DE1130785B

DE1130785B - Process for the preparation of 5'-nucleotides, nucleosides and their mixtures by hydrolysis of ribonucleic acids, oligoribonucleotides or their mixtures

Info

Publication number: DE1130785B
Application number: DET16408A
Authority: DE
Inventors: Einosuke Omura; Koichi Ogata; Yukio Sugino; Seizi Igarasi; Masahiko Yoneda; Yoshio Nakao; Ikuo Suhara
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1958-03-21
Filing date: 1959-03-17
Publication date: 1962-06-07

Description

Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden, Nucleosiden und deren Gemischen durch Hydrolyse von Ribonucleinsäuren, Oligoribonucleotiden oder deren Gemischen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Nucleotiden und Nucleosiden oder deren Gemischen auf biologischem Wege.Process for the preparation of 5 'nucleotides, nucleosides and their Mixtures by hydrolysis of ribonucleic acids, oligoribonucleotides or their Mixtures The invention relates to a process for the preparation of 5 'nucleotides and nucleosides or their mixtures by biological means.

Nucleinsäuren, die im lebenden Körper als nichtproteinische Komponenten in Nucleoproteinen weit verbreitet sind und in enger Beziehung zu den Erscheinungen des Lebens stehen, sind wichtige Bestandteile des lebenden Körpers und aus verschiedenen Nucleotiden aufgebaut.Nucleic acids found in the living body as non-proteinic components are widespread in nucleoproteins and closely related to the phenomena of life are important components of the living body and made up of different Built up of nucleotides.

Von diesen Nucleotiden sind die 5'-Nucleotide wichtig als wertvolle Reagenzien für biologische Forschungen. Ferner werden sie als Würze für Nahrungsmittel, als Heilmittel oder deren Zwischenprodukte verwendet.Of these nucleotides, the 5 'nucleotides are important as valuable Reagents for biological research. They are also used as a condiment for food, used as remedies or their intermediates.

Trotz der weiten Verbreitung von 5'-Nucleotiden in natürlichen Quellen als Komponenten von Ribonucleinsäuren wurden 5'-Nucleotide als schwer in reiner Form darzustellende Verbindungen angesehen, da bisher kein geeignetes Verfahren zur Hydrolyse von Ribonucleinsäuren zu 5'-Nucleotiden gefunden wurde. Ihre Verwendung war daher bis heute sehr beschränkt.Despite the widespread use of 5 'nucleotides in natural sources as components of ribonucleic acids, 5 'nucleotides were found to be difficult in pure Compounds to be represented are viewed as no suitable method to date for the hydrolysis of ribonucleic acids to 5'-nucleotides. Your use was therefore very limited until today.

Es sind sowohl chemische als auch biochemische Verfahren zur Hydrolyse von Ribonueleinsäuren bekannt. Beim chemischen Verfahren werden jedoch keine 5'-Nucleotide, sondern 2'- und/oder 3'-Nucleotide gebildet. In einem der bekannten biochemischen Verfahren werden Ribonucleinsäuren oder Produkte, die durch Hydrolyse der Substanz mit Ribonuclease der Bauchspeicheldrüse erhalten wurden, mit Phosphodiesterase aus Schlangengiften oder aus einer Schleimhaut des Rinderdünndarms weiter hydrolysiert. Dieses Verfahren hat jedoch die Nachteile einer niedrigen Ausbeute an 5'-Nucleotiden und der Schwierigkeit, die benötigten Enzyme zu beschaffen. Daher eignet sich dieses Verfahren kaum für eine industrielle Herstellung von 5'-Nucleotiden.There are both chemical and biochemical methods of hydrolysis known from ribonueleic acids. In the chemical process, however, no 5 'nucleotides, but 2 'and / or 3' nucleotides are formed. In one of the well-known biochemical Process are ribonucleic acids or products made by hydrolysis of the substance obtained with pancreatic ribonuclease, made with phosphodiesterase Snake venom or from a mucous membrane of the bovine small intestine is further hydrolyzed. However, this method has the disadvantages of a low yield of 5 'nucleotides and the difficulty of obtaining the enzymes needed. Therefore this is suitable Process hardly for industrial production of 5 'nucleotides.

Auf der Suche nach einer Ribonuclease, die in der Lage ist, Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotide zwecks Herstellung von 5'-Nucleotiden oder von Nucleosiden im industriellen Maßstab zu hydrolysieren, wurde folgendes festgestellt: Erstens Verschiedene Mikroorganismen erzeugen ein Enzym, das für den vorgesehenen Zweck geeignet ist; zweitens: 5'-Nucleotide oder Nucleoside können durch Hydrolyse von Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotiden unter Verwendung dieser Mikroorganismen selbst oder der durch sie gebildeten Enzyme hergestellt werden. Auf der Grundlage dieser Erkenntnisse wurde das im industriellen Maßstab durchführbare Verfahren gemäß der Erfindung entwickelt. In der Beschreibung soll der Ausdruck »Ribonuclease« eine Enzymmischung bezeichnen, durch die Ribonucleinsäure in ihre Komponenten hydrolysiert wird. Es handelt sich dabei um Ribonuclease, 5'-Phosphodiesterase, Adenylsäure, Deaminase, Phosphomonoesterase usw.Looking for a ribonuclease that is capable of producing ribonucleic acids or oligoribonucleotides to produce 5 'nucleotides or nucleosides To hydrolyze on an industrial scale, the following has been found: First Different microorganisms produce an enzyme that works for its intended purpose suitable is; second: 5'-nucleotides or nucleosides can be produced by hydrolysis of Ribonucleic acids or oligoribonucleotides using these microorganisms themselves or the enzymes formed by them. Based on The process that can be carried out on an industrial scale was based on these findings of the invention. In the description, the term "ribonuclease" is intended to mean Denote a mixture of enzymes by which ribonucleic acid is hydrolyzed into its components will. These are ribonuclease, 5'-phosphodiesterase, adenylic acid, Deaminase, phosphomonoesterase, etc.

Als Ausgangsmaterial für das Verfahren gemäß der Erfindung geeignete Ribonucleinsäuren können aus natürlichen Quellen, wie Hefe und tierischen Geweben, gewonnen werden. Ebenso können durch Teilhydrolyse von Ribonucleinsäuren erhaltene Oligoribonucleotide als Ausgangsstoffe eingesetzt werden. Geeignet sind ferner Substanzen, wie wäßrige Hefeextrakte, die unraffinierte Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotide enthalten. Da sie bekanntlich Adenylsäure, Cytidylsäure, Uridylsäure, Guanylsäure usw. enthalten, stellt das Produkt gemäß der Erfindung ein Gemisch von 5'-Mononucleotiden oder ein durch Abtrennung von Phosphorsäure daraus gebildetes Gemisch von Nucleosiden dar. Diese Gemische können natürlich als solche für die eingangs genannten Zwecke verwendet werden, jedoch kann gegebenenfalls jede Komponente nach an sich bekannten Verfahren abgetrennt werden.Suitable as starting material for the process according to the invention Ribonucleic acids can be obtained from natural sources, such as yeast and animal tissues, be won. Likewise, ribonucleic acids can be obtained by partial hydrolysis Oligoribonucleotides are used as starting materials. Substances are also suitable such as aqueous yeast extracts, the unrefined ribonucleic acids or oligoribonucleotides contain. As they are known to be adenylic acid, cytidylic acid, uridylic acid, guanylic acid etc., the product according to the invention is a mixture of 5'-mononucleotides or a mixture of nucleosides formed therefrom by separation of phosphoric acid represent. These mixtures can of course be used as such for the initially mentioned purposes, however, each component can optionally be used according to methods known per se are separated.

Für das Verfahren gemäß der Erfindung eignen sich die verschiedensten Arten von Mikroorganismen oder die von ihnen erzeugten Enzyme. Diese Mikroorganismen gehören zu Klassen, wie Schizomyceten, Fungi imperfecti usw. Hiervon sind die zu genas Fusarium, genas Verticillium, genas Gliomastix, genas Helminthosporium, genas Bacillus, genas Streptomyces usw. gehörenden Mikroorganismen besonders geeignet. Als Beispiele für die im Verfahren gemäß der Erfindung verwendbaren Mikroorganismen seien folgende genannt: Fusarium roseum Link.The most varied of options are suitable for the method according to the invention Types of microorganisms or the enzymes they produce. These microorganisms belong to classes like Schizomycetes, Fungi imperfecti, etc. Of these, those belong to recovered Fusarium, recovered Verticillium, recovered Gliomastix, recovered Helminthosporium, recovered Microorganisms belonging to Bacillus, genas Streptomyces, etc. are particularly suitable. As examples of the microorganisms which can be used in the method according to the invention the following are mentioned: Fusarium roseum Link.

Fusarium solani (Mart.) Appel et Wollenweber. Verticillium niveostratosum Lindau. Gliomastix convoluta (Harz.) Mason var. felina (Marchal) Mason.Fusarium solani (Mart.) Appel et Wollenweber. Verticillium niveostratosum Lindau. Gliomastix convoluta (Harz.) Mason var. Felina (Marchal) Mason.

Helminthosporium sigmoideum var. irregulare Cralley et Tullis.Helminthosporium sigmoideum var. Irregular Cralley et Tullis.

Bacillus subtilis Cohn einend. Prazmowski. Bacillus brevis Migula einend. Ford. Streptomyces griseus (Krainsky einend. Waksman et a1) Waksman et a1.Bacillus subtilis Cohn united. Prazmowski. Bacillus brevis Migula unifying. Ford. Streptomyces griseus (Krainsky and Waksman et a1) Waksman et a1.

Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici.Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici.

Streptomyces fiavus (Krainsky) Waksman et Henrici.Streptomyces fiavus (Krainsky) Waksman et Henrici.

Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.

Streptomyces ruber (Krainsky) Waksman et Henrici.Streptomyces ruber (Krainsky) Waksman et Henrici.

Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici.Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici.

Streptomyces pupurescens Lindenbeim. Streptomyces albogriseolus Benedict et a1. Streptomyces olivochromogenus (Bergey et a1.) Waksman et Henrici.Streptomyces pupurescens Lindenbeim. Streptomyces albogriseolus Benedict et a1. Streptomyces olivochromogenus (Bergey et a1.) Waksman et Henrici.

Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici.

Strept,imyces gougeroti (Dache) Waksman et T gznr s;'; S«eptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici. C:::-=:i-ne von -ihen :cie@:eli `Jikroorganismen befir lex_ sich. irc ins«tute für Fermentation, Osaka, ui-.d sind dort erhältlich. Ferner sind sie leicht von den T-,akt-vi ieral~altur-Sammeistellen in verschiedenen Ländern beziehbar, z. B. vom American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA., Northern Utilization Research Branch of United States Department of Agriculture, Peoria, I11., USA., und vom Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland. Außer den vorstehend als Beispiel aufgeführten Mikroorganismen kann jeder Mikroorganismus, der Ribonuclease erzeugt, für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden.Strept, imyces gougeroti (Dache) Waksman et T gznr s; '; S «eptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici. C ::: - =: i-ne from -ihen: cie @: eli `microorganisms be for lex_. irc ins «tute for fermentation, Osaka, ui-.d are available there. Furthermore, they are easily different from the T, akt-vi ieral ~ altur collection points Countries available, e.g. B. from the American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA., Northern Utilization Research Branch of United States Department of Agriculture, Peoria, I11., USA., And from the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland. In addition to the microorganisms listed above as an example, any microorganism, the ribonuclease produced can be used for the method according to the invention.

Im Verfahren gemäß der Erfindung werden die oben als Beispiel genannten Mikroorganismen oder die von ihnen erzeugte Ribonuclease einer Reaktion mit Ribonucleinsäuren oder mit Oligoribonucleotiden unterworfen. Bei Verwendung der Mikroorganismen wird die Hydrolyse der Ribonucleinsäuren oder der Oligoribonucleotide durch die von den Mikroorganismen erzeugte Ribonuclease bewirkt. Daher kann die Erfindung als Verfahren zur Hydrolyse von Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotiden zu 5'-Nucleotiden oder Nucleosiden durch Ribonucleasen der Mikroorganismen angesehen werden.In the method according to the invention those mentioned above are exemplified Microorganisms or the ribonuclease they produce react with ribonucleic acids or subjected to oligoribonucleotides. When using the microorganisms will the hydrolysis of ribonucleic acids or oligoribonucleotides by the Ribonuclease produced by microorganisms causes. Therefore, the invention can be used as a method for the hydrolysis of ribonucleic acids or oligoribonucleotides to 5'-nucleotides or nucleosides by ribonucleases of the microorganisms.

Wie bereits erwähnt, können diese Ribonueleasen in Form einer Komponente im lebenden Mycel oder von Kulturfiltraten der Mikroorganismen, einer Suspension ihrer Mikrobialzellen, von extrahierten Enzymen usw. verwendet werden. Die extrahierten Enzyme können in roher oder reiner Form gebraucht werden. Um die Ribonucleasen in den lebenden Zellen der Mikroorganismen mit den Ribonucleinsäuren oder Oligoribonucleotiden in Berührung zu bringen, ist es zweckmäßig, die Mikroorganismen auf einem Nährmedium, das das Ausgangsmaterial enthält, zu inkubieren oder das Ausgangsmaterial nachher in die Kultur der Mikroorganismen zu geben. Die Inkubation in den obigen Fällen kann in einem flüssigen oder festen Medium durchgeführt werden, wobei das Medium unter Belüftung gerührt oder auch nicht gerührt wird. Das einfachste und vorteilhafteste Verfahren ist jedoch die sogenannte submerse Kultur mit Belüftung und Rührung.As already mentioned, these ribonueleases can be in the form of a component in the living mycelium or from culture filtrates of the microorganisms, a suspension their microbial cells, extracted enzymes, etc. The extracted Enzymes can be used in raw or pure form. To get the ribonucleases in the living cells of the microorganisms with the ribonucleic acids or oligoribonucleotides to bring into contact, it is advisable to place the microorganisms on a nutrient medium, which contains the starting material, or the starting material afterwards to be added to the culture of the microorganisms. Incubation in the above cases can be carried out in a liquid or solid medium, the medium being stirred or not stirred with aeration. The simplest and most advantageous However, the method is the so-called submerged culture with aeration and agitation.

Wird das Verfahren gemäß der Erfindung nach einer der obigen Kulturmethoden durchgeführt, wird das für die verwendeten Mikroorganismen geeignetste Medium ausgewählt, jedoch kann jedes für die Inkubation gewöhnlicher Mikroorganismen gebrauchte Kulturmedium verwendet werden. So können Stärke, Dextrin, Saccharose, Lactose, Maltose, Glycerin usw. als Kohlenstoffquelle und Pepton, Fleischextrakt, Hefe oder Hefeextrakt, Sojabohnenpulver, Maiskeimextrakt, Gluten, Harnstoff, Ammoniumsalze, Nitrate usw. als Stickstoffquellen gebraucht werden. Gegebenenfalls können auch anorganische Salze von Metallen, wie Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, und Spuren von Kupfer-, Eisen-, Mangan-, Kobalt- usw. Salzen zugesetzt werden. Die Inkubation kann auch in einem Medium durchgeführt werden, das ein Spurenelement usw. enthält. In einigen Fällen können Ribonucleinsäure oder Oligoribonucleotide selbst als Nährstoff verwendet werden.If the method according to the invention is carried out using one of the above culture methods carried out, the most suitable medium for the microorganisms used is selected, however, any culture medium used for the incubation of common microorganisms be used. So can starch, dextrin, sucrose, lactose, maltose, glycerin etc as carbon source and peptone, meat extract, yeast or yeast extract, soybean powder, Corn extract, gluten, urea, ammonium salts, nitrates, etc. as nitrogen sources to be needed. Optionally, inorganic salts of metals, such as Magnesium, calcium, potassium, sodium and traces of copper, iron, manganese, cobalt etc. salts can be added. The incubation can also be carried out in a medium that contains a trace element, etc. In some cases, ribonucleic acid can or oligoribonucleotides themselves can be used as a nutrient.

Die Reaktion geht durch Berührung zwischen der Ribonucleinsäure oder dem Oligoribonucleotid und den Mikroorganismen oder ihrem Enzymsystem vonstatten. Werden lebende Zellen der Mikroorganismen verwendet, kann Ribonucleinsäure oder Oligoribonucleotid dem Medium in einer Phase der Inkubation zugesetzt werden, oder die Mikroorganismen können in einem Medium, das das Ausgangsmaterial enthält, inkubiert werden. Bei Verwendung des Enzymsystems des Mikroorganismus kann das Kulturfiltrat oder die Zellensuspension des Mikroorganismus oder das extrahierte Enzym mit oder ohne Verwendung eines geeigneten Mediums in Berührung mit dem Ausgangsmaterial gebracht werden. Wenn das Kulturfiltrat oder die Zellensuspension verwendet wird, ist in den meisten Fällen ein Medium nicht unbedingt erforderlich.The reaction goes through contact between the ribonucleic acid or the oligoribonucleotide and the microorganisms or their enzyme system. If living cells of the microorganisms are used, ribonucleic acid or Oligoribonucleotide can be added to the medium in a phase of incubation, or the microorganisms can be incubated in a medium containing the starting material will. When using the enzyme system of the microorganism, the culture filtrate or the cell suspension of the microorganism or the extracted enzyme with or brought into contact with the starting material without using a suitable medium will. If the culture filtrate or the cell suspension is used, in in most cases a medium is not absolutely necessary.

Als Medium - wenn ein solches gebraucht wird - eignet sich Wasser oder eine wäßrige Lösung, beispielsweise eine wäßrige Lösung eines Salzes, z. B. eine. Pufferlösung. Die Konzentration des Ausgangsmaterials im Medium einschließlich des Kulturfiltrats oder der Zellensuspension beträgt zweckmäßig mehr als einige Prozent. Die Reaktion wird bei einem pH-Wert durchgeführt, der für die Entwicklung der enzymatischen Aktivität am geeignetsten ist, selbst wenn das extrahierte Enzym verwendet wird und selbstverständlich auch für den Fall der Verwendung lebender Zellen. Dieser pH-Wert liegt etwa im neutralen Bereich, z. B. über 4 und unter 10. Die Reaktionstemperatur darf die enzymatische Aktivität nicht zu stark schädigen und das Enzymsystem nicht zerstören. Die Temperatur ist je nach der Art der verwendeten Mikroorganismen oder den anderen Bedingungen mehr oder weniger veränderlich und liegt gewöhnlich im Bereich zwischen 30 und 45° C. Die Reaktionszeit ist ebenfalls verschieden und hängt von Bedingungen, wie Art der Mikroorganismen, Enzymsysteme oder Medien, der Konzentration des Materials im Medium, der Reaktionstemperatur usw., ab, jedoch muß die Reaktion so lange durchgeführt werden, bis die gewünschte Verbindung in höchster Ausbeute gebildet ist. Die Reaktionsbedingungen werden vorzugsweise so eingestellt, daß 15 bis 40 Stunden erforderlich sind, um das gewünschte Produkt in höchster Ausbeute zu erzeugen.A suitable medium - if one is needed - is water or an aqueous solution, for example an aqueous solution of a salt, e.g. B. one. Buffer solution. The concentration of the starting material in the medium including of the culture filtrate or the cell suspension is expediently more than a few Percent. The reaction is carried out at a pH suitable for the development of enzymatic activity is most appropriate, even if that extracted enzyme is used and of course also in case of use living cells. This pH value is approximately in the neutral range, e.g. B. over 4 and below 10. The reaction temperature must not make the enzymatic activity too strong damage and not destroy the enzyme system. The temperature varies depending on the species the microorganisms used or the other conditions more or less variable and is usually in the range between 30 and 45 ° C. The reaction time is also different and depends on conditions such as types of microorganisms, enzyme systems or media, the concentration of the material in the medium, the reaction temperature etc., but the reaction must be carried out until the desired Compound is formed in the highest yield. The reaction conditions become preferable adjusted so that 15 to 40 hours are required to produce the desired product to produce in the highest yield.

Dem Reaktionssystem kann ein Beschleuniger zugesetzt werden, um die Aktivität der Enzyme zu steigern. Hierzu eignen sich beispielsweise Salze von divalenten Metallen, wie Magnesium.An accelerator can be added to the reaction system to reduce the Increase the activity of the enzymes. Salts of divalent ones, for example, are suitable for this purpose Metals such as magnesium.

In den meisten Fällen liegt jedoch Phosphomonoesterase im Enzymsystem der Mikroorganismen vor. Daher hört die Reaktion nicht beim 5'-Nucleotid auf, sondern geht weiter bis zu Nucleosiden. In einem solchen Fall kann als Produkt ein Gemisch aus Nucleosiden, wie Adenosin, Guanosin, Citydin, Uridin, Inosin, Xanthosin usw., oder von daraus abgeleiteten Desoxynucleosiden gebildet werden.In most cases, however, phosphomonoesterase is in the enzyme system of the microorganisms. Therefore, the reaction does not stop at the 5 'nucleotide, but rather goes on to nucleosides. In such a case, the product can be a mixture from nucleosides such as adenosine, guanosine, citydin, uridine, inosine, xanthosine, etc., or from deoxynucleosides derived therefrom.

Werden die 5'-Nucleotide allein gewünscht, muß die Phosphomonoesterase durch Reinigung aus dem Enzymsystem entfernt oder die Wirkung der Phosphomonoesterase auf andere Weise gehemmt werden. Um die Phosphomonoesterase unwirksam zu machen, kann ein Phosphomonoesterase-Inhibitor dem Enzymsystem zugesetzt werden. Hierzu eignen sich beispielsweise Phosphate, Arsenate, Cyanate, Aminosäuren, wie Cystein- und Glutaminsäure, Äthylendiamintetraessigsäure, Metallionen, wie Zink- und Cupriionen. In einem gewissen Enzymsystem liegt Deaminase gleichzeitig mit der Ribonuclease vor. In einem solchen Fall können deaminierte Verbindungen das Produkt verunreinigen. Eine solche Reaktion kann jedoch mit Vorteil für die Gewinnung von Deaminierungsprodukten, wie Inosinsäure, ausgenutzt werden.If the 5 'nucleotides alone are desired, the phosphomonoesterase must be used removed from the enzyme system by purification or the effect of phosphomonoesterase be inhibited in other ways. To make the phosphomonoesterase ineffective, a phosphomonoesterase inhibitor can be added to the enzyme system. For this phosphates, arsenates, cyanates, amino acids such as cysteine and glutamic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, metal ions such as zinc and cupric ions. In a certain enzyme system, deaminase is present at the same time as ribonuclease before. In such a case, deaminated compounds can contaminate the product. Such a reaction can, however, be used with advantage for the production of deamination products, such as inosinic acid.

Ist die Phosphomonoesterase-Aktivität des Enzymsystems sehr hoch, wird im Verfahren gemäß der Erfindung bei Verwendung eines Phosphomonoesterase-Inhibitors ein hauptsächlich aus 5'-Nucleotiden bestehendes Gemisch gebildet, während ohne Zusatz dieses Inhibitors ein hauptsächlich aus Nucleosiden bestehendes Gemisch entsteht. In beiden Fällen ist gewöhnlich eine gewisse Menge von Oligonucleotiden mit dem gewünschten Produkt vermischt. Selbst bei Verwendung eines Phosphomonoesterase-Inhibitors läßt es sich kaum vermeiden, daß Nucleoside mit dem Produkt gemischt sind. Wie bereits erwähnt, besteht somit stark die Gefahr der Vermischung von Deaminoverbindungen mit dem Produkt. Aus den vorstehenden Ausführungen ist ersichtlich. daß das Produkt in Form eines sehr komplizierten Gemisches von verschiedenen Arten von Verbindungen anfallen kann. Es ist daher zweckmäßig, die Reaktion zu dem Zeitpunkt zu beenden, zu dem die Konzentration der gewünschten Verbindung im Reaktionsgemisch am höchsten ist. Zu diesem Zweck wird der Fortgang der Hydrolyse durch Messung der Konzentration verfolgt. Die Messung der Konzentration kann nach bekannten Methoden, z. B. durch einen enzymatischen Prozeß, Papierelektrophorese und Papierchromatographie erfolgen.If the phosphomonoesterase activity of the enzyme system is very high, is used in the method according to the invention when using a phosphomonoesterase inhibitor formed a mixture consisting mainly of 5 'nucleotides while without Addition of this inhibitor results in a mixture consisting mainly of nucleosides. In both cases there is usually a certain amount of oligonucleotides with the desired product mixed. Even when using a phosphomonoesterase inhibitor it can hardly be avoided that nucleosides are mixed with the product. As already mentioned, there is therefore a high risk of mixing of deamino compounds with the product. From the above it can be seen. that the product in the form of a very complex mixture of different types of compounds may arise. It is therefore advisable to stop the reaction at the time to which the concentration of the desired compound in the reaction mixture is highest is. For this purpose, the progress of the hydrolysis is measured by measuring the concentration tracked. The concentration can be measured by known methods, e.g. B. by an enzymatic process, paper electrophoresis and paper chromatography.

Aus dem so gebildeten Gemisch, das hauptsächlich 5'-Nucleotide und/oder Nucleoside enthält, können die gewünschten Substanzen durch Ausnutzung der Unterschiede in den physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen den Verunreinigungen und den gewünschten Substanzen isoliert bzw. als Gemisch erhalten werden. Zu den für diesen Zweck ausnutzbaren physikalisch-chemischen Eigenschaften gehören Unterschiede in der Löslichkeit, dem Verteilungsfaktor zwischen zwei Lösungsmitteln, der Absorbierbarkeit, Dialysierbarkeit, Fällbarkeit usw. Zu dem gleichen Zweck kann auch ein Fällungszusatz zugegeben werden. Die 5'-Nucleotide werden zweckmäßig in Form ihrer organischen oder anorganischen Salze, z. B. als Salze von Barium, Calcium, Kalium, Ammonium, Aminosäuren, Cyclohexylamin und Brucin, gesammelt.From the mixture thus formed, which is mainly 5'-nucleotides and / or Containing nucleosides, the desired substances can be obtained by taking advantage of the differences in the physicochemical properties between the impurities and the desired substances are isolated or obtained as a mixture. To the for this one Purpose exploitable physicochemical properties include differences in the solubility, the distribution factor between two solvents, the absorbability, Dialysability, precipitability, etc. A precipitating additive can also be used for the same purpose be admitted. The 5 'nucleotides are conveniently in the form of their organic or inorganic salts, e.g. B. as salts of barium, calcium, potassium, ammonium, Amino acids, cyclohexylamine and brucine.

Die Abtrennung und Reinigung jeder Komponente des Gemisches kann nach an sich bekannten Verfahren, z. B. durch Chromatographie, vorgenommen werden. Ein Beispiel hierfür ist nachstehend beschrieben.The separation and purification of each component of the mixture can after methods known per se, e.g. B. by chromatography. A An example of this is described below.

Zunächst werden die unlöslichen Verunreinigungen aus dem Gemisch abfiltriert und dann die aktiven Substanzen an Aktivkohle adsorbiert. Die adsobierten Substanzen werden mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. verdünnter Salzsäure, verdünntem Ammoniak öder Alkohol, eluiert. Dann wird die Ultraviolettabsorption jeder Fraktion gemessen und jede Fraktion, die eine Komponente enthält, aufgefangen und eingeengt. Wird das Produkt als Bariumsalz gewonnen, läßt sich die anschließende Reinigung einfacher durchführen.First of all, the insoluble impurities are filtered off from the mixture and then adsorb the active substances on activated carbon. The adsorbed substances are treated with a suitable solvent, e.g. B. dilute hydrochloric acid, dilute Ammonia or alcohol, eluted. Then the ultraviolet absorption of each fraction measured and each fraction that contains a component, collected and concentrated. If the product is obtained as a barium salt, the subsequent purification can be carried out easier to perform.

Das vorstehend beschriebene Verfahren ist ein Beispiel für die Chromatographie in einer Aktivkohlesäule. Auch andere Verfahren, z. B. Ionenaustausch-Chromatographie an Ionenaustauschern oder Gegenstromverteilung, können für diesen Zweck angewendet werden.The procedure described above is an example of the chromatography in an activated carbon column. Other methods, e.g. B. Ion exchange chromatography on ion exchangers or countercurrent distribution, can be used for this purpose will.

Das Verfahren gemäß der Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele erläutert. Die angegebenen Temperaturen sind sämtlich unkorrigiert, und die Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen. Die benutzten Abkürzungen haben folgende Bedeutung: AMP = Adenosinmonophosphat; GMP = Guanosinmonophosphat; UMP = Uridinmonophosphat; CMP = Cytidinmonophosphat und IMP = Inosinmonophosphat. Die als Ausgangsmaterial in den Beispielen verwendete Nucleinsäure wurde, falls nicht anders angegeben, nach einem bekannten Verfahren aus Hefe hergestellt. Die Namen der Bakterienkultur-Sammelstellen wurden wie folgt abgekürzt IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan. NRRL = Northern Utilization Research Branch of US. Department of Agriculture, Peoria, 111., USA. ATCC = American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA. CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland. Beispiel 1 Ein Stamm Streptomyces albogriseolus Benedict, Shotwell et Pridham, wird 24 Stunden bei 28-C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0o/0 lösliche Stärke, 3,0% Maiskeimextrakt, 0,10/0 Ammoniumsulfat, 0,05o/0 wäßriges Magnesiumsulfat, 0,50% Pepton und 0,2% Calciumcarbonat. Auf 1001 des gleichen Mediums in einem Behälter werden 500 cm3 der' vorstehend genannten Kultur eingesät. Anschließend wird die Inkubation 30Stunden bei 28° C durchgeführt. Eine Suspension von 1 kg Ribonucleinsäure in 2001 Wasser wird mit einer Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt. Der Lösung werden 1001 des Kulturfiltrats der obigen Kultur zugegeben. Ferner wird Natriumarsenat in solcher. Menge zugesetzt, daß seine Konzentration in der Lösung 10 Millimol je Liter beträgt. Anschließend wird der pH-Wert auf 8,0 eingestellt. Nach Zugabe von 500 g Toluol für antiseptische Zwecke wird die Hydrolyse 16 Stunden bei 37° C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird mit einem Filtermittel filtriert und der pH-Wert des Filtrats auf 2,5 gesenkt. Nach Adsorption des im Filtrat enthaltenen Produkts an Aktivkohle wild mit 1,5%igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Die Nucleotide im Eluat werden mit Hilfe eines Ionenaustauschharzes abgetrennt und die Fraktion, die 5'-AMP enthält, aufgefangen. Die 5'-AMP enthaltende Fraktion wird mit Natriumnitrit deaminiert, wobei 100 g 5'-IMP erhalten werden. Von den anderen Fraktionen wurde 5'-GMP, 5'-UMP und 5'-CMP in Ausbeuten von 55, 70 bzw. 78 g gewonnen.The method according to the invention is illustrated by the following working examples. The temperatures given are all uncorrected and the percentages are based on weight. The abbreviations used have the following meanings: AMP = adenosine monophosphate; GMP = guanosine monophosphate; UMP = uridine monophosphate; CMP = cytidine monophosphate and IMP = inosine monophosphate. The nucleic acid used as the starting material in the examples was prepared from yeast by a known method, unless otherwise specified. The names of the bacterial culture collection points have been abbreviated as follows IFO = Institute for Fermentation, Osaka, Japan. NRRL = Northern Utilization Research Branch of US. Department of Agriculture, Peoria, 111. USA. ATCC = American Type Culture Collection, Washington, DC, USA. CBS = Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland. example 1 A strain of Streptomyces albogriseolus Benedict, Shotwell et Pridham, is incubated for 24 hours at 28 ° C. in an aqueous medium with a pH of 7.0 and the following composition: 5.0 / 0 soluble starch, 3.0% corn germ extract, 0 , 10/0 ammonium sulfate, 0.05% aqueous magnesium sulfate, 0.50% peptone and 0.2% calcium carbonate. 500 cm3 of the above-mentioned culture are sown on 100 liters of the same medium in a container. Incubation is then carried out for 30 hours at 28 ° C. A suspension of 1 kg of ribonucleic acid in 2001 water is adjusted to a pH of 7.8 with a sodium hydroxide solution. 100 liters of the culture filtrate of the above culture are added to the solution. Furthermore, sodium arsenate is used in such. Amount added so that its concentration in the solution is 10 millimoles per liter. The pH is then adjusted to 8.0. After adding 500 g of toluene for antiseptic purposes, the hydrolysis is carried out at 37 ° C. for 16 hours, the pH being kept at 7.5 to 8. The reaction mixture is filtered with a filter medium and the pH of the filtrate is lowered to 2.5. After adsorption of the product contained in the filtrate on activated charcoal, eluted wildly with 1.5% aqueous ammonia. The nucleotides in the eluate are separated off with the aid of an ion exchange resin and the fraction containing 5'-AMP is collected. The fraction containing 5'-AMP is deaminated with sodium nitrite to give 100 g of 5'-IMP. From the other fractions, 5'-GMP, 5'-UMP and 5'-CMP were recovered in yields of 55, 70 and 78 g, respectively.

Der Stamm Streptomyces albogriseolus ist vom NRRL unter der Nummer B-1305 erhältlich. Beispiel 2 Ein Stamm Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici wird 24 Stunden unter Schütteln bei einer Temperatur von 28° C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0010 lösliche Stärke, 1,00% Fleischextrakt, 0,05010 wäßriges Magnesiumsulfat und 0,5010 Natriumchlorid. Auf 1001 eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung werden 500 cm3 der vorstehend genannten Kultur eingesät. Die Inkubation wird 45 Stunden bei 28° C in einem Behälter durchgeführt.Streptomyces albogriseolus strain is available from the NRRL under number B-1305. Example 2 A strain of Streptomyces aureus (Waksman et Curtis) Waksman et Henrici is incubated for 24 hours with shaking at a temperature of 28 ° C. in an aqueous medium with a pH of 7.0 and the following composition: 5.0010 soluble starch, 1.00% meat extract, 0.05010 aqueous magnesium sulfate and 0.5010 sodium chloride. 500 cm3 of the above-mentioned culture are sown on 100 liters of a medium with the same composition. Incubation is carried out in a container at 28 ° C. for 45 hours.

Einer Suspension von 1 kg Ribonucleinsäure in 2001 Wasser werden 1001 des Kulturfiltrats der vorstehend genannten Kultur zugesetzt. Anschließend wird der.pH-Wert des Gemisches mit einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf 7,8 eingestellt und Natriumarsenat in einer Menge zugegeben, daß seine Konzentration im Gemisch 10 Mzllimol je Liter beträgt. Nach Einstellung des pH-Wertes des Gemisches auf 8,0 werden 500 g Toluol für antiseptische Zwecke zugesetzt. Dann wird die Hydrolyse 20 Stunden bei 37° C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird mit einem Filtermittel filtriert und der pH-Wert des Filtrats auf 3,0 gesenkt. Nach Adsorption des Produkts im Filtrat an Aktivkohle wird es mit 1,5o/0igem wäßrigem Ammoniak eluiert. Aus dem Eluat werden mit Hilfe eines Ionenaustauschharzes 5'-IMP, 5'-UMP, 5'-GMP und 5'-CMP in einer Ausbeute von 120, 75, 90 bzw. 95 g abgetrennt.A suspension of 1 kg of ribonucleic acid in 2001 water becomes 1001 of the culture filtrate added to the aforementioned culture. Then will der.pH value of the mixture adjusted to 7.8 with an aqueous sodium hydroxide solution and sodium arsenate added in an amount such that its concentration in the mixture 10 Mzllimol per liter. After adjusting the pH of the mixture to 8.0 500 g of toluene are added for antiseptic purposes. Then the hydrolysis Carried out 20 hours at 37 ° C, the pH is kept at 7.5 to 8.0. The reaction mixture is filtered with a filter medium and the pH of the filtrate is adjusted lowered to 3.0. After adsorption of the product in the filtrate on activated carbon, it becomes with 1.5% aqueous ammonia eluted. The eluate is made with the help of an ion exchange resin 5'-IMP, 5'-UMP, 5'-GMP and 5'-CMP separated in a yield of 120, 75, 90 and 95 g, respectively.

Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces aureus wird als Ogata-Stamm Nr.1031 bezeichnet und ist vom IFO unter der Nummer IFO-3303 und vom ATCC unter der Eintragungs-Nummer ATCC-13357 erhältlich. Beispiel 3 Ein Stamm Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici wird 24 Stunden bei 28°C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 3,0o% lösliche Stärke, 1,0% Pepton, 0,50,1o Fleischextrakt, 0,05% wäßriges Magnesiumsulfat, 0,1 % Kaliumphosphit. Auf 1001 eines Mediums mit der gleichen Zusammensetzung werden 500 cm3 der vorstehend genannten Kultur eingesät. Die Inkubation wird 60 Stunden bei 28°C in einem Behälter durchgeführt.The strain Streptomyces aureus used in this example is identified as Ogata strain number 1031 and is registered by the IFO under the number IFO-3303 and dated ATCC under registration number ATCC-13357. Example 3 A strain of Streptomyces viridochromogenes (Krainsky) Waksman et Henrici is 24 hours at 28 ° C in a aqueous medium with a pH of 7.0 and the following composition: 3.0o% soluble starch, 1.0% peptone, 0.50.1o meat extract, 0.05% aqueous magnesium sulfate, 0.1% potassium phosphite. Be on 1001 of a medium with the same composition 500 cm3 of the above-mentioned culture were sown. Incubation is 60 hours carried out at 28 ° C in a container.

Einer Suspension von 1 kg Ribonucleinsäure in 2001 Wasser wird zur Einstellung des pH-Wertes des Gemisches auf 7,8 eine wäßrigeNatriumhydroxydlösung zugegeben. Dann werden 1001 des Kulturfiltrats der vorstehend genannten Kultur zugesetzt. Anschließend wird die Hydrolyse 30 Stunden bei einer Temperatur von 37° C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 8,0 gehalten wird. Da das Kulturfiltrat Phosphomonoesterase von hoher Aktivität enthält, wird die Ribonucleinsäure fast quantitativ zu Nucleosiden hydrolysiert. Aus dem Hydrolysat werden 150 g Adenosin, 110 g Guanosin, 130 g Cytidin und 140 g Uridin gewonnen.A suspension of 1 kg of ribonucleic acid in 2001 water is used Adjust the pH of the mixture to 7.8 with an aqueous sodium hydroxide solution admitted. Then 100 liters of the culture filtrate are added to the above-mentioned culture. The hydrolysis is then carried out for 30 hours at a temperature of 37 ° C, keeping the pH at 8.0. As the culture filtrate is phosphomonoesterase of high activity, the ribonucleic acid becomes nucleosides almost quantitatively hydrolyzed. The hydrolyzate gives 150 g of adenosine, 110 g of guanosine and 130 g of cytidine and 140 g of uridine obtained.

Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces viridochromogenes ist von CBS erhältlich. Der Stamm wurde dieser Bakterienkultur-Sammelstelle ursprünglich von Dr. S. A. Wa k s m a n , Rutgers University, New Brunswick, New Jersey, zugesandt.The strain Streptomyces viridochromogenes used in this example is available from CBS. The strain was originally this bacterial culture collection point by Dr. S. A. Wa k s m a n, Rutgers University, New Brunswick, New Jersey.

Beispiel 4 Ein Stamm Streptomyces Purpurescens Lindenbein wird 15 Stunden bei einer Temperatur von 28° C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert 3,00% lösliche Stärke, 1,001o Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,05010 wäßriges Magnesiumsulfat, 0,05010 Calciumcarbonat und 0,10% Natriumchlorid. 1001 des Kulturfiltrats der vorstehenden Kultur wird I kg Ribonucleinsäure und anschließend Natriumarsenat in einer Menge zugegeben, daß dessen Konzentration im Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann wird die Hydrolyse 20 Stunden bei 37°C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird. Aus dem Hydrolysat werden 85 g 5'-AMP, 70 g 5'-GMP, 80 g CMP und 75 g 5'-UMP gewonnen. Aus dem Rückstand werden sowohl Nucleoside als auch Oligonucleotide gewonnen.Example 4 A strain of Streptomyces Purpurescens Lindenbein is incubated for 15 hours at a temperature of 28 ° C. in an aqueous medium with a pH of 7.0 and the following composition: 3.00% soluble starch, 1.0010 peptone, 0.5% yeast extract , 0.05010 aqueous magnesium sulfate, 0.05010 calcium carbonate and 0.10% sodium chloride. 1001 of the culture filtrate from the above culture is added 1 kg of ribonucleic acid and then sodium arsenate in an amount such that its concentration in the mixture is 10 millimoles per liter. The hydrolysis is then carried out at 37 ° C. for 20 hours, the pH being maintained at 7.5 to 8.0. 85 g of 5'-AMP, 70 g of 5'-GMP, 80 g of CMP and 75 g of 5'-UMP are obtained from the hydrolyzate. Both nucleosides and oligonucleotides are obtained from the residue.

Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces purpurescens befindet sich beim IFO unter der Eintragungsnummer IFO-3389 und wurde ursprünglich vom NRRL unter der Nummer B-1454 über das National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA., verteilt.The strain Streptomyces purpurescens used in this example is located at the IFO at registration number IFO-3389 and was originally published by the NRRL under number B-1454 through the National Institute of Health, Bethesda, Maryland, USA., distributed.

Beispiel 5 Ein Stamm Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici wird 15 Stunden bei 28'C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0% lösliche Stärke, 3,0% Maiskeimextrakt, 1,00/0 Pepton, 0,050% Ammoniumsulfat, 0,20% Calciumcarbonat und 0,20/0 Natriumchlorid. 1001 des Kulturfiltrats der vorstehenden Kultur wird 1 kg Ribonucleinsäure zugesetzt und das Gemisch 16 Stunden bei einer Temperatur von 37° C stehengelassen. Aus dem Hydrolysat werden 55 g 5'-AMP, 30 g 5'-GMP, 45 g 5'-CMP und 48 g 5'-UMP gewonnen. Durch Entphosphosieren wird ein Teil des Hydrolysats als Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin erhalten.Example 5 A strain of Streptomyces coelicolor (Müller) Waksman et Henrici is 15 hours at 28'C in an aqueous medium with a pH of 7.0 and Incubated with the following composition: 5.0% soluble starch, 3.0% corn germ extract, 1.00 / 0 peptone, 0.050% ammonium sulfate, 0.20% calcium carbonate and 0.20 / 0 sodium chloride. 1001 of the culture filtrate from the above culture is added to 1 kg of ribonucleic acid and the mixture was allowed to stand for 16 hours at a temperature of 37 ° C. From the 55 g of 5'-AMP, 30 g of 5'-GMP, 45 g of 5'-CMP and 48 g of 5'-UMP are obtained from the hydrolyzate. Part of the hydrolyzate is converted into adenosine, guanosine, and cytidine by dephosphating and uridine received.

Der Stamm Streptomyces Coelicolor befindet sich im IFO unter der Nummer IFO-3807 und wurde beim ATCC unter der Nummer ATCC-13358 eingetragen.The strain Streptomyces Coelicolor is in the IFO under the number IFO-3807 and was registered with the ATCC under number ATCC-13358.

Beispiel 6 Ein Stamm Helminthosporium sigmoideum var. irregulare Cralley et Tullis wird 45 Stunden bei einer Temperatur von 28°C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0% Glucose, 1,00/0 Pepton, 1,00/0 Sojabohnenpulver, 0,0-0/0 wäßriges Magnesiumsulfat, 0,10% Kaliumphosphit und 0,2% Natriumchlorid. Einer Suspension "on 1 kg Ribonucleinsäure in 2001 Wasser werden 1001 des Kulturfiltrats der vorstehend genannten Kultur und anschließend Natriumarsenat in einer Menge zugegeben, daß dessen Konzentration im Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann wird die Hydrolyse 16 Stunden bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird. Aus dem Hydrolysat wurden 70g 5'-AMP, 50g 5'-GMP, 65g 5'-UMP und 65g 5'-CMP gewonnen. Ferner wurden aus einem Teil der Rückstände infolge Entphosphorung Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin erhalten.Example 6 A strain of Helminthosporium sigmoideum var. Irregular Cralley et Tullis is 45 hours at a temperature of 28 ° C in an aqueous medium incubated with a pH of 7.0 and the following composition: 5.0% glucose, 1.00 / 0 peptone, 1.00 / 0 soybean powder, 0.0-0 / 0 aqueous magnesium sulfate, 0.10% Potassium phosphite and 0.2% sodium chloride. A suspension of 1 kg of ribonucleic acid in 2001 water become 1001 of the culture filtrate of the above culture and then added sodium arsenate in an amount that its concentration in the Mixture is 10 millimoles per liter. Then the hydrolysis is 16 hours at a Temperature of 37 ° C carried out, the pH is kept at 7.5 to 8.0. 70 g of 5'-AMP, 50 g of 5'-GMP, 65 g of 5'-UMP and 65 g of 5'-CMP were obtained from the hydrolyzate. Furthermore, adenosine, guanosine, Receive cytidine and uridine.

Der'in diesem Beispiel verwendete Stamm Helminthosporium sigmoidium var. irregulare ist beim IFO unter der Nummer IFO-5273 hinterlegt urid wurde beim ATCC unter der Eingangsnummer ATCC-13359 eingetragen. Beispiel 7 Ein Stamm Bacillus brevis Migula emend. Ford wird in einem Behälter 60 Stunden bei einer Temperatur von 28° C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0% lösliche Stärke, 1,00% Pepton, 1,00/0 Fleischextrakt, 0,10% Kaliumphosphit und 0,50% Natriumchlorid. Einer Lösung von 1 kg Ribonucleiiisäure in 2001 Wasser werden 100 cm3 des Kulturfiltrats der obengenannten Kultur zugegeben. Anschließend wird Natriumarsenat in einer solchen Menge zugesetzt, daß seine Konzentration im Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann erfolgt Hydrolyse für 20 Stunden bei einer Temperatur von 37° C, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird. Aus dem Hydrolysat werden 90g 5'-AMP, 70g 5'-GMP, 80g 5'-UMP und 85 g 5'-CMP gewonnen.The strain Helminthosporium sigmoidium used in this example var. irregulare is deposited with the IFO under the number IFO-5273 urid was deposited with the ATCC registered under accession number ATCC-13359. Example 7 A strain of Bacillus brevis Migula emend. Ford is placed in a container for 60 hours at one temperature of 28 ° C in an aqueous medium with a pH of 7.0 and the following composition incubated: 5.0% soluble starch, 1.00% peptone, 1.00 / 0 meat extract, 0.10% potassium phosphite and 0.50% sodium chloride. A solution of 1 kg of ribonucleiiic acid in 2001 water 100 cm3 of the culture filtrate are added to the culture mentioned above. Afterward sodium arsenate is added in such an amount that its concentration in the Mixture is 10 millimoles per liter. Then hydrolysis takes place for 20 hours a temperature of 37 ° C, the pH being kept at 7.5 to 8.0. the end 90 g of 5'-AMP, 70 g of 5'-GMP, 80 g of 5'-UMP and 85 g of 5'-CMP are obtained from the hydrolyzate.

Der in diesem Beispiel verwendete Stamm des Bacillus brevis ist vom ATCC unter der Nummer ATCC-8185 erhältlich.The strain of Bacillus brevis used in this example is from ATCC available under number ATCC-8185.

Beispiel 8 Ein Stamm des Bacillus subtilis Cohn emend. Prazmowski wird in einem Tank 45 Stunden bei einer Temperatur von 28'C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert: 5,0% Glukose, l,00/0 Pepton, 1,00% Fleischextrakt, 0,10/0 Kaliumphosphit, 0,050% wäßriges Magnesiumsulfat und 0,20/0 Natriumchlorid. In 1001 des Kulturfiltrats der vorgenannten Kultur wird 1 kg Ribonucleinsäure gelöst und dann die Hydrolyse 16 Stunden bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt, wobei der pH-Wert des Gemisches bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird. Aus dem Hydrolysat werden 60 g 5'-AMP, 45 g 5'-GMP, 50 g 5'-UMP und 55 g 5'-CMP gewonnen. Ferner können Adenosin, Guanosin, Uridin und Cytidin aus den Rückständen gewonnen werden, da das Kulturfiltrat Phosphomonoesterase enthält und daher die Hydrolyse über die 5'-Nucleotide erfolgt.Example 8 A strain of Bacillus subtilis Cohn emend. Prazmowski is incubated in a tank for 45 hours at a temperature of 28 ° C. in an aqueous medium with a pH of 7.0 and the following composition: 5.0% glucose, 1.00/0 peptone, 1.00% meat extract , 0.10 / 0 potassium phosphite, 0.050% aqueous magnesium sulfate and 0.20 / 0 sodium chloride. In 1001 of the culture filtrate of the above culture 1 kg ribonucleic acid is dissolved and then the hydrolysis is carried out for 16 hours at a temperature of 37 ° C, wherein the pH value of the mixture is maintained at 7.5 to 8.0. 60 g of 5'-AMP, 45 g of 5'-GMP, 50 g of 5'-UMP and 55 g of 5'-CMP are obtained from the hydrolyzate. Furthermore, adenosine, guanosine, uridine and cytidine can be obtained from the residues, since the culture filtrate contains phosphomonoesterase and therefore hydrolysis takes place via the 5 'nucleotides.

Der in diesem Beispiel verwendete Stamm des Bacillus subtilis wurde von Dr. C. Matsumura von IFO isoliert und bereits im Institute for Fermentation, Osaka, und beim American Type Culture Collection, Washington, D. C., unter der Eingangsnummer IFO-3032 bzw. ATCC-13360 hinterlegt.The strain of Bacillus subtilis used in this example was by Dr. C. Matsumura isolated from IFO and already in the Institute for Fermentation, Osaka, and the American Type Culture Collection, Washington, D. C., under accession number IFO-3032 or ATCC-13360 deposited.

Beispiel 9 Ein Stamm Streptomyces coelicolor wird in einem Tank 15 Stunden bei einer Temperatur von 28° C in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung inkubiert 5,00% lösliche Stärke, 3,0% Maiskeimextrakt, 1,00% Pepton, 0,05% wäßriges Magnesiumsulfat, 0,10/0 Ammoniumsulfat, 0,20/0 Calciumcarbonat und 0,2% Natriumchlorid.Example 9 A strain of Streptomyces coelicolor is grown in a tank 15 Hours at a temperature of 28 ° C in an aqueous medium with a pH value of 7.0 and the following composition incubated 5.00% soluble starch, 3.0% corn germ extract, 1.00% peptone, 0.05% aqueous magnesium sulfate, 0.10 / 0 ammonium sulfate, 0.20 / 0 calcium carbonate and 0.2% sodium chloride.

Einem wäßrigen Extrakt, hergestellt aus 10 kg Hefe und 1501 Wasser bei einem pH-Wert von 7 bis 9 unter Erhitzen, werden 351 Kulturfiltrats der vorgenannten Kultur und anschließend Natriumarsenat in solcher Menge zugegeben, daß dessen Konzentration im Gemisch 10 Millimol je Liter beträgt. Dann wird die Hydrolyse 20 Stunden bei einer Temperatur von 37° C durchgeführt, wobei der pH-Wert bei 7,5 bis 8,0 gehalten wird. Aus dem Hydrolysat werden 110 g 5'-AMP, 70 g 5'-GMP, 90 g 5'-CMP und 80 g 5'-UMP gewonnen. Aus den Rückständen werden außerdem Nucleoside und Oligonucleotide erhalten.An aqueous extract made from 10 kg yeast and 150 liters of water at a pH of 7 to 9 with heating, the culture filtrate becomes 351 of the aforementioned Culture and then sodium arsenate added in such an amount that its concentration in the mixture is 10 millimoles per liter. Then the hydrolysis will last for 20 hours carried out at a temperature of 37 ° C., the pH being kept at 7.5 to 8.0 will. The hydrolyzate becomes 110 g of 5'-AMP, 70 g of 5'-GMP, 90 g of 5'-CMP and 80 g Won 5'-UMP. The residues also become nucleosides and oligonucleotides obtain.

Der in diesem Beispiel verwendete Stamm Streptomyces coelicolor ist der gleiche, wie er im Beispiel 5 gebraucht wurde.The strain used in this example is Streptomyces coelicolor the same as used in Example 5.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the production of suitable seasonings 5'-nucleotides, nucleosides and their mixtures by hydrolysis of ribonucleic acids, Oligoribonucleotides or mixtures thereof biologically, thereby marked, that the starting material (s) with an enzyme system generated by a microorganism hydrolyzed and the hydrolyzates optionally in a known manner into their components be disassembled.

2. The method according to claim 1, characterized in that the of Streptomyces, Bacillus, Hehninthosporium, Giomastix, Verticillium or Fusarium species generated enzyme systems can be used.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized characterized in that the hydrolysis with the enzyme system in the presence of a phosphormonoesterase inhibitor, such as phosphates, arsenates, amino acids, ethylenediaminetetraacetic acid, metal ions, he follows.

4. Process according to Claims 1 to 3, characterized in that the hydrolysis takes place in or on a nutrient medium containing the starting material.

5. Procedure according to claims 1 to 3, characterized in that; that the hydrolysis with the culture filtrate of a microorganism.

6. The method according to claims 1 to 3, characterized in that that the hydrolysis takes place with the cell suspension of a microorganism.

7. Procedure according to claims 1 to 3, characterized in that the hydrolysis with the extracted Enzyme of a microorganism takes place in an aqueous medium. B.

Method according to claims 1 to 7, characterized in that the individual components of the hydrolyzate separated by column chromatography on activated charcoal and the individual components be concentrated from the eluates.

9. The method according to claim 8, characterized in that that the individual components are obtained as barium, calcium or cyclohexylamine salts will.