DE1123085B

DE1123085B - Process for the manufacture of antibiotics of the tetracycline series

Info

Publication number: DE1123085B
Application number: DEA35227A
Authority: DE
Inventors: Jerry Robert Daniel Mccormick; Nancy Hazlett Arnold; Philip Andrew Miller; Newell Oscar Sjolander
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1958-06-20
Filing date: 1959-06-18
Publication date: 1962-02-01

Description

Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Tetracyclinreihe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Antibiotika der Tetracyclinreihe unter Zusatz einer Substanz mit biologischer Wirksamkeit, die von verschiedenen Spezies des Genus Streptomyces gebildet wird. Diese Substanz, die im folgenden als cosynthetischer Faktor-1 und an einigen Stellen als CF-1 bezeichnet wird, besitzt einerseits die Eigenschaft, die Bildung von Chlortetracyclin und anderen Tetracyclinantibiotika in hohen Konzentrationen hervorzurufen, wenn sie bei einer Gärung mittels Stämmen von S. aureofaciens zugesetzt wird, die nur geringe Mengen Chlortetracyclin erzeugen. Andererseits besitzt die Substanz die Eigenschaft, die Stämme zur Bildung anderer Tetracyclinantibiotika zu veranlassen, als von denselben normalerweise produziert werden.Process for the preparation of antibiotics of the tetracycline series Die The invention relates to a method for producing antibiotics of the tetracycline series with the addition of a substance with biological activity differentiated by different Species of the genus Streptomyces is formed. This substance, hereinafter referred to as cosynthetic factor-1 and referred to in some places as CF-1 on the one hand the property of the formation of chlortetracycline and other tetracycline antibiotics in high concentrations when they are fermented by means of strains by S. aureofaciens, which produce only small amounts of chlortetracycline. On the other hand, the substance has the property that the stems to form others To induce tetracycline antibiotics than normally produced by them will.

Im Patent 1089 511 sind neue, den Tetracyclinen verwandte Verbindungen beschrieben, die als 5 a(11 a)-Dehydrotetracycline bezeichnet wurden. Diese 5 a(11 a)-Dehydrotetracycline werden von bestimmten Stämmen von S. aureofaciens, z. B. dem Stamm S 1308, erzeugt, dessen morphologische und Wachstumcharakteristika in dem genannten Patent eingehend abgehandelt sind. Außerdem sind lebensfähige Kulturen von S.-aureofaciens-Stamm S 1308 sowie mehrerer Varianten desselben bei der American Type Culture Collection in Washington. D. C.. hinterlegt worden, wo ihnen die ATCC Accession Numbers 12748 bis 12751 zugeteilt worden sind. Die 5 a(11 a)-Dehydrotetracycline sind biologisch weitgehend inaktiv, können jedoch durch ein geeignetes katalytisches Reduktionsverfahren in das bekannte Breitspektrum-Antibiotikum Tetracyclin übergeführt werden.Patent 1089 511 in the new, the tetracycline related compounds are described which (11 a) were -Dehydrotetracycline referred to as 5 a. These 5 a (11 a) dehydrotetracyclines are produced by certain strains of S. aureofaciens, e.g. B. the strain S 1308, whose morphological and growth characteristics are discussed in detail in the patent mentioned. In addition, viable cultures of S. aureofaciens strain S 1308 and several variants thereof are in the American Type Culture Collection in Washington. DC. where they have been assigned ATCC Accession Numbers 12748 to 12751 . The 5 a (11 a) -Dehydrotetracycline are biologically largely inactive, but can be converted by a suitable catalytic reduction process into the well-known broad-spectrum antibiotic tetracycline.

Es wurde nun gefunden, daß bei Zugabe von cosynthetischem Faktor-1 zu einem beispielsweise mit S.-aureofaciens-Stamm S 1308 (ATCC Nr. 12 748) beimpften Fernmentationsmedium und Züchtung der Kultur unter üblichen aeroben Bedingungen die gebildete Chlortetracyclinmenge von etwa 100 bis 400 auf über 5000 #tg/ml gesteigert wird. In diesem Fall wird kein 5 a(11 a)-Dehydrotetracyclin mehr gebildet. Die Gründe, weshalb durch die Zugabe des cosynthetischen Faktors-1 bei der Fermentation eine derartig hohe Chlortetracyclinkonzentration gebildet wird, während bei der gleichen Fermentation gewöhnlich nur minimale Chlortetracyclinmengen entstehen, sind noch nicht geklärt, und es soll auch keine Theorie für diese Erscheinung angegeben werden. Es wird jedoch angenommen, daß CF-1 nicht als Precursor anzusehen ist, was sich daraus ergibt, daß die Zugabe von 1 wg CF-1 zu einer ausreichenden Menge von S. aureofaciens ATCC Nr. 12 748 zu der Biosynthese von bis zu 57 mg Chlortetracyclin mehr führt, als normalerweise unter den gleichen Bedingungen gebildet wird. Andere Tetracyclin-Antibiotika können erzeugt werden, indem man Fermentationsmedien, die andere S.-aureofaciens-Stämme enthalten, CF-1 zusetzt, wie aus den nachfolgenden Beispielen zu ersehen ist.It has now been found that when cosynthetic factor-1 is added to a remote fermentation medium inoculated, for example, with S. aureofaciens strain S 1308 (ATCC No. 12 748) and the culture is grown under conventional aerobic conditions, the amount of chlorotetracycline formed is about 100 to 400 is increased to over 5000 # tg / ml. In this case, no more 5 a (11 a) -dehydrotetracycline is formed. The reasons why such a high concentration of chlorotetracycline is formed through the addition of cosynthetic factor-1 during fermentation, while usually only minimal amounts of chlorotetracycline are formed during the same fermentation, have not yet been clarified, and no theory should be given for this phenomenon. It is believed, however, that CF-1 is not to be regarded as a precursor, as follows from the fact that the addition of 1 wg CF-1 to a sufficient amount of S. aureofaciens ATCC No. 12,748 to the biosynthesis of up to 57 mg Chlortetracycline produces more than is normally produced under the same conditions. Other tetracycline antibiotics can be generated by adding fermentation media containing other S. aureofaciens strains to CF-1 as shown in the examples below.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht daran, daß man unter aeroben Bedingungen ein wäßriges Nährmedium mittels Steptomyceten, welche Antibiotica der Tetracyclinreihe erzeugen, in Gegenwart von nach Patent 1106 453 hergestelltem cosynthetischem Faktor-1 vergärt.The process of the invention is the fact that one, under aerobic conditions, an aqueous fermented broth by means Steptomyceten which produce antibiotics in the presence of the Tetracyclinreihe prepared according to patent 1106 453 cosynthetischem factor -1.

Der cosynthetische Faktor-1 wird nach Patent 1 106 453 erhalten, indem ein Mikroorganismus des Genus Streptomyces in bekannter Weise in einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet wird, bis dieses eine in der Hauptsache auf dem cosynthetischen Faktor-1 beruhende Aktivität aufweist, anschließend bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 7 filtriert wird und aus dem Filtrat durch übliche Aufarbeitung der cosynthetische Faktor-1 gewonnen wird. Als besonders vorteilhaft zu verwendender Mikroorganismus erwies sich Streptomyces aureofaciens ATCC-Nr.13190 oder dessen Mutanten oder Varianten, von dem lebensfähige Kulturen bei der American Type Culture Collection, Washington D.C., hinterlegt sind.The cosynthetic factor-1 is obtained according to patent 1 106 453 by a microorganism of the genus Streptomyces in a known manner in an aqueous Culture medium is grown until this one is mainly based on the cosynthetic Has Factor-1 based activity, then at a pH of about 6 to 7 is filtered and from the Filtrate by customary work-up the cosynthetic factor-1 is obtained. As particularly advantageous to use The microorganism was found to be Streptomyces aureofaciens ATCC No. 13190 or its Mutants or Variants of the Viable Cultures in American Type Culture Collection, Washington D.C..

Im Gegensatz zur Fermentation mit einer 5 a(11 a)-Dehydrotetracyclin erzeugenden Kultur von S 1308 und seinen Varianten, wobei geringe Mengen an Chlortetracyclin gebildet werden, wurde bei der Züchtung des neuen S.-aureofaciens-Stamms W-5 unter üblichen aeroben Bedingungen keinerlei Tetracyclin-oder Chlortetracyclinbildung beobachtet. Dieses Verhalten des Stammes W-5 ist jedoch ein Charakteristikum, das andere CF-1 in guten Ausbeuten erzeugende Stämme von S. aureofaciens nicht notwendigerweise besitzen.In contrast to fermentation with a 5 a (11 a) -Dehydrotetracycline producing culture of S 1308 and its variants, with small amounts of chlortetracycline were formed during the breeding of the new S. aureofaciens strain W-5 under Under normal aerobic conditions, no tetracycline or chlortetracycline formation whatsoever observed. However, this behavior of the W-5 strain is a characteristic that other strains of S. aureofaciens producing CF-1 in good yields not necessarily own.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Bereitung des Inokulums Ein typisches, für die Züchtung des primären Inokulums verwendetes Medium wird nach folgender Vorschrift bereitet: Saccharose .................... 30,0 g Maisquellwasser ............... 16,5 ml Ammoniumsulfat .............. 2,0 g Calciumcarbonat .............. 7,0 g Wasser ................... auf 1000 ml Anteile dieses Mediums von jeweils 8 ml werden in eine Reihe von 20-cm-Reagenzgläsem eingebracht und 20 Minuten unter einem Druck von etwa 1 atü im Autoklav sterilisiert. Sporen des Stammes S. aureofaciens W-5 werden mit sterilem destilliertem Wasser von einem Schrägagar weggegewaschen, wobei eine Suspension erhalten wird, die etwa 60 - 10s Sporen je Milliliter enthält. 0,33 ml dieser Suspension werden zur Beimpfung eines jeden der 8 ml des oben beschriebenen Mediums enthaltenden Reagenzgläser verwendet. Das beimpfte Schüttelrohr wird dann 24 Stunden bei 28° C auf einer Schüttelvorrichtung mit Hinundherbewegung bei 116 Schwingungen je Minute inkubiert. Fermentation Ein Fermentationsmedium wird nach folgender Vorschrift bereitet: (N H4)2 S 04 .................. 5,0 g CaCO3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9,0 g NH4C1 ...................... 1,5 g Mg C12 -6H20 .............. 2,0 g Fe S 04 *7H 20 .............. 0,06 g Mn S 04 * 4 H20 .............. 0,05 g C0 C12 *6H 20 .............. 0,005 g Zn S 04 -7H20 .............. 0,1 g Maisquellwasser .............. 25,0 g Baumwollsamenmehl .......... 2,0 g Maisstärke ................... 55,0 g Wasser .................. auf 1000 ml Jeweils 25 ml des Mediums werden in 250-ml-Erlenmeyerkolben eingebracht und mit jeweils 0,5 ml Schmalzöl versetzt. Die das Fermentationsmedium und das Schmalzöl enthaltenden Kolben werden in einem Autoklav 20 Minuten unter einem Druck von etwa 1 atü sterilisiert. Nach der Sterilisation und dem Abkühlen wird 1 ml des nach der früher angegebenen Vorschrift bereiteten Inokulums zu jedem Kolben zugesetzt und die Fermentation auf einer Rundschüttelvorrichtung mit 180 Umdr./Min. bei 25° C 120 Stunden geführt. Die Gehaltsprüfung der Maische ergibt 1 wg cosynthetischen Faktor-1/ml. Beispiel 1 Nach der vorstehend beschriebenen Arbeitsweise wird ein Inokulum von S. aureofaciens S 1308 (ATCC 12 749) bereitet. Anteile von kristallinem CF-1 werden zu einem Fermentationsmedium obiger Zusammensetzung, das jedoch noch 0,1 #tg/ml an Ribofiavin enthält, gegeben. Das Medium wird dann sterilisiert, mit dem 24stündigen vegetaviten Inokulum von S. aureofaciens S 1308 beimpft, 120 Stunden bei 20° C inkubiert und auf seinen Gehalt an Chlortetracyclin geprüft. Zugesetzter CF-1 Gebildetes Chlortetracyclin (turbidimetrische Prüfung) mcgi ml mcg% ml 0 360 0,01 925 0,02 1500 0,04 2550 0,08 4270 0,16 5600 0,32 6200 Beispiel 2.The following examples illustrate the invention without restricting it. Preparation of the inoculum A typical medium used for the cultivation of the primary inoculum is prepared according to the following instructions: Sucrose .................... 30.0 g corn steep liquor .... ........... 16.5 ml ammonium sulfate .............. 2.0 g calcium carbonate .............. 7 , 0 g water ................... to 1000 ml portions of this medium of 8 ml each are placed in a row of 20 cm test tubes and placed under pressure for 20 minutes sterilized from about 1 atm in the autoclave. Spores of the strain S. aureofaciens W-5 are washed away from an agar slant with sterile distilled water, a suspension being obtained which contains about 60-10s spores per milliliter. 0.33 ml of this suspension is used to inoculate each of the test tubes containing 8 ml of the medium described above. The inoculated shaker tube is then incubated for 24 hours at 28 ° C on a shaker with reciprocation at 116 vibrations per minute. Fermentation A fermentation medium is prepared according to the following procedure: (N H4) 2 S 04 .................. 5.0 g CaCO3. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9.0 g NH4C1 ...................... 1.5 g Mg C12 -6H20 .............. 2 , 0 g Fe S 04 * 7H 20 .............. 0.06 g Mn S 04 * 4 H20 .............. 0.05 g C0 C12 * 6H 20 .............. 0.005 g Zn S 04 -7H20 .............. 0.1 g corn steep water .... .......... 25.0 g cottonseed flour .......... 2.0 g corn starch ................... 55 , 0 g water .................. to 1000 ml 25 ml of the medium are placed in 250 ml Erlenmeyer flasks and each time 0.5 ml of lard oil is added. The flasks containing the fermentation medium and the lard oil are sterilized in an autoclave for 20 minutes under a pressure of about 1 atm. After sterilization and cooling, 1 ml of the inoculum prepared according to the instructions given earlier is added to each flask and fermentation is carried out on a rotary shaker at 180 rev / min. performed at 25 ° C for 120 hours. The content test of the mash results in 1 wg cosynthetic factor-1 / ml. Example 1 An inoculum of S. aureofaciens S 1308 (ATCC 12 749) is prepared according to the procedure described above. Portions of crystalline CF-1 are added to a fermentation medium of the above composition, but which still contains 0.1 tg / ml of ribofiavin. The medium is then sterilized, inoculated with the 24-hour vegetarian inoculum of S. aureofaciens S 1308, incubated for 120 hours at 20 ° C. and checked for its chlorotetracycline content. Added CF-1 Formed chlorotetracycline (turbidimetric test) mcgi ml mcg% ml 0 360 0.01 925 0.02 1500 0.04 2550 0.08 4270 0.16 5600 0.32 6200 Example 2.

Nach der oben beschriebenen Arbeitsweise wird eine 120-Stunden-Fermentation mit S. aureofaciens W-5 durchgeführt. Die gebildete Maische wird ohne pH-Werteinstellung filtriert, wodurch man ein W-5-Filtrat erhält.A 120-hour fermentation is carried out according to the procedure described above performed with S. aureofaciens W-5. The mash formed is made without pH adjustment filtered to give a W-5 filtrate.

Man führt eine S.-aureofaciens-S,1308-Fennentation, wie im Beispiel 1 beschrieben, durch, ersetzt jedoch den dort verwendeten kristallinen CF-1 durch 0,08 ml dieses neutralen W-5-Filtrats. Die erhaltene Maische liefert bei der Gehaltsprüfung folgende Werte: ml neutrales W-5-Filtrat Gebildetes Chlortetracyclin je ml S-1308-Maische (turbidimetrische Prüfung) 0,00 150 0,08 3410 Beispiel 3 Ein neutrales S.-aureofaciens-W-5-Filtrat wird, wie im Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Eine Gärung mittels S. aureofaciens E 504 (ATCC 13, 191) wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch das dort verwendete kristalline CF-1 durch unterschiedliche Volumina an neutralem S.-aureofaciens-W-5-Fütrat ersetzt wird. Die Gehaltsprüfung der erhaltenen Maischen ergibt folgende Werte: Gebildetes ml neutrales 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin W-5-Filtrat je ml turbidimetrische spektrophoto- E-504-Maische Prüfung metrische Prüfung mcg!ml mcglml I 0,00 0,5 50 0,04 105 85 0,72 180 170 Die Zugabe von cosynthetischem Faktor-1 zu der oben beschriebenen S.-aureofaciens-Fermentation führt zur erhöhten Bildung von 7-Chlor-6-desmethyltetracyclin.An S. aureofaciens S, 1308 separation is carried out as described in Example 1, but the crystalline CF-1 used there is replaced by 0.08 ml of this neutral W-5 filtrate. The mash obtained provides the following values in the content test: ml neutral W-5 filtrate Formed chlortetracycline per ml of S-1308 mash (turbidimetric test) 0.00 150 0.08 3410 Example 3 A neutral S. aureofaciens W-5 filtrate is prepared as described in Example 2. Fermentation using S. aureofaciens E 504 (ATCC 13, 191) is carried out as described in Example 1, but the crystalline CF-1 used there is replaced by different volumes of neutral S. aureofaciens W-5 feed . The content check of the mashes obtained gives the following values: Educated ml of neutral 7-chloro-6-desmethyltetracycline W-5 filtrate per ml turbidimetric spectrophoto- E-504 mash test metric test mcg! ml mcglml I. 0.00 0.5 50 0.04 105 85 0.72 180 170 The addition of cosynthetic factor-1 to the S. aureofaciens fermentation described above leads to the increased formation of 7-chloro-6-desmethyltetracycline.

Beispiel 4 Ein S.-aureofaciens-W-5-Neutralfiltrat wird, wie im Beispiel 2 beschrieben, zubereitet. Jeweils 25 ml des früher beschriebenen Fermentationsmediums werden in sechs 250-ml-Erlenmeyerkolben eingebracht. Ein Inhibitor der fermentativen Chlorierung, 2,5-Dimercapto-1,3,4-thiadiazol (DMTD), wird zu zweien der sechs Kolben in dem Verhältnis von 0,10 mg DMTD je Millimeter Fermentationsmedium gegeben. Alle sechs Kolben werden dann sterilisiert und abgekühlt. Eine S.-aureofaciens-S-1308-Gärung wird, wie im Beispiel l beschrieben, durchgeführt, wobei jedoch an Stelle des dort verwendeten kristallinen CF-1 0,08 ml des S.-aureofaciens-W-5-Neutralfiltrats eingesetzt werden. Die Gehaltsprüfung der erhaltenen Maische ergibt folgende Werte: ml W-5-Neu- Chlortetracyclin Tetracyclin tralfiltrat je DMTD (fluorometrische (spektro- ml S-1308- Prüfung) photometrische Maische Prüfung) mg?mI mcg.-ml mcg%ml 0 0 220 0 0,08 0 1420 130 0,08 0,10 110 3410 0 0 280 0 0,08 0 3300 295 0,08 0,10 160 3140 Die vorstehenden Daten zeigen, daß die Zugabe von cosynthetischen Faktor-1 zu einer S.-aureofaciens-S-1308-Gärung in Gegenwart eines Chlorierungsinhibitors zu der Bildung von Tetracyclin führt.Example 4 An S. aureofaciens W-5 neutral filtrate is prepared as described in Example 2. 25 ml each of the fermentation medium described earlier are placed in six 250 ml Erlenmeyer flasks. An inhibitor of fermentative chlorination, 2,5-dimercapto-1,3,4-thiadiazole (DMTD), is added to two of the six flasks in the ratio of 0.10 mg DMTD per millimeter of fermentation medium. All six flasks are then sterilized and cooled. S. aureofaciens S-1308 fermentation is carried out as described in Example 1, but 0.08 ml of the S. aureofaciens W-5 neutral filtrate are used in place of the crystalline CF-1 used there. The content test of the mash obtained gives the following values: ml W-5-Neu- Chlortetracycline Tetracycline central filtrate per DMTD (fluorometric (spectro- ml S-1308 test) photometric Mash test) mg? mI mcg.-ml mcg% ml 0 0 220 0 0.08 0 1420 130 0.08 0.10 110 3410 0 0 280 0 0.08 0 3300 295 0.08 0.10 160 3140 The above data show that the addition of cosynthetic factor-1 to S. aureofaciens S-1308 fermentation in the presence of a chlorination inhibitor results in the formation of tetracycline.

Claims

CLAIMS: 1. A process for the preparation of antibiotics of the Tetracyclinreihe, particularly chlortetracycline and tetracycline, in the usual way by means of antibiotics of the biological Tetracyclinreihe producing streptomycetes, characterized in that the nutrient medium of the cosynthetische factor-1 prepared according to Patent 1 106 435 is added.

2. The method according to claim 1, characterized in that the cosynthetic factor-1 is in crystalline form is used.

3. The method according to claim 1, characterized in that as a cosynthetic Factor-1, optionally filtered, through an organism of the genus Streptomyces fermented and the cosynthetic factor-1 containing aqueous nutrient medium used will.

4. The method according to claim 1, characterized in that as streptomycetes Organisms of strain ATCC 12,748 can be used.