the solid Part for example by filtration, centrifugation, etc. to separate and both parts to extract the rufomycin. The extraction of rufomycin from the fermented nutrient fluid can take advantage of differences in the chemico-physical Properties such as solubility in a solvent, adsorbability on one Adsorbent, crystallizability, etc., between rufomycin and the impurities be made. For example, rufomycin can be extracted from the broth with a solvent, such as alcohol, acetic acid ester, acetone or the like., Are extracted. According to the chemical-physical properties of rufomycin and the impurities leaves the former can be purified in a simple manner, for example by adsorption chromatography, using a suitable adsorbent such as alumina, silica gel, etc. is, by recrystallization from a suitable solvent such as ethanol, Methanol, an aqueous alcohol, etc., fractionated by countercurrent distribution Precipitation or other methods usually used to obtain a product can be applied from a nutrient medium.

Als Ergebnis der vorstehend beschriebenen Behandlungen werden aus der Kulturflüssigkeit des Rufomycin erzeugenden Stamms zwei Arten von Antibiotika erhalten, die als Rufomycin A und Rufomycin B bezeichnet werden und ziemlich ähnliche Eigenschaften aufweisen. Infolge des Unterschiedes ihrer Löslichkeit beispielsweise in Äthanol ist es jedoch möglich, sie voneinander zu trennen. Genauer gesagt, wenn eine wäßrige Äthanollösung beider Antibiotika unter vermindertem Druck eingeengt und eine Weile stehengelassen wird, scheidet sich Rufomycin B in Form von Kristallen ab, während Ruf omycin A erhalten wird, indem das Lösungsmittel der Mutterlauge unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft wird.As a result of the treatments described above, from of the culture liquid of the rufomycin-producing strain, two kinds of antibiotics which are named rufomycin A and rufomycin B and quite similar Have properties. As a result of the difference in their solubility, for example however, in ethanol it is possible to separate them from each other. More precisely, if an aqueous ethanol solution of both antibiotics concentrated under reduced pressure and left standing for a while, rufomycin B separates in the form of crystals while Ruf omycin A is obtained by adding the solvent to the mother liquor evaporated to dryness under reduced pressure.

RufomycinA weist folgende Eigenschaften auf: 1. Es ist eine physilogisch neutrale Substanz und wird gewöhnlich als gelbes Pulver erhalten.RufomycinA has the following properties: 1. It is a physilogical neutral substance and is usually obtained as a yellow powder.

2. Es ist in Wasser unlöslich, in Äthyläther, Petroläther, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff usw. schwerlöslich, jedoch in Methanol, Äthanol, Propanol, Äthylacetat, Chloroform, Pyridin, Dioxan, Eisessig, Aceton, Dimethylformamid, 2-Methoxyätllanol (Methylcellosolv) usw. leicht löslich.2. It is insoluble in water, in ethyl ether, petroleum ether, benzene, Carbon tetrachloride etc. sparingly soluble, but in methanol, ethanol, propanol, Ethyl acetate, chloroform, pyridine, dioxane, glacial acetic acid, acetone, dimethylformamide, 2-methoxyethanol (Methylcellosolv) etc. Easily soluble.

3. Es ist bei der Ninhydrinreaktion, Molish-Reaktion, Fehlingschen Reaktion, Sakaguchi-Reaktion, Ferrichloridreaktion, Maltolreaktion, Natriumnitroprussid-Reaktion usw. negativ.3. It's in the ninhydrin reaction, Molish reaction, Fehlingschen Reaction, Sakaguchi reaction, ferric chloride reaction, maltol reaction, sodium nitroprusside reaction etc. negative.

4. Sein Infrarotabsorptionsspektrum, gemessen in einer Kaliumbromidscheibe, ist in Fig. 1 dargestellt. Die wichtigsten Absorptionsbanden sind folgende: 3,0 (stark), 3,27 (schwach), 3,4 (stark), 6,04 (Knick), 6,1 (sehr stark), 6,53 (stark), 6,64 (mäßig), 6,90 (schwach), 7,1 (Knick), 7,32 (schwach), 7,55 (mäßig), 8,02 (stark), 8,54 (schwach), 8,85 (schwach), 9,37 (schwach), 9,80 (schwach), 10,05 (schwach), 10,37 (schwach), 10,96 (schwach), 11,43 (schwach), 12,20 (mittel), 13,15 (Knick) und 13,55 #t (mittel).4. Its infrared absorption spectrum, measured in a potassium bromide disk, is shown in FIG. The most important absorption bands are as follows: 3.0 (strong), 3.27 (weak), 3.4 (strong), 6.04 (kink), 6.1 (very strong), 6.53 (strong), 6 , 64 (moderate), 6.90 (weak), 7.1 (kink), 7.32 (weak), 7.55 (moderate), 8.02 (strong), 8.54 (weak), 8, 85 (weak), 9.37 (weak), 9.80 (weak), 10.05 (weak), 10.37 (weak), 10.96 (weak), 11.43 (weak), 12.20 (medium), 13.15 (kink) and 13.55 #t (medium).

5. Sein Ultraviolettabsorptionsspektrum in Äthanol ist in Fig. 3 als ausgezogene Linie dargestellt. Die Maxima sind folgende: @max 222 m#t (E'1',. = 450). 2max 282 m#L (Ei-,'. =l00). Am", 355 mit. (El l'- = 27).5. Its ultraviolet absorption spectrum in ethanol is shown in Fig. 3 as a solid line. The maxima are as follows: @max 222 m # t (E'1 ',. = 450). 2max 282 m # L (Ei-, '. = L00). Am ", 355 with. (El l'- = 27).

6. Spezifische Drehung: [a]o' = -64° (c = 1 % in Äthanol).6. Specific rotation: [a] o ' = -64 ° (c = 1 % in ethanol).

7. Bei der qualitativen Elementaranalyse wurde weder Halogen noch Schwefel festgestellt. Die Analysenwerte waren folgende: 1. C 62,39 0/0, H 7,69 %, N 10,80 %; 2. C 62,26 0/0, H 7,33 %, N l1,17 %. B. Die Stabilität von Rufomycin A wurde unter verschiedenen Bedingungen geprüft. Die antimikrobische Wirksamkeit nahm durch 1stündiges Kochen bei p119 auf etwa die Hälfte ab. Bei pH-Werten im neutralen oder sauren Bereich ist Rufomycin A ziemlich stabil. Bei der Prüfung wurde die antimikrobische Wirksamkeit nach der Agar-Verdünnungsmethode bestimmt, wobei als Prüforganismus ein streptomycinresistenter Stamm von Mycobacterium avium verwendet wurde. Wirksamkeit Lösungsmittel pg-Wert Behandlung (Einheiten je Kubikzenti- meter) Ohne Lösungs- mittel ........ - 1 Stunde bei 2000 100 ° C im Vakuum Methanol ..... neu- 1 Stunde 1500 tral unter dem Rückfluß- kühler erhitzt Mit H C 1 ange- säuertes Metha- nol........... 2,0 desgl. 1500 Mit Na O H alka- lisch gemachtes Methanol ... 9,0 desgl. 750 Rufomycin B hat folgende Eigenschaften: 1. Es ist eine neutrale Substanz, die die Form von gelben prismenartigen Kirstallen hat, die bei 165 bis 168'C unter Zersetzung schmelzen.7. No halogen or sulfur was found in the qualitative elemental analysis. The analytical values were as follows: 1. C 62.39%, H 7.69%, N 10.80%; 2. C 62.26%, H 7.33%, N 11.17%. B. The stability of Rufomycin A was tested under various conditions. The antimicrobial effectiveness was reduced to about half by boiling for 1 hour at p119. Rufomycin A is fairly stable at pH values in the neutral or acidic range. During the test, the antimicrobial activity was determined by the agar dilution method, a streptomycin-resistant strain of Mycobacterium avium being used as the test organism. effectiveness Solvent pg value treatment (units per Cubic centi- meter) Without solution medium ........ - 1 hour at 2000 100 ° C in vacuum Methanol ..... new - 1 hour 1500 tral under the Reflux cooler heated With HC 1 acidified metha- nol ........... 2.0 same as 1500 With Na OH alka- nicely made Methanol ... 9.0 the same. 750 Rufomycin B has the following properties: 1. It is a neutral substance, which has the shape of yellow prismatic kirstall that melt at 165 to 168'C with decomposition.

2. Es ist in Wasser unlöslich, in Äthyläther, Petroläther, Benzol, Tetrachlorkohlenstoff usw. schwerlöslich und in Äthanol, Butanol usw. wenig löslich, jedoch in Methanol, heißem Äthanol, Äthylacetat, Chloroform, Pyridin, Dioxan, Eisessig usw. leicht löslich.2. It is insoluble in water, in ethyl ether, petroleum ether, benzene, Carbon tetrachloride etc. sparingly soluble and sparingly soluble in ethanol, butanol etc., but in methanol, hot ethanol, ethyl acetate, chloroform, pyridine, dioxane, glacial acetic acid etc. easily soluble.

3. Bei der Titration zeigt es einen pxa#-Wert von 8,4 in Methanol-Wasser.3. When titrated, it shows a pxa # value of 8.4 in methanol-water.

4. In bezug auf Farbreaktionen weist es die gleichen Merkmale wie Rufomycin A auf.4. With regard to color reactions, it has the same characteristics as Rufomycin A.

5. Sein Infrarotabsorptionsspektrum in einer Kaliumbromidscheibe ist in Fig. 2 dargestellt. Die wesentlichen Absorptionsbanden sind folgende: 3,04 (stark), 3,26 (schwach), 3,38 (stark), 5,94 (Knick), 6,05 (Knick), 6,10 (sehr stark), 6,53 (stark), 6,6 (Knick), 6,9 (mittel), 7,1 (Knick), 7,25 (Knick), 7,34 (schwach), 7,62 (mittel), 7,85 (schwach), .8,05 (mittel), 8,32 (schwach), 8,50 (schwach), 8,85 (mittel), 9,26 (mittel), 10,35 (schwach), 10,90 (schwach), 11,45 (schwach), 12,15 (schwach), 13,10 (schwach) und 13,55 #t (mittel).5. Its infrared absorption spectrum in a potassium bromide disk is shown in FIG. The main absorption bands are as follows: 3.04 (strong), 3.26 (weak), 3.38 (strong), 5.94 (kink), 6.05 (kink), 6.10 (very strong), 6.53 (strong), 6.6 (kink), 6.9 (medium), 7.1 (kink), 7.25 (kink), 7.34 (weak), 7.62 (medium), 7.85 (weak), .8.05 (medium), 8.32 (weak), 8.50 (weak), 8.85 (medium), 9.26 (medium), 10.35 (weak), 10.90 (weak), 11.45 (weak), 12.15 (weak), 13.10 (weak) and 13.55 #t (medium).

6. Sein Ultraviolettabsorptionsspektrum in Äthanol ist in Fig. 3 als gestrichelte Linie dargestellt. Die Maxima sind folgende: imax 222 mp. (Elle,'. = 524). Amax 282 m(.t (E" = 113). Amax 355 m#t (EI! = 28).6. Its ultraviolet absorption spectrum in ethanol is shown in Fig. 3 as a dashed line. The maxima are as follows: imax 222 mp. (Cubit, '. = 524). Amax 282 m (.t (E "= 113). Amax 355 m # t (EI! = 28).

7. Spezifische Drehung: [a] ö` _ -73 ° (c = 10/, in Methanol). Sowohl Rufomycin A als auch Rufomycin B zeigen spezifische Wirksamkeit gegenüber säurefesten Bakterien, insbesondere Mycobacterium tuberculosis var. hominis, sind jedoch unwirksam gegenüber üblichen grampositiven und gramnegativen Bakterien. Das Ergebnis der biologischen Prüfung von Rufomycin A und Rufomycin B nach der Verdünnungsmethode ergibt sich aus dem folgenden antibakteriellen Spektrum. In diesem Test wurden Mycobacterium tuberculosis auf Kirchners Medium, die anderen säurefesten Bakterien auf Glycerin-Bouillon-Agar und andere übliche Bakterien auf Bouillon-Agar geimpft. Als Lösungsmittel diente Methanol. Wachstumshemmende Min- destkonzentration in Mikro- Testkeim gramm je Kubikzentimeter RufomycinA ! Rufomycin B Escherichia coli . . . . . . . . . > 100 >l00 Proteus vulgaris . . . . . . . . . >l00 > 100 Staphylococcus aureus .... >l00 > 100 Bacillus subtilis . . . . . . . . . >l00 I > 100 Pseudomonas aerugmosa. . >l00 >l00 Serratia marcescens ...... > 100 > 100 Bacillus brevis . . . . . . . . . . 100 >l00 Sarcina lutea . . . . . . . . . . . 100 > 100 Mycobacterium species 607 . . . . . . . . . . . . 2,0 5,0 Mycobacterium avium ... 1,0 5,0 Mycobacterium avium, streptomycinresistent ... 1,0 5,0 Mycobacterium avium, neomycinresistent ...... 1,0 5,0 Mycobacterium smegmatis 0,2 0;5 Mycobacterium phlei .... 2,0 5,0 Mycobacterium tuber- culosis H"Rv.... ..... 0,1 ; 1,0 Die Toxizität von Rufomycin A und Rufomycin B wurden an 4 Wochen alten Mäusen (Stamm dd) durch intraperitoneale Injektion ermittelt: Rufomycin A: LDp = 4000 mg/kg. Rufomycin B : LDo = 2000 mg/kg.7. Specific rotation: [a] ö` _ -73 ° (c = 10 /, in methanol). Both rufomycin A and rufomycin B show specific activity against acid-fast bacteria, in particular Mycobacterium tuberculosis var. Hominis, but are ineffective against common gram-positive and gram-negative bacteria. The result of the biological test of rufomycin A and rufomycin B by the dilution method is given in the following antibacterial spectrum. In this test, Mycobacterium tuberculosis was inoculated on Kirchner's medium, the other acid-fast bacteria on glycerine broth agar and other common bacteria on broth agar. Methanol was used as the solvent. Growth-inhibiting min- minimum concentration in micro Test germ gram per cubic centimeter RufomycinA! Rufomycin B Escherichia coli. . . . . . . . . > 100 > l00 Proteus vulgaris. . . . . . . . . > l00 > 100 Staphylococcus aureus ....> l00 > 100 Bacillus subtilis. . . . . . . . . > l00 I> 100 Pseudomonas aerugmosa. . >l00> l00 Serratia marcescens ...... >100> 100 Bacillus brevis. . . . . . . . . . 100 > l00 Sarcina lutea. . . . . . . . . . . 100> 100 Mycobacterium species 607. . . . . . . . . . . . 2.0 5.0 Mycobacterium avium ... 1.0 5.0 Mycobacterium avium, streptomycin resistant ... 1.0 5.0 Mycobacterium avium, neomycin resistant ...... 1.0 5.0 Mycobacterium smegmatis 0.2 0; 5 Mycobacterium phlei .... 2.0 5.0 Mycobacterium tuber- culosis H "Rv .... ..... 0.1; 1.0 The toxicity of rufomycin A and rufomycin B was determined in 4-week-old mice (strain dd) by intraperitoneal injection: rufomycin A: LDp = 4000 mg / kg. Rufomycin B: LDo = 2000 mg / kg.

Die letale Mindestdosis von Rufomycin B, intraperitoneal injiziert, betrug 4000 mg/kg.The minimum lethal dose of rufomycin B injected intraperitoneally was 4000 mg / kg.

Die Tatsache, daß die vorstehend aufgeführten Eigenschaften von Rufomycin A und Rufomycin B sich stark von denen aller bekannten Antibiotika unterscheiden, ist eine Bestätigung dafür, daß Rufomycin A und Rufomycin B neue Antibiotika sind.The fact that the properties of rufomycin listed above A and rufomycin B are very different from those of all known antibiotics, is confirmation that rufomycin A and rufomycin B are new antibiotics.

Die in dem folgenden Beispiel genannten Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, falls nicht anders angegeben. Sämtliche Temperaturen sind unkorrigiert. Beispiel In vier 2-1-Kolben wurden je 500 cm3 eines Kulturmediums folgender Zusammensetzung gegossen: 2,0 °/o Glukose, 0,60/, Fleischextrakt, 0,60/,) Natriumchlorid, 0,60/, Calciumcarbonat, Wasser. Das Medium wurde mit Streptomyces atratus (IFO-3897, ATCC-14046) geimpft und 2 Tage bei 28'C unter Schütteln zur Herstellung eines Vorinkubationsmediums bebrütet. Das auf diese Weise in den vier Kolben erhaltene Medium wurde zu 5001 eines wäßrigen Kulturmediums gegeben, das aus 2,011/0 Glukose, 0,60/0 Fleischextrakt, 0,5 °,/o Pepton, 0,30/, Reiskleie, 0,5 °/o Natriumchlorid, 0,3 °/o Calciumcarbonat und Wasser bestand. Die Mischung wurde nach Einstellung auf pg 7,0 in einem 1-t-Tank bei 28°C unter Rühren und Zuführung von 501 Luft je Minute bebrütet. Vor der Bebrütung wurden 50 g und zur entsprechenden Zeit während der Bebrütung weitere 170 g eines die Schaumbildung verhindernden Öls dem Medium zugesetzt. Das Gesamtgewicht des Antischaumöls von 220 g entspricht etwa 0,22°/a, bezogen auf das Gesamtmedium. Der Fortschritt der Bebrütung während einer Zeit von 89 Stunden ist aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich. Die antibiotische Wirksamkeit wurde nach der Agar-Verdünnungsmethode unter Verwendung des streptomycinresistenten Stamms von Mycobacterium avium als Testmikroorganismus gemessen und ist in Waksmanschen Verdünnungseinheiten je Kubikzentimeter Brühe angegeben. Antimikrobische Wirk- Bebrütungszeit PH-Wert samkeit des Mediums, Stunden des Mediums Einheiten je Kubikzenti- meter 0 7,05 <10 17 7,08 <10 30 8,21 < 10 41 7,98 < 10 54 7,98 20 65 7,89 50 78 7,80 100 89 7,30 100 Das fermentierte Medium wurde nach Zugabe einer Filterhilfe filtriert, wobei 4501 Filtrat und 29 kg Mycel erhalten wurden. Das Filtrat wurde auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und zweimal mit einem Drittel seiner Menge an Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschichten wurden vereinigt, und die Lösung wurde mit einer geringen Wassermenge gewaschen und dann unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 kondensiert.The percentages given in the following example are based on weight, unless otherwise stated. All temperatures are uncorrected. Example 500 cm3 of a culture medium of the following composition were poured into four 2-1 flasks: 2.0% glucose, 0.60%, meat extract, 0.60%, sodium chloride, 0.60%, calcium carbonate, water. The medium was inoculated with Streptomyces atratus (IFO-3897, ATCC-14046) and incubated for 2 days at 28 ° C. with shaking to produce a preincubation medium. The medium thus obtained in the four flasks was added to 500 liters of an aqueous culture medium composed of 2.011 / 0 glucose, 0.60 / 0 meat extract, 0.5%, / 0 peptone, 0.30 /, rice bran, 0, 5% sodium chloride, 0.3% calcium carbonate and water. After adjustment to pg 7.0, the mixture was incubated in a 1 t tank at 28 ° C. with stirring and supplying 50 liters of air per minute. Before the incubation, 50 g and at the appropriate time during the incubation a further 170 g of an oil preventing the formation of foam were added to the medium. The total weight of the antifoam oil of 220 g corresponds to about 0.22 ° / a, based on the total medium. The progress of the incubation over a period of 89 hours can be seen from the table below. The antibiotic activity was measured by the agar dilution method using the streptomycin-resistant strain of Mycobacterium avium as the test microorganism and is given in Waksman's dilution units per cubic centimeter of broth. Antimicrobial agents Incubation time PH value of the medium, Hours of the medium units per cubic centimeter meter 0 7.05 <10 17 7.08 <10 30 8.21 <10 41 7.98 <10 54 7.98 20 65 7.89 50 78 7.80 100 89 7.30 100 The fermented medium was filtered after adding a filter aid, whereby 450 l of filtrate and 29 kg of mycelium were obtained. The filtrate was adjusted to pH 2 and extracted twice with a third of its amount of ethyl acetate. The ethyl acetate layers were combined and the solution was washed with a small amount of water and then condensed to about 1 liter under reduced pressure.

Das Mycel wurde in der dreifachen Methanohnenge suspendiert, und die Suspension wurde bei Raumtemperatur bewegt, um das Antibiotikum zu extrahieren. Die Suspension wurde dann filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck auf etwa l01 kondensiert. Zum Kondensat wurden 21 Wasser gegeben. Die wäßrige Mischung wurde auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und zweimal mit einem Viertel seiner Menge an Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte wurden zusammengegeben, und die Lösung wurde unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 eingeengt. , Die eingeengten Äthylacetatlösungen, die aus dem Filtrat und dem Mycel erhalten worden waren, wurden getrennt wie folgt behandelt: Zur Äthylacetatlösung wurde etwa ein Fünftel ihrer Menge an Wasser gegeben. Die Mischung wurde geschüttelt, während der pH-Wert der Wasserschicht auf 9 eingestellt wurde. Diese Behandlung wurde wiederholt, worauf die Äthylacetatschicht ausreichend entfärbt war. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck abgedampft, wobei etwa 30 bis 35 g eines Rückstandes verblieben, der in 300 cm3 Äthanol gelöst wurde. Die Lösung ließ man durch eine mit 1 kg Aluminiumoxyd gefüllte Kolonne rieseln, die mit Äthanol entwickelt und schließlich mit 80°/Qigem wäßrigem Äthanol eluiert wurde, wobei die Komponenten in drei Banden aufgeteilt wurden, nämlich Gelb, Purpur und Orangegelb. Die orangegelbe Bande entspricht dem gewünschten Antibiotikum Rufomycin.The mycelium was suspended in three times the amount of methane, and the Suspension was agitated at room temperature to extract the antibiotic. The suspension was then filtered and the filtrate taken up under reduced pressure about l01 condensed. 21 water were added to the condensate. The aqueous mixture was adjusted to pH 2 and twice with a quarter of its amount extracted on ethyl acetate. The ethyl acetate extracts were pooled and the Solution was concentrated to about 1 liter under reduced pressure. , The constricted Ethyl acetate solutions obtained from the filtrate and mycelium became treated separately as follows: About one fifth of it was added to the ethyl acetate solution Amount of water given. The mixture was shaken while the pH of the Water layer was set to 9. This treatment was repeated, after which the ethyl acetate layer was sufficiently discolored. The solvent was reduced under Pressure evaporated, leaving about 30 to 35 g of a residue, which in 300 cm3 of ethanol has been dissolved. The solution was passed through one containing 1 kg of aluminum oxide trickle filled column, which develops with ethanol and finally with 80 ° / Qigem aqueous ethanol was eluted, the components being divided into three bands viz. yellow, purple and orange-yellow. The orange-yellow band corresponds to that desired antibiotic rufomycin.

Die der letzten Bande entsprechende ablaufende Flüssigkeit wurde aufgefangen und unter vermindertem Druck auf etwa 100 cm3 eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde über Nacht stehengelassen, wobei sich etwa 4 g Rufomycin B in Form von Kristallen abschieden. Die Mutterlauge wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei etwa 15 g Rufomycin A erhalten wurden, das durch wiederholte Umkristallisation aus Äthanol gereinigt werden kann. Reinigung von Ruf omycin Eine Lösung von 0,2g des nach vorstehendem Beispiel erhaltenen Rufomycins A in 3 cm3 einer Mischung von Aceton, Essigsäure und Benzol im Verhältnis von 10:4:86 ließ man durch eine mit Silikagel gefüllte Kolonne laufen, die dann mit dem Lösungsmittelgemisch der gleichen Zusammensetzung eluiert wurde. Das Eluat wurde durch Feinfraktionierung in Fraktionen von je 3 cm3 getrennt. Die 33. bis 40. Fraktion wurden aufgefangen und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde aus Äthanol umkristallisiert, wobei Rufomycin B mit folgenden Eigenschaften erhalten wurde: Schmelzpunkt: 165 bis 168°C (Zersetzung) Spezifische Drehung: [x] ö = -73' (c = 1 °/o in Methanol).The draining liquid corresponding to the last band was collected and concentrated to about 100 cm3 under reduced pressure. The concentrated solution was left to stand overnight, about 4 g of rufomycin B being deposited in the form of crystals. The mother liquor was evaporated to dryness under reduced pressure to give about 15 g of rufomycin A which can be purified by repeated recrystallization from ethanol. Purification of Rufomycin A solution of 0.2 g of the rufomycin A obtained according to the above example in 3 cm3 of a mixture of acetone, acetic acid and benzene in a ratio of 10: 4: 86 was passed through a column filled with silica gel, which was then filled with the Solvent mixture of the same composition was eluted. The eluate was separated into fractions of 3 cm3 each by fine fractionation. The 33rd to 40th fractions were collected and concentrated to dryness. The residue was recrystallized from ethanol to give rufomycin B with the following properties: Melting point: 165 to 168 ° C. (decomposition) Specific rotation: [x] δ = -73 ' (c = 1% in methanol).

Die Fraktionen 41 bis 50 wurden vereinigt und zur Trockene eingeengt. Erhalten wurde ein leicht gelbes Pulver von Rufomycin A, das eine spezifische Drehung [a]0' von -58° (c = 10/0 in Methanol) hatte.Fractions 41 to 50 were combined and concentrated to dryness. A slightly yellow powder of rufomycin A was obtained which had a specific rotation [a] 0 'of -58 ° (c = 10/0 in methanol).

Claims

PATENT CLAIM: The use of Streptomyces atratus nov. sp. (113O-3897, deposited with the Institute for Fermentation, Osaka, Japan and ATCC-14046 at the American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA.) or its natural or induced mutants or variants for the production of the antibiotic rufomycin by biological means under the usual conditions, preferably submerged Process, extraction of the antibiotic by known processes from the fermentation liquid and optionally breaking down the rufomycin into its components rufomycin A and B by treatment with ethanol.